RU171152U1 - Дозированная форма для полимеразной цепной реакции - Google Patents

Abstract

Полезная модель относится к медицине и биологии и предназначена для использования при производстве наборов для полимеразной цепной реакции (ПЦР). Дозированная форма для полимеразной цепной реакции включает ядро, содержащее прессованную сахарозу, смоченную водным раствором следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента Taq-полимеразы, смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и буфера для постановки полимеразной цепной реакции, а также сплошную оболочку, состоящую по меньшей мере из одного гидрофобного ингредиента, выбранного из ряда: парафин, воск и минеральное масло, причем содержание сахарозы и водного раствора в ядре, мас.%: сахароза - 23,0-58,0 и водный раствор - 42,0-77,0. Дозированная форма может быть выполнена в виде глобулы или таблетки, при этом глобула имеет предпочтительный диаметр 2,0-4,0 мм, а таблетка имеет предпочтительный диаметр 2,0-4,0 мм и предпочтительную толщину 2,0-4,0 мм. В качестве компонентов дозированная форма может дополнительно включать меченый зонд и краситель для гель-электрофореза. Техническим результатом полезной модели является увеличение срока сохранения реакционной активности компонентов для ПЦР (реагентов), в том числе при температурах выше 0°С. 3 з.п. ф-лы.

Description

Полезная модель относится к медицине и биологии и предназначена для использования при производстве наборов для полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Увеличение срока сохранения реакционной активности использующихся в качестве реагентов компонентов ПЦР, в том числе при температурах выше 0°С, а также универсальное увеличение точности, уменьшение и упрощение ручных манипуляций при постановке ПЦР в любых емкостях (в том числе имеющих различный объем в отдельных пробирках, стрипированных пробирках и планшетах любых размеров и форм) являются важными задачами производителей наборов для ПЦР.

Известно использование для увеличения срока сохранения реакционной активности реагентов для ПЦР лиофильного высушивания их смесей с добавлением различных стабилизаторов: глюцитола, глюкозы, фиколла, сахарозы и других (Klatser P.R., Kuijper S., van Ingen C.W., Kolk A.H. Stabilized, freeze-dried PCR mix for detection of mycobacteria // Journal of clinical microbiology. - 1998. V. 36, N 6. - P. 1798-1800; US 5861251 от 19.01.1999; US 6153412 от 28.11.2000; RU 2259401 от 27.08.2005).

Основным недостатком этих аналогов заявляемого технического решения является общеизвестная частичная инактивация используемого фермента при его высушивании и растворении (регидратации) даже с использованием стабилизаторов, которые уменьшают инактивацию фермента при лиофилизации, что может снижать эффективность ПЦР; необходимость использования дорогостоящих лиофильных сушек и процесса лиофилизации при изготовлении наборов для ПЦР.

Известен способ изотермической амплификации нуклеиновых кислот, согласно которому для раздельного нагревания компонентов реакции (реагентов) и их смешивания при более высоких температурах по меньшей мере один из компонентов реакции (в том числе мезофильный фермент для амплификации нуклеиновых кислот, праймеры, дезоксинуклеозидтрифосфаты - dNTP, нуклеозидтрифосфаты - NTP, кофакторы и другие реагенты) помещается в матрицу (матрикс), которая дезинтегрируется при температуре 60°С или более (US 9133508 от 15.09.2015). Известная матрица может быть выбрана из группы, включающей полисахариды, белки, воски и синтетические полимеры с гидрофильными свойствами, так как матрица должна образовывать гидрогель. Согласно известному способу в качестве полисахаридов могут использоваться агароза, легкоплавкая агароза, пектин, амилоза, агар-агар, ксантан, карраген, карбоксиметилцеллюлоза, гуар, карубин, инулин или декстран, в качестве белков - желатин или фибриллярные белки, в качестве воска и синтетических полимеров - поливиниловый спирт или дериваты целлюлозы.

Основным недостатком этого аналога заявляемого технического решения является возможность подсыхания гидрофильных матриц со смесями реагентов для ПЦР без масел, воска или парафина с гидрофобными свойствами, которые не предусмотрены в известном способе.

Наиболее близким аналогом заявляемого технического решения - прототипом - является восковой шарик, содержащий внутри водный раствор одного из реагентов, в том числе: термостабильного фермента, меченых и немеченых нуклеотидов, дезоксинуклеозидтрифосфаты, дидезоксинуклеозидтрифосфаты, рибонуклеозидтрифосфаты и их аналоги, соль металла, выбранного из Mg, Mn, Fe, Со, Cu и Zn, меченого вещества (US 5413924 от 09.05.1995).

