WO2012010708A1 - Verfahren, vorrichtung und testkit für molekularbiologische reaktionen - Google Patents

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Timo Hillebrand
Elmara Graser
Katjana Daskalow
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    • C12Q2565/625—Detection means characterised by use of a special device being a nucleic acid test strip device, e.g. dipsticks, strips, tapes, CD plates

Definitions

  • the invention relates to reagent components for carrying out molecular genetic investigations, in particular under field conditions. These reagent formulations are also storage stable at ambient temperature. Possible applications include polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription (RT) enzyme-substrate, antigen-antibody interactions, and protein synthesis.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT reverse transcription
  • a number of different components is required. These are e.g. Amplification buffers, salts, enzymes, dNTPs, nucleic acids, etc.
  • all components for the detection reaction including the biomolecules, must be stable over a longer period of time, if possible.
  • a compilation of multiple solutions (kit components) will only last as long as its most delicate component.
  • This critical component is often biocatalysts or proteins that must be present in native and / or active form according to the application.
  • dNTPs nucleotides
  • polydextrose, mannitol or sorbitol may also be used as humectants be used because they functionally replace water.
  • This type of stabilization is also often linked to a cooling possibility, so that the degradation of the biomolecule over a longer period can not be excluded.
  • Successful storage of enzyme preferably a Taq HOT start polymerase
  • primer, probe, dNTPs and an internal positive control is described in US patent application US 02005 006 98 98A1.
  • the corresponding chemicals were applied together with HEPES on a bead with mannitol, which is dissolved in water for PCR and then used.
  • 4,891,319 describes the protection of proteins and other biological molecules by adding trehalose to an aqueous solution, thus achieving successful stabilization while maintaining the activity of the components, for example, for 6 months at 40 ° C for blood coagulation factors (US Patent 7501493). and other molecules (Paz-Alfaro KJ, Ruiz-Granados YG, Uribe-Carvajal S, Sampedro JG, Trehalose-mediated thermal stabilization of glucose oxidase from Aspergillus niger. J Biotechnol., 2009 May 20; 141 (3-4): 130 Epub 2009 Mar 25 and Morana A, Stiuso P, Colonna G, Lamberti M, Carteni M, De Rosa M.
  • biomolecules can be freeze-dried and rehydrated before use. However, here too the dried biomolecules must be stored cool. In this connection are also the 2.6 nm large, lyophilized particles of the company Cepheid (Sunnyvale, CA) mentions.
  • dNTPs, polymerase, magnesium chloride and buffer are combined in one particle and can be used for further applications (PCR) after addition of water and primers.
  • Cepheid relies on a freeze-drying process developed by ABAXIS Inc., the so-called "Orbos Technology" (http://www.abaxis.com/about_us/history.html) .Disadvantage of the method of drying is the rather high equipment costs for a freeze-drying.
  • the Ready-to-go product line is a partially stabilized PCR component, with small beads containing Taq polymerase, dNTPs, and amplification buffer, which are stable at room temperature for an extended period of time is that the primer and probe must be freshly added by the customer, which makes this method unsuitable for use outside of a laboratory
  • Klatser et al Klatser et al (Klatser PR, Sjoukje Kuijper, van Ingen CW, Kolk AHL Stabilized, Freeze-dried PCR Mix for detection of mycobacteria. J Clin Microb, 1998 Jun 36 (6): 1798-1800 1998).
  • primers, buffers, dNTPs, uracil DNA glycosylase and polymerase are freeze-dried with 5% trehalose.
  • trehalose When stored at 4 or 20 ° C, they were still active for up to one year after drying. Storage at 37 ° C reduced the storage time to 3 months or 56 ° C to 1 week. The authors used 2 different polymerases. It turned out that a higher content of glycerol negatively influences the storage stability since glycerol has a hygroscopic effect.
  • the disadvantage here, however, is that trehalose inhibits a series of amplification reactions and in particular reactions which couple an amplification reaction with a probe hybridization. Thus, such an agent is in any way universally applicable.
  • the stabilization of the reagents mediated by trehalose can be increased even more by adding prionex, a polypeptide from porcine skin collagen, as in this case.
  • the stability of the reagents was four times as long after addition of the polypeptide as with trehalose alone, instead of 30 days at 37 ° C.
  • Another method for stabilizing biomolecules is to bind them to a mold carrier. Via a coupling reaction with an amino group, the biomolecule stably and permanently binds to the carrier material and can thus be used for detection reactions.
  • This method is patented and disclosed (European Patent Application EP0511559).
  • a modified, also patented method for stable immobilization of antibodies U.S. Patent 4,948,836) and oligonucleotides (German Patent DE 10053553C2) is also described.
  • the drying takes place partially after incubation in a protein-sugar solution. This process is very cumbersome and time consuming and can not be realized in this form for a mixture of different substances, as they are necessary for a PCR.
  • dNTPs nucleotide triphosphates
  • primers primers
  • buffer an enzyme
  • Taq or reverse transcriptase an enzyme
  • dNTPs One of the critical components for the storage stability of the individual solutions are the dNTPs, which decompose at a physiological pH (pH 7.0 to 7.5) to corresponding diphosphates and monophosphates.
  • pH 7.0 to 7.5 physiological pH
  • the content of functional dNTPs already decreases by 2-3% after 10 days at 37 ° C.
  • the dNTPs can be stored in the presence of an appropriate stabilizer.
  • adenosine triphosphate could be confirmed as stabilizers in the presence of EDTA (pH 8.3 to 9.2), guanidine / aminoguanidine (pH 9.0 to 10.0) or glycerol / hydrogen phosphate (pH 3.7) (EP0941370 bl).
  • EDTA pH 8.3 to 9.2
  • guanidine / aminoguanidine pH 9.0 to 10.0
  • glycerol / hydrogen phosphate pH 3.7
  • the prior art also includes the documents US 3645853 A, DE 2800437 AI, DE1220083 A, WO 98/37229 AI, EP0733714A2, EP0823972 AI and EP0925113 AI.
  • U.S. Patent 3,645,853 describes a diagnostic composition and method for detecting nitrate reduction.
  • a spongy material containing at least four impregnated zones is disclosed.
  • the compartmentalization is carried out by applying solutions individually to paper and then assembling them manually after complete drying. There is no compatibility by nature. Only from one side substance is replaced. Other components are not dissolved, but a direct color change occurs after mixing the solutions on the strip.
  • DE 2800437 Al mentions a device for obtaining a non-toxic atmosphere for use in growing anaerobic micro-organisms, wherein the surface area and the permeability of a membrane are selected such that the rate of access of the liquid and thus the rate of generation of the gas atmosphere is controlled.
  • EP 0 733 714 A2 describes a nucleic acid amplification method and apparatus.
  • a sample is pumped from the sample application to the reaction area.
  • the reaction region is preferably described as a continuous channel: "Although it is preferred to provide the sample area and reaction area in the form of a continuous, undivided channel as shown, it is within the scope of the present invention to provide partitions or barriers It is therefore within the scope of the invention to provide partitions or barriers between the decontamination zone and the amplification zone of the reaction area. " However, there is no intention for the authors to separate the products.
  • the subject of EP0733714A2 is a diagnostic device in which the release and capture medium form a biphasic chromatographic substrate. Both media are separate and made of different materials.
  • the capture medium has no other immobilized components and is used for adsorption.
  • the release medium is a hydrophilic material for holding, releasing and transporting the immunological material. The application is carried out by capillary action of the test solutions. Mixing is not specifically prevented.
  • EP 0 925 113 AI reports an apparatus and a method for storing and distributing biochemical reagents.
  • Each reagent is arranged in a single room, with the rooms separated from each other.
  • the reagent cartridge is a single item. Reagent cartridges are combined to cassette cartridge.
  • the invention had the object to eliminate the disadvantages mentioned in the prior art.
  • the present invention has provided a molecular diagnostic detection method which contains all the required critical reagent components in a form which:
  • the spatial separation of the components involved in the amplification or reverse transcription has not been considered in any of the previously disclosed solution.
  • the agent according to the invention precisely takes into account the spatial separation of the components which are required for the reactions and thus makes it possible to protect the components involved from one another. This approach thus makes it impossible to initiate non-specific reactions (e.g., formation of primer domains, nonspecific amplification under suboptimal conditions, etc.).
