JP3532826B2

JP3532826B2 - ポリメラーゼ連鎖反応の特異性と簡便性の改良

Info

Publication number: JP3532826B2
Application number: JP2000115806A
Authority: JP
Inventors: ブロック，ウィル; レイモンド，ジョナサン; リード，アラン，アール．
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1990-02-16
Filing date: 2000-04-11
Publication date: 2004-05-31
Anticipated expiration: 2019-05-31
Also published as: ATE188509T1; DE69131891D1; AU653712B2; CA2075050C; JP2000316561A; US5411876A; CA2075050A1; EP0515506A1; JP3087907B2; WO1991012342A1; EP0515506B1; JPH05506143A; ES2141088T3; DK0515506T3; DE69131891T2; AU7307391A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の技術分野本発明は、ポリメラーゼチェイン反応の簡便化と特異性
の改良のための新規組成物と方法に関する。ポリメラー
ゼチェイン反応は特異的な核酸配列を増幅させる方法で
あり、遺伝学、分子生物学、細胞生物学、分析生化学、
臨床化学、および法医学の分野で広く使用されている方
法である。

【０００２】発明の背景ポリメラーゼチェイン反応(PCR) は試料中の特異的な核
酸配列の濃度を何オーダーもの単位で増加させる化学的
方法である。 PCR法は米国特許第 4,683,195号； 4,68
3,202号；および 4,965,188号に開示されており、参考
のため本明細書中に引用されている。

【０００３】PCR においては、１つまたはそれ以上の標
的核酸配列を含むと考えられる試料は、以下の試薬とと
もに総量が通常約20〜200 μｌ中に組合せられる：緩衝
液水溶液、室温でpH８〜９、通常約0.05ＭのKCl も含
む；約10^-5〜10^-3Ｍの濃度の４種類すべての共通ヌクレ
オシド３リン酸（例えばDNA ポリメラーゼについては４
つの共通のdNTP：dATP、dTTP、dCTP、およびdGTP）；マ
グネシウム化合物、通常MgCl₂、通常約１から５mMの濃
度；ポリヌクレオチドポリメラーゼ、好ましくは熱安定
性DNA ポリメラーゼ、最も好ましくはサームスアクアテ
ィクス(Thermus aquaticus) のDNA ポリメラーゼＩ（Ta
q ポリメラーゼ、これは米国特許第 4,889,818号の対象
であり、参考のため本明細書中に引用されている）、通
常10^-10から10^-8の濃度；そして１本鎖オリゴヌクレオ
チドプライマー、通常15から30ヌクレオチドの長さであ
り、通常標的核酸配列の両方の鎖の配列にワトソンクリ
ック（Watson-Crick) 相補的な塩基配列を含むデオキシ
リボヌクレオチドよりなる。各プライマーは通常10^-7か
ら10^-5Ｍの濃度で存在する。プライマーは、核酸化学の
分野で公知の固相法を用いて合成される。

【０００４】最も単純な型では、PCR は各標的配列に対
して２つのプライマーが必要である。これらのプライマ
ーは、反対の標的鎖にアニーリングされた時、３’末端
がお互いのハイブリダイゼーション部位に向いており、
100 から1,000 ヌクレオチド（たまに約10,000ヌクレオ
チドまでのこともある）により分離されている。ポリメ
ラーゼは、増殖する核酸中にヌクレオシドを取り込みピ
ロリン酸を放出しながら、プライマーの３’末端から各
プライマーのマグネシウム依存性、鋳型指向性伸張を触
媒する。

【０００５】この伸張反応はポリメラーゼが鋳型鎖の
５’末端に達するまで続き、ここで伸張したプライマー
がアニーリングされ、ここでポリメラーゼは他のプライ
マー−鋳型二本鎖に自由に結合しプライマー分子の伸張
を触媒する。酵素が鋳型の５’末端に達する前に鋳型を
伸張したプライマーから分離するのに充分な温度に反応
混合物を加熱すると、この伸張反応も停止する。

【０００６】プライマー−鋳型二本鎖の大部分を二本鎖
核酸に変換するのに充分なだけ酵素が作用した後、二本
鎖核酸は高温（普通90から 100℃）で変性させて２本の
１本鎖ポリヌクレオチドを作成し、これを冷却して新し
いプライマー分子にアニーリングさせると、次の酵素触
媒プライマー伸張反応の鋳型となる。両方のDNA 鎖が鋳
型となるため各回の核酸の複製により、２つのプライマ
ー配列によりその末端で規定される特異的核酸配列の濃
度は大体２倍になる。従ってPCR 増幅により標的核酸配
列の濃度は約２ⁿ倍増加する。ここでｎは、二本鎖DNA
が変性する高温と、プライマー−鋳型二本鎖のアニーリ
ングとプライマー伸張が起きる低温または１組の温度
（40から75℃）の間の、完全な熱サイクルの回数であ
る。

【０００７】２つの温度範囲の恒温槽の中でPCR 反応チ
ューブを手で前後に振ることは可能であるが、PCR は一
般的には「熱サイクラー（thermal cycler) 」として知
られている自動温度調節装置の中で行われる。熱サイク
ラーは、マイクロプロセッサーがプログラムされてお
り、各温度を一定時間（通常１分半から２分）維持し
て、数種類の規定温度を規定回数行ったり来たりさせ
て、反応チューブを含む熱交換ブロックまたは熱交換槽
の温度を変化させる。

【０００８】このような熱サイクラーはパーキンエルマ
ーシータスインスツルメンツ社（Perkin Elmer Cetus I
nstruments) から市販されている。１回のサイクル時間
の合計は普通10分以内であり、サイクルの合計回数は普
通40回以下であるため、１回の多サイクル増幅（標的核
酸配列を10⁵から10¹⁰倍に増幅）は普通７時間以下であ
り、大体は５時間以下である。

【０００９】PCR 核酸増幅の実用的利点は、遺伝学、分
子生物学、細胞生物学、臨床化学、法医学、分析生化
学、などの分野で急速に認識されてきており、以下の総
説や論文に記載されている：エーリッヒ（Erlich)
（編）、1989年、PCR 技術（PCR Technology) 、ストッ
クトン・プレス（Stockton Press) （ニューヨーク）；
エーリッヒ（Erlich) ら（編）、1989年、ポリメラーゼ
チェイン反応（Polymerase Chain Reaction)、コールド
スプリングハーバープレス（Cold Spring Harbor Pres
s) （コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbo
r) 、ニューヨーク）；イニス(Innis) ら、1990年、PCR
プロトコールズ（PCR Protocols)、アカデミックプレ
ス（Academic Press) （ニューヨーク）；およびホワイ
ト(White) ら、1989年、トレンド・イン・ジェネティッ
クス（Trends in Genetics) ５／６：185〜189 頁。

【００１０】PCR は、普通細菌で行われている分子クロ
ーニングと突然変異誘発操作を代替することができ、ス
ピードが早く、簡便であり、低コストであり、時には安
全性も高いという利点がある。さらに、PCR により核酸
配列の高感度の定性的さらには定量的分析も可能であ
り、またPCR 生成物は非放射性検出で充分なものが多く
安全性も高いことが多い。生化学および化学の分野で急
速かつ広範囲にPCR が採用されているが、PCR の分析上
かつ合成上の可能性を充分実現するためにはまだ解決す
べき実用上の問題点がいくつかある。そのいくつかを以
下に記載する。

【００１１】多くの場合増幅により、使用するプライマ
ーの標的配列とはサイズと配列が異なる副生成物が生じ
る。ある場合にはこの非特異性はミスプライミング（mi
spriming) （試料中に存在する標的配列の類似の非標的
配列にプライマーがアニーリングされる）により引き起
こされる。PCR 試料中に通常含まれるゲノムDNA は普通
二本鎖であると考えられているが、増幅のためのDNA を
調製するのに使用する方法はDNA を大部分１本鎖にす
る。１本鎖DNA は、周囲温度または周囲温度近辺で、完
全なPCR 試薬セットと混合されると特にミスプライミン
グを受け易い。

【００１２】また多くのPCR 反応により、いくつかのプ
ライマー分子が末端で結合したプライマーダイマーまた
はオリゴマー、二本鎖副生成物が生じ、これらの収率は
標的配列の収率に反比例する。「低コピー数」PCR （最
初の標的配列の総数が1,000以下））は、特にプライマ
ーダイマー化やミスプライミングの影響を受けやすく、
このため特異的生成物の収率、収率の正確さ、および増
幅の特異性が低下する。

【００１３】PCR はその高増幅率と高特異性のために特
に逆コンタミナーションを受けやすく、１つの反応から
増幅された標的がたまたま同じプライマーを用いる次の
反応に移され、後の反応で偽陽性の結果を与える。PCR
の臨床診断への応用については、特に総増幅時間は数時
間でなく30から60分で有用であろう。試薬を大量に混合
して、小さい反応チューブ（普通 0.5mlで、20から 200
μｌ含有する）に分注し、調製と使用の間に増幅収率に
低下がなく長期間保存できれば、PCR のコスト、スピー
ドの増加および正確性は向上するであろう。

【００１４】これまで標準的PCR 技術では、数時間の加
熱の間の溶媒の蒸発を防ぐため、反応混合水溶液を50か
ら 100μｌの鉱物油で覆うことが必要であった。しかし
鉱物油重層法はいくつかの実用上の問題がある：（ａ）
PCR 後の分析のために取った反応混合物試料が鉱物油汚
染を受け、PCR 後の処理での妨害を避けるためしばしば
水と混ざらない有害な有機溶媒による抽出が必要であ
る。（ｂ）（油層の熱容量が大きいため）熱サイクリン
グ中の熱平衡が遅れ、総サイクル時間が長くなる。そし
て（ｃ）PCR を阻害すると考えられる不純物が、ある反
応の鉱物油から時々混ざることがあるため、鉱物油の厳
しい精度管理が必要である。