Основным недостатком прототипа является невозможность достижения технического результата - увеличения срока сохранения реакционной активности компонентов для ПЦР (реагентов), в том числе при температурах выше 0°С, - в связи с отсутствием ингредиента (реагента, подготовленного определенным образом), не только повышающего продуктивность ПЦР и увеличивающего плотность буфера для загрузки, а также пригодного для предварительного дозирования смесей реагентов вне емкостей для постановки ПЦР, при этом, во-первых, применимого для использования разных гидрофобных барьеров (парафина, воска, смеси парафина с воском или масла), применяемых в качестве пароизоляторов и предотвращающих перекрестную контаминацию реакционных смесей, во-вторых, обеспечивающего заданное варьирование вида дозированной формы (глобулы или таблетки) в зависимости от используемого дозатора (диспенсера), в-третьих, снижающего риск слипания, деформирования и слияния отдельных дозированных форм (глобул или таблеток), в-четвертых, обеспечивающего дезинтеграцию дозированной формы без образования геля.

Главной задачей, решаемой заявляемым техническим решением, является увеличение срока сохранения реакционной активности компонентов для ПЦР (реагентов), в том числе при температурах выше 0°С.

Поставленная задача реализуется за счет того, что дозированная форма для ПЦР включает ядро, содержащее прессованную сахарозу, смоченную водным раствором следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента Taq-полимеразы, смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и буфера для постановки полимеразной цепной реакции, а также сплошную оболочку, состоящую по меньшей мере из одного гидрофобного ингредиента, выбранного из ряда: парафин, воск и масло, и выполнена в форме глобулы или таблетки.

В качестве буфера для постановки ПЦР, включенного в качестве компонента в смачивающий прессованную сахарозу водный раствор (далее по тексту описания, формулы и реферата полезной модели - это смачивающий водный раствор или смачивающий раствор, или водный раствор компонентов, или водный раствор, или раствор), используют любой буфер для ПЦР, содержащий употребляемые для постановки ПЦР ингредиенты буферной системы, донаторы катионов калия (I), донаторы катионов магния (II) и любые другие известные реагенты, используемые в ПЦР-буфере, в известных, применяемых в ПЦР концентрациях (Компоненты PCR смеси. - URL: http://molbiol.edu.ru/protocol/12_01.html; PCR Buffers (A to W). - URL: http://york-bio.com/pcr%20related.htm; GeneAmp PCR Buffers. - URL: http://www6.appliedbiosystems.com/support/techtools/pcropt/; 10xPCR Buffer. - URL: http://www.allelebiotech.com/content/pdf/10x_PCR_Buffer.pdf; 10X Buffer Cfr9I. - URL: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011926_10X_Buffer_Cfr9I_wBSA_UG.pdf; 10X PCR Buffer. - URL: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?D7=0&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&N4=P2192| SIGMA&N25=0&QS=ON&F=SP EC; PCR Amplification. - URL: http://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/pcr-amplification/; Taq DNA Polymerase PCR Buffer. - URL: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/taq_buffer_man.pdf; Taq Buffer (10X), with (NH₄)₂SO₄ and 20 mM MgCl₂. - URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B34; KnorrA., Turner R.T., Bolander M.E., Sarkar G. Stimulatory effect of potassium glutamate in PCR // PCR methods and applications. - 1993. - Vol. 3, №1. - P. 73-74; Ahmad A., Ghasemi J. New buffers to improve the quantitative real-time polymerase chain reaction // Bioscience, biotechnology, and biochemistry. - 2007. - V. 71, N 8. - P. 1970-1978; патент WO 03048391 от 12.06.2003; патент WO 2008013885 от 31.01.2008; патент US 2009325278 от 31.12.2009; патент RU 2496883 от 27.10.2013).

В качестве гидрофобного ингредиента оболочки дозированной формы для ПЦР используют парафин, воск и минеральное масло, обычно применяемые при ПЦР в качестве пароизоляторов и барьеров, предотвращающих перекрестную контаминацию реакционных смесей (Sparkman D.R. Paraffin wax as a vapor barrier for the PCR // PCR methods and applications. - 1992. - V. 2, N 2. - P.180-181; Gilgen M., Hofelein C, Ltithy J., Htibner P. Hydroxyquinoline overcomes PCR inhibition by UV-damaged mineral oil // Nucleic acids research. - 1995. - V. 23, N 19. - P.4001-4002; Mineral oil. PCR Reagent. –

Сахароза и смачивающий водный раствор содержатся в ядре при следующем их предпочтительном соотношении, мас.%: прессованная сахароза - 23,0-58,0, водный раствор - 42,0-77,0.

