DE602004002485T2

DE602004002485T2 - In gegenwart von collagen und disacchariden lyophilisierte nukleinsäuren umfassende zusammensetzung

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Publication number: DE602004002485T2
Application number: DE602004002485T
Authority: DE
Inventors: Raymond Robert; Claude Buffard
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-05-23
Filing date: 2004-05-21
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2024-05-22
Also published as: EP1629118B1; FR2855177B1; FR2855177A1; EP1629118A2; WO2004106549A2; ATE340272T1; DE602004002485D1; WO2004106549A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhalten einer Zusammensetzung mit Nukleinsäuren durch Lyophilisierung einer wässrigen Lösung aus Nukleinsäuren in Gegenwart von Disacchariden und Collagen, vorzugsweise von Trehalose und Collagen. Sie betrifft gleichermaßen lyophilisierte Zusammensetzungen mit Nukleinsäuren, insbesondere "verwendungsfertige" lyophilisierte Mischungen mit den für die Amplifikation von Nukleinsäuren durch PCR erforderlichen Bestandteilen.
Die Nukleinsäuren, und insbesondere die Desoxyribonukleinsäuren, werden in zahlreichen molekularbiologischen Anwendungen verwendet, insbesondere in Reaktionsmedien für Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR), die Sequenzierung und die reverse Transkription (Reverse Transcription, RT).
Insbesondere durch Polymerase-Kettenreaktion (nachfolgend "PCR" genannt) wird es möglich, eine DNA-Sequenz bis zu einer Million Mal zu amplifizieren und so Sequenzen, die in einer Probe in sehr geringer Quantität vorhanden sind und nach Amplifikation detektierbar sind, zu detektieren.
Für die Durchführung einer PCR-Reaktion werden Oligonukleotide, die geeignet sind, an den Enden der zu amplifizierenden Sequenz zu hybridisieren, im Allgemeinen durch chemische Synthese vorbereitet. Diese Oligonukleotide dienen als Starter für die Synthese in vitro von DNA, die durch wärmestabile DNA-Polymerase in Gegenwart von 2'-Desoxyribonukleosid-5'-triphosphat katalysiert wurde. Für jeden PCR-Zyklus ist ein Schritt der Denaturierung der zu amplifizierenden DNA, ein Schritt der Hybridisierung von Startern und ein Schritt der Elongation erforderlich. Um eine ausreichende Amplifikation zu erhalten, umfasst die PCR im Allgemeinen 25 bis 40 Zyklen.
Die PCR wird genauer beschrieben, insbesondere in den Patenten US 4,683,195 , US 4,683,202 und US 4,800,159 . Unterschiedliche alternative Verfahren werden gleichermaßen im Stand der Technik beschrieben, einschließlich insbesondere der isothermen Amplifikationsverfahren wie TMA (transcription mediated amplification), NASBA (nucleic acid sequence based amplification), SSR (self sustained sequence replication) oder Amplifikation durch Ersetzung von Strängen, SDA (strand displacement amplification). Es ist des Weiteren möglich, vor der PCR eine reverse Transkriptions-Reaktion (RT-PCR) zu kombinieren. Die reverse Transkriptions-Reaktion ermöglicht es, eine mRNA mittels reverser Transkriptase (reverse transcriptase) in komplementäre DNA (cDNA) zu transkribieren.
Es ist bekannt, dass die Nukleinsäuren, und insbesondere die dNTPs oder die Oligonukleotide, Produkte sind, die in Lösung wenig stabil sind und sehr schnell denaturiert sind, wenn sie in Lösung bei Umgebungstemperatur aufbewahrt werden. Aus diesen Gründen werden die für eine PCR-Reaktion verwendbaren Oligonukleotide und dNTPs im Allgemeinen in kristallisierter (oder getrockneter) Form aufbewahrt, dann rehydratisiert und dem Reaktionsmedium zum Zeitpunkt der Durchführung der PCR-Reaktion hinzugefügt.
In den amerikanischen Patenten US 5,861,251 und US 6,153,412 wird die Herstellung einer als "verwendungsfertige" Mischung formulierten lyophilisierten Zusammensetzung für die Durchführung von PCR-Reaktionen beschrieben, welche die Verwendung eines Stabilisierungsmittels, einer DNA-Polymerase, von dNTPs und Magnesiumchlorid vor dem Schritt der Lyophilisierung aufweist. Als Stabilisierungsmittel werden Gelatine, BSA, Thesit, PEG8000 und Polyole, wie beispielsweise Ficoll, Sucrose, Glycerol, Glucose, Mannitol, Galacitol, Glucitol und Sorbitol, genannt.
Trehalose wird ebenfalls als Stabilisierungsmittel für eine als "verwendungsfertige" Mischung formulierte lyophilisierte Zusammensetzung für die Durchführung von RT-PCR ( US 5,832,254 ), und insbesondere für die Lyophilisierung oder die Dehydratisierung biologischer Makromoleküle, insbesondere Proteine, genannt ( US 5,834,254 ).
In dem amerikanischen Patent US 5,310,885 und in der Patentanmeldung US 2002/064536 werden Collagen und Polysaccharide wie beispielsweise Saccharose und Trehalose als Stabilisierungsmittel von Proteinen beschrieben, ohne jedoch die kombinierte Verwendung von Collagen und einem Disaccharid zu beschreiben oder die Proteine für die Durchführung der PCR-Reaktionen spezifisch zu erwähnen.
Um die dreidimensionale Struktur von Proteinen beizubehalten, wenn sich diese in Umgebungsbedingungen befinden, die ihre Denaturierung erleichtern, wurden gleichermaßen verschiedene Stabilisierungsmittel verwendet und insbesondere Proteine, wie Albumin oder Collagen. Collagen ist insbesondere als Stabilisierungsmittel für Proteine, insbesondere lyophilisierte Proteine, bekannt.