  • primer or primer and probes are placed on a porous filter disc (eg made of polyethylene).
  • a porous filter disc eg made of polyethylene.
  • the components are dried (eg incubation at 37 ° C. for 1 h) or else lyophilized. Subsequently, the filter disc is stored dry. The release of the spent reaction components takes place in that the filter disk is supplied with an aqueous solution which contains all further reaction components required for the amplification reaction / detection reaction in the respectively optimum concentration (dNTPs, amplification buffer, magnesium and optionally further additives).
  • This aqueous solution can be prepared in advance as a master mix and may already contain the nucleic acid to be examined.
  • a detergent eg, an octylphenol ethoxylate or polysorbate
  • This detergent improves the release of the components located on the filter disk.
  • the required amount of dNTPs can additionally be compartmentalized on the filter disc and thus spatially separated from the other reaction components.
  • the preparation of the storage-stable filter disc and the storage is carried out as described.
  • the release of the spent reaction components again takes place by supplying to the filter disk an aqueous solution which contains all further reaction components required for the amplification reaction / detection reaction in the respectively optimum concentration.
  • This aqueous solution can be prepared in advance and may already contain the nucleic acid to be examined.
  • An advantage of this embodiment is that the dNTPs were also stored stable on the filter disk. Thus, this component of the aqueous solution to release the reaction components no longer needs to be included.
  • the agent according to the invention can also be used for carrying out a reverse transcriptase reaction for the investigation of a target RNA.
  • the reverse transcriptase, dNTPs, the concentrated buffer and primers required for the reaction are spent on the filter disk.
  • RNA to be rewritten possibly a detergent and RNA-stabilizing reagents.
  • this method has another advantage: The amount of RNA used can be considerably increased because the necessary components are not added as an aqueous solution but are dissolved directly in the RNA to be rewritten. This increases the sensitivity of the test method.
  • the reaction buffer, the enzyme mix, the dNTPs and the primer and probe required for the reaction are spent and stabilized on the filter disc.
  • the detachment of the components is carried out as in the case of a two-step PCR (cDNA synthesis and PCR in different reaction vessels) with an aqueous solution containing the RNA to be examined.
  • compartmentalization and storage-stable immobilization of individual reaction components in different mixtures and enzyme-catalyzed reactions can be used. It is always ideal if the required reaction partners are not allowed to interact with each other before a reaction.
  • reaction components which are required for a reaction in spatially separated arrangement can also be done without porous material on spatially separated areas of a vessel.
  • the individual components are brought together by washing out with an aqueous solution immediately before the beginning of the reaction.
  • the filter disc of the present invention provides greater protection against exogenous factors (e.g., oxygen, moisture, light).
  • reaction molecular biological reactions
  • biological molecules include any substances and compounds of essentially biological origin which possess properties which are scientifically, diagnostic and / or pharmaceutical applications are relevant.
  • native molecules are included, as can be isolated from natural sources, but also derived forms, fragments and derivatives, as well as recombinant forms and artificial molecules, provided they have at least one property of the native molecules.
  • RNA in DNA include the amplification, detection or transcription of nucleic acids, enzyme-substrate, antigen-antibody interactions and protein synthesis.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT reverse transcription
  • primer or “probes” the skilled person understands oligonucleotides, wherein primers for amplification or reverse transcription are necessary. The singles can be marked. Labels of probes are known to those skilled in the art.
  • enzymes includes polymerase and reverse transcriptase and other enzymes useful in molecular biology, such as peroxidases, dehydrogenases, phosphatases, etc.
  • DNTPs are deoxyribose nucleotide triphosphates. These are the building blocks that are added during a PCR to synthesize a new strand. Examples are: dATP (adenosine triphosphate), dUTP (uracyl), dCTP (cytidine), dTTP (thymidine) and dGTP (guanosine).
  • dATP adenosine triphosphate
  • dUTP uracyl
  • dCTP cytidine
  • dTTP thymidine
  • dGTP guanosine
  • buffer stands for reaction buffer. The person skilled in the corresponding reaction buffer known.
  • Polyethylene filter disks were used as porous supports.
  • FIG. 1 On different zones of the filter disk, the following components were added (FIG. 1):
  • FIG. 1 shows a filter disk with different zones and PCR materials.
  • the components were applied in the amount corresponding to a ⁇ PCR approach.
  • the solutions were placed on the filter disk and dried for about 2 h under physiological temperature conditions (37 ° C). After drying, the filter discs were transferred to a 2 ml screw, sealed with a lid and stored at room temperature for 3 months and tested after this storage time in a comparison reaction with freshly added reaction components.
  • the DNA buffer mixture was added to the filter plate in the 2 ml tube and vortexed for 1 min.
  • the 100 ⁇ each of the PCR mixture was distributed to 6 wells of a SpeedCycler plate of 15 ⁇ each. After carrying out the amplification reaction, the amplification products were evaluated on an agarose gel (FIG. 2).
  • FIG. 2 shows PCR products after amplification of genomic DNA with fresh and storage-stable reagents.
  • the compartmentalized reagents were prepared for the performance of a probe-based LFA assay.
  • the compartmentalized transfer of the individual reaction components should prevent an irregular start of reaction and thus prevent the occurrence of false-positive results.
  • Polyethylene filter disks were used as porous supports.
  • FIG. 3 On different zones of the filter disk, the following components were added (FIG. 3):
  • FIG. 3 shows the top view of a filter disk. Compartmentation of storage-stable components for a probe-based LFA assay.
  • the reagents were applied in the amount corresponding to a 100 ⁇ PCR approach.
  • the solutions were pipetted onto the filter disc and dried for approximately 2 h under physiological temperature conditions of 37.degree. After drying, the filter discs were placed in a 2 ml screw, sealed with a lid provided and stored at RT for 3 months and tested in a comparison reaction with freshly added reaction components.
  • 2x15 ⁇ of the batch were pipetted off as a negative control, to the remainder of the master mix 5 ⁇ S. Enterica DNA were added and of which 2x15 ⁇ of the PCR mixture were added to the well of a PCR plate for the SpeedCycler.
  • the DNA buffer mixture was placed on the filter disc in the 2 ml tube, capped and vortexed for 1 min. 2x15 ⁇ of the batch were pipetted off as a negative control, 5 ⁇ S. enterica DNA was added to the remainder of the master mix, and 2 ⁇ 15 ⁇ of the PCR mixture were added to the well of a PCR plate for the SpeedCycler. 3) "Fresh + Primer / Probe Mix"
  • primer and probe were mixed together in the given amount (see “Frisch” approach) 2 hours prior to the reaction and stored at room temperature to favor dimer formation 2x15 ⁇ of the batch was pipetted off as a negative control to which The remainder of the master mix was added to 5 ⁇ S. enterica DNA and 2x15 ⁇ of the PCR mix was added to the well of a PCR plate for the SpeedCycler.
  • Figure 4 shows an amlification hybridization reaction (RAH technology) after evaluation of the PCR approach on the gel (A) and on an LFA (B).
  • RH technology amlification hybridization reaction
  • Embodiment 3 Preparation of a compartmentalized storage-stable reaction mixture and use thereof for OneStep cDNA synthesis and amplification of an influenza A virus.
  • Polyethylene filter disks were used as porous supports.
  • FIG. 5 shows the top view of a filter disk. Compartmentation of storage-stable components for a OneStep PCR.
  • buffer containing dNTPs was dried on the bottom of the reaction vessel (Herculase® II RT-PCR 2x Mastermix, Agilent).
  • the chemicals were applied in the amount corresponding to a ⁇ approach.
  • the solutions were placed on the filter disc or on the bottom of a 2 ml screw, screwed with a lid and dried for about 2 h at physiological temperature conditions of 37 ° C.
  • the filter discs were placed in a 2 ml screw and stored at RT for 3 months and tested a comparative reaction with freshly added reaction components.
  • RNA samples [0069] A dilution series of RNA samples from cultured influenza A viruses was prepared. The samples were diluted so that 12 ⁇ RNA each corresponded to 10 5 , 10 4 , 10 3 , 10 2 and 10 1 virus particles.
  • RNA solution was placed on the filter plate in the 2 ml tube and vortexed for 1 min.
  • FIG. 6 shows different virus dilutions were amplified with freshly prepared components (fresh) or storage-stable components (dried) on a filter disc in a OneStep RT-PCR and detected on a lateral flow strip.