Дозированная форма согласно заявляемой полезной модели может быть выполнена в форме глобулы с предпочтительным диаметром 2,0-4,0 мм, соответствующим внутренним диаметрам пробирок, стрипированных пробирок и планшетов, обычно используемых для ПЦР.

Дозированная форма согласно заявляемой полезной модели может быть также выполнена в форме таблетки с предпочтительным диаметром 2,0-4,0 мм и с предпочтительной толщиной 2,0-4,0 мм, которые соответствуют внутренним диаметрам пробирок, стрипированных пробирок и планшетов, обычно используемых для ПЦР.

Смачивающий водный раствор может дополнительно включать в качестве компонента любой меченый зонд для ПЦР в реальном времени.

Смачивающий водный раствор также может дополнительно включать в качестве компонента любой краситель для гель-электрофореза, используемый после ПЦР (Al-Awadi S.J., Ghareeb A.M., Salo W.H. Food dyes as an alternative tracking dye for DNA gel electrophoresis // Baghdad Science Journal. - 2013. - V. 10, N 4. - P. 1150-1156; Сомма M., Кверчи M. Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов. Сессия 5. Электрофорез в агарозном геле. - Европейское региональное бюро Всемирной организации здравоохранения. - С. 7. - URL: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/manual%20RUS/UM%20Rus-S5.pdf), предпочтительно выбранный из ряда: бромфеноловый синий, ксиленцианол, бромкрезоловый красный или крезоловый красный.

В основу заявляемой полезной модели положена обеспечивающая решение поставленной задачи новая совокупность оригинальных отличительных признаков. Во-первых, это использование прессованной сахарозы в качестве матрицы, которая, согласно проведенным авторами заявляемого технического решения исследованиям, без дезинтеграции удерживает необходимый объем раствора компонентов для ПЦР (реагентов) и дезинтегрируется без образования геля в окончательном объеме реакционной смеси (смеси раствора компонентов для ПЦР, подготовленной пробы и растворителя), внесенных в любую емкость для ПЦР при нагревании. Кроме того, использование прессованной сахарозы обеспечивает получение заданной формы и заданных размеров дозированной формы для ПЦР, при необходимости варьирование вида (формы) и размеров заявляемой дозированной формы с сохранением или изменением в обеспечивающих проведение ПЦР пределах объема раствора компонентов для ПЦР и количества этих реагентов. При этом прессованная сахароза позволяет использовать в качестве оболочки заявляемой дозированной формы разных гидрофобных барьеров (парафина, воска, смеси парафина с воском или масла), применяемых в качестве пароизоляторов и предотвращающих перекрестную контаминацию реакционных смесей. Жесткая матрица из прессованной сахарозы снижает риск слипания, деформирования и слияния отдельных дозированных форм для ПЦР. Важно то, что прессованная сахароза при растворении в окончательном объеме реакционной смеси обеспечивает повышение продуктивности ПЦР и увеличивает плотность буфера для загрузки. Во-вторых, это варьирование в дозированной форме состава ингредиентов с гидрофобными свойствами, первоначально обеспечивающих изоляцию от внешних воздействий и защищающих от высыхания ядра дозированной формы, а затем создающих при ПЦР пароизолирующий гидрофобный барьер, предотвращающий перекрестную контаминацию реакционных смесей. Данное варьирование в дозированной форме состава ингредиентов с гидрофобными свойствами в сочетании с использованием прессованной сахарозы в качестве матрицы дает возможность изменять толщину оболочки в очень широких пределах. При этом соблюдение условия наличия сплошной гидрофобной оболочки заявляемой дозированной формы для ПЦР обеспечивает полное покрытие реакционных смесей в известных емкостях для ПЦР гидрофобным слоем из ингредиентов оболочки при дезинтеграции вариантов дозированной формы с эффективным проведением ПЦР. Вышеизложенное позволяет при характеристике оболочки заявляемой дозированной формы не указывать предельные значения ее толщины в качестве отличительных признаков. Для облегчения извлечения продукта классической ПЦР из емкости, в которой проходила реакция, предпочтительно использовать толщину оболочки, минимально необходимую для предотвращения испарения воды из ядра заявляемой дозированной формы, что обеспечивается предпочтительными размерами глобул и таблеток заявляемой дозированной формы.