Die Amplifikationstechniken für Nukleinsäuren werden in zahlreichen Bereichen verwendet, insbesondere im Bereich der Nahrungsmittel oder der Agrikultur, für medizinische Diagnostik, für die Durchführung von Gentests, in der Archäologie, in der Kriminologie.
Unter Berücksichtigung der steigenden Verwendung dieser Techniken in sehr unterschiedlichen Bereichen besteht ein wirkliches Bedürfnis, Kits für die Durchführung dieser Verfahren zu entwickeln, die bei Umgebungstemperatur über lange Zeiträume aufbewahrt werden können.
Um des Weiteren die Verschmutzungsgefahr bei der Durchführung der Reaktion und der Vorbereitung der Reaktionsmischungen zu reduzieren, sind insbesondere "verwendungsfertige" Mischungen, die einen Hauptbestandteil der voraliquotierten Reagenzien in geeigneten Mengen enthalten, gefragt.
Die äußere Erscheinungsform lyophilisierter Zusammensetzungen ist ein wesentlicher Faktor im Rahmen der Vermarktung dieser Zusammensetzungen, insbesondere für die Durchführung molekularbiologischer Reaktionen wie PCR. Eine Darstellung der lyophilisierten Zusammensetzungen in kompakter und dichter Form wird nämlich im Allgemeinen vom Durchschnittsfachmann als Qualitätsmerkmal betrachtet.
Die vorliegende Erfindung ist insbesondere Ergebnis der Feststellung, dass die Lyophilisierung von Nukleinsäurezusammensetzungen in Gegenwart einer Kombination aus Disacchariden und Collagen es ermöglicht, die Aufbewahrungsdauer bei Umgebungstemperatur der Nukleinsäuren und insbesondere von Oligonukleotiden oder Mischungen aus dNTPs wesentlich zu verbessern.
Die vorliegende Erfindung ist gleichermaßen Ergebnis der Feststellung, dass die Lyophilisierung von Nukleinsäurezusammensetzungen in Gegenwart einer Kombination aus Disacchariden und Collagen es ermöglicht, eine kompakte und dichte äußere Erscheinungsform der Zusammensetzungen zu erhalten, wie es im Rahmen der Vermarktung gewünscht ist.
Nach dem Kenntnisstand der Anmelderin wurde die kombinierte Verwendung von Trehalose und Collagen als Stabilisierungsmittel und/oder die Komprimierung lyophilisierter Nukleinsäuren im Stand der Technik weder beschrieben noch vorgeschlagen.
Im Sinn der Erfindung wird mit dem Begriff "Nukleotid" ohne genauere Präzisierung ein Molekül bezeichnet, das aus einer nitrierten Base (im Allgemeinen Adenin, Thymin, Uracil, Cytosin und Guanin), einem Zucker (Ribose oder Desoxyribose) und einer oder mehreren Phosphatgruppen gebildet ist. Ein Nukleotid ist insbesondere ein Ribonukleosid-5'-triphosphat oder ein Desoxyribonukleosid-5'-triphosphat oder deren Derivate, die als Substrate für die DNA-Polymerase oder die RNA-Polymerase dienen können. Insbesondere handelt es sich um dATP, dGTP, dITP, dUTP, dCTP, dTTP oder um ATP, GTP, ITP, UTP, CTP, TTP.
Mit dem Begriff "dNTPs" wird im Sinn der Erfindung eine äquimolare Mischung aus dATP, dCTP, dGTP und dTTP bezeichnet.
Mit dem Begriff "Polynukleotid" wird im Sinn der Erfindung ohne genaue Präzisierung ein Nukleotidpolmer mit wenigstens 50 Nukleotiden, einstrangig oder doppelstrangig, insbesondere DNA oder RNA, bezeichnet.
Mit dem Begriff "Oligonukleotid" wird im Sinn der Erfindung ohne genaue Präzisierung ein einstrangiges Nukleotidpolymer mit höchstens 50 Nukleotiden, vorzugsweise mit 10 bis 30 Nukleotiden, bezeichnet.
Mit dem Begriff Nukleinsäure wird unterschiedslos Bezug auf einstrangige oder doppelstrangige Nukleotide, Oligonukleotide oder Polynukleotide genommen.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zum Erhalten einer lyophilisierten Zusammensetzung, welche Nukleinsäuren enthält, dadurch gekennzeichnet, dass es die Lyophilisierung einer wässrigen Lösung von Nukleinsäuren in Gegenwart von Disacchariden und Collagen aufweist.
Alle Disaccharide und deren Kombinationen können in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden. Insbesondere werden Saccharose, Maltose, Lactose und Trehalose genannt. In einer besonderen Ausführungsform wird Trehalose verwendet.
Das in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendete Collagen kann zum Beispiel ein Collagen sein, dass durch Thermohydrolyse eines Collagens aus der Lederhaut eines Säugetiers erhalten wird, uns insbesondere ein Collagen, dass durch Thermohydrolyse bei 145°C eines Collagens aus der Lederhaut eines Schweins, in hohem Maße gereinigt, erhalten wird.
Die Mengen an Disacchariden und Collagen werden vom Durchschnittsfachmann optimiert, damit die bestmögliche Stabilität der Nukleinsäuren erhalten wird. Die Stabilität der Nukleinsäuren kann zum Beispiel durch Vergleich der Sensibilität einer Amplifikationsreaktion von Nukleinsäuren in Gegenwart von getesteten Nukleinsäuren nach einer bestimmten Aufbewahrungsdauer und von Kontroll-Nukleinsäuren, die frisch zubereitet wurden, gemessen werden.
In einer bestimmten Ausführungsform weist die wässrige Lösung 800 μM Nukleinsäuren (4 × 200 μM dNTP), 150 mM bis 600 mM Disaccharide und 0,1% bis 1% Collagen auf.
Die wässrige Lösung weist wenigstens eine der folgenden Nukleinsäuren auf:

– 2'Desoxyribonukleosid-5'-triphosphate;
– ein Oligonukleotid;
– ein Polynukleotid.

Insbesondere sind Nukleinsäuren mit geringem Molekulargewicht instabil. Die vorliegende Erfindung ist geeignet, Zusammensetzungen zu liefern, die durch Lyophilisierung in Gegenwart von Disacchariden und Collagen stabilisierte Nukleinsäuren mit geringem Molekulargewicht enthalten.
In einer bestimmten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung sind die in der wässrigen Lösung enthaltenen Nukleinsäuren Oligonukleotide oder Nukleotide, und insbesondere dNTPs.
Das Verfahren gemäß der Erfindung ermöglicht es insbesondere, lyophilisierte Zusammensetzungen für die Durchführung von molekularbiologischen Reaktionen zu erhalten, welche Nukleinsäuren sowie alle anderen bei der Durchführung einer molekularbiologischen Reaktion nützlichen Bestandteile aufweisen. Aus diesen Bestandteilen werden die Enzyme, die als Substrat oder Co-Substrat von Nukleinsäuren verwendet werden, Reaktionspuffer, Stabilisierungsmittel oder Cofaktoren von Enzymen, Reduktionsmittel und Farbstoffe genannt.
Unter den Enzymen, die als Substrat oder Co-Substrat für Nukleinsäuren verwendet werden können, werden zu Beispielzwecken die DNA-Polymerasen und insbesondere die wärmestabilen DNA-Polymerasen, die DNA-Polymerasen auf RNA-Matrix (reverse Transkriptase), die RNA-Polymerase und die Enzyme mit korrigierender Tätigkeit 5'-3'genannt.
Unter den Stabilisierungsmitteln oder Cofaktoren werden insbesondere die Metallsalze wie zum Beispiel Zink- oder Magnesiumsalz, die Proteine, die Disaccharide oder auch Polyvinylpyrrolidon (PVP) genannt.
Unter den Farbstoffen werden zum Beispiel Bromphenolblau, Xylolcyanol, Bromcresolrot oder Cresolrot genannt.
Aus den oben genannten Bestandteilen wählt der Durchschnittsfachmann entsprechend der gewünschten Anwendung die vor der Lyophilisierung zu der Lösung hinzuzufügenden Bestandteile in geeigneten Mengen, damit die Anwendung direkt nach Rehydratisierung der lyophilisierten Zusammensetzung durchgeführt werden kann oder zumindest die Menge der hinzuzufügenden Bestandteile minimiert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere das Erhalten von als "verwendungsfertig" formulierten Zusammensetzungen für die Amplifikation von Nukleinsäuren durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Für die Zubereitung derartiger Mischungen weist die vor der Lyophilisierung vorbereitete wässrige Lösung außer Trehalose und Collagen beispielsweise die folgenden Bestandteile auf:

– eine Mischung aus 2'Desoxyribonukleosid-5'-phosphaten (dNTPs);
– einen Reaktionspuffer; und
– gegebenenfalls ein Oligonukleotid, Magnesiumchlorid, eine DNA-Polymerase, ein Enzym mit korrigierender Tätigkeit 5'-3' und/oder einen Farbstoff.

Der Begriff "verwendungsfertig" bedeutet in diesem Text, dass die Bestandteile der Mischung in für die Durchführung einer Amplifikationsreaktion von Nukleinsäuren geeigneten Mengen durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nach Rehydratisierung vorhanden sind, ohne dass die jeweiligen Mengen der anfänglich in der lyophilisierten Mischung vorhandenen Bestandteile modifiziert werden müssen. Selbstverständlich muss der Durchschnittsfachmann gegebenenfalls für die Durchführung der Reaktion bestimmte Bestandteile hinzufügen, die anfänglich in der lyophilisierten Mischung nicht vorhanden sind.
In einer bestimmten Ausführungsform weist eine derartige Zusammensetzung gemäß der Erfindung keine Enzyme, insbesondere keine DNA-Polymerase auf.
Ein Beispiel für eine wässrige Lösung hinsichtlich der Zubereitung "verwendungsfertiger" lyophilisierter Mischungen für die Amplifikation von Nukleinsäuren durch PCR ist eine Lösung, welche außer Trehalose und Glycogen aufweist:

– eine Mischung aus 2'Desoxyribonukleosid-5'-phosphaten (dNTPs);
– einen Reaktionspuffer;
– ein oder mehrere Starterpaare, wobei jedes Starterpaar die Amplifikation einer bestimmten Nukleinsäuresequenz ermöglicht;
– eine DNA-Polymerase; und
– Magnesiumchlorid.