  • the example illustrates that the use of the storage-stable coated filter disk even with a OneStep RT-PCR reaction shows no loss of activity compared to freshly added reaction components.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung, ein Verfahren und ein Testkit zur Durchführung molekularbiologischer Reaktionen, wobei sich die verschiedenen Komponenten für die molekularbiologische Reaktionen vor dem Reaktionsstart auf einem festen Träger in unterschiedlichen, räumlich getrennten, Kompartimenten befinden. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Träger um eine poröse Filterscheibe aus Polyethylen. Anwendungsgebiete sind die Amplifikation von Nukleinsäuren, z.B. PCR oder RealTime-PCR, die reverse Transkription von RNA in DNA Enzym- Substrat-, Antigen- Antikörper Wechselwirkungen oder die Proteinsynthese.

Description

VERFAHREN, VORRICHTUNG UND TESTKIT FÜR
MOLEKULARBIOLOGISCHE REAKTIONEN
[0001] Gegenstand der Erfindung sind Reagenzienkomponenten für die Durchführung molekulargenetischer Untersuchungen, insbesondere unter Feldbedingungen. Diese Reagenzienformulierungen sind auch bei Umgebungstemperatur lagerstabil. Mögliche Anwendungsgebiete sind die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die reverse Transkription (RT) Enzym- Substrat-, Antigen-Antikörper- Wechselwirkungen, und die Proteinsynthese.
Stand der Technik
[0002] Die Untersuchung diagnostisch relevanter biologischer Proben wie Serum, Plasma, Blut, Urin, Tupferproben oder Organabriebe zum Nachweis infektiöser Erreger hat in den letzten Jahren enorm an Bedeutung gewonnen. Virusinfektionen wie HIV, HCV oder HBV sind weltweit auf dem Vormarsch. Darüber hinaus sind auch bakterielle Infektionen weltweit verstärkt vertreten, u.a. auch als Ergebnis beginnender klimatischer Veränderungen. Das Auftreten neuer, z.T. tödlich verlaufender Krankheiten mit einem extrem hohen Infektionspotential (Schweres Akutes Atemwegssyndrom (SARS), Vogelgrippe) zeigt immer deutlicher, dass in Zukunft eine schnelle und vor Ort durchführbare Diagnostik entscheidend für die Verhinderung von Epidemien sein wird. Darüber hinaus spielen einfach handhabbare, zuverlässige und zugleich relativ preiswerte diagnostische Systeme vor allem für Entwicklungsländer eine bedeutende Rolle bei der Bekämpfung der Ausbreitung von Infektionskrankheiten. Die derzeitig vor allem für die Detektion viraler Infektionskrankheiten (HIV, HCV, HBV, Dengue, u.a.m.) eingesetzten Tests basieren mehrheitlich auf einer invasiven Probennahme und auf die Durchführung von Real-Time-PCR's. Diese Tests sind an extrem teure gerätetechnische Voraussetzungen und Reagenzien gebunden. Die Durchführung dieser Methode kann nur durch geschultes Fachpersonal in Speziallaboratorien erfolgen.
[0003] Ein weiterer Schwerpunkt betrifft die Durchführung von diagnostischen Tests in Bezug auf die Früherkennung von bioterroristischen Anschlägen (Pocken, Pest, Anthrax). In diesem Kontext ist es extrem wichtig, mobile Detektionssysteme einsetzten zu können. Einige wenige mobile Detektionssysteme sind mittlerweile verfügbar. Allerdings sind deren Applikationsfelder zurzeit noch sehr begrenzt. Diese Systeme basieren dabei prinzipiell auf der Um- Setzung klassischer diagnostischer Verfahren, welche unter Laborbedingungen standardisiert eingesetzt werden. Nach Isolierung der Nukleinsäuren erfolgen eine spezifische Amplifizie- rungsreaktion und ein spezifischer Nachweis der PCR-Produkte.
[0004] Problematisch für den Einsatz der klassischen labordiagnostischen Nachweisverfahren unter Feldbedingungen ist dabei aber, dass unter Feldbedingungen keine Kühlkapazitäten verfügbar sind und dass die umfangreichen Schritte der Pipettierung von Reaktionsansätzen (z.B. für eine PCR) ebenfalls unter Feldbedingungen nicht durchführbar sind. Diese Reaktionen sind in der Regel nur vom Fachpersonal durchzuführen.
[0005] Der Erfindung lag deshalb unter anderem die Aufgabe zugrunde, alle für molekulardiagnostische Detektionsverfahren benötigten kritischen Reagenzienkomponenten in einer Form zur Verfügung zu stellen, die:
1. eine sehr einfache Handhabung der Herstellung von Reaktionsansätzen erlauben
und
2. auch ohne Kühlung und unter Umgebungstemperaturbedingungen einsetzbar sind.
[0006] Für molekulargenetische Nachweisverfahren ist eine Reihe von unterschiedlichsten Komponenten erforderlich. Dabei handelt es sich z.B. um Amplifizierungspuffer, Salze, Enzyme, dNTPs, Nukleinsäuren etc. Um die Reproduzierbarkeit und Funktionalität der Nachweisreaktion gewährleisten zu können, müssen sämtliche Komponenten für die Nachweisreaktion, einschließlich der Biomoleküle, möglichst über einen längeren Zeitraum stabil vorliegen. Eine Zusammenstellung mehrerer Lösungen (Kitkomponenten) ist nur so lange haltbar wie seine empfindlichste Komponente. Bei dieser kritischen Komponente handelt es sich häufig um Biokatalysatoren oder Proteine, die entsprechend der Anwendung in nativer und/ oder aktiver Form vorliegen müssen. Hochproblemtisch sind auch Nukleotide (dNTPs), die oftmals einen einsatzlimitierenden Faktor darstellen, da sie sehr schnell inaktiv werden.
[0007] Um eine längere Haltbarkeit solcher Biomoleküle zu gewährleisten, werden diese häufig gekühlt verschickt und bei < 4°C gelagert. Dabei führt häufiges Einfrieren und Auftauen zum Aktivitätsverlust bzw. zur Zerstörung des Biomoleküls. Ursache dafür ist die Ausbildung von Eiskristallen im Lösungsmittel, welche die Proteine spalten können. Um die Bildung von Eiskristallen zu verhindern, werden häufig 50% des wässrigen Lösungsmittels durch Glyzerin ersetzt. Dies kann jedoch nur dann zugegeben werden, wenn die Aktivität der Biomoleküle nicht beeinflusst wird und Glyzerin die nachfolgenden Anwendungen nicht stört oder hemmt.
Alternativ zu Glyzerin können auch Polydextrose, Mannitol oder Sorbit als Feuchthaltemittel eingesetzt werden, da sie Wasser funktionell ersetzen. Diese Art der Stabilisierung ist ebenfalls häufig an eine Kühlungsmöglichkeit gebunden, so dass der Abbau des Biomoleküls über einen längeren Zeitraum nicht ausgeschlossen werden kann. Eine erfolgreiche Lagerung von Enzym (vorzugsweise eine Taq HOT Start Polymerase), Primer, Sonde, dNTPs und eine interne Positivkontrolle ist in der US Patentanmeldung US 02005 006 98 98A1 beschrieben. Hier wurden die entsprechenden Chemikalien zusammen mit HEPES auf ein Kügelchen mit Mannitol aufgebracht, welches für die PCR in Wasser gelöst und anschließend eingesetzt wird. Ein ähnliches Prinzip findet sich auch in der Natur: Aufgrund einer hohen Konzentration nicht-reduzi er ender Zucker gelingt es einigen Organismen (Mikroorganismen, Pflanzen, Tiere), eine fast vollständige Dehydration (Anhydrobiose) zu überstehen und nach der Re- hydration den normalen Stoffwechsel fortzusetzen (Teramoto N, Sachinvala ND, Shibata M. Trehalose and trehalose-based polymers for environmentally benign, biocompatible and bio- active materials. Molecules. 2008 Aug 21; 13(8): 1773-816). Bei dem Zucker handelt es sich in der Regel um Trehalose, einem Zweifachzucker aus zwei Molekülen Glukose, welcher umgangssprachlich als„natürliches Frostschutzmittel" bezeichnet wird. Es wird angenommen, dass Trehalose Wassermoleküle funktionell substituiert und so die molekulare Integrität des Biomoleküls erhält. Ein entsprechendes Patent (US Patent 4891319) beschreibt den Schutz von Proteinen und anderen biologischen Molekülen durch Zugabe von Trehalose zu einer wässrigen Lösung. Eine erfolgreiche Stabilisierung unter Erhalt der Aktivität der Komponenten ist so beispielsweise über 6 Monate bei 40°C für Blutgerinnungsfaktoren gelungen (US Patent 7501493) sowie für andere Moleküle (Paz-Alfaro KJ, Ruiz-Granados YG, Uribe- Carvajal S, Sampedro JG. Trehalose-mediated thermal stabilization of glucose oxidase from Aspergillus niger. J Biotechnol. 2009 May 20; 141(3-4): 130-6. Epub 2009 Mar 25 und Morana A, Stiuso P, Colonna G, Lamberti M, Carteni M, De Rosa M. Stabilization of S- adenosyl-L-methionine promoted by trehalose. Biochim Biophys Acta. 2002 Nov 14; 1573(2): 105-8). Entsprechend erfolgreich konnten auch Primer und Nukleinsäuren in Trehalose stabil gelagert werden, wie im Patent DE 10 2006 056 790 B3 beschrieben. Nachteil einer Lagerstabilisierung mit Zuckern ist, dass eine geringe Anwesenheit von Wasser bzw. ein unvollständiges Trocknen der Reagenzien die Gefahr einer Kontamination mit Bakterien oder Pilzen birgt.