Основными известными формами (видами) комплектации выпускаемых наборов для ПЦР являются нераскапанные наборы, раскапанные наборы (http://www.interlabservice.ru/uploaaViblock/fa3/Parainfluenza%20virus-FL_VV_040215.pdf; http://alphalabs.ru/assets/files/rabochaya-instrukziya-gelmoskrin.pdf; http://www.lytech.ru/articles_l32.htm) и наборы с готовыми лиофилизированными ПЦР-смесями (http://www.syntol.ru/catalog/nabory-reagentov-dlya-ptsr-v-realnom-vremeni/dlya-viyavleniya-dnk-rnk-vozbuditeley-osobo-opasnykh-infektsiy-metodom-pcr-v-realnom-vremeni.html).

Заявляемая дозированная форма для ПЦР - это основа новых форм комплектации наборов для ПЦР: пеллетированных наборов для ПЦР (pelleted kit PCR) и таблетированных наборов для ПЦР (tableted kit PCR).

Из патентно-технической литературы и практики ПЦР-исследований неизвестно о дозированной форме для ПЦР, включающей твердые ингредиенты, которая была бы идентична заявляемой.

Отсюда правомерен вывод о соответствии заявляемого решения критерию «новизна».

Указанная выше совокупность существенных признаков необходима и достаточна для получения технического результата - увеличения срока сохранения реакционной активности компонентов для ПЦР (реагентов), в том числе при температурах выше 0°С.

Предлагаемая дозированная форма может быть получена многократно, а значит, заявляемое техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость».

Предлагаемая дозированная форма апробирована в Обществе с ограниченной ответственностью «Микро Тех».

Сущность полезной модели поясняется на следующих примерах, показывающих увеличение срока сохранения реакционной активности компонентов для ПЦР (реагентов), в том числе при температурах выше 0°С при использовании вариантов заявляемой дозированной формы для ПЦР. При этом приведенные примеры дозированной формы для ПЦР показывают конкретную реализацию заявляемой полезной модели, но не ограничивают объем притязаний формулы заявляемой полезной модели.

Пример 1. Получена дозированная форма для ПЦР, включающая ядро, содержащее прессованную сахарозу, смоченную водным раствором следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента Taq-полимеразы, смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и буфера для постановки полимеразной цепной реакции, а также сплошную оболочку, состоящую из одного гидрофобного ингредиента - парафина, выполненную в форме глобулы с диаметром 2,0 мм. Соотношение прессованной сахарозы и водного раствора составляло 23,0 мас. % и 77,0 мас. %, соответственно.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для Ureaplasma urealyticum (U5 - 5'-CAATCTGCTCGTGAAGTATTAC-3', U4 - 5'-ACGACGTCCATAAGCAACT-3'), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP), буфер для постановки полимеразной цепной реакции (состав буфера: 100 мМ трис-HCl с рН 8,8 при 25°С, 500 мМ KCl, 0,8% нонидета Р-40 - Nonidet Р-40, 0,12 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 8% глицерина, 15 мкг/мл бромфенолового синего).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился в течение 1,5 лет при 8°С.

Для проведения ПЦР использовались различные емкости (пробирки объемом 0,1 мл, 0,2 мл и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,1 мл, 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,1 мл, 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (материала слизистой оболочки цервикального канала шейки матки обезьяны вида Павиан анубис, инфицированной Ureaplasma urealyticum).

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения классической ПЦР с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат ПЦР с праймерами для Ureaplasma urealyticum во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат ПЦР во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Кроме того, при внесении в емкости полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено универсальное уменьшение в 1,5-2 раза ошибок специалиста, показано универсальное уменьшение числа пипетирований не менее чем в 3 раза при постановке ПЦР, также уменьшающее число ручных манипуляций, снижающее риск перекрестной контаминации реакционных смесей. Установлено универсальное упрощение ручных манипуляций при внесении полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с внесением обычно используемых аналогичных жидких реагентов.