Es ist bekannt, dass die Aufbewahrung und die Lyophilisierung von Nukleinsäuren in gleichem Maße weniger wirksam sind wie die lyophilisierten Mengen reduziert werden. Nun sind in der Mehrzahl von Anwendungen von "verwendungsfertigen" lyophilisierten Mischungen die Mengen an Nukleinsäuren, insbesondere von dNTPs oder Oligonukleotiden, kleiner als 3000 μM. Einer der Vorteile der vorliegenden Erfindung ist es, dass diese ermöglicht, sehr geringe Mengen von Nukleinsäuren zu lyophilisieren und in lyophilisierter Form aufzubewahren.
In einer Ausführungsform des Verfahrens enthält die wässrige Lösung eine Menge an Nukleinsäure von weniger als 3000 μM, vorzugsweise zwischen 600 μM und 1000 μM, und in der Mehrzahl von Anwendungen eine Menge von 800 μM (4 × 200 μM dNTP).
Gemäß dem Verfahren der Erfindung besteht die Lyophilisierung darin, eine Lösung erstarren zu lassen, dann das Wasser durch Erhitzen unter Vakuum zu sublimieren, um das Wasser zu entfernen und nur die dehydrierten Produkte zu bewahren. Die Techniken zur Lyophilisierung sind dem Durchschnittsfachmann bekannt. Ein Beispiel eines Lyophilisierungprotokolls ist des Weiteren in dem Versuchsteil beschrieben. In einer bestimmten Ausführungsform sind die folgenden Parameter in den unten angegebenen Bereichen enthalten:
Temperatur des Erstarrens: zwischen –20°C und –50°C
Temperatur der Schalen: zwischen 0°C und 30°C
Temperatur des Abscheiders: zwischen –10°C und –60°C
Wert des Vakuums: zwischen 0,1 und 0,01 mbar
und Stopp der Lyophilisierung 3 bis 10 Stunden nach Stabilisierung der Temperatur des lyophilisierten Produkts zwischen 10°C und 40°C.
Die Werte dieser Parameter können entsprechend der Art der zu lyophilisierenden Lösung angepasst werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine lyophilisierte Zusammensetzung mit Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass sie Disaccharide und Collagen, zum Beispiel Trehalose und Collagen, aufweist.
Derartige Zusammensetzungen sind insbesondere jene, die durch das oben beschriebene Verfahren erhalten werden können.
Die lyophilisierten Zusammensetzungen gemäß der Erfindung weisen im Allgemeinen 5 bis 50 mmol Disaccharide und 40 bis 400 μg Collagen auf.
In einer bestimmten Ausführungsform weist eine lyophilisierte Zusammensetzung gemäß der Erfindung eine Menge an Nukleinsäure von weniger als 100 μmol, vorzugsweise zwischen 20 μmol und 30 μmol, auf.
Zu Beispielzwecken ist eine in der lyophilisierten Zusammensetzung gemäß der Erfindung enthaltene Nukleinsäure ein 2'Desoxyribonukleosid-5'-phosphat; ein Oligonukleotid; und/oder ein Polynukleotid, insbesondere eine Mischung aus dNTPs oder einem oder mehreren Oligonukleotiden.
In einer bestimmten Ausführungsform sind die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung als "verwendungsfertige" Mischung für die Sequenzierung von DNA-Molekülen gemäß dem Sanger-Verfahren (Sanger, 1977) formuliert. Eine derartige lyophilisierte Zusammensetzung weist außer dem Disaccharid und dem Collagen dNTPs und Didesoxyribonukleosid-5'-triphosphat (ddNTPs) auf.
In einer anderen bestimmten Ausführungsformen ist die lyophilisierte Zusammensetzung gemäß der Erfindung eine "verwendungsfertige" lyophilisierte Mischung für die Durchführung einer PCR-Reaktion, welche außer Disaccharid und Collagen wenigstens die folgenden Bestandteile aufweist:

– eine Mischung aus 2'Desoxyribonukleosid-5'-phosphaten (dNTPs);
– einen Puffer; und
– gegebenenfalls ein Oligonukleotid, Magnesiumchlorid, eine DNA-Polymerase und/oder einen Farbstoff;

Zum Beispiel ist eine verwendungsfertige lyophilisierte Mischung gemäß der Erfindung für die Amplifikation von Nukleinsäuren durch PCR eine lyophilisierte Zusammensetzung, welche aufweist:

– Disaccharide zu 5 bis 50 mmol
– 40 bis 400 μg Collagen
– ein oder mehrere Oligonukleotidpaare zu 4 μmol bis 20 μmol
– dNTPs zu 20 bis 30 μmol
– eine DNA-Polymerase: 0,1 bis 5 Einheiten