[0008] Eine weitere Möglichkeit einer längeren Lagerstabilität bietet der generelle Entzug von Wasser. So können Biomoleküle gefriergetrocknet und vor Gebrauch wieder rehydriert werden. Allerdings müssen auch hier die getrockneten Biomoleküle kühl gelagert werden. In diesem Zusammenhangen seien auch die 2,6 nm großen, lyophilisierten Partikel der Firma Cepheid (Sunnyvale, CA) erwähnt. Hier werden dNTPs, Polymerase, Magnesiumchlorid und Puffer in einem Partikel kombiniert und können nach Zugabe von Wasser und Primern für weitere Applikationen (PCR) verwendet werden. Cepheid greift dafür auf ein von ABAXIS Inc. entwickeltes Verfahren der Gefriertrocknung zurück, der sogenannten„Orbos Technology" (http://www.abaxis.com/about_us/history.html). Nachteil der Methode des Eintrocknens ist der recht hohe Geräteaufwand für eine Gefriertrocknung.
[0009] Darüber hinaus wäre es sinnvoll, auch Primer und Sonden mit eintrocknen zu können. Dies ist jedoch in dieser Form nicht möglich, da das Mischen von Primer und Sonde zu Pri- mer-Dimeren und anderen Artefakten führen würde, wodurch eine einwandfreie anschließende PCR nicht mehr gewährleistet werden kann. Darüber hinaus würde dies bei einer Reihe von Amplifizierungsreaktionen und insbesondere Reaktionen, welche eine Amplifizierungs- reaktion mit einer Sondenhybridisierung koppeln, zu falsch-positiven Ergebnissen führen. Die Dimerbildung stellt daher bei der Stabilisierung von PCR-Ansätzen ein wesentliches Problem dar, da mehrere einzelne Reaktionsgefäße notwendig wären um den optimalen Reaktionsablauf gewährleisten zu können. Eine solche Lösung ist allerdings für Feldversuche unhandlich, birgt eine Verwechslungs- und Kontaminationsgefahr und erschwert die Handhabbarkeit des gesamten Systems. Prinzipiell nachteilig ist auch, dass diese Gemische auf Grund der Beimischung von Lagerstabilisatoren stark hygroskopisch (wasseranziehend) wirken, sodass die Aktivität und Lagerstabilität der Komponenten rasch bei unsachgemäßer Lagerung abnimmt. Um dem entgegenzuwirken, kann das eingetrocknete Gemisch mit einer Paraffinschicht überzogen. Durch Zugabe einer wässrigen Lösung und durch Erwärmung schmilzt die Paraffinschicht, die getrockneten Substanzen lösen sich auf und sind für die PCR-Methode zugänglich. Diese Methode wird im EU Patent DE 10 2004 021 822 B3 offenbart. Hier werden die für die PCR notwendigen Reagenzien direkt an der Kavität eingetrocknet, wo auch die PCR Reaktion stattfindet.
[0010] Weitere lagerstabile bzw. präformulierte Reaktionsmixturen sind kommerziell von der Firma GE Healthcare verfügbar. Bei der Produktlinie„Ready-to-go" handelt es sich um teilweise stabilisierte Komponenten für die PCR. So sind auf kleinen Kügelchen Taq- Polymerase, dNTPs und Amplifikationspuffer aufgebracht. Diese Kügelchen sind bei Raumtemperatur über einen längeren Zeitraum stabil. Der Nachteil dieser Methode ist, dass Primer und Sonde frisch vom Kunden zugegeben werden müssen, was diese Methode ungeeignet macht für die Anwendung außerhalb eines Labors. Dieser Nachteil wird bei einer von Klatser et al. (Klatser PR, Sjoukje Kuijper, van Ingen CW, Kolk AHL Stabilized, Freeze-dried PCR Mix for detection of Mycobacteria. J Clin Microb, 1998 Jun 36(6): 1798-1800 1998) entwickelten Methode ausgeglichen. Hierbei werden Primer, Puffer, dNTPs, Uracil-DNA- Glykosylase und Polymerase mit 5% Trehalose gefriergetrocknet. Wurden die Ansätze bei 4 oder 20°C gelagert, waren sie bis zu einem Jahr nach der Trocknung noch aktiv. Eine Lage- rung bei 37°C verkürzte die Lagerzeit auf 3 Monate bzw. bei 56°C auf 1 Woche. Die Autoren verwendeten 2 verschieden Polymerasen. Dabei stellte sich heraus, die ein höherer Gehalt an Glycerol die Lagerstabilität negativ beeinflusst, da Glycerol hygroskopisch wirkt. Nachteilig hierbei ist aber, dass Trehalose eine Reihe von Amplifizierungsreaktionen und insbesondere Reaktionen, welche eine Amplifizierungsreaktion mit einer Sondenhybridisierung koppeln, inhibiert. Damit ist ein solches Mittel in keiner Weise universell einsetzbar. Ein ähnliches Verfahren wurde auch im Patent DE 10 2006 056 790 B3 offengelegt. Hier wurden sämtliche Komponenten in einem geeigneten Gefäß eingetrocknet und kurz vor der PCR mit Wasser in Lösung gebracht. Auch hier wurde das eingetrocknete Gemisch durch einen Kohlenwasserstoffwachs zur besseren Lagerstabilität überzogen. Diese Methode wurde auch durch Wolff et al. für eine nested PCR in einem Reaktionsgefäß beschrieben (Wolff C, Hörnschemeyer D, Wolff D, Kleesiek K. Single-tube nested PCR with room-temperature-stable reagents. PCR Methods Appl. 1995 4:376-379). Laut der Patentschrift DE 60 2004 002 48/5 T2 kann die durch Trehalose vermittelte Stabilisierung der Reagenzien noch erhöht werden, indem wie in diesem Fall Prionex zugegeben wurde, ein Polypeptid aus porcinem Hautkollagen. Hier be- trug die Stabilität der Reagenzien statt 30 Tage bei 37°C vier Mal solange nach Zugabe des Polypeptids als mit Trehalose allein.
[0011] Ein weiteres Verfahren zur Stabilisierung von Biomolekülen besteht darin, diese an einen Formträger zu binden. Über eine Kopplungsreaktion mit einer Aminogruppe bindet das Biomolekül stabil und dauerhaft an das Trägermaterial und kann so für Nachweisreaktionen genutzt werden. Diese Methode ist patentiert und offengelegt (European Patent Application EP0511559). Eine abgewandelte, ebenfalls patentierte Methode zur stabilen Immobilisierung von Antikörpern (U.S. Patent 4,948,836) und Oligonukleotiden (Deutsches Patent DE 10053553C2) ist ebenfalls beschrieben. Die Trocknung erfolgt teilweise nach Inkubation in einer Protein-Zuckerlösung. Dieses Verfahren ist sehr umständlich und zeitaufwendig und kann in dieser Form nicht für eine Mischung verschiedener Substanzen, wie sie für eine PCR notwendig sind, realisiert werden.