Пример 2. Получена дозированная форма для ПЦР, включающая ядро, содержащее прессованную сахарозу, смоченную водным раствором следующих компонентов: праймеров, меченого зонда, термостабильного фермента Taq-полимеразы, смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и буфера для постановки полимеразной цепной реакции, а также сплошную оболочку, состоящую из одного гидрофобного ингредиента - воска, выполненную в форме глобулы с диаметром 4,0 мм. Соотношение прессованной сахарозы и водного раствора составляло 40,0 мас. % и 60,0 мас. %, соответственно.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для Simian virus 40 (SV40) (F+ - 5'-GGGTCTTCTACCTTTCTCTTC-ТТТ-3', А - 5'-GCAGTGGTGGAATGCCTTT-3'), меченый зонд для SV40 (ТМ - 5'-AACCTGTTTTGCTCAGAAGAAATGCCA-3', меченый 6-карбоксифлуоресцином (FAM) на 5' конце и гасителем 6-карбокситетраметилродамином (TAMRA) на 3' конце), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP), буфер для постановки полимеразной цепной реакции (состав буфера: 100 мМ трис-HCl с рН 8,8 при 25°С, 500 мМ KCl, 0,8% нонидета Р-40 - Nonidet Р-40, 0,12 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 8% глицерина).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился в течение 1,5 лет при 6-10°С.

Для проведения ПЦР использовались различные емкости (пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (крови обезьяны вида Макак резус, инфицированной SV40).

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения ПЦР в реальном времени с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат ПЦР с праймерами и меченым зондом для SV40 во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат ПЦР во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Кроме того, при внесении в емкости полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено универсальное уменьшение в 1,5-2 раза ошибок специалиста, показано универсальное уменьшение числа пипетирований не менее чем в 3 раза при постановке ПЦР, также уменьшающее число ручных манипуляций, снижающее риск перекрестной контаминации реакционных смесей. Установлено универсальное упрощение ручных манипуляций при внесении полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с внесением обычно используемых аналогичных жидких реагентов.

Пример 3. Получена дозированная форма для ПЦР, включающая ядро, содержащее прессованную сахарозу, смоченную водным раствором следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента Taq-полимеразы, смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и буфера для постановки полимеразной цепной реакции, а также сплошную оболочку, состоящую из трех гидрофобных ингредиентов (смеси парафина с воском и минерального масла), выполненную в форме глобулы с диаметром 3,0 мм. Соотношение прессованной сахарозы и водного раствора составляло 58,0 мас. % и 42,0 мас. %, соответственно.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для Candida albicans (ITS3 - 5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3', ITS4 - 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP), буфер для постановки полимеразной цепной реакции (состав буфера: 500 мМ трицин-KOH с рН 8,8 при 25°С, 170 мМ (NH₄)₂SO₄, 0,1% твин-20, 0,12 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 15 мкг/мл ксиленцианола).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился в течение 1,5 лет при 6-10°С.

Для проведения ПЦР использовались различные емкости (пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (материала слизистой оболочки цервикального канала шейки матки обезьяны вида Павиан гамадрил, инфицированной Candida albicans).

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения классической ПЦР с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат ПЦР с праймерами для Candida albicans во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат ПЦР во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Кроме того, при внесении в емкости полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено универсальное уменьшение в 1,5-2 раза ошибок специалиста, показано универсальное уменьшение числа пипетирований не менее чем в 3 раза при постановке ПЦР, также уменьшающее число ручных манипуляций, снижающее риск перекрестной контаминации реакционных смесей. Установлено универсальное упрощение ручных манипуляций при внесении полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с внесением обычно используемых аналогичных жидких реагентов.

Пример 4. Получена дозированная форма для ПЦР, включающая ядро, содержащее прессованную сахарозу, смоченную водным раствором следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента Taq-полимеразы, смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и буфера для постановки полимеразной цепной реакции, а также сплошную оболочку, состоящую из двух гидрофобных ингредиентов (смеси парафина с воском), выполненную в форме таблетки с диаметром 3,0 мм и высотой 3,0 мм. Соотношение прессованной сахарозы и водного раствора составляло 58,0 мас. % и 42,0 мас. %, соответственно.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для Candida albicans (ITS3 - 5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3', ITS4 - 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP), буфер для постановки полимеразной цепной реакции (состав буфера: 500 мМ трицин-KOH с рН 8,8 при 25°С, 170 мМ (NH₄)SO₄, 0,1% твин-20, 0,12 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 15 мкг/мл ксиленцианола).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился в течение 1,5 лет при 6-10°С.

Для проведения ПЦР использовались различные емкости (пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (материала слизистой оболочки цервикального канала шейки матки обезьяны вида Павиан гамадрил, инфицированной Candida albicans).