【００１５】本発明は、PCR 法とその材料の、いくつか
の驚くほど簡単な改良により上記のPCR の問題点を大幅
に改善している。周囲温度でもまたは周囲温度近辺で
も、また熱サイクリングがない場合も標的DNA がない場
合も、PCR 試薬のすべてを混合した時は、いつもプライ
マーダイマーやオリゴマーの形成が起きるため、最初の
増幅サイクルの前にすべての試薬が混ざらないように少
なくとも１つの試薬を他の試薬から分離しておけば、プ
ライマーのオリゴマー化が減少し、これにより不完全な
試薬混合物の寿命が大幅に伸び最終反応の構成が複雑に
なることはない。特に分離された試薬と試料が最小の撹
拌でPCR 反応チューブに導入されるなら、こうした分離
により、熱サイクリングの開始の前にPCR 試薬と試料が
周囲温度または周囲温度近辺で混合され保存されるよう
な、不十分な調整の間に起きるミスプライミングを最小
限に抑えることができる。

【００１６】マグネシウムのいくつかの化学的性質は、
PCR 増幅を計画する場合に、マグネシウムを他のPCR 試
薬から分離することに対して（酵素、プライマー、また
はdNTPを分離することよりも）、特別な利点を与える。
マグネシウムの脂肪酸塩は油、グリース、または蝋に溶
解可能であり、PCR の間有機層が高温の水性試薬と接触
している場合水で抽出できる可能性もある。添加すべき
試薬水溶液を別々に調製するよりも、マグネシウムを有
機層に導入することにより、試薬の分離と反応チューブ
の調製が簡略化される。マグネシウムは無機試薬である
ため、その調製と保存に微生物汚染に対して特別な注意
を払う必要はない（微生物汚染はヌクレオシド３リン
酸、酵素、またはプライマーを含有する混合物にとって
は問題である）。

【００１７】ヌクレオシド３リン酸とプライマーを分解
するホスファターゼとホスホジエステラーゼは、しばし
ばマグネシウムを必要とし、マグネシウムなしで（また
は少量存在するマグネシウムにも結合する微量のキレー
ト化合物の存在下で）生物試薬を保存すれば寿命が伸
び、酵素や酵素を分泌する微生物による汚染に対して抵
抗性が向上する。カリウムイオンもまた細胞の増殖に必
要であるから、マグネシウム化合物とともにすべてのカ
リウム塩を、蛋白や核酸から分離することにより、試薬
の微生物による消費に対する抵抗性が改良される。

【００１８】グリースまたは蝋の室温またはそれより低
い温度での溶解度は、グリースまたは蝋の上と下に分離
されている水性試薬の混合に対してバリアーを形成する
ため、本発明は、重層鉱物油をグリースまたは蝋の層で
代替する手段を与えることにより、特に有効な試薬の分
離法を与える。熱サイクリングは固体のバリアーを水よ
り軽い低粘度の液体に変化させ、これは上の水性の層に
置換される。上の水性の層は下の水性の層には存在しな
いすべてのPCR 試薬を含有している。

【００１９】従って反応チューブの加熱にともなうかな
りの熱対流のため、これまで分離されていた試薬が混合
して完全な反応を始める。溶解したグリースまたは蝋は
蒸気バリアーを形成し、熱サイクリング中の溶媒の蒸発
を最小限に抑え、増幅後冷却されると、再び固体バリア
ーを形成し、これが特に、反応チューブが開かれた時PC
R 生成物が環境中に分散するのを低下させ、従って後の
反応の逆汚染の可能性を減少させる。

【００２０】逆汚染を防ぐための光滅菌が開発されてお
り、ソラレン（psoralen) とイソソラレン(isopsorale
n) を照射して、PCR 後の分析は可能であるが、その生
成物の以後の増幅の鋳型として、使用されるのを防ぐよ
うに、PCR 生成物を光滅菌する。しかし、普通増幅前に
加えられるソラレンとイソソラレンは、PCR を時々阻害
するようである。さらに、PCR に必要なマグネシウムイ
オンは、２本鎖核酸に対する光試薬の親和性を低下させ
る可能性があり（ハイデとハースト（Hyde and Hears
t)、1978年、バイオケミストリー（Biochemistrt) 17
巻：1251〜1257頁）、光反応性物質の効率を低下させ
る、すなわち実用的な光滅菌に必要な光反応性物質の濃
度を大きく上昇させる。

【００２１】本発明で与えられるように、鉱物油をグリ
ースまたは蝋で代替することは、光滅菌の実用的な変更
となり、新しい標的核酸の増幅にを試薬が妨害するのを
防止し、光反応性効率を増加させる。光反応性物質の存
在しない場合の増幅の後、およびグリースまたは蝋の再
固化の後は、PCR 生成物で環境を汚染する心配をしない
で反応チューブを開けることができる。光反応性物質や
マグネシウムに結合するキレート試薬の水溶液は、グリ
ースまたは蝋の上にのせる。試験管に栓をして簡単に短
時間加熱してグリースまたは蝋を溶かすことにより、光
反応性物質やキレート試薬とPCR 生成物とが混合され
る。マグネシウムイオンがキレート化すると光反応性物
質が核酸に強固に結合するため、この混合物は最適な光
滅菌の準備が整ったことになる。

【００２２】PCR 増幅の後一般的には、分析信号発生
物、またはPCR 反応混合物の他の成分から、増幅された
核酸の分離を促進する試薬を有する試薬に、増幅された
核酸を反応させて増幅された核酸が検出する。このよう
な試薬は標的配列（核酸プローブ）の一部に相補的な配
列を有するオリゴヌクレオチドを含むか、またはフルオ
レセインやビオチン（PCR 生成物中に取り込まれるプラ
イマーやヌクレオシド３リン酸に都合よく結合する）な
どの分子に結合するため、増幅された核酸に強固に結合
するように設計されている。

【００２３】検出試薬中に含まれる信号発生物質には、
放射性同位元素、蛍光発色団、化学発光分子、電気化学
発光触媒、および触媒一般（例えば酵素）などがある。
分離促進物質としては、抗体、アビジン、ストレプトア
ビジン、ビオチン、高親和性ハプテン（例えばフルオレ
セイン）、磁性粒子、水より重い物質、凝集が可能な格
子様物質、１本鎖または２本鎖または特異的核酸配列に
結合可能な吸着物質などがある。

【００２４】このような検出試薬は、多くの蛋白のよう
にPCR における長時間の加熱により不活性化されるか、
または多くの分離促進試薬のように、溶液から試薬を除
去してPCR を阻害する可能性があるため、このような検
出試薬はPCR 増幅と融和性がないことが多い。従って増
幅反応が完全にまたはほとんど終了してから、PCR 生成
物検出試薬を加えることが一般に有効である。本発明に
おいては、PCR 生成物はグリースまたは蝋の層の下に密
封することができるため、光滅菌のように、研究室を増
幅された核酸で汚染する可能性を最小にしてPCR 試薬チ
ューブにあとで試薬を加えることが可能である。

【００２５】PCR 試薬への後期添加(late addition) が
好ましいもう１つの状況は、「ネストプライマー」
（“nested primers”）の場合である。ここでは最初の
増幅の後に、元々のプライマーまたはプライマー相補的
領域には存在しないが元々のプライマーの伸張により増
幅される配列に対して相補的なプライマーを用いて増幅
することにより、PCR の特異性が上昇する。本発明は、
研究室の環境を増幅された核酸で汚染する心配をほとん
どせずに、ネストプライマー系の後期添加を可能にす
る。添加の後に、検出に充分な量の短いPCR 生成物を産
生させるには、１回かまたは数回の増幅サイクルが必要
なだけである。

【００２６】PCR 増幅への物質の後期添加がPCR 感度、
特異性、簡便性、または生成物分析に有効であるさらに
多くの状態が存在する。いずれにしても、本発明は
（ａ）増幅された核酸を一次的に隔離する条件で；およ
び／または（ｂ）高温で、添加をすることにより、従来
技術を改良している。

【００２７】発明の要約本発明の第１の面は、PCR 増幅の特異性を増加させ、あ
らかじめ混合されたPCR 試薬の寿命を延ばす方法であ
り、ここでPCR 試薬（標準DNA を含む試料は除く）は、
長期間（数カ月）反応または劣化することなく保存でき
る。少なくとも２つの非重複性サブセットとして調製さ
れており、これらが熱サイクリングの少し前（30分以
内）に最小の混合でPCR 反応チューブ中で一緒にされ
る。

【００２８】以下に詳述されるように、この分離は、
（１）１つ（またはそれ以上）以外のすべての基本的PC
R 成分を１つの容器に入れ、その他の基本的成分を別の
容器に入れること、（２）すべての基本的PCR 試薬を１
つの容器に入れるが１つまたはそれ以上の基本的試薬を
他の基本的試薬から隔離することによりなされる。この
後者の隔離をするには、試薬混合物間に単に蝋の層のよ
うなバリアーを置くか、または１つまたはそれ以上の基
本的試薬をマトリックスまたはゲル（例えばアガロース
またはアクリルアミドゲル、またはリポソーム）中に埋
め込む。

【００２９】好適な実施態様において、マグネシウム化
合物以外のすべての試薬は増幅前に混合され、最初の増
幅サイクルが始まるまではマグネシウム化合物と残りの
試薬との混合は最小になるように、完全な反応混合物は
調製される。具体的には、この実施態様では、反応チュ
ーブ中でマグネシウム化合物の溶液または懸濁液、マグ
ネシウムを含まない試薬、および試料を、好ましくは試
料すなわち溶媒層が２つの試薬調製物の間に位置するよ
うに重層する。カリウム塩を含める場合は好ましくは、
他の試薬とではなく、マグネシウム化合物と一緒にPCR
反応混合物中に加えられる。