[0012] Die für ein molekulargenetisches Nachweisverfahren (beispielsweise PCR oder rever- se Transkription) notwendigen Komponenten sind Nukleotidtriphosphate (dNTPs), Primer, ggf. Sonde, Puffer und ein Enzym (Taq oder Reverse Transkriptase), wobei letzteres die Reaktion katalysiert. Eine der kritischen Komponenten für die Lagerstabilität der einzelnen Lösungen sind die dNTPs, die bei einem physiologischen pH-Wert (pH 7,0 bis 7,5) zu entsprechenden Diphosphaten und Monophosphaten zerfallen. So nimmt unter physiologischen Bedingungen der Gehalt an funktionellen dNTPs nach 10 Tagen bei 37°C bereits um 2-3% ab. Um diesem entgegenzuwirken, können die dNTPs bei Anwesenheit eines entsprechenden Stabilisators gelagert werden. Insbesondere die Stabilität von Adenosintriphosphat konnte unter Anwesenheit von EDTA (pH 8,3 bis 9,2), Guanidin/ Aminoguanidin (pH 9,0 bis 10,0) oder Glyzerol/ Hydrogenphosphat (pH 3,7) als Stabilisatoren bestätigt werden (EP0941370 Bl). Eine stabile Langzeitlagerung ohne die Notwendigkeit eines Stabilisators wird im Patent EP 0941370B 1 offengelegt. Hier wird die Stabilität der dNTPs bei einem pH-Wert zwischen 8,0 bis 10,0 beschrieben, wobei der Wert sowohl durch Zugabe von Basen, als auch durch Zugabe von Puffern (Tris-Puffer, Natriumcarbonat-Puffer, Phosphatpuffer) eingestellt werden kann.
[0013] Zum Stand der Technik gehören auch die Druckschriften US 3645853 A, DE 2800437 AI, DE1220083 A, WO 98/37229 AI, EP0733714A2, EP0823972 AI und EP0925113 AI .
[0014] Im US-Patent 3,645,853 wird eine diagnostische Zusammensetzung und ein Verfahren zum Nachweis der Nitratreduktion beschrieben. Es wird ein schwammartiges Material offenbart, das mindestens vier imprägnierte Zonen enthält. Die Kompartimentierung erfolgt dadurch, dass Lösungen einzeln auf Papier aufgetragen werden und nach vollständiger Trocknung dann manuell zusammengefügt werden. Eine Kompatibilität von Natur aus ist nicht vorhanden. Nur von einer Seite wird Substanz abgelöst. Übrige Komponenten werden nicht in Lösung gebracht, sondern es erfolgt ein direkter Farbumschlag nach Mischen der Lösungen auf dem Streifen.
[0015] DE 2800437 AI erwähnt eine Vorrichtung zum Erhalt einer nicht-toxischen Atmosphäre zur Verwendung beim Züchten von anaeroben Mikrooganismen, wobei die Oberflä- chenfläche und die Permeabilität einer Membran so ausgewählt sind, dass die Zutrittsgeschwindigkeit der Flüssigkeit und damit auch die Erzeugungsgeschwindigkeit der Gasatmosphäre kontrolliert wird.
[0016] Die Offenlegungsschrift DE 1220083 A beschreibt Teilkammern, die in eine Hauptkammer integriert sind und durch einschiebbare Plättchen voneinander trennbar sind. [0017] In der internationalen Patentanmeldung WO 98/37229 AI wird ein Verfahren und Apparatur für einen schnellen Hygiene-Test vorgeschlagen. Dabei wird eine Flüssigkeit, die ein Extraktionsreagens einschließen kann, wird auf eine Testoberfläche aufgebracht. Es liegt keine Kompartimentierung vor.
[0018] In EP 0 733 714 A2 wird eine Nukleinsäure-Amplifikations-Methode und -apparatur beschrieben. Eine Probe wird vom Probenauftrag zum Reaktionsbereich gepumpt. Der Reak- tionsbereich wird bevorzugt als kontinuierlicher Kanal beschrieben: "Although it is preferred to provide the sample area and reaction area in the form of a continuous, undivided Channel as shown, it is within the scope of the present invention to provide partitions or barriers between these areas if desired. It is also within the scope of the invention to provided partitions or barriers between the decontamination zone and amplification zone of the reaction area." Allerdings besteht für die Autoren keine Intention, die Produkte voneinander zu trennen.
[0019] Gegenstand der Druckschrift EP0733714A2 ist eine diagnostische Vorrichtung, bei der das Freisetzungs- und Einfangmedium ein zweiphasiges chromatographisches Substrat bilden. Beide Medien sind getrennt voneinander und bestehen aus unterschiedlichen Materialien Das Einfangmedium hat keine weitere immobilisierten Komponenten und dient der Adsorption. Das Freisetzungsmedium ist ein hydrophiles Material zur Halterung, Freisetzung und Transport des immunologischen Materials. Das Aufbringen erfolgt durch Kapillarwirkungen der Testlösungen. Ein Vermischen wird dabei nicht gezielt verhindert.
[0020] EP 0 925 113 AI berichtet über eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Aufbewahren und Verteilen biochemischen Reagenzien. Jedes Reagenz ist in je einem Raum angeordnet, wobei die Räume voneinander getrennt sind. Die Reagenz-Patrone ist ein Einzelgegenstand. Reagenz-Patronen werden zur Kassetten Patrone kombiniert.
[0021] Die Analyse des Standes der Technik zeigt damit eindrucksvoll, dass es eine Vielzahl von Offenbarungen gibt, welche sich mit der Stabilisierung von Reaktionskomponenten für molekulargenetische Nachweisverfahren beschäftigen. Dabei handelt es sich aber immer um Lösungsansätze, welche keine universelle Anwendung der eigentlichen Nachweisreaktion garantieren können oder nicht den gesamten erforderlichen Reaktionsmix stabilisieren können.
Aufgabe der Erfindung [0022] Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die im Stand der Technik genanten Nachteile zu beseitigen.
Lösung der Aufgabe
[0023] Die Aufgabe wurde gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst. Erfindungsgemäß wurde mit der vorliegenden Erfindung ein molekulardiagnostisches Detektionsverfah- ren bereitgestellt, dass alle benötigten kritischen Reagenzienkomponenten in einer Form enthält, welche:
1. eine sehr einfache Handhabung eines molekulargenetischen Nachweisverfahrens erlaubt und
2. auch ohne Kühlung unter Umgebungstemperaturbedingungen universell einsetzbar sind.
[0024] Insbesondere die räumliche Trennung der Komponenten, die bei der Amplifizierung bzw. reversen Transkription beteiligt sind, ist bei keiner der bisher offenbarten Lösung berücksichtigt worden. Das erfindungsgemäße Mittel berücksichtigt aber gerade die räumliche Trennung der Komponenten, welche für die Reaktionen benötigt werden und ermöglicht so einen Schutz der beteiligten Komponenten voneinander. Diese Herangehensweise macht so einen unerwünschten Start von nichtspezifischen Reaktionen (z.B. Bildung von Primerdimä- ren, unspezifische Amplifizierung bei den suboptimalen Bedingungen etc.) unmöglich.