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения классической ПЦР с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат ПЦР с праймерами для Candida albicans во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат ПЦР во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Кроме того, при внесении в емкости полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено универсальное уменьшение в 1,5-2 раза ошибок специалиста, показано универсальное уменьшение числа пипетирований не менее чем в 3 раза при постановке ПЦР, также уменьшающее число ручных манипуляций, снижающее риск перекрестной контаминации реакционных смесей. Установлено универсальное упрощение ручных манипуляций при внесении полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с внесением обычно используемых аналогичных жидких реагентов.

Пример 5. Получена дозированная форма для ПЦР, включающая ядро, содержащее прессованную сахарозу, смоченную водным раствором следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента Taq-полимеразы, смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и буфера для постановки полимеразной цепной реакции, а также сплошную оболочку, состоящую из одного гидрофобного ингредиента - воска, выполненную в форме таблетки с диаметром 4,0 мм и высотой 2,0 мм. Соотношение прессованной сахарозы и водного раствора составляло 40,0 мас. % и 60,0 мас. %, соответственно.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для Trichiuris trichiuria (NC5 - 5'-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3', NC2 - 5'-GGTTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3'), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP), буфер для постановки полимеразной цепной реакции (состав буфера: 750 мМ трис-HCl с рН 8,8 при 25°С, 200 мМ (NH₄)₂SO₄, 0,1% твин-20, 0,12 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 80 мкг/мл крезолового красного).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился в течение 1,5 лет при 6-10°С.

Для проведения ПЦР использовались различные емкости (пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (кал больного, инфицированного Trichiuris trichiuria).

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения классической ПЦР с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат ПЦР с праймерами для Trichiuris trichiuria во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат ПЦР во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Кроме того, при внесении в емкости полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено универсальное уменьшение в 1,5-2 раза ошибок специалиста, показано универсальное уменьшение числа пипетирований не менее чем в 3 раза при постановке ПЦР, также уменьшающее число ручных манипуляций, снижающее риск перекрестной контаминации реакционных смесей. Установлено универсальное упрощение ручных манипуляций при внесении полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с внесением обычно используемых аналогичных жидких реагентов.

Пример 6. Получена дозированная форма для ПЦР, включающая ядро, содержащее прессованную сахарозу, смоченную водным раствором следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента Taq-полимеразы, смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и буфера для постановки полимеразной цепной реакции, а также сплошную оболочку, состоящую из трех гидрофобных ингредиентов (смеси парафина с воском и минерального масла), выполненную в форме таблетки с диаметром 2,0 мм и толщиной 4,0 мм. Соотношение прессованной сахарозы и водного раствора составляло 23,0 мас. % и 77,0 мас. %, соответственно.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для вируса гепатита В (HBV А - 5'-TTGCCTTCTGACTTCTTTCC-3', HBV S - 5'-TCTGCGAGGCGAGGGAGTTCT-3'), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP), буфер для постановки полимеразной цепной реакции (состав буфера: 500 мМ трицин-KOH с рН 8,8 при 25°С, 170 мМ (NH₄)₂SO₄, 0,1% твин-20, 0,12 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 15 мкг/мл ксиленцианола).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился в течение 1,5 лет при 6-10°С.

Для проведения ПЦР использовались различные емкости (пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (кровь больного гепатитом В).

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения классической ПЦР с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат ПЦР с праймерами для вируса гепатита В во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат ПЦР во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Кроме того, при внесении в емкости полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено универсальное уменьшение в 1,5-2 раза ошибок специалиста, показано универсальное уменьшение числа пипетирований не менее чем в 3 раза при постановке ПЦР, также уменьшающее число ручных манипуляций, снижающее риск перекрестной контаминации реакционных смесей. Установлено универсальное упрощение ручных манипуляций при внесении полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с внесением обычно используемых аналогичных жидких реагентов.