Die PCR-Reaktion kann nach Rehydratisierung der oben beschriebenen lyophilisierten Zusammensetzung durchgeführt werden, indem eine Lösung hinzugefügt wird, die geeignet ist, insbesondere die zu amplifizierende Nukleinsäuresequenz zu enthalten.
In einer bestimmten Ausführungsform der oben beschriebenen Zusammensetzung ist die Menge jedes dieser Bestandteile für die Durchführung einer Amplifikationsreaktion von Nukleinsäuren durch PCR nach Rehydratisierung der Zusammensetzung in einer Wassermenge oder einer für die Durchführung einer PCR-Reaktion geeigneten Lösung, und insbesondere eines geeigneten Puffers, zwischen 10 und 100 μL, geeignet. Die lyophilisierten Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können in einem Mikroröhrchen enthalten sein, das in einem Thermozykler für PCR-Reaktionen verwendbar ist.
Im Allgemeinen ist ein in einem Thermozykler für PCR-Reaktionen verwendbares Mikroröhrchen ein Mikroröhrchen aus Polypropylen mit dünnen Wänden, das geeignet ist, eine Reaktionsmenge zwischen 50 μl und 200 μl, vorzugsweise 50 μl bis 100 μl, zu enthalten.
Die Erfindung betrifft gleichermaßen ein Amplifikationsverfahren für Nukleinsäure, welches die Rehydratisierung einer als "verwendungsfertige" Mischung formulierten lyophilisierten Zusammensetzung für die Durchführung einer PCR-Reaktion wie oben beschrieben aufweist, durch Hinzufügen einer wässrigen Lösung, welche gegebenenfalls einen oder mehrere für die Amplifikation von Nukleinsäuren durch PCR erforderlichen Bestandteile und insbesondere eine DNA-Matrix und/oder ein Oligonukleotidpaar aufweist.
Die Erfindung betrifft gleichermaßen die Verwendung einer Kombination aus Disacchariden und Collagen als Stabilisierungsmittel und/oder die Komprimierung lyophilisierter Nukleinsäuren, insbesondere einer Kombination aus Trehalose und Collagen.
Die vorliegende Erfindung und ihre Vorteile werden anhand der folgenden Beispiele dargestellt.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGSFIGUREN
1: 1 stellt das Lyophilisierungsprotokoll dar.
Kurve A: - .. Temperatur des lyophilisierten Produkts
Kurve B: -- Temperatur der Schalen
Kurve C: – Temperatur des Abscheiders
Kurve D: ... Wert des Vakuums
2: Äußere Erscheinungsform der Lyophilisate
2 stellt die äußere Erscheinungsform der nach Lyophilisierung erhaltenen Mischungen dar

– bei Fehlen eines Konservierungsmittels (Mischung 1)
– bei Vorhandensein von Trehalose (Mischung 2)
– bei Vorhandensein von Collagen (Mischung 3)
– bei Vorhandensein von Trehalose und Collagen (Mischung 4).

3: Elektrophorese eines DNA-Amplifikons von Bordetella pertussis, erhalten durch PCR aus:
1000 Bakterien = Spur a
100 Bakterien = Spur b
10 Bakterien = Spur c
1 Bakterien = Spur b
Mischung 1: nicht lyophilisiertes Produkt mit Bestandteilen, die den Reaktionspuffer bilden, dNTPs, DNA-Polymerase und Startern.
Mischung 2: lyophilisiertes Produkt in Mikroröhrchen mit Bestandteilen, die den Reaktionspuffer bilden, dNTPs, DNA-Polymerase, Startern und Trehalose.
Mischung 3: lyophilisiertes Produkt in Mikroröhrchen mit Bestandteilen, die den Reaktionspuffer bilden, dNTPs, DNA-Polymerase, Startern und Prio nex^R (Collagen, das aus Thermohydrolyse von Collagen aus der Lederhaut von Schweinen, in hohem Maße gereinigt, erhalten wurde).
Mischung 4: lyophilisiertes Produkt in Mikroröhrchen mit Bestandteilen, die den Reaktionspuffer bilden, dNTPs, DNA-Polymerase, Startern, Trehalose und Prionex^R.
BEISPIELE
Beispiel 1: Herstellung einer als "verwendungsfertige" Mischung formulierten lyophilisierten Zusammensetzung
In einem Mikroröhrchen [durch PCR zu 200 μL] werden 40 μL einer wässrigen Lösung abgelagert, welche aufweist:
Reaktionspuffer: Tris HCl (10 mM – pH 8,4); KCl (50 mM); MgCl₂ (1,5 mM)
Mischung aus dNTPs: jeweils 200 μM
DNA-Polymerase: 2,5 Einheiten (Hotstart Taq)
Starter (fakultativ): 1 μM
Disaccharide: 300 mM
Collagen 0,5%
Die Lyophilisierung wird gemäß dem folgenden Protokoll durchgeführt (wie in 1 dargestellt):

– schrittweises Erstarren der Zusammensetzungen auf –20°C
– Aufwärmen der Schalen auf 20°C
– Temperatur des Abscheiders auf –50°C
– Wert des Vakuums 0,05 mbar
– Stopp der Lyophilisierung, wenn die Temperatur des Produkts 20°C erreicht.

Die so lyophilisierte Zusammensetzung kann bei Umgebungstemperatur bis wenigstens drei Monate ohne Aktivitätsverlust aufbewahrt werden.
Für die Durchführung der PCR-Reaktion wird die Zusammensetzung mit 45 μl Wasser und 5 μL DNA-Matrix und gegebenenfalls den Startern zu einer Endkonzentration von 1 μM rehydratisiert.
Die PCR-Reaktion wird mit Hilfe eines Perkins-Thermozyklers durchgeführt und weist auf:
Beispiel 2: Lyophilisierte Zusammensetzung mit dNTPs
Eine lyophilisierte Zusammensetzung von dNTPs (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) wird durch Lyophilisierung eines mL eines wässrigen Lösung hergestellt, welche aufweist:

Trehalose 300 mM

Collagen 0,5%

dNTPs 2 mM jedes dNTP

Puffer Tris HCl (100 mM – pH 8,4) KCl (50 mM) MgCl₂ (15 mM)
Eine Ryhydratisierung dieser Lösung in 1 ml destilliertem Wasser ermöglicht es, eine verwendungsfertige Lösung dNTPs zu 8 mM (2 mM von jedem dNTP) zu erhalten.
Eine so rehydratisierte Lösung ist insbesondere in einem PCR-Reaktionsmedium (5 μl in einem endgültigen PCR-Reaktionsmedium von 50 μl ermöglichen es, eine geeignete Konzentration von 200 μM von jedem dNTP zu erhalten) verwendbar.
Alternativ ist es möglich, lyophilisierte Zusammensetzungen für jedes dNTP (dATP, dCTP, dGTP oder dTTP) herzustellen. Kits mit 4 Mikroröhrchen, die jeweils eins der 4 dNTPs enthalten, sind folglich erhältlich.
Die Lösungen sind gleichermaßen für die Markierung von DNA oder die Sequenzierung verwendbar.
Beispiel 3: Beispiele für "verwendungsfertige" Mischungen für die Durchführung einer PCR-Reaktion

Eine "verwendungsfertige" Mischung kann durch Lyophilisierung gemäß den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen einer Menge von 40 μL einer nachstehenden wässrigen Lösung erhalten werden: Mischung PCR

Reaktionspuffer:	Tris HCl (10 mM pH 8,4) KCl (5 mM) MgCl₂ (1,5 mM)
dNTPs	jeweils 200 μM
DNA-Polymerase	2,5 Einheiten (Hotstart Taq)
Starter	1 μM
DMSO	fakultativ, wenn ja 5%
Collagen	0,5%
Trehalose	300 mM

Beispiel 4: "Verwendungsfertige" Mischung für die Durchführung einer reversen Transkriptions-Reaktion

Die "verwendungsfertigen" Mischungen werden durch Lyophilisierung gemäß den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen einer Menge von 40 μL einer nachstehenden wässrigen Lösung erhalten:

Reaktionspuffer:	Tris HCl (10 mM) KCl (5 mM) MgCl₂ (2 mM)
Sense-Starter:	1 μM
Antisense-Starter:	1 μM
dNTPs:	jeweils 200 μM
Reverse Transkriptase:	MMLV RT Biolabs 10 Einheiten
RNase-Inhibitor(en):	10 EinheitenRNAsin
Taq-Polymerase Promega	0,02 Einheiten

Die Zusammensetzung wird mit 50 μL destilliertem Wasser, welches die mRNA und gegebenenfalls die Starter enthält, rehydratisiert. Sie ermöglicht das Erzeugen von cDNA für das Klonen und die Analyse und/oder das Messen des Expressionsniveaus eines Gens durch Detektion der entsprechenden mRNA nach quantitativer Amplifikation (quantitative RT-PCR).
Vergleichsbeispiele:
Um die Vorteile der Verwendung einer Kombination aus Disacchariden und Prionex^R zu beweisen, wurde eine Vergleichsstudie mit Mischungen für die Amplifikation eines DNA-Fragments von Bordetella pertussis durchgeführt.
A – Die folgenden Mischungen wurden getestet:

Mischung 0: Lösung, welche aufweist:

– die den Reaktionspuffer bildenden Bestandteile, Tris HCl (10 mM) KCl (5 mM) MgCl₂ (2 mM)
– dNTPs: jeweils 200 μM
– DNA-Polymerase (Hot start Taq) 2,5 Einheiten
– die Starter: Starter 1 = 5' ccaacgcgcatgcgtgcagattcgtc 3' Starter 2 = 5' ccctctgcgttttgatggtgcctatttta 3'

Mischung 1: in einem Mikroröhrchen in einer Menge zu 40 μl lyophilisiertes Produkt, das aufweist:

Mischung 2: in einem Mikroröhrchen in einer Menge zu 40 μl lyophilisiertes Produkt, das aufweist:

– die den Reaktionspuffer bildenden Bestandteile, Tris HCl (10 mM) KCl (5 mM) MgCl₂ (2 mM)
– dNTPs: jeweils 200 μM
– DNA-Polymerase (Hot start Taq) 2,5 Einheiten
– die Starter: Starter 1 = 5' ccaacgcgcatgcgtgcagattcgtc 3' Starter 2 = 5' ccctctgcgttttgatggtgcctatttta 3'
– Trehalose 300 mM

Mischung 3: in einem Mikroröhrchen in einer Menge von 40 μl lyophilisiertes Produkt, das aufweist:

– die den Reaktionspuffer bildenden Bestandteile, Tris HCl (10 mM) KCl (5 mM) MgCl₂ (2 mM)
– dNTPs: jeweils 200 μM
– DNA-Polymerase (Hot start Taq) 2,5 Einheiten
– die Starter: Starter 1 = 5' ccaacgcgcatgcgtgcagattcgtc 3' Starter 2 = 5' ccctctgcgttttgatggtgcctatttta 3'
– Prionex^R 0,5%

Mischung 4: in einem Mikroröhrchen in einer Menge von 40 μl lyophilisiertes Produkt, das aufweist:

– die den Reaktionspuffer bildenden Bestandteile, Tris HCl (10 mM) KCl (5 mM) MgCl₂ (2 mM)
– dNTPs: jeweils 200 μM
– DNA-Polymerase (Hot start Taq) 2,5 Einheiten
– die Starter: Starter 1 = 5' ccaacgcgcatgcgtgcagattcgtc 3' Starter 2 = 5' ccctctgcgttttgatggtgcctatttta 3'
– Trehalose 300 mM
– Prionex^R 0,5%

B – Die Protokolle
(i) Protokoll zum Studium der "spontanen" Rehydratisierung

1) Aufbewahren der Röhrchen mit den lyophilisierten Produkten bei Umgebungstemperatur (18°C bis 22°C) für 120 Tage;
2) Beobachten der Lyophilisate alle 2 bis 3 Tage und Notieren ihrer äußeren Erscheinungsform.