[0025] Die Erfindung wird nachfolgend beschrieben:
[0026] Für eine PCR-basierte Amplifizierungsreaktion (Standard PCR oder Real-Time PCR) benötige Polymerase, Primer oder Primer und Sonden werden auf eine poröse Filterscheibe (z.B. aus Polyethylen) verbracht. Die Verwendung eines solchen Materials zeigt überraschenderweise eine Reihe von Vorteilen. Es ist möglich die Komponenten als Einzelkomponente an destingten Orten auf der Filterscheibe zu positionieren und damit kompartimentiert zu lagern. Damit kommen die zu kombinierenden Komponenten nicht in Kontakt zueinander. Dies hat den Vorteil, dass eine unerwünschte Reaktion der Komponenten untereinander vermieden werden kann. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass durch das Eindringen der Komponenten in die Poren der Filterscheibe ein viel besser Schutz gegenüber schädigenden Umwelteinflüssen besteht, was sich günstig auf eine Lagerung bei Umgebungstemperatur ohne Aktivitätsverlust auswirkt. Nach Verbringung aller jeweils benötigten Komponenten auf die poröse Filterscheibe werden die Komponenten eingetrocknet (z.B. Inkubation bei 37°C für lh) oder aber auch lyophilisiert. Nachfolgend wird die Filterscheibe trocken gelagert. Das Freisetzen der verbrachten Reaktionskomponenten erfolgt dadurch, dass man der Filterscheibe eine wässrige Lösung zuführt, welche alle weiteren für die Amplifizierungsreakti- on/Detektionsreaktion benötigten Reaktionskomponenten in der jeweils optimalen Konzentration enthält (dNTPs, Amplifikationspuffer, Magnesium und ggf. weitere Additive). Diese wässrige Lösung kann vorab als Mastermix vorbereitet werden und kann auch schon die zu untersuchende Nukleinsäure enthalten. Vorzugsweise wird der wässrigen Lösung ein Deter- genz (z.B. ein Octylphenolethoxylate oder Polysorbat) zugegeben. Dieses Detergenz verbessert die Freisetzung der auf der Filterscheibe befindlichen Komponenten. Nach kurzer Inkubation wird der Ansatz in ein PCR-Reaktionsgefäß überführt und die Reaktion durchgeführt.
[0027] Neben der Verbringung einer Polymerase, Primern bzw. Primern und Sonde kann auf die Filterscheibe zusätzlich auch die benötigte Menge an dNTPs kompartimentiert und damit räumlich getrennt von den anderen Reaktionskomponenten verbracht werden. Die Herstellung der lagerstabilen Filterscheibe und die Lagerung erfolgt wie beschrieben. Das Freisetzen der verbrachten Reaktionskomponenten erfolgt wiederum dadurch, dass man der Filterscheibe eine wässrige Lösung zuführt, welche alle weiteren für die Amplifizierungsreakti- on/Detektionsreaktion benötigten Reaktionskomponenten in der jeweils optimalen Konzentration enthalten. Diese wässrige Lösung kann vorab vorbereitet werden und kann auch schon die zu untersuchende Nukleinsäure enthalten. Vorteilhaft bei dieser Ausführungsform ist, dass auch die dNTPs lagerstabil auf der Filterscheibe verbracht wurden. Damit muss diese Komponente der wässrigen Lösung zur Freisetzung der Reaktionskomponenten nicht mehr enthalten sein. Das erleichtert die Durchführung einer Nachweisreaktion, z.B. unter Feldbedingungen zusätzlich, da die wässrige Lösung nur noch Amplifikationspuffer, Magnesium und ggf. weitere Additive, vorzugsweise das schon aufgeführte Detergenz, enthält. Eine solche Lösung ist auch unter Umgebungstemperatur problemlos lagerbar. In Kombination mit der lagerstabilen Filterscheibe steht damit ein Mittel zur Verfügung, was den Zielstellungen der Erfindung in idealster Weise gerecht wird. [0028] Das erfindungsgemäße Mittel kann aber auch für die Durchführung einer reversen Transkriptasereaktion zur Untersuchung einer Ziel-RNA eingesetzt werden. Dazu werden auf die Filterscheibe kompartimentiert die Reverse Transkriptase, dNTPs, der konzentrierte Puffer und für die Reaktion benötigte Primer (z.B. Random Primer) verbracht. Die Ablösung der Komponenten erfolgt dann wieder mit einer wässrigen Lösung, welche alle anderen benötigten Reaktionskomponenten enthält (umzuschreibende RNA; ggf. ein Detergenz und RNA- stabilisierende Reagenzien). Neben der Stabilisierung der Reagenzien hat diese Methode noch einen weiteren Vorteil: Die Menge der eingesetzten RNA kann dadurch beträchtlich erhöht werden, da die notwendigen Komponenten nicht als wässrige Lösung zugegeben sondern direkt in der umzuschreibenden RNA gelöst werden. Dies erhöht die Sensitivität der Testmethode.
[0029] Im Fall einer sog. One-Step PCR (cDNA Synthese und PCR im gleichen Reaktionsgefäß) werden auf der Filterscheibe der Reaktionspuffer, der Enzymmix, die dNTPs und die für die Reaktion benötigten Primer und Sonde kompartimentiert verbracht und stabilisiert. Das Ablösen der Komponenten erfolgt wie auch im Fall einer Two-Step PCR (cDNA Synthese und PCR in verschiedenen Reaktionsgefäßen) mit einer wässrigen Lösung, welche die zu untersuchende RNA enthält.
[0030] Darüber hinaus kann die Kompartimentierung und lagerstabile Immobilisierung einzelnen Reaktionskomponenten bei unterschiedlichen Gemischen und enzymkatalysierten Reaktionen eingesetzt werden. Sie ist immer dann ideal, wenn die benötigten Reaktionspartner vor einer Reaktion nicht miteinander in Wechselwirkung treten dürfen.
[0031] Das Verbringen von unterschiedlichen Reaktionskomponenten, die für eine Reaktion benötigt werden, in räumlich voneinander getrennter Anordnung kann auch ohne poröses Material auf räumlich getrennten Arealen eines Gefäßes erfolgen. Wie auch im Fall der Filterscheibe werden die einzelnen Komponenten durch Herauswaschen mit einer wässrigen Lösung unmittelbar vor dem Anfang der Reaktion zusammengebracht. Eine kleine Einschränkung besteht dabei darin, dass die erfindungsgemäße Filterscheibe einen größeren Schutz gegenüber exogener Faktoren bietet (z.B. Sauerstoff, Feuchtigkeit, Licht).
Definitionen [0032] Unter dem Begriff "molekularbiologische Reaktionen" (im folgenden„Reaktion" genannt) versteht man eine Zusammenwirkung von biologischen Molekülen.„Biologische Moleküle" umfassen jedwede Substanzen und Verbindungen im wesentlichen biologischen Ursprungs, die über Eigenschaften verfügen, welche im Rahmen wissenschaftlicher, diagnostischer und/oder pharmazeutischer Anwendungen relevant sind.
[0033] Umfasst sind nicht nur native Moleküle, wie sie aus natürlichen Quellen isoliert werden können, sondern auch davon abgeleitete Formen, Fragmente und Derivate, sowie rekom- binante Formen und artifizielle Moleküle, sofern sie mindestens eine Eigenschaft der nativen Moleküle aufweisen.
[0034] Darunter fallen die Amplifizierung, Detektion oder Umschreibung von Nukleinsäuren, Enzym- Substrat-, Antigen- Antikörper Wechselwirkungen und die Proteinsynthese. Dazu zählen beispielsweise die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) von DNA und die RT (reverse Transkription) von RNA in DNA.
[0035] Unter "Primer" oder "Sonden" versteht der Fachmann Oligonukleotide, wobei Primer für eine Amplifizierung oder reverse Transkription notwendig sind. Die Sondern können markiert sein. Markierungen von Sonden sind dem Fachmann bekannt.
[0036] Unter dem Begriff "Enzyme" fallen Polymerase und reverse Transkriptase und andere in der Molekularbiologie verwendbare Enzyme wie Peroxydasen, Dehydrogenasen, Phosphatasen etc..
[0037] dNTPs sind Desoxyribosenucleotidtriphosphate. Es sind dies die Bausteine, die während einer PCR angefügt werden, um einen neuen Strang zu synthetisieren. Beispiele sind: dATP (Adenosintriphosphat), dUTP (Uracyl), dCTP (Cytidin), dTTP (Thymidin) und dGTP (Guanosin).
[0038] Der Begriff "Puffer" steht für Reaktionspuffer. Dem Fachmann sind entsprechende Reaktionspuffer bekannt.
[0039] Weitere bekannte Komponenten zur Durchführung einer Reaktion sind z.B. Salze und Puffersubstanzen, z.B. Magnesiumverbindungen.
[0040] Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen beschrieben. Diese stellen dabei keine Einschränkung der Erfindung dar. Ausführungsbeispiele
Ausführungsbeispiel 1
Herstellung eines kompartimentierten lagerstabilen Reaktionansatzes und Verwendung in einem Lagerversuch zur Amplifikation einer humanspezifischen Targetsequenz
A. Herstellung eines kompartimentierten lagerstabilen Reaktionansatzes
[0041] Als poröse Träger wurden Polyethylen Filterscheiben verwendet.