Пример 7. Получена дозированная форма для ПЦР, включающая ядро, содержащее прессованную сахарозу, смоченную водным раствором следующих компонентов: праймеров, меченого зонда, термостабильного фермента Taq-полимеразы, смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и буфера для постановки полимеразной цепной реакции, а также сплошную оболочку, состоящую из двух гидрофобных ингредиентов (смеси парафина с воском), выполненную в форме таблетки с диаметром 4,0 мм и шириной 2,0 мм. Соотношение прессованной сахарозы и водного раствора составляло 40,0 мас. % и 60,0 мас. %, соответственно.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для Simian virus 40 (SV40) (F+ - 5'-GGGTCTTCTACCTTTCTCTTC-ТТТ-3', А - 5'-GCAGTGGTGGAATGCCTTT-3'), меченый зонд для SV40 (ТМ - 5'-AACCTGTTTTGCTCAGAAGAAATGCCA-3', меченый 6-карбоксифлуоресцином (FAM) на 5' конце и гасителем 6-карбокситетраметилродамином (TAMRA) на 3' конце), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP), буфер для постановки полимеразной цепной реакции (состав буфера: 100 мМ трис-HCl с рН 8,8 при 25°С, 500 мМ KCl, 0,8% нонидета Р-40 - Nonidet Р-40, 0,12 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 8% глицерина).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился в течение 1,5 лет при 6-10°С.

Для проведения ПЦР использовались различные емкости (пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (крови обезьяны вида Макак резус, инфицированной SV40).

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения ПЦР в реальном времени с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат ПЦР с праймерами и меченым зондом для SV40 во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат ПЦР во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Кроме того, при внесении в емкости полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено универсальное уменьшение в 1,5-2 раза ошибок специалиста, показано универсальное уменьшение числа пипетирований не менее чем в 3 раза при постановке ПЦР, также уменьшающее число ручных манипуляций, снижающее риск перекрестной контаминации реакционных смесей. Установлено универсальное упрощение ручных манипуляций при внесении полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с внесением обычно используемых аналогичных жидких реагентов.

Пример 8. Получена дозированная форма для ПЦР, включающая ядро, содержащее прессованную сахарозу, смоченную водным раствором следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента Taq-полимеразы, смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и буфера для постановки полимеразной цепной реакции, а также сплошную оболочку, состоящую из одного гидрофобного ингредиента - масла, выполненную в форме глобулы с диаметром 4,0 мм. Соотношение прессованной сахарозы и водного раствора составляло 58,0 мас. % и 42,0 мас. %, соответственно.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для Ureaplasma urealyticum (U5 - 5'-CAATCTGCTCGTGAAGTATTAC-3', U4 - 5'-ACGACGTCCATAAGCAACT-3'), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP), буфер для постановки полимеразной цепной реакции (состав буфера: 100 мМ трис-HCl с рН 8,8 при 25°С, 500 мМ KCl, 0,8% нонидета Р-40 - Nonidet Р-40, 0,12 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 8% глицерина, 15 мкг/мл бромфенолового синего).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился в течение 1,5 лет при 8°С.

Для проведения ПЦР использовались различные емкости (пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (материала слизистой оболочки цервикального канала шейки матки обезьяны вида Павиан анубис, инфицированной Ureaplasma urealyticum).

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения классической ПЦР с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат ПЦР с праймерами для Ureaplasma urealyticum во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат ПЦР во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Кроме того, при внесении в емкости полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено универсальное уменьшение в 1,5-2 раза ошибок специалиста, показано универсальное уменьшение числа пипетирований не менее чем в 3 раза при постановке ПЦР, также уменьшающее число ручных манипуляций, снижающее риск перекрестной контаминации реакционных смесей. Установлено универсальное упрощение ручных манипуляций при внесении полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с внесением обычно используемых аналогичных жидких реагентов.

Пример 9. Получена дозированная форма для ПЦР, включающая ядро, содержащее прессованную сахарозу, смоченную водным раствором следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента Taq-полимеразы, смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и буфера для постановки полимеразной цепной реакции, а также сплошную оболочку, состоящую из двух гидрофобных ингредиентов (смеси парафина с маслом), выполненную в форме глобулы с диаметром 3,0 мм. Соотношение прессованной сахарозы и водного раствора составляло 50,0 мас. % и 50,0 мас. %, соответственно.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для Candida albicans (ITS3 - 5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3', ITS4 - 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP), буфер для постановки полимеразной цепной реакции (состав буфера: 500 мМ трицин-KOH с рН 8,8 при 25°С, 170 мМ (NH₄)₂SO₄, 0,1% твин-20, 0,12 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 15 мкг/мл ксиленцианола).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился в течение 1,5 лет при 6-10°С.

Для проведения ПЦР использовались различные емкости (пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (материала слизистой оболочки цервикального канала шейки матки обезьяны вида Павиан гамадрил, инфицированной Candida albicans).