【００３０】第２の面において、本発明は、各サブセッ
トが水性懸濁液または溶液として調製されて、増幅前に
２つのサブセットの間にグリースまたは蝋の層がくるよ
うにすることにより、PCR 試薬のサブセットの相補的サ
ブセットからの分離を簡便化する組成物と方法よりな
る。最初の増幅サイクル中にグリースまたは蝋は、低粘
度水より軽い液体中にとけ込み、そこで溶融したグリー
スまたは蝋とその上の水層の相互排除が起き、一緒にな
った水性試薬の対流混合により増幅が可能となる。

【００３１】第３の面において、本発明は、別のサブセ
ットの水性懸濁液または溶液の上に重層される水より軽
い油、グリースまたは蝋に１つのサブセットが取り込ま
れることによる、PCR 試薬のサブセットの相補的サブセ
ットからの分離を簡便化する組成物と方法よりなる。最
初の増幅サイクルの間の加熱によりグリースまたは蝋が
溶けて液体となり、水層の加熱により、水より軽い上層
から欠けていた試薬サブセットが水層へ抽出され、一緒
になった試薬の対流混合により増幅が可能となる。

【００３２】本発明のこの面の１つの具体的な実施態様
は、油、グリースまたは蝋中のPCR試薬のサブセットの
水溶液または懸濁液のエマルジョンである。別の実施態
様は、油、グリースまたは蝋中のPCR 試薬のサブセット
の溶液である。具体的には、油グリースまたは蝋への溶
解のために調製される好ましいPCR 試薬は、マグネシウ
ム脂肪酸塩、およびヌクレオシド３リン酸やプライマー
のトリアルキルアンモニウム塩である。

【００３３】第４の面において、本発明は、グリースま
たは蝋の物理学的性質を変化させることによる、本発明
の第２の面の機能を改良する組成物よりなる。具体的な
実施態様は：（１）グリースまたは蝋中の界面活性剤の
溶液；（２）グリースまたは蝋の下の水層中の界面活性
剤の溶液；（３）その内表面が親水性である増幅容器；
（４）グリースまたは蝋中のプラスチック粒子の懸濁
物；そして（５）グリースまたは蝋中に懸濁されたプラ
スチックメッシュの層よりなる。親水性表面を有する好
適な増幅容器は、（ａ）界面活性剤でコーティングされ
ている、（ｂ）酸化性環境下でプラズマエッチングされ
ている、（ｃ）強酸化性液体で処理されている、または
（ｄ）界面活性剤が加えられた樹脂溶融物から鋳造され
ているものである。

【００３４】第５の面において、本発明は、容器とその
容器の水性内容物の漏出した表面を完全に覆うことがで
きる充分な量の蝋（ここで容器の内表面は親水性である
かまたは、蝋は非イオン性界面活性剤と混合物されてい
る）よりなる、水性化学反応を行うための容器よりな
る。第６の面において、本発明は、核酸のPCR 増幅のた
めにキットよりなる。これらのキットは本発明のPCR 組
成物の新規調製物よりなり、また本発明の組成物を用い
てPCR を行うための説明書も含む。

【００３５】発明の具体的な説明本発明の最初の４つの面は、最初の増幅サイクルまでは
核酸ポリメラーゼの他の試薬との触媒反応を防止するこ
とにより、PCR 増幅の特異性を改良する。特に、核酸鋳
型の存在しないところで室温またはそれ以下の温度でも
起きる、プライマーオリゴマーとして知られているPCR
副生成物の生成が大幅に減少する。また試料が１本鎖DN
A を含む時に起きる、非特異的標的のミスプライミング
による増幅も好ましくない。副生成物が抑制される時、
標的PCR 生成物の増幅はしばしば増加し、より再現性が
ある。

【００３６】本発明による反応特異性の上昇により、し
ばしば実質的に純粋な増幅された標的配列が得られ、PC
R 生成物の分析と定量が非常に簡便になる。例えば核酸
プロービングのような遅くて面倒で比較的非定量的な検
出法に頼ることなく、PCR 生成物を電気泳動またはクロ
マトグラフィー泳動速度により、自信を持って固定する
ことができる。特に現在は、PCR 生成物の早くて高度に
自動化されたHPLC分析が実用的である。

【００３７】本発明の最初の４つの面は、寿命が１週間
またはそれ以上の、調製済みPCR 試薬のバルク製造業者
の作業を簡単にする。すべての試薬をあらかじめ混合す
ると、鋳型DNA が非存在下で室温またはそれ以下の温度
で起きる、プライマーオリゴマー調製のような副反応に
より、寿命が数日以下になる。最初の増幅サイクルまで
少なくとも１つの試薬が他の試薬から分離されれば、こ
の副反応は起きない。調製済み試薬のバルク調製は、ユ
ーザーを使用時に試薬を注意深く混合する必要から解放
し、PCR のスピード、簡便性および信頼性が向上する。
使用時の調製は、しばしば少量の混合と一度に数回分の
反応混合の調製となるため、増幅の日内および日間誤差
が大きくなる。

【００３８】本発明の第１の面のマグネシウム分離（好
ましくはカリウム分離を含む）は、いくつかの理由で他
の試薬（例えば酵素、プライマー、またはヌクレオシド
３リン酸）の分離よりも改良されている。唯一の非生物
学的、生物分解不可能なPCR試薬として、マグネシウム
化合物は調製や保存の条件（例えば無菌性）が厳しくな
い。好ましくはその他の試薬は、その生物分解性や化学
的不安定性に応じた方法で、一緒に調製し保存される。
生物分解性PCR 試薬からマグネシウムやカリウムのよう
な生物の基本的栄養素を排除することは、それらの保存
中の生物分解に対する抵抗性を改良する。

【００３９】ヌクレオシド３リン酸や１本鎖核酸（例え
ばプライマー）をマグネシウムなしで保存すると、これ
らを分解する酵素の多く（これらはしばしば試薬中や表
面に微量の汚染物質として存在する）はその活性にマグ
ネシウムを要求するため、寿命が延びることが一般に観
察されている。核酸ポリメラーゼのマグネシウム活性化
の濃度依存性は、他のPCR 試薬の混合物中に低レベルの
マグネシウムが漏れても副反応は無視できる程である
が、副反応のヌクレオシド３リン酸、プライマー、およ
び酵素濃度への依存性は試薬濃度にほぼ比例する。

【００４０】油と異なり蝋は増幅の後にPCR 生成物を取
るのに使用されるピペットにまといつかず、PCR 後の検
出反応を汚染しないため、本発明の第２の面の蝋の実施
態様は、PCR 中の溶媒の蒸発を最小限に抑えるのに現在
使用されている鉱物油を大きく改良している。PCR の現
在の技術では、鉱物油はしばしば毒性または有害な有機
溶媒による時間のかかる抽出により除去されている。

【００４１】鉱物油を蝋で置換することは蒸気バリアー
としての機能や副反応を最小限に抑える手段としての機
能の他に以下の利点がある；増幅後に反応混合物上に形
成される固相のシールは、PCR 生成物による作業環境の
汚染の可能性を減少させ、従ってその後の反応を逆汚染
する可能性を減少させる。製造中またはユーザーにより
急速かつ正確に反応チューブ中に分注されている蝋ペレ
ットの、現在高度に自動化された正確な大量製造は、PC
R の簡便性と信頼性を増加させる。

【００４２】本発明の第２または第３の面は、完全な反
応混合物を準備するのに手先の器用さや注意深さを必要
としないため、第１の面の単に重層する実施態様を改良
したものである。これはまた完全な調製試薬の寿命を大
幅に延長し、これらの調製物はバルクで調製し保存する
ことができる。すべてのPCR 試薬を一緒にして活性混合
物とするのに最初の増幅サイクルの加熱が必要な場合
は、すべての試薬を含み試料の添加と加熱のみが必要な
即使用可能な反応チューブを製造することができる。

【００４３】本発明の第４の面の組成物は、いくつかの
点で蝋の機能を改良している。蝋またはグリースまたは
下の水層の界面活性剤は水−蝋メニスカスの深さを減少
させ、従って水層を完全に覆うのに必要な蝋またはグリ
ースの量を減少させる。親水性組成物または反応チュー
ブの内表面のコーティングおよび蝋またはグリースに界
面活性剤を含有させることは、蝋−空気メニスカスの深
さを減少させ、従って蝋またはグリースの最小必要量を
低下させる。蝋またはグリース中のプラスチックメッシ
ュは、両メニスカスの深さを減少させ、従って蝋または
グリースの最小必要量を低下させる。

【００４４】このメッシュはまた、増幅後のPCR 生成物
を取るのに使用するマイクロピペットが蝋またはグリー
スで詰まる可能性を減少させ、蝋またはグリース層が貫
通された時PCR 生成物の噴出するのを防止しやすい。蝋
またはグリース中に懸濁されたプラスチック粒子も上層
の量を減少させ、その大きな利点は蝋またはグリースを
もろくさせ、これもまたピペットの先が詰まることやPC
R 生成物の噴出を減少させる。

【００４５】PCR 増幅が起きる水層上の油、グリースま
たは蝋層の量を最小にすることはいくつかの利点があ
る。熱サイクラー中で増幅チューブが標的温度に達する
速度は、チューブと内容物の総量に逆比例する。本発明
がない場合、疎水性上層の量はしばしば水層の量に近
い。多くのPCR 応用（特に臨床診断）においては、最高
のサイクリング速度が好ましく、これは上層の量を少な
くすることで促進される。蝋の層が厚い場合、PCR 生成
物を取るためのピペットの先が貫通しにくく、チップの
先にきついシールが形成され、増幅チューブからPCR 生
成物が噴出する可能性が増加する。層が厚いとピペット
のチップがグリースまたは蝋で詰まる可能性が上昇す
る。