[0042] Auf unterschiedlichen Zonen der Filterscheibe erfolgte die Zugabe folgender Komponenten (Figur 1):
[0043] Figur 1 zeigt eine Filterscheibe mit unterschiedlichen Zonen und PCR-Materialien.
1 Ligand-modifizierte Hot-Start Taq DNA Polymerase stabilisiert mit 10 % Sorbitol und 3,75 % FCS im Endansatz
2 dNTPs
3 Primer (sense)
4 Primer (anti sense)
[0044] Die Komponenten wurden in der Menge, die einem ΙΟΟμΙ-PCR- Ansatz entspricht, aufgetragen.
[0045] Die Lösungen wurden auf die Filterscheibe gebracht und für ca. 2 h unter physiologischen Temperaturbedingungen (37°C) getrocknet. Nach erfolgter Eintrocknung wurden die Filterscheiben in ein 2 ml Schraubgefäß überführt, mit einem Deckel fest verschlossen und bei Raumtemperatur für 3 Monate gelagert und nach dieser Lagerzeit in einer Vergleichsreaktion mit frisch zugegebenen Reaktionskomponenten getestet.
B. Amplifikation einer humanspezifischen Targetsequenz mit frischen Reagenzien bzw. unter Nutzung der erfindungsgemäß hergestellten Reaktionsansatzes nach Lagerung für 3 Monate
[0046] Die Amplifikationsreaktion erfolgte mittels eines SpeedCyclers (Analytik Jena AG). Ansätze:
1) "Frisch"
5 μΐ DNA (human)
10 μΐ Amplifikationspuffer, incl. Magnesium chlorid (lOx)
2 μΐ dNTPs (12,5 mM, jeweils)
0,7 μΐ Primer (sense; 50 pmol)
0,7 μΐ Primer (antisense; 50 pmol)
5 Units Taq Polymerase
Auffüllen mit Wasser auf Finalvolumen von 100 μΐ
2) "Lagerstabile Filterscheibe" 5 μΐ DNA (human)
10 μΐ Amplifikationspuffer, incl. Magnesium chlorid (lOx)
Auffüllen mit Wasser auf Finalvolumen von 100 μΐ
[0047] Die DNA-Puffer-Mischung wurde auf die Filterplatte im 2ml-Röhrchen gegeben und 1 min gevortext. Die jeweils 100 μΐ vom PCR-Ansatz wurden auf 6 Wells einer SpeedCycler- Platte zu je 15 μΐ verteilt. Nach Durchführung der Amplifikations-Reaktion wurden die Amplifikationsprodukte auf einem Agarosegel ausgewertet (Figur 2).
[0048] Figur 2 zeigt PCR Produkte nach Amplifikation genomischer DNA mit frischen und lagerstabilen Reagenzien.
M ... DNA Marker
Spuren 1 - 6 ... Amplifikationsprodukte unter Verwendung der lagerstabil beschichteten Filterscheibe (Ansatz 1)
Spuren 7 - 12 ... Amplifikationsprodukte unter Verwendung frisch zugegebener Reaktionskomponenten (Ansatz 2)
[0049] Das Beispiel illustriert eindrucksvoll, dass die Verwendung der lagerstabil beschichteten Filterscheibe nach Lagerung von 3 Monaten bei Raumtemperatur keinerlei Aktivitätsverlust im Vergleich zu frisch zugegeben Reaktionskomponenten zeigt. Ausführungsbeispiel 2
Herstellung eines kompartimentierten lagerstabilen Reaktionansatzes und Verwendung in einem Lagerversuch zur Amplifikation und Hybridisierung einer Salmonella enterica spezifischen Targetsequenz.
[0050] Die kompartimentierten Reagenzien wurden für die Durchführung eines sondenbasier- ten-LFA-Assays präpariert. Bei der Durchführung des Assays ist es essentiell, das die FLTC- markierte Sonde und der Biotin-markierte Primer keine Dimerisationsprodukte vor der Reaktion bilden. Erfindungsgemäß soll die kompartimentierte Verbringung der einzelnen Reaktionskomponenten einen irregulären Reaktionsstart verhindern und damit das Auftreten von falsch-positiven Ergebnissen verhindern.
A. Herstellung eines kompartimentierten lagerstabilen Reaktionsansatzes
[0051] Als poröse Träger wurden Polyethylen Filterscheiben verwendet.
[0052] Auf unterschiedlichen Zonen der Filterscheibe erfolgte die Zugabe folgender Komponenten (Figur 3):
[0053] Figur 3 zeigt die Aufsicht auf eine Filterscheibe. Kompartimentierung lagerstabiler Komponenten für einen sondenbasierten LFA-Assay.
1 dNTPs
2 FITC markierte Sonde
3 Primer 1, unmarkiert
4 Primer 2, Biotin markiert
5 Ligand-modifizierte Hot-Start Taq DNA Polymerase stabilisiert mit 10 % Sorbitol und 3,75 % FCS im Endansatz
[0054] Die Reagenzien wurden in der Menge, die einem 100 μΙ-PCR- Ansatz entsprechen, aufgetragen. Die Lösungen wurden auf die Filterscheibe pipettiert und für ca. 2 h unter physiologischen Temperaturbedingungen von 37°C getrocknet. [0055] Nach erfolgter Eintrocknung wurden die Filterscheiben in ein 2 ml Schraubgefäß platziert, mit einem dafür vorgesehenen Deckel fest verschlossen und bei RT für 3 Monate gelagert und in einer Vergleichsreaktion mit frisch zugegebenen Reaktionskomponenten getestet.
B. Amplifikation einer humanspezifischen Targetsequenz
[0056] Die Amplifikationsreaktion erfolgte mittels eines SpeedCyclers (Analytik Jena AG). Ansätze:
1) "Frisch"
10 μΐ Amplifikationspuffer, incl. Magnesiumchlorid (lOx)
2 μΐ dNTPs (12,5 mM, jeweils)
0,35 μΐ Primer (unmarkiert; 50 pmol)
0,7 μΐ Primer (Biotin markiert; 50 pmol)
0,7 μΐ Sonde (FITC markiert; 50 pmol)
5 Units Taq Polymerase
Auffüllen mit Wasser auf Finalvolumen von 100 μΐ.
[0057] 2x15 μΐ des Ansatzes wurden als Negativkontrolle abpipettiert, zu dem Rest des Mastermixes wurden 5 μΐ S. enterica-DNA zugegeben und davon wurden 2x15 μΐ des PCR Ansatzes in das Well einer PCR-Platte für den SpeedCycler gegeben.
2) "Lagerstabile Filterscheibe"
10 μΐ Amplifikationspuffer, incl. Magnesium chlorid (lOx)
Auffüllen mit Wasser auf ein Finalvolumen von 100 μΐ
[0058] Die DNA-Puffer-Mischung wurde auf die Filterscheibe im 2 ml-Röhrchen gegeben, mit einem Deckel verschlossen und 1 min gevortext. 2x15 μΐ des Ansatzes wurden als Negativkontrolle abpipettiert, zu dem Rest des Mastermixes wurden 5 μΐ S. enterica-DNA zugegeben und davon wurden 2x15 μΐ des PCR Ansatzes in das Well einer PCR-Platte für den SpeedCycler gegeben. 3)„Frisch + Primer/Sonde Mix"
[0059] Bei diesem Ansatz wurden Primer und Sonde in der gegebenen Menge (siehe „Frisch"-Ansatz) 2 Stunden vor der Reaktion zusammengemischt und bei Raumtemperatur gelagert, um die Dimerbildung zu begünstigen. 2x15 μΐ des Ansatzes wurden als Negativkontrolle abpipettiert, zu dem Rest des Mastermixes wurden 5 μΐ S. enterica-DNA zugegeben und davon wurden 2x15 μΐ des PCR Ansatzes in das Well einer PCR-Platte für den SpeedCycler gegeben.
[0060] Nach Durchführung der Amplifikations/Hybridisierungs-Reaktion mittels eines SpeedCyclers wurden die jeweils 2 gleichen Ansätze zusammengemischt. Eine Hälfte wurde auf einen Agarosegel aufgetragen (Figur 4A). Die andere Hälfte wurde auf einen Late- ral-Flow- Streifen aufgetragen (Figur 4B).
[0061] Figur 4 zeigt einen Amlifikations-Hybridiserungs-Reaktion (RAH Technologie) nach Auswertung des PCR-Ansatzes auf dem Gel (A) und auf einem LFA (B).