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения классической ПЦР с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат ПЦР с праймерами для Candida albicans во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат ПЦР во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Кроме того, при внесении в емкости полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено универсальное уменьшение в 1,5-2 раза ошибок специалиста, показано универсальное уменьшение числа пипетирований не менее чем в 3 раза при постановке ПЦР, также уменьшающее число ручных манипуляций, снижающее риск перекрестной контаминации реакционных смесей. Установлено универсальное упрощение ручных манипуляций при внесении полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с внесением обычно используемых аналогичных жидких реагентов.

Пример 10. Получена дозированная форма для ПЦР, включающая ядро, содержащее прессованную сахарозу, смоченную водным раствором следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента Taq-полимеразы, смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и буфера для постановки полимеразной цепной реакции, а также сплошную оболочку, состоящую из трех гидрофобных ингредиентов (смеси парафина с воском и минерального масла), выполненную в форме таблетки с диаметром 2,0 мм и толщиной 2,0 мм. Соотношение прессованной сахарозы и водного раствора составляло 58,0 мас. % и 42,0 мас. %, соответственно.

При этом использованы: прямые и обратные праймеры для вируса гепатита В (HBV А - 5'-TTGCCTTCTGACTTCTTTCC-3', HBV S - 5'-TCTGCGAGGCGAGGGAGTTCT-3'), смесь четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP), буфер для постановки полимеразной цепной реакции (состав буфера: 500 мМ трицин-KOH с рН 8,8 при 25°С, 170 мМ (NH₄)₂SO₄, 0,1% твин-20, 0,12 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 15 мкг/мл ксиленцианола).

Полученный вариант заявляемой дозированной формы перед постановкой реакции хранился в течение 1,5 лет при 6-10°С.

Для проведения ПЦР использовались различные емкости (пробирки объемом 0,1 мл, 0,2 мл и 0,5 мл, стрипированные пробирки объемом 0,1 мл, 0,2 мл и 0,5 мл и планшеты на 48 и 96 лунок с юбкой и без юбки, с рабочим объемом лунки 0,1 мл, 0,2 мл и 0,3 мл).

Первоначально выделяли ДНК из биологического материала (кровь больного гепатитом В).

Также использовались положительный контроль и отрицательный контроль.

В результате проведения классической ПЦР с использованием заявляемой дозированной формы установлен положительный результат ПЦР с праймерами для вируса гепатита В во всех случаях с использованием подготовленных проб биологического материала и положительного контроля и отрицательный результат ПЦР во всех случаях с использованием отрицательного контроля. Кроме того, при внесении в емкости полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с использованием обычно используемых аналогичных жидких реагентов отмечено универсальное уменьшение в 1,5-2 раза ошибок специалиста, показано универсальное уменьшение числа пипетирований не менее чем в 3 раза при постановке ПЦР, также уменьшающее число ручных манипуляций, снижающее риск перекрестной контаминации реакционных смесей. Установлено универсальное упрощение ручных манипуляций при внесении полученного варианта заявляемой дозированной формы по сравнению с внесением обычно используемых аналогичных жидких реагентов.

Claims (5)

1. Дозированная форма для полимеразной цепной реакции, отличающаяся тем, что включает ядро, содержащее прессованную сахарозу, смоченную водным раствором следующих компонентов: праймеров, термостабильного фермента Taq-полимеразы, смеси четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и буфера для постановки полимеразной цепной реакции, а также сплошную оболочку, состоящую по меньшей мере из одного гидрофобного ингредиента, выбранного из ряда: парафин, воск и минеральное масло, причем содержание сахарозы и водного раствора в ядре, мас.%:

сахароза 23,0-58,0 водный раствор 42,0-77,0

2. Дозированная форма по п. 1, отличающаяся тем, что она выполнена в виде глобулы или таблетки, при этом глобула имеет предпочтительный диаметр 2,0-4,0 мм, а таблетка имеет предпочтительный диаметр 2,0-4,0 мм и предпочтительную толщину 2,0-4,0 мм.

3. Дозированная форма по п. 1, отличающаяся тем, что водный раствор дополнительно включает в качестве компонента меченый зонд.

4. Дозированная форма по п. 1, отличающаяся тем, что водный раствор дополнительно включает в качестве компонента краситель для гель-электрофореза, предпочтительно выбранный из ряда: бромфеноловый синий, ксиленцианол, бромкрезоловый красный или крезоловый красный.