【００４６】PCR 生成物の噴出は、研究室の環境や装
置、試薬をPCR 生成物で汚染するエアロゾルを含有する
生成物を発生させるため、PCR 生成物の噴出を避ける蝋
またはグリース層のピペット貫通のしやすさは極めて好
ましい。PCR 反応は極めて感度が高いため、微量の汚染
でも後の増幅で偽陽性の結果を与える。

【００４７】さらに本発明の別の大きな利点は、PCR の
任意の変更を可能にすることであり、PCR 法の性質を変
化させ、増幅された核酸の検出を促進し、または以後の
増幅の逆汚染を防止するために、試薬を増幅の後期また
は終了時に加えることができる。このような修飾には以
下のものが含まれる：PCR 生成物切断、非対象PCR 、ネ
ストプライミング、マルチプレックスPCR 、PCR 生成物
光滅菌、PCR 生成物標識、およびPCR 生成物の分析。

【００４８】このような試薬には以下のものが含まれ
る：修飾されたプライマー、内部プライマー、新しい標
的をめざしたプライマー、金属イオン、キレート物質、
新しい酵素、追加の核酸ポリメラーゼ、修飾または異常
ヌクレオシド３リン酸、光試薬、増幅された核酸に特異
的に結合する媒体、核酸プローブ、増幅または１本鎖核
酸を捕捉、沈降または凝集させる媒体、増幅された核酸
の存在を知らせる分析信号の発生を助ける媒体。いずれ
の場合も、本発明はこのような後期の添加を可能にし、
PCR 反応チューブを開くことにより増幅された核酸が研
究室の環境中に導入される心配を減少させる。

【００４９】本発明の理解を促進するために、以下の用
語が定義される。「マグネシウム化合物」とは、その物
質に接触して約50℃と 100℃の間の温度で約 0.5から５
分間加熱された場合、２価のマグネシウム（Mg⁺²）がpH
６〜９の水性溶媒中に放出されるような型のマグネシウ
ムを含む化合物を意味する。

【００５０】「PCR 反応チューブ」とは、PCR 増幅の間
中PCR 試薬や試料を保持するための任意の容器を意味す
る。ある場合には、この用語は容器の内容物を含む。PC
R 増幅中PCR 試薬と試料を保持するのに適した容器の決
定的特徴は、容器がPCR を阻害しない物質でできてお
り、約20℃と約 100℃の温度範囲に耐えて容器のサイズ
と形を実質的に保持し、任意の液体内容物とともに、約
４分を越えない時間内に50〜100 ℃の範囲内で40℃の温
度変化を完了することができることである。

【００５１】好ましくはこの容器はきつく締まるフタが
ついており、容器から水蒸気や液体が漏れることを防
ぎ、研究室の環境からの核酸を含有する可能性のあるエ
アロゾルやほこりで反応が汚染されることを防ぐ。PCR
反応チューブは通常ポリプロピレンでできており、20〜
200 μｌの反応混合物を含有するのに適したサイズであ
り、きつく締まるキャップがついている。PCR 反応チュ
ーブは、多くの市販の熱サイクラー中で反応温度をコン
トロールするのに使用される金属熱ブロック中に加工さ
れた孔にきちんと入る形をしている。PCR 反応チューブ
は通常 500〜600μｌの容量のマイクロ遠心分離管の形
をしており、下半分は円錐形であり、上の半分は円筒形
である。

【００５２】「熱サイクラー」とは、プライマーアニー
リング、プライマー伸張、および生成物変性に必要な範
囲内のPCR 反応温度を調節するための自動装置を意味す
る。この範囲は通常約40℃から約 100℃である。サイク
ラーは反応温度を繰り返し変化させ、各温度で約 0.2か
ら10分間かけ、１つの温度から次の温度に移るのに数分
間必要とする。一般に熱サイクラー温度はプログラム可
能なマイクロプロセッサーの制御下にあり、ユーザーは
あらかじめサイクル数、各サイクルでの異なるインキュ
ベート温度の数、各温度、各温度でのインキュベート時
間、および温度間の移動時間を指定することができる。
熱サイクラーは循環サーモスタット空気、循環サーモス
タット液体、サーモスタット金属ブロック、または赤外
線またはマイクロ波源にチューブを接触させることによ
り、PCR 反応チューブの中および外に熱を移すことがで
きる。

【００５３】「プラスチック」とは、炭素および水素、
酸素、窒素、フッ素、またはまれに他の元素（例えばイ
オウ）のある組合せよりなるポリマーであり、このポリ
マーはある形（例えばペレット、糸、板、棒、メッシ
ュ、ビーズ、またはチューブ）に加工され、水不溶性で
あり実質的に水非透過性である。本発明の目的において
有用なプラスチックはポリエチレン、ポリプロピレン、
ポリメチルペンテン、ポリエステル、ナイロン、フルオ
ロカーボン、フッ化炭化水素、ポリメチルメタクリレー
ト、およびポリスチレンなどがある。

【００５４】「プラズマエッチング」および「コロナ放
電」とは、閉じた容器中で大気圧よりすこし低い気圧で
表面（特にプラスチック表面）を、気体の電気的励起に
より産生される電子および原子イオンまたは分子イオン
の高度に腐食性の雰囲気中にさらすことにより、その表
面を改質する方法である。雰囲気中に存在する気体に依
存して、表面の異なる化学的改質が得られる。本発明の
目的において、雰囲気には酸素または水蒸気を含み、さ
らされたプラスチックは実質的に酸化され、親水性が増
加する。

【００５５】「液体取扱装置」とは、約１〜100 μｌの
範囲の液量を迅速かつ正確に分注することができる自動
化装置を意味し、液体容器、ポンプ、分注チップまたは
ノズル、ヒーター、分注チップを３次元に位置させるこ
とができる可動性ヘッドまたは可動台、および時間、容
量、温度および分注位置の調節器の組合せからなる。
「油」とは、水不溶性有機物質であり、約40℃以下で液
体であり、水より密度が小さい。「鉱物油」は、また液
体ペトロラータムまたはパラフィン油としても知られて
おり、無色で光学的に透明であり、密度が0.84ｇ／ml近
くの高分子量炭化水素の混合物であり、広く市販されて
おり、PCR 反応上の蒸気バリアーとして使用される。

【００５６】「グリース」とは有機物質であり、固体ま
たは半固体であるが約40℃以下の温度で非常にやわらか
く、40〜80℃の範囲で溶けて液体となり水より密度は小
さい。典型的なグリースは白色ペトロラータム（例えば
ワセリン石油ゼリー）であり、これは高分子量炭化水
素の混合物である。「蝋」は有機物質であり、固体であ
るが約40℃以下の温度でグリースよりはるかに硬く、少
し高い温度で溶けて水より密度の小さい液体となる。蝋
はグリースや油よりも固体（例えばプラスチック）表面
への付着は少ない。

【００５７】有用な蝋としての典型的で純粋な化合物は
エイコサン（Ｃ₂₀Ｈ₄₂）、オクタコサン（Ｃ₂₈Ｇ₅₈）、
セチルパルミテート（Ｃ₃₂Ｈ₆₄Ｏ₂）、およびペンタエ
リスリトールテトラベヘネート（Ｃ₉₃Ｈ₁₈₀Ｏ₈）があ
る。典型的な有用な蝋混合物としては、パラプラスト
（Paraplast)（シャーウッドメディカル（Sherwood Med
ical) の商標名）、ウルトラフレックス（Ultraflex)
（ペトロライトコーポレーション(Petrolite Corporati
on) の商標名）、およびベスクエア（BeSquare）（ペト
ロライトコーポレーション(Petrolite Corporation) の
商標名）がある。蝋は、純粋または混合蝋をお互いに、
またはグリースまたは油と、蝋に特異的なある程度の硬
さと低い粘性を保持する任意の比率で混合することによ
り調製される。

【００５８】「PCR 試薬」とは、PCR 増幅に必要な以下
の任意の物質を意味する：ヌクレオシド３リン酸（少な
くとも４つが必要である；例えばDNA ポリメラーゼを使
用する場合はdATP、dTTP、dCTP、およびdGTP）、オリゴ
ヌクレオチドプライマー（普通少なくとも２つが必要、
増幅すべき標的配列の２つの末端に相補的な配列で規定
される）、マグネシウム化合物（普通MgCl₂）、および
DNA ポリメラーゼ（普通サーマスアクアティカス（Term
us aquaticus) [Taq] ポリメラーゼＩ）。PCR試薬はヌ
クレオシド３リン酸類似物（例えばdITPおよび７−デア
ザ−dGTP）を含む。

【００５９】「試料」とは、PCR 試薬中に含まれるプラ
イマーの標的となる核酸を含む液体調製物（溶液または
懸濁液）であり、ここで核酸はPCR 増幅に適した化学的
および物理的状態にある。「サブセット」とは、上記の
試薬の組合せから少なくとも１つが欠け、従ってPCR 増
幅をすることができない。PCR 試薬の「相補的サブセッ
ト」：とは、組合せた時上記リストが完全になり、標的
核酸配列の存在下でPCR 増幅をすることができるサブセ
ットである。相補的試薬サブセットはお互いに「相補
的」である。