1... Ansatz 1 (Frisch), Positive PCR; 2 ... Ansatz 1, Negativkontrolle; 3 ... Ansatz 2 (lagerstabile Filterscheibe), Positive PCR; 4 ... Ansatz 2, Negativkontrolle; 5 ... Ansatz 3 (Frisch + Primer/Sonde Mix) , Positive PCR; 6 ... Ansatz 3, Negativkontrolle
[0062] Dieses Beispiel zeigt, dass eine lange Inkubation von Primer und Sonde bei Raumtemperatur zur Bildung von Dimeren zwischen der markierten Sonde und dem markierten Primer führen kann. Dieses Phänomen ist zwar auf dem Agarosegel nicht sichtbar (die Negativkontrolle bleibt negativ), führt aber zu falschpositiven Testergebnissen auf einem Lateral- Flow- Streifen, wo alle doppeltmarkierten Dimere sichtbar werden und so ein falsch-positives Testergebnis vermitteln. Bei einer kompartimentierten Immobilisierung können die benötigten Reaktionskomponenten bereits in den vorgegebenen Mengen zusammengebracht werden. Die Möglichkeit eines unerwünschten Reaktionsstarts oder der Dimerbildung bestehen aber infolge der räumlichen Trennung der Komponenten nicht.
Ausführungsbeispiel 3 Herstellung eines kompartimentierten lagerstabilen Reaktionansatzes und Verwendung dessen zur OneStep cDNA-Synthese und Amplifikation von einem Influenza A Virus.
A. Herstellung eines kompartimentierten lagerstabilen Reaktionsansatzes
[0063] Als poröse Träger wurden Polyethylen Filterscheiben verwendet.
[0064] Auf unterschiedlichen Zonen der Filterscheibe erfolgte die Zugabe folgender Komponenten (Figur 5):
[0065] Figur 5 zeigt die Aufsicht auf eine Filterscheibe. Kompartimentierung lagerstabiler Komponenten für eine OneStep PCR.
1. FITC markierte Sonde
2. Primer 1, unmarkiert
3. Primer 2, Biotin markiert
4. Affinityscript Enzymmix für OneStep RT-PCR (ggf. stabilisiert)
5. Darüber hinaus wurde Puffer, dNTPs enthaltend, auf dem Boden des Reaktionsgefäßes eingetrocknet (Herculase® II RT-PCR 2x Mastermix, Agilent).
[0066] Die Chemikalien wurden in der Menge, die einem ΙΟΟμΙ -Ansatz entsprechen, aufgetragen. Die Lösungen wurden auf die Filterscheibe bzw. auf dem Boden eines 2 ml Schraubgefäßes gebracht, mit einem Deckel verschraubt und für ca. 2 h bei physiologischen Temperaturbedingungen von 37°C getrocknet.
[0067] Nach erfolgter Eintrocknung wurden die Filterscheiben in einem 2 ml Schraubgefäß platziert und bei RT für 3 Monate gelagert und einer Vergleichsreaktion mit frisch zugegebenen Reaktionskomponenten getestet.
B. OneStep RT-PCR einer Influenza A - spezifischen Targetsequenz
[0068] Die Amplifikationsreaktion erfolgte mittels eines SpeedCyclers (Analytik Jena AG). RNA-Proben: [0069] Es wurde eine Verdünnungsreihe an RNA-Proben aus angezüchteten Influen- za-A- Viren hergestellt. Die Proben wurden so verdünnt, dass 12 μΐ RNA jeweils 105, 104, 103, 102 und 101 Viruspartikeln entsprachen.
Ansätze:
1) "Frisch"
12 μΐ Virus-RNA
50 μΐ Herculase® II RT-PCR 2x Mastermix (Agilent)
0,35 μΐ Primer (unmarkiert; 50 pmol)
0,7 μΐ Primer (Biotin markiert; 50 pmol)
0,7 μΐ Sonde (FITC markiert; 50 pmol)
1 μΐ Affinityscript Enzymmix (Agilent)
Auffüllen mit Wasser auf ein Finalvolumen von 100 μΐ
2) "Lagerstabile Filterscheibe" 12 μΐ Virus-RNA
Auffüllen mit Wasser auf Finalvolumen von 100 μΐ
[0070] Die RNA-Lösung wurde auf die Filterplatte im 2ml-Röhrchen gegeben und 1 min ge- vortext.
[0071] Nach Durchführung der OneStep RT-PCR und einer anschließenden Hybridisierung der Sonde mittels eines SpeedCyclers wurden die Reaktionsprodukte auf Late- ral-Flow- Streifen aufgetragen (Figur 6).
[0072] Figur 6 zeigt unterschiedliche Virusverdünnungen wurden mit frisch angesetzten Komponenten (frisch) oder lagerstabilen Komponenten (eingetrocknet) auf einer Filterscheibe in einer OneStep RT-PCR amplifiziert und auf einem Lateral-Flow- Streifen nachgewiesen.
[0073] Das Beispiel illustriert, dass die Verwendung der lagerstabil beschichteten Filterscheibe auch bei einer OneStep RT-PCR-Reaktion keinerlei Aktivitätsverlust im Vergleich zu frisch zugegeben Reaktionskomponenten zeigt.

Claims

Patentansprüche
1 . Vorrichtung zur Durchführung einer molekularbiologischen Reaktion, dadurch gekennzeichnet, dass die einzelnen für eine Reaktion benötigten Komponenten sich zwar am gleichen Reaktionsort befinden, jedoch vor der Reaktion auf einem Trägermaterial räumlich voneinander getrennt sind, so dass eine unerwünschte Zusammenwirkung der Einzelkomponenten vor dem Reaktionsstart unmöglich ist.
2. .Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den
molekularbiologische Reaktionen um
a) Amplifikation von Nukleinsäuren, z.B. PCR oder RealTime-PCR oder b) reverse Transkription von RNA in DNA oder
c) Enzym- Substrat. -Wechselwirkungen oder
d) Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen oder
e) Proteinsynthesen
handelt.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem
festen Träger um einen porösen Träger, vorzugsweise eine poröse Filterscheibe, handelt.
4. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem
festen Träger um eine Oberfläche handelt auf die die Reaktionskomponenten räumlich getrennt aufgetragen werden.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der
Träger aus Polyethylen besteht.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sich
f) Primer und Enzyme oder
g) Primer, Enzyme und Sonde oder
h) Primer, Enzyme, Sonde und dNTPs oder
i) Primer, Enzyme, Sonde, dNTPs und Puffer oder j) Enzym und Coenzym oder
k) zwei oder mehrere unterschiedliche Antikörper
auf dem Träger in unterschiedlichen, räumlich getrennten, Kompartimenten befinden.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten
Komponenten für die Reaktion auf dem Träger in unterschiedlichen Kompartimenten immobilisiert sind.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten durch Wasserentzug oder Wasser Substitution, vorzugsweise durch Eintrocknen oder
Gefriertrocknung, auf dem Träger stabilisiert werden.
9. Verfahren zur Durchführung einer Reaktion, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Bereitstellen des festen Trägers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8
b) Hinzugabe einer Flüssigkeit mit dem nachzuweisenden Biomolekül und ggf. anderen für die Reaktion benötigten Substanzen c) Inkubation und Durchführung der Reaktion nach bekannten Verfahren.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit reines
Wasser, eine Lösung, eine Detergenzhaltige Lösung, eine die zu testende Probe enthaltende Lösung, eine weitere Reaktionskomponenten enthaltende Lösung ist.
1 1 . Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Detergenz Nichtionische Tenside verwendet werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass für den Fall, dass der Träger nicht alle für die Reaktion benötigte Sunstanzen enthält, sich diese Komponenten in der Lösung befinden.
13. Molekulardiagnostisches Testkit, umfassend einerseits einen festen Trägers gemäß
einem der Ansprüche 1 bis 8 und andererseits eine Lösung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12.
14. Testkit nach Anspruch 13, dass es weitere bekannte Komponenten zur Durchführung und Auswertung einer molekulardiagnostischen Reaktion enthält.
1 5. Verwendung des Testkits gemäß Anspruch 13 oder 14 zur Durchführung
molekulardiagnostischen Tests, insbesondere unter Feldbedingungen.
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