(ii) Protokoll zum Studium der Sensibilität

1) Herstellen der Bakterien-Suspensionen, um 10³, 10⁴, 10⁵ oder 10⁶ Bakterien pro ml oder 1, 10, 100 oder 1000 in 10 μl zu haben;
2) Herstellen von DNA-Proben aus den Bakterien-Suspensionen;
3) für die Amplifikation Ablagern von 90 μl frisch zubereiteter Mischung 0 in den Mikroröhrchen;
4) Wiederaufnehmen der lyophilisierten Mischungen 1, 2, 3 und 4 mit 90 μl destilliertem Wasser (oder Ähnlichem);
5) Hinzufügen von 10 μl zu amplifizierender DNA-Matrix in alle Röhrchen;
6) nach Amplifikation Analyse der Produkte durch Elektrophorese und Notieren des Vorhandenseins und der Intensität von Streifen mittels der folgenden Angaben: • Fehlen eines Streifens – • Streifen mit schwacher Intensität + • Streifen mit starker Intensität + + bis + + + +.

(iii) Protokoll zum Studium der Stabilität

1) Aufbewahren der Mischung 0 und der lyophilisierten Mischungen bei 37°C für 120 Tage;
2) Herstellen der Bakterien-Suspensionen, um 10³, 10⁴, 10⁵ oder 10⁶ Bakterien pro ml oder 1, 10, 100 oder 1000 in 10 μl zu haben;
3) Herstellen von DNA-Proben aus den Bakterien-Suspensionen
4) für die Amplifikation Ablagern von 90 μl frisch zubereiteter Mischung 1 in den Mikroröhrchen;
5) Wiederaufnehmen der lyophilisierten Mischungen 1, 2, 3 und 4 mit 90 μl destilliertem Wasser;
6) Hinzufügen von 10 μl zu amplifizierender DNA-Matrix in alle Röhrchen;
7) nach Amplifikation Analyse der Produkte durch Elektrophorese und Notieren des Vorhandenseins und der Intensität von Streifen.

C – Ergebnisse
1. Äußere Erscheinungsform und Rehydratisierung
2 zeigt die äußere Erscheinungsform der erhaltenen Produkte nach Lyophilisierung bei Fehlen des Konservierungsmittels (Mischung 1) oder bei Vorhandensein von Trehalose (Mischung 2) oder von Prionex^R (Mischung 3) oder bei Vorhandensein beider Konservierungsmittel (Mischung 4). Aus Perspektive eines zu vermarktenden Produkts wird die beste äußere Erscheinungsform (kompaktes und dichtes Lyophilisat) erhalten, wenn die Lyophilisierung bei Vorhandensein von Trehalose und Prionex^R durchgeführt wird. Eine Rehydratisierung der Lyophilisate wird bei einer Aufbewahrung bei Labortemperatur (18–22°C) in 3 bis 6 Tagen für die Lyophilisate beobachtet, die kein Konservierungsmittel enthalten (Mischung 1) oder die nur Trehalose enthalten (Mischung 2). Es wird keine Rehydratisierung für die Lyophilisate beobachtet, die einzig Prionex^R-Salz (Mischung 3) oder Trehalose und Prionex^R (Mischung 4) enthalten, nach einer Aufbewahrung für 120 Tage.
2. Sensibilität
3 zeigt, dass es die Mischung 4, welche Trehalose und Prionex^R enthält, ermöglicht, eine Sensibilität zu erhalten, die wenigstens genauso hoch ist wie jene, die mit der Mischung 0 (1 bis 10 Bakterien) erhalten wird.
3. Stabilität der Produkte
Für die nicht lyophilisierten Produkte (Mischung 0) oder bei Fehlen eines Konservierungsmittels lyophilisierten Produkte (Mischung 1) oder bei Vorhandensein von Prionex^R (Mischung 3) wird nach einer Aufbewahrung von mehr als 7 Tagen bei 37°C ein Aktivitätsverlust festgestellt (Tabelle 1).
Bei Vorhandensein von Trehalose (Mischung 2) wird nach 30 Tagen bei 37°C ein Aktivitätsverlust beobachtet. Im Gegensatz dazu behalten die bei Vorhandensein von Trehalose und Prionex^R (Mischung 4) lyophilisierten Produkte für wenigstens 120 Tage ihre Aktivität.
Tabelle 1: Stabilität der Lyophilisate nach Aufbewahrung (T0 bis T120) bei 37°C
Die oben dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Zusammensetzungen, die gleichzeitig ein Disaccharid (Trehalose) und Collagen enthalten,

(i) eine schöne dichte und kompakte äußere Erscheinungsform aufweisen;
(ii) nicht spontan rehydratisieren, und
(iii) über die Zeit eine hervorragende Stabilität aufweisen.