【００６０】PCR の「活性」とは、PCR 試薬のサブセッ
トがPCR 反応チューブ中で緩衝液、相補的試薬サブセッ
ト、およびその標的を含む試料と組合されて、サイクリ
ングの直前にすべてのPCR 試薬、緩衝液、および試料が
混合された時増幅することが知られている条件下で熱サ
イクリングをされた場合、特異的標的の増幅をするPCR
試薬サブセットの能力である。「完全な活性」とは、特
定の増幅条件下で特異的PCR 生成物の量がこれまでの最
大量にほぼ等しいことを意味する。

【００６１】PCR 増幅の「特異性」とは、プライマー
と、プライマーが塩基相補的にアニーリングするように
設計されている核酸のゲノムまたは転写領域の配列から
予想されるサイズと配列を有する、単一の「特異的」PC
R 生成物の産生を意味する。「非特異的」PCR 生成物
は、このような予想とは異なるサイズと配列を有する。
PCR 「標的」は、PCR 試薬の完全なセットに含まれる一
対のプライマーに対してその末端は（正しい配向で）塩
基相補的な、核酸のゲノムまたは転写領域である。「正
しい配向」とは、２つのプライマーがその３’末端がお
互いの方向を向いている２本鎖標的の反対の鎖に対して
アニーリングし、普通介在する領域は約50〜10,000ヌク
レオチドの範囲である。このようなプライマーは、その
末端に塩基相補的なゲノムまたは転写配列を「標的」す
ると言われている。

【００６２】PCR 試薬または試料または溶媒の「重層」
とは、異なる試薬サブセットまたは試料または溶媒をPC
R 反応チューブ中に、それらの間に非透過性のバリアー
（例えば蝋またはグリース）を介在させずに混合を最小
限にするように液体を分注する操作を意味する。「蒸気
バリアー」とは、熱サイクリング中の水性画分からの水
の蒸発を実質的に低下させるために、漏出した水性画分
の充分に大きな割合を覆う、PCR 反応の水性画分の上の
油、グリースまたは蝋の層を意味する。約20〜200 μｌ
の水性画分について、30サイクルのPCR 増幅が蒸気バリ
アーのレベルの上のPCR 反応チューブの壁とキャップに
約２mg以下の水を留出するのみであるなら、蒸気バリア
ー被覆は「完全」である。

【００６３】「液体バリアー」とは、少なくとも約40℃
までの温度および約90℃以下の温度で、少なくとも約15
分間その層の両側で水性の画分の混合を阻止するのに充
分な、グリースまたは蝋の層を意味する。この15分間の
基準が達成されれば液体バリアーの被覆は「完全」であ
る。PCR の「熱サイクリング」とは、２本鎖DNA の変性
と１本鎖DNA へのプライマーアニーリングそしてプライ
マーの伸張が交互に行われるようにする、40〜100℃の
間のおよその温度範囲内でPCR 反応混合物の温度を全体
的かつ繰り返し変化させる操作を意味する。

【００６４】「界面活性剤」とは、水または水溶液と疎
水性固体または液体（例えばポリオレフィンプラスチッ
ク、油、グリースまたは蝋）の間の界面の張力を低下さ
せる物質である。界面活性剤は親水性部分と疎水性部分
が共有結合した構造をしている。「非イオン性界面活性
剤」は陽性荷電部分も陰性荷電部分も有さない。

【００６５】典型的な非イオン性界面活性剤には以下の
ファミリーの構造類似物がある；「スパン」（アトラス
ケミカルインダストリーズ（Atlas Chemical Industrie
s)の商標：ソルビタンの脂肪酸モノ−、ジ−、またはト
リエステル）；「ツイーン」（アトラスケミカルインダ
ストリーズ（Atlas Chemical Industries)の商標：ソル
ビタン脂肪酸エステルのポリオキシエチレンエーテ
ル）；「ブリジ」（“Brij”）（Atlas Chemical Indus
tries)の商標：脂肪アルコールのポリオキシエチレンエ
ーテル）；「ミルジ」（“Myrj”）（Atlas Chemical I
ndustries)の商標：脂肪酸のポリオキシエチレンエステ
ル）；および「トリトン」（ロームアンドハース（Rohm
and Haas Company)の商標：アルキルアリールポリオキ
シエチルエーテル）。本発明に好適な特異的非イオン性
界面活性剤には、ツイーン85（ポリオキシエチルソルビ
タントリオレート）とツイーン65（ポリオキシエチルソ
ルビタントリステアレート）がある。これら２つの市販
されている界面活性剤は、「ポリオキシエチルソルビタ
ントリアシレート」として知られている構造クラスの例
であり、種々の長さのポリオキシエチル鎖と種々のサイ
ズと構造の脂肪酸がソルビタン部分に共有結合してい
る。

【００６６】本発明の目的のための、「親水性」表面
は、水がチューブを部分的に満たすときチューブの内壁
で凹面状のメニスカスを示すものである。「マグネシウ
ム脂肪酸アシレート塩」とは、モル比１：２のMg⁺²との
脂肪酸の共役塩基よりなる組成物を含む。代表的脂肪酸
は酪酸（Ｃ₄Ｈ₈Ｏ₂）、カプロン酸（Ｃ₆Ｈ
₁₂Ｏ₂）、カプリル酸（Ｃ₈Ｈ₁₆Ｏ₂）、カプリン酸
（Ｃ₁₀Ｈ₂₀Ｏ ₂）、ラウリン酸（Ｃ₁₂Ｈ₂₄Ｏ₂）があ
る。

【００６７】PCR プライマー配列の選択、DNA 含有試
料、PCR 試薬、およびPCR 試薬混合物の調製、PCR 熱サ
イクルの設計と実施、そしてPCR 生成物の定量的および
定性的分析法は、PCR 技術において公知の方法である。
本発明の第１の面を実施するための好適な方法は、PCR
反応チューブに緩衝液、ポリメラーゼ、dNTPおよびプラ
イマーを、最終反応混合物中で必要な濃度の２倍に濃縮
された水溶液として組合せて、この「プレミックス」の
上に任意の順序でMgCl₂の保存液、標的DNA 配列を含む
と考えられる試料、および有効な蒸気バリアーを形成す
るのに充分な鉱物油を、MgCl₂と試料の合計量がプレミ
ックスの量に大体等しくなり、最終MgCl₂濃度がプライ
マーで規定される特異的標的配列の増幅に最適であるよ
うに、重層する。

【００６８】プレミックスは実質的にマグネシウムを含
まないが、最初にプレミックスから分離されていた大量
のマグネシウムをあとで加える前に、PCR 増幅をしない
で約10^-4Ｍ以下の濃度のマグネシウムを含有してもよ
い。好適な重層の順序は、プレミックスとMgCl₂の間に
試料を入れることであり、鉱物油を最後に加えることで
ある。それはこの順序が相補的試薬サブセットの分離を
最大にするからである。

【００６９】好ましくは重層はすべての成分を室温で行
い、添加中に異なる成分の混合を最小にするようにす
る。好ましくはこうして増幅開始の約30分以内（短けれ
ば短いほどよい）に反応チューブを調製する。また好ま
しくは迅速で完全な対流混合を確保するために、熱サイ
クリングの第１段階は、室温から90〜100 ℃へのPCR 反
応チューブの加熱が最も速くなるようにする。最下層
に、化学的に不活性で非イオン性の密度増加剤（例えば
ショ糖）を、約１重量％と20重量％の間の濃度で取り込
むことにより、加熱前の試薬層の安定性が増す。

【００７０】PCR 反応チューブ中の鉱物油をグリースま
たは好ましくは蝋で置換することは、本発明の第２の面
であり、これは本発明の第１の面を実施するための好適
な方法である。蝋またはグリースの層がPCR 試薬のサブ
セット（「プレミックス」）の溶液の上をシールしてし
まえば、うまく手でコントロールして試薬を加えなけれ
ば熱サイクリングが始まるのではないかという心配をし
ないで、蝋またはグリースの上に相補的試薬サブセット
（好ましくはマグネシウム塩を含む）の水溶液を加える
ことができる。試料は蝋またはグリースバリアーが形成
される前または後に加えることができる。

【００７１】蝋またはグリースで覆われたプレミックス
を含有する大バッチの反応チューブをあらかじめ作成
し、数日間から数カ月間、好ましくは０〜５℃で保存す
るなら、普通試料を後で加えるほうがより便利であり、
そうすれば試料はPCR 反応が必要な場合にのみ加えるこ
とができる。この製造方法では、バリアーが形成された
後および保存前に、バリアーの下の水層に欠如している
試薬を蝋またはグリースバリアーの層の上に加えること
が好ましく、そうすることによりユーザーは熱サイクリ
ングの直前に試料を加えるだけでよい。

【００７２】１時間またはそれ以下の時間スケールでは
漏出を無視できるほど小さいが、１日またはそれ以上の
スケールでは相当の漏出を示す蝋またはグリース層があ
るため、製造されたチューブが試料以外のすべてを含む
場合、蝋またはグリースのバリアーは保存期間のスケー
ルでバリアーを越えて試薬の移動を防ぐために堅牢でな
ければならない。バリアーを通しての漏出を試験する１
つの方法は、上の水層にブロモフェノールブルーなどの
蝋不溶性色素を0.01％から 0.1％の濃度で加えて、下の
水層に移行するかどうかを肉眼で観察することである。

【００７３】蝋またはグリースバリアーを作成する好適
な方法は、反応チューブにバリアーの下にくる試薬サブ
セットの溶液を加え、蒸気バリアーを形成するのに充分
な蝋またはグリースを加え、チューブを好ましくは閉じ
て、蝋またはグリースが溶けて試薬水溶液の上で均一な
液層を形成するのに充分な温度で充分な時間インキュベ
ートすることである。次に少なくとも蝋またはグリース
が固化するのに充分な時間、チューブを室温に戻す。

【００７４】インキュベート温度は蝋またはグリースの
融点より高いが、好ましくは融点より10℃以上高くはな
く、決して90℃より高くはなく、そうすることによりプ
レミックス溶液中に存在するかも知れないポリヌクレオ
チドポリメラーゼの熱による不活性化を最小にすること
ができる。普通融解時間は30秒から約５分で充分であ
り、バリアーが完全に固化するためには少なくとも約５
分の冷却時間が好ましい。蝋またはグリースが下層の水
性画分を覆う可能性が小さくなるため、例えば氷浴中で
急速に冷却することは好ましくない。

【００７５】好ましくは蝋またはグリースの量は最小に
とどめ、熱サイクリング中の蝋またはグリースの溶解に
より上の水層と下のバリアー層が混合した後、反応チュ
ーブの水性内容物が完全に覆われるのに充分な量だけ用
いる。この被覆の程度は、PCR 増幅中に反応チューブの
壁およびキャップに留出される水の量を測定することに
より評価できる。例えば増幅の後、チューブの重さを
（好ましくは 0.1mg以下まで測定できる分析天秤で）計
り、蒸気バリアーの上に溜った水を綿棒で静かに取り、
除去された水の重さを求めるためにチューブの重さをも
う一度測定する。

【００７６】標準的なPCR 反応量（20〜200 μｌ）に対
して、完全に覆われた場合蒸気バリアーの上にチューブ
表面に留出する水は２mg以下である。水層部分の容量が
増加すると典型的なPCR 反応チューブの円錐形の断面が
空気−水界面の表面積を増加させるため、一般に完全に
覆う（最大の蒸気バリアーの有効性）のに必要な蝋また
はグリースの最小量は水層の総量に比例して変化する。
蝋またはグリースの量を最小にする理由は少なくとも２
つある：（１）サイクリングの時熱平衡に必要な時間
は、反応チューブとその内容物の総量に比例して変化す
る、（２）有効な蒸気バリアーとして必要な最小量以上
の過剰の蝋またはグリースは、サイクリング後のPCR 生
成物の回収を困難にし、チューブからPCR 生成物を取る
ときに使用するマイクロピペットのチップを詰まらせや
すく、または（蝋のケースの中で）機械的に硬いバリア
ーを形成してマイクロピペットのチップが貫通するのに
かなりの圧力を必要とする。

【００７７】普通蝋またはグリースバリアーは、普通の
空気−排除または陽圧排除マイクロピペットまたは「サ
ンプラー」により、バリアーの上（普通層が最も薄いま
ん中）に手で軽く圧力をかけて、試料を取るために貫通
される。しかし蝋のバリアーは、蝋で覆われた水層を凍
結融解することで破ることができる。氷の膨張が蝋を破
り、ピペットは簡単に貫通することができる；アングル
ローターで軽く遠心分離すると蝋の破砕が容易になる。

【００７８】グリースより蝋の方がマイクロピペットの
チップを詰まらせにくいから、蝋が好ましい。蝋はグリ
ースより強固であるから、蝋はPCR 試薬サブセットをよ
り薄く従ってより少ない量で有効に分離することができ
る。本発明の目的のために多くの蝋組成物が有効であ
り、以下のものがある：パラフィン（融点の範囲55〜61
℃）、エイコサン(eicosan) 、パラプラスト(Paraplas
t) 、ウルトラフレックス(Ultraflex) 、オクタコサン
（octacosane) 、セチルパルミテート (cetyl palmitat
e)、ペンタエリスリトールテトラベヘネート（pentaery
thritol tetrabehenate)、および「ベスクエア175 ワッ
クス」（“BeSquare175 ”Wax)。

【００７９】種々の比率のこれらの蝋の混合物、これら
の蝋と白色ペトロラータムのようなグリースとの混合
物、およびこれらの蝋と鉱物油との混合物も有効であ
る。個々の蝋調製物はPCR を阻害する物質を含むか、ま
たは生物に由来するため偽陽性のPCR 応答を与える汚染
DNA を含む可能性があるため不適当であるが、一般に約
40℃と約80℃の間で溶解するほとんどすべての蝋は、熱
サイクリング前にPCR 試薬を分離するバリアー層とし
て、および熱サイクリングの間に水の蒸発を最小にする
蒸気バリアーとして有用である。動物や植物から直接得
られた物質より、石油から調製された蝋、グリース、ま
たは油の方が、核酸ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、ま
たはプロテアーゼによる汚染の可能性を最小にするのに
好ましい。

【００８０】これらは増幅時に蒸気バリアーとして用い
る場合は、PCR で使用される水溶液よりも密度は小さく
なければならない。最初の増幅サイクルまでは、水より
重い蝋やグリース（例えばケイ素、リン、イオウ、また
は水素原子を含む）も、PCR試薬サブセットを分離する
のに使用することができるであろう。これらは加熱後は
蒸気バリアーとしては役に立たないが、蒸気バリアーが
必要でない場合は反応チューブの底に沈み、そのためそ
れまで分離されていた水性試薬の撹拌を促進する。しか
し水性画分の上に水より重いグリースまたは蝋を重層す
ることは、かなり技術が必要である。

【００８１】本発明の蝋の適切性を試験する最も簡単な
方法は、（１） 500μｌのポリプロピレン製マイクロ遠
心分離チューブ中に、15mgの蝋とマグネシウム化合物以
外のすべてのPCR 試薬を含有する水溶液約50μｌを加
え；（２）チューブにキャップをして、蝋の融点より高
い温度の水浴に、蝋が完全に溶けるのに充分な時間（約
１分）チューブを入れ；（３）チューブを水浴から取り
出し室温まで冷却し；（４）蝋の上に、MgCl₂とPCR 試
薬中に含まれるプライマーの標的であるDNA を含む試料
の混合物約50μｌを加え；（５）プライマーと標的DNA
の特定の組合せに適した熱サイクル条件でPCR 増幅を行
い；（６）分子生物学の分野で公知の技術を用いて、予
想される介在（非プライマー）配列を含む予想される長
さのPCR 生成物の存在について分析する。PCR 試薬と標
的DNA の濃度は、蝋の代わりに鉱物油（一般に40から80
mgの範囲）が使用される場合、有効な増幅をすると考え
られる範囲内でなければならない。

【００８２】この試験法の中で、いくつかの分析法を付
け加えると結果の最適化に有用である。MgCl₂とDNA を
加える前と熱サイクルの後に蝋層を肉眼で観察すれば、
蝋の量は液体バリアーおよび蒸気バリアーとして働くの
に充分であることを確認することができる。使用される
蝋の量が水層を完全に覆うのに不十分な場合、被覆が完
全になるまで量を増やしてもよい。蝋を通過して反応チ
ューブの上部に留出した水の重量測定（吸収性綿棒で水
をぬぐった前後のチューブの重さを測定）すれば、蒸気
バリアーの有効性を評価するのに有用である。２mg以上
の水が留出したことは、さらに蝋の量を増やすことが有
効なことを示している。

【００８３】マイクロピペットのチップで蝋層の硬さと
強固さを調べることは、蝋調製物がPCR に有用であるか
どうかを示してくれる；サンプラーのチップが詰まった
りその側面に蝋がくっついたりしないで貫通することが
好ましく、貫通するのにはほとんど力が不要で調節しや
すいことが好ましい。ある種の非イオン性色差（例えば
濃度範囲が0.01％から 0.1％のブロムフェノールブル
ー）は、蝋またはグリースの上の水層に加えてもPCR を
妨害しない。最初のサイクルの後に色素がどれだけ蝋ま
たはグリースの下の水層に混合したかを肉眼で調べれ
ば、蝋またはグリースが混合を妨害していないかどうか
を試験するのに有効である。

【００８４】これらの試験は、PCR および分子生物学の
分野の当業者が、PCR 試薬を分離し溶媒の蒸発を阻止す
るのに最適な蝋、蝋混合物、および蝋と油およびグリー
スとの混合物を選択し、蝋バリアーの上下の特定の組合
せの水性の量に対する蝋の最適量を見つけることを可能
にする。さらにもし蝋層の上に相補的サブセットが長期
に存在するかまたはしない場合に蝋で覆われたPCR 試薬
サブセットに対して長期安定性を与えるために蝋製剤ま
たは量が必要なら、好ましくは熱サイクリングの直前に
蝋層の上に欠如している反応成分（標的DNA を含む）を
加えて、調製と熱サイクルの間の異なる期間の後にこれ
らの試験を実施すればよい。

【００８５】本発明の第２の面に特に好適なのは、蝋中
の界面活性剤の溶液であり、好ましくは非イオン性で約
0.1重量％から１重量％の濃度範囲で、蝋を溶かして、
界面活性剤を加え、混合物を少なくとも約１分間撹拌し
て、次に混合物を少なくとも約10分間静置してから、界
面活性剤が別の液相（普通蝋より密度が大きい）を形成
したかどうかを観察して、調製される。層分離は界面活
性剤の濃度が界面活性剤の溶解度を越えていることを示
しており、さらに低い濃度を使用すべきであることを示
唆している。前述したように、下の水層を完全に覆うの
に必要な蝋の最小量を求めることにより示されるよう
に、界面活性剤を添加すると一般に、液体バリアーを形
成し蒸気バリアーを完成させるのに必要な蝋の量を低下
させる。

【００８６】好適な界面活性剤はそれほど水に溶けなく
て、比較的少量の親水性部分と比較的多量の疎水性基を
含むものである。特に好ましい市販の界面活性剤は、ツ
イーン85とツイーン65である。PCR 蒸気バリアー用に最
適化されたポリオキシエチル鎖長または脂肪酸構造を有
する新規のポリオキシエチルソルビタントリアシレート
界面活性剤は、種々の点で性質が改良されている。例え
ば界面活性剤含有蝋層の下の水性溶媒のPCR 熱サイクリ
ングにより、おそらく蝋と一緒に界面活性剤が少し水層
へ抽出される。これは、抽出された界面活性剤は特徴的
な光散乱性スペクトルを有するミセル粒子を形成するた
め、水層の紫外および可視吸収スペクトルを測定するこ
とにより、分析できる。