Das gleichzeitige Vorhandensein von Trehalose und Collagen in den "verwendungsfertigen" lyophilisierten Mischungen, die für die Amplifikation von Nukleinsäuren formuliert sind, ermöglichen eine bessere Stabilisierung und ein besseres Aussehen des Produkts, wobei eine gute Reaktionssensibilität erhalten bleibt.
Beispiel 5: Studien zur DNA-Amplifikation von Bordetella pertussis, die aus lyophilisiserten Mischungen durchgeführt wird, die für die Durchführung einer PCR-Reaktion formuliert sind und Collagen in Gegenwart unterschiedlicher ...osen (Saccharose, Glucose, Lactose, Trehalose) enthalten.
Die lyophilisierten Mischungen enthalten:

– die den Reaktionspuffer bildenden Bestandteile, Tris HCl (10 mM) KCl (5 mM) MgCl₂ (2 mM)
– dNTPs: jeweils 200 μM
– DNA-Polymerase (Hot start Taq) 2,5 Einheiten
– die Starter: Starter 1 = 5' ccaacgcgcatgcgtgcagattcgtc 3' Starter 2 = 5' ccctctgcgttttgatggtgcctatttta 3'
– Prionex^R 0,5%
– ...ose zu 300 mM Mischung 1 enthält Saccharose Mischung 2 enthält Glucose Mischung 3 enthält Lactose Mischung 4 enthält Maltose Mischung 5 enthält Trehalose

Ergebnisse der DNA-Amplifikation von Bordetella pertissis
Die erhaltenen Ergebnisse belegen die Überlegenheit von Trehalose als Konservierungsmittel gegenüber den anderen ...osen.

Claims

Verfahren zum Erhalten einer lyophilisierten Zusammensetzung, welche Nukleinsäuren enthält, dadurch gekennzeichnet, dass es die Lyophilisierung einer wässrigen Lösung von Nukleinsäuren in Gegenwart von Disacchariden und Collagen aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Disaccharid Trehalose ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung 150 bis 600 mM Disaccharide und 0,1 bis 1% Collagen aufweist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung wenigstens eine der folgenden Nukleinsäuren aufweist: – 2'Desoxyribonukleosid-5'-phosphate; – ein Oligonukleotid; – ein Polynukleotid.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung zusätzlich zu den Disacchariden und dem Collagen die folgenden Bestandteile aufweist: – eine Mischung aus 2'Desoxyribonukleosid-5'-phosphaten (dNTPs); – einen Reaktionspuffer; und – gegebenenfalls ein Oligonukleotid, Magnesiumchlorid, eine DNA-Polymerase und/oder einen Farbstoff; wobei die Bestandteile in geeigneten Mengen vorliegen für die Durchführung einer Amplifikationsreaktion von Nukleinsäuren durch PCR-(polymerase chain reaction) Reaktion nach Rehydratisierung der lyophilisierten Zusammensetzung.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Lösung eine Menge an Nukleinsäure von weniger als 3000 μM, vorzugsweise zwischen 600 und 1000 μM, enthält.
Lyophilisierte Zusammensetzung, welche Nukleinsäuren enthält, dadurch gekennzeichnet, dass sie geeignet ist, durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 erhalten zu werden.
Lyophilisierte Zusammensetzung, welche Nukleinsäuren enthält, dadurch gekennzeichnet, dass sie Disaccharide, zum Beispiel Trehalose, und Collagen aufweist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass diese 5 bis 50 mmol Disaccharide und 40 bis 400 μg Collagen aufweist.
Lyophilisierte Zusammensetzung gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass diese eine Menge an Nukleinsäure von weniger als 100 μmol, vorzugsweise zwischen 20 und 30 μmol, enthält.
Lyophilisierte Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens eine der folgenden Nukleinsäuren aufweist: – 2'Desoxyribonukleosid-5'-phosphate; – ein Oligonukleotid; und/oder – ein Polynukleotid.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich zu den Disacchariden und dem Collagen die folgenden Bestandteile aufweist: – eine Mischung aus 2'Desoxyribonukleosid-5'-phosphaten (dNTPs); – einen Puffer; und – gegebenenfalls ein Oligonukleotid, Magnesiumchlorid, eine DNA-Polymerase und/oder einen Farbstoff; wobei die Bestandteile in geeigneten Mengen vorliegen für die Durchführung einer Amplifikationsreaktion von Nukleinsäuren durch PCR-(polymerase chain reaction) Reaktion nach Rehydratisierung der lyophilisierten Zusammensetzung.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge jedes dieser Bestandteile geeignet ist für die Durchführung einer Amplifikationsreaktion von Nukleinsäuren durch PCR nach Rehydratisierung der Zusammensetzung in einer Menge Wasser von 10 bis 100 μl.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einem Mikroröhrchen enthalten ist, das in einem Thermozykler für PCR-Reaktionen verwendet werden kann.
Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren, welches Rehydratisierung einer lyophilisierten Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14 durch Hinzufügen einer wässrigen Lösung mit gegebenenfalls einem oder mehreren für die Amplifikation von Nukleinsäuren durch PCR erforderlichen Bestandteilen, und insbesondere einer DNA-Matrix, aufweist.
Verwendung einer Kombination aus Disacchariden und Collagen als Stabilisierungsmittel und/oder Kompaktierungsmittel für lyophilisierte Nukleinsäuren.
Verwendung gemäß Anspruch 16, bei welcher das Disaccharid Trehalose ist.