【００８７】抽出された界面活性剤は一般的にPCR また
はPCR 後の分析を妨害しないが、特定の例で有害なこと
がある。ツイーン65やツイーン85に使用されているもの
より、ポリオキシエチル鎖を短くしたり脂肪酸の長さを
長くしたりすると、熱サイクリング中の界面活性剤の水
溶性と抽出性が増加する。本発明の第２の面は、蝋また
はグリースに脂溶性の色素（例えばオイルレッドＯ（Oi
l Red O)、オイルブルーエヌ（Oil Blue N) 、ソルベン
トグリーン（Solvent Green)、ファットレッド（Fat Re
d)、およびスダンオレンジ（Sudan Orange））を、約10
^-3％から10^-1％の範囲で導入することによっても改良す
ることができる。

【００８８】底の水層に 0.1〜10％の界面活性剤（好ま
しくは非イオン性）を加れば、これも水層を完全に覆う
のに必要な蝋の量を低下させることにより、本発明の第
２の面を改良するのに有用である。好適な界面活性剤は
比較的水溶性のもの（例えばツイーン20、およびトリト
ンＸ−100)であり、これらの多くはPCR を妨害しないよ
うである。また本発明の第２の面に特に好適なのは、親
水性内表面を有するように製造され処理された、プラス
チック製PCR 反応チューブを使用することである。これ
は液体バリアーおよび蒸気バリアーに必要な蝋またはグ
リースの量を低下させるのに有用である。

【００８９】このようなチューブを作成する具体的な方
法は、（ａ）開いたチューブが酸化性雰囲気中にさらさ
れているところで、チェンバー内でプラズマエッチング
またはコロナ放電し、（ｂ）フレントンの試薬（Frento
n's reagent)のような液性酸化剤中でプラスチックをイ
ンキュベートし、（ｃ）チューブが鋳造される溶融樹脂
中に界面活性剤を添加し、そして（ｄ）界面活性剤でチ
ューブを覆う。普通疎水性の反応チューブの界面活性剤
による被覆は以下の段階により行われる：（１） 0.1〜
10（重量）％の界面活性剤を非水性溶媒（例えば１−プ
ロパノール、２−プロパノールまたは１−ブタノール）
への溶解、（２）開いたチューブに20〜30℃で界面活性
剤溶液を満たす、（３）満たしたチューブを20〜30℃で
約１から30分間インキュベートする、（４）インキュベ
ートしたチューブからすべてのバルク界面活性剤溶液を
排水する、そして（５）排水したチューブを大気圧また
は減圧下で、約20〜60℃で空気乾燥する。

【００９０】必ずしもすべての界面活性剤が10％までの
濃度で有用な非水性溶媒には溶けない。被覆用界面活性
剤を完全に溶解させるためにいくつかの注意が必要であ
る。各被覆にあまり多くの界面活性剤を消費しないた
め、この被覆は少なくとも10回繰り返すことができる。
好適な非水性溶媒の沸点は、約60℃から 110℃の間であ
り、少なくとも約１％まで界面活性剤を溶解させる。好
適な界面活性剤はツイーン65とツイーン85である。

【００９１】プラスチックを処理するためのコロナ放電
とプラズマエッチングは以下の論文や書物に総説が記載
されている：ホフマン（Hoffman)、1988年、Jounal of
Applied Polymer Science : Applied Polymer Symposiu
m 第42巻： 251〜265 頁；ゴンボッツとホフマン（Gomb
otz and Hoffman)、1987, C.R.C. Critical Reviewsin
Biocompatibility 第４巻：１〜42頁；ボーイング（Boe
ing) 、1982、プラズマ化学と技術（Plasma Science an
d Technology)、コーネル大学出版（CornellUniversity
Press) 、イタカ（Ithaca) ；オスカム（Oskam)、198
4, Plasma Processing of Materials、ノエス出版（Noy
es Publications) 、パークリッジ（Park Ridge) 、ニ
ュージャージー。

【００９２】フレトンの試薬（Frreton's reagent)は以
下の論文に記載されている：ウォーリング（Walling)、
1975, Accounts of Chemical Research 第８巻： 125〜
131頁；グラフ（Graf) ら1984, Jounal of Biological
Chemistry 第 259巻：3620〜3624頁；イマリーとリン
（Imalay and Linn)、1988, Science 第 240巻：1302〜
1309頁。親水性反応チューブを使用して本発明の第２の
面を実施する場合、このようなチューブを使用できるよ
うにするための好適な方法は、特定の水性反応容量を完
全に覆うのに充分な量の蝋のペレットを各チューブに分
注することである。

【００９３】次にユーザーは、PCR 試薬のサブセットの
水溶液を加え、蝋の融点より５〜10℃高い温度で数分間
チューブを加熱し、室温またはそれ以下の温度にチュー
ブを冷却し、新しく形成された蝋の層の上に相補的PCR
試薬サブセットと試料を含む混合物を加え、供給される
蝋の量より水溶液の総量は少なく維持するように注意し
て、PCR 増幅を開始するだけでよい。

【００９４】もし熱サイクリングの最初のサイクルの間
に、反応チューブが最初の約０〜25℃からできるだけ急
速に、95℃より上で 100℃より下のDNA の変性温度（好
ましくは98℃）に加熱され、約１から２分間この高い温
度に維持されるなら、本発明の第２の面は最も有孔であ
る。この方法は、蝋またはグリースを溶かして試料中の
DNA を変性させるのみでなく、新たに一緒にした上と下
の水層に激しい熱対流を起こすのに有用であり、こうし
てすべてのPCR 試薬と試料DNA が完全に混合される。混
合が不完全な場合は増幅効率が低下する。完全に混合す
るのに役立つ他の実施態様は、上のPCR 試薬サブセット
にKCl のような無機塩を加えて、下の相補的サブセット
からはこれを除き、上の水層に１〜20％濃度の低分子量
密度増加剤（例えばショ糖）を加えることである。

【００９５】一般に下の水層より上の水層の密度を高く
しておくほうが有用であり、好ましくはいずれの層から
も、粘度を上げて対流乱流を低下させやすい有機ポリマ
ーや不活性の蛋白（例えばゼラチン）を排除しておく。
上の水層と下の水層の対流混合を促進するさらに別の方
法は、蝋またはグリースが溶けてから反応チューブを垂
直から約10から30度の角度で傾け、バリアー層をこの角
度で固化させることである。傾けることによりバリアー
層は薄くなるため、冷却後、蝋の上を肉眼で観察して下
の水層が完全に覆われていることを確認する。

【００９６】本発明の第２の面の蝋またはグリース層
は、そこにポリマー性粒子または比較的細かいプラスチ
ックメッシュ（サンプラーチップが詰まるのを少なくす
る２つの添加物）を導入することである。メッシュはパ
ンチを用いて、下の水層の上で反応チューブの内径に大
体等しい直径の円盤に切るのが便利である。普通のチュ
ーブの下半分は円錐形であり、この直径は数ミリメート
ルのオーダーで、下の水層の容量に依存する。メッシュ
の組成と孔径は多種多様である。許容されるプラスチッ
クは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペン
テン、ポリエステル、ナイロンおよび種々のフルオロカ
ーボンがある；孔径は約 0.001から１mmまである。ナイ
ロンは核酸を結合させるためあまり好ましくない。

【００９７】フルオロカーボンは粘度が高くコストも高
いためあまり好ましくない。ポリプロピレンは最も密度
が低く（蝋、グリースまたは油と最も融和性がある）、
疎水性が高く、最も一般的に使用されるPCR 反応チュー
ブの材質（これもポリプロピレン）に匹敵する耐熱性を
有し、おそらく最も安価であるため、最も好ましい。ポ
リメチルペンテンも、その低密度、高い疎水性、および
高い耐熱性のために好ましいが、あらかじめ製造された
メッシュは市販されていないかも知れない。

【００９８】種々のメッシュ組成物と孔径が、スペクト
ラムメディカルインダストリーズ（Spectrum Medical I
ndustries)（ロサンゼルス）から入手できる。ポリマー
粒子の形、組成、直径および多孔性も種々ある。不規則
な形から球形のものまである（後者はビーズと呼ばれ
る）。組成物とはメッシュについて前述した任意のポリ
マーとビーズを作るのに普通使用される２つのポリマー
（ポリメチルメタクリレートとポリスチレン）を含む。
直径は約10^-3mmから約１mmの範囲である。直径の大きい
(0.1mm以上）ほうがマイクロピペットのチップの中に入
りにくいので好ましい。非多孔性粒子は、蝋またはグリ
ース層に接触するPCR 試薬を捕捉する表面積が小さく好
ましい。好ましくは粒子の密度は水より小さいかまたは
水に近く、そのため蝋またはグリースが油に溶解した時
粒子が蝋またはグリース層から滴下して水層を通過しに
くい。

【００９９】本発明に適した市販のポリマー粒子の例と
しては以下のものがある：グッドフェロー（Goodfello
w) （マルベルン（Malvern)、ペンシルバニア）のポリ
プロピレン顆粒（最大 0.5mm）；ポリサイエンシーズイ
ンク（Polysciences Inc.)（ワリントン（Warrington)
、ペンシルバニア）からの直径約0.01mmから0.15mmの
クロマトグラフィーグレードのポリプロピレンおよびポ
リエチレン球形粒子；バイオラッド（Bio-Rad)（リッチ
モンド、カリホルニア）からの、バイオ−ビーズSMポリ
スチレンジビニルベンゼンおよびアクリルエステル吸着
体、20〜50メッシュ；ロームアンドハース（Rohm and H
aas)（フィラデルフィア、ペンシルバニア）からの、ア
ンバーライトXAD とポリスチレンおよびアクリルエステ
ル吸着体、20〜60メッシュ；ワットマンバイオシステム
ズ（Whatmann BioSystems, Inc.)（クリフトン（Clifto
n)、ニュージャージー）からの、プラスチックまたはガ
ラス被覆プラスチックバイオスフィア（BioSpheres) 、
直径 0.1から 0.2mm；アイシーエヌバイオメディカルズ
インク（ICN Biomedicals, Inc.)（クリーブランド、オ
ハイオ）からの、ラピッドセルピープラスチック（Rapi
d Cell P) またはガラス被覆プラスチックビーズ、直径
0.15〜0.2mm ；ポリサイエンシーズインク（Poluscienc
es, Inc)からのポリビーズ（Polubead) とポリスチレン
マイクロスフィアとポリメチルメタクリレートビーズ。

【０１００】これらのポリマー性粒子のあるもの（特に
ポリスチレンまたはポリメチルメタクリレートからでき
ているもの）は、低分子量溶媒（例えば水やアルコー
ル）に接触すると膨潤する。好ましくはこれらは比較的
水不溶性の有機溶媒（例えば液体脂肪族炭化水素（純粋
なものまたは混合物、例えば石油エーテルまたはリグロ
イン））中で室温で膨潤し、その結果これらは、水層と
グリースまたは蝋の界面では水を吸収しない。これらの
あるものは、水性スラリーとして供給され、すでに膨潤
しており、この場合これらは室温で極性の小さい溶媒
（例えばエタノール、アセトン、および液体脂肪族炭化
水素）中で撹拌して脱水することが好ましい。

【０１０１】グリースまたは蝋中のポリマー性粒子の濃
度（重量％）は相当の変化があり、粒子−蝋／グリース
混合物のいくつかの機能的性質の任意について最適化さ
れる。例えば粒子対蝋またはグリースの種々の重量比に
ついて試験して、ある一定量の下の水層に対して最小量
の被覆で完全な蒸気バリアー保護を与えるものを見つけ
る。一方種々の重量比を試験して、マイクロピペットの
チップによる貫通に対して最大または最小の抵抗を与え
るもの、または長期保存時に最大の安定性を与えるもの
を見つける（ポリマー性粒子および蝋またはグリースの
固化した混合物により分離された上の水層から下の水層
へのマグネシウムの通過の最大の抵抗性）。

【０１０２】バリアー中の蝋またはグリースが溶ける場
合バリアーとその上の水層の相互排除を促進するのに、
ポリマー性粒子および特にプラスチックメッシュの円盤
を含む蝋またはグリースバリアーは、PCR 反応チューブ
を垂直から10〜30度傾けて固化させることにより、利点
があるかも知れない。

【０１０３】本発明の第３の面には２つの大きい実施態
様がある：（ａ）異なる試験サブセットの水溶液を覆う
蝋またはグリースバリアー中のPCR 試薬のサブセットの
水性エマルジョン、および（ｂ）バリアー中のPCR 試薬
サブセットの溶液。熱サイクリングにともなうバリアー
の溶解はエマルジョンを破壊し、PCR 試薬を含有する水
層を下の水層に放出し、ここで熱対流がすべてのPCR 試
薬を試料（好ましくはサイクリングが開始する前にバリ
アー層の上の水層として添加される）と混合させる。

【０１０４】あるいはバリアー層中の溶解したPCR 試薬
は抽出され、下の水層に混合され、バリアー層は溶解し
て粘度が下がり、下の水層とバリアー層のいずれにも熱
対流が確立される。これらの実施態様に対して、上記の
任意の方法を単独または組合せて、バリアー層の量を最
小にすることが好ましい：バリアー中のポリマー性粒子
またはメッシュまたは界面活性剤、反応チューブの親水
性内表面、または水層の界面活性剤。バリアー量、従っ
て厚さを最小にすることは、水層およびバリアー層の平
衡を加速し、バリアー溶解PCR 試薬の水層への分配を促
進する。

【０１０５】油中水または蝋中水エマルジョンは物質科
学の分野で公知の方法で作成され、基本的には適当な容
量の水相（この場合PCR 試薬サブセットを含む）と溶解
したグリースまたは蝋をグリースまたは蝋の融点より高
い温度で高速混合し、次に相分離する前に均一なエマル
ジョンを急速に冷却する。片方の相または両方の相に界
面活性剤を取り込むとエマルジョンが安定化する。この
目的のためには、PCRを阻害せず、水中油エマルジョン
よりも油中水エマルジョンを安定化させる濃度で使用さ
れるという条件下で、大きい界面活性剤（好ましくは非
イオン性）が有効である。

【０１０６】エマルジョン作成技術は以下の総説に記載
されている：ベッカー（Becker) 、1966、エマルジョン
ズ（Emulsions)：理論と実践（Theory and Practice)、
第２版、レインホルド（Reinhold) 、ニューヨーク；シ
ャーマン（Sheerman) 、1968、エマルジョンサイエンス
（Emulsion Science) 、アカデミックプレス（Academic
Press) 、ニューヨーク；リサント(Lissant) 、1974
（第１部と第２部）そして1984（第３部）、エマルジョ
ンとエマルジョン技術（Emulsions and EmulsionTechno
logy)、マーセルデッカー（Marcel Dekker)、ニューヨ
ーク。

【０１０７】水−蝋または水−グリースエマルジョンへ
の取り込みには実質的に任意のPCR試薬の組合せが適し
ているが、乳化剤の存在しない場合は１つの試薬（マグ
ネシウム化合物）が蝋またはグリースへの溶解には最も
好ましい。これはマグネシウムイオンと比較的短い脂肪
酸（例えば酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン
酸、ラウリン酸）の共役塩基は、１〜50mMのレベルまで
油中に溶解可能であるという性質と、冷水より熱水中の
方がはるかによく溶けるという両面性を有するためであ
る。

【０１０８】こうしてマグネシウム脂肪酸塩は溶融蝋ま
たはグリースに溶解され、水層の上に重層され、かなり
急速に（約１分間で）冷却され、その結果お湯の中に抽
出される前に硬化した蝋またはグリース中に捕捉され、
しかしながら多層混合物は熱サイクリングの開始時に１
から２分間95〜98℃に加熱されると効率的に抽出され
る。バリアーの鋳造中に水層への抽出を最小にするため
に、できるだけ低い実用的な溶解温度（好ましくは約40
〜50℃の範囲）で蝋またはグリースを用いることが好ま
しい。

【０１０９】このような蝋の例としては、エイコサン
（融点36〜38℃）、低融点パラフィン（融点56〜61
℃）、およびこれらの蝋の混合物またはエイコサンと他
の高融点蝋との混合物がある。オリゴヌクレオチドプラ
イマーやdNTPもそのトリアルキルアンモニウム（例えば
トリエチルアンモニウム）塩に変換されれば、蝋可溶性
にすることができる。この反応はヌクレオチド（普通そ
のナトリウム塩として入手できる）を、トリアルキルア
ミンで平衡化させた陽イオン交換樹脂（例えばダウエッ
クス（Dowex) 50)を含むクロマトグラフィーカラムに通
過させて行う。

【０１１０】Ｃ₄−Ｃ₁₂サイズの範囲のマグネシウム脂
肪酸アシレート塩は普通市販されていないから合成しな
ければならない。その合成は好ましくは、脂肪酸を約60
〜80℃の範囲に加熱して、２モルの脂肪酸に対して１モ
ルのマグネシウムを加えて、マグネシウム酸化物を完全
に溶解（反応）するのに充分な時間撹拌する。室温に冷
却した後、マグネシウム脂肪酸塩を乾燥剤（例えばMgSO
₄またはP₂O₅上で保存し、反応中に生じたが加熱中に蒸
発していないすべての水分を除去する。

【０１１１】本発明の第３の面の実施法において、グリ
ースまたは蝋中のまたは下の水層中のPCR 試薬サブセッ
トは相補的であり、従って追加の水性PCR 試薬製剤をグ
リースまたは蝋の上に置く必要はない。ある方法におい
て、相補性のためには３つのPCR 試薬サブセットが必要
である：１つはグリースまたは蝋と２つの水性製剤の
中、１つはグリースまたは蝋の上で１つは下である。後
者の方法は、すべてのPCR 試薬がPCR 増幅の最初のサイ
クルの前に１つの水層中で一緒になるのを防ぐのに特に
有効である。

【０１１２】蝋またはグリースが界面活性剤、ポリマー
性粒子、マグネシウム脂肪酸塩、またはPCR 試薬サブセ
ットの乳化水溶液を含んでいようがいまいが、本発明の
蝋またはグリースをPCR 反応チューブに分注するには多
くの方法がある。固体の蝋またはグリースは別々のチュ
ーブに計り取られる；一般的に30mg以下の少量には、１
mgまたはそれ以上、好ましくは 0.1mgまで測定できる天
秤を使用することが好ましい。

【０１１３】しかしもっと速くて充分に正確な方法は、
蝋またはグリースを溶かして、有効な蒸気バリアーを与
えて最小量を分注するように調整された陽圧排除マイク
ロピペットで容量的に分注することである。プライマー
は蝋またはグリースを捕捉して精度を悪くするため、好
ましくはマイクロピペットはガラスチップを有してい
る。適当な可変容量ガラスチップ製陽圧排除マイクロピ
ペットは、SMI 製のマイクロ／ペッター（Micro/Pette
r) である。もし蝋またはグリースが室温またはそれ以
下の温度で固体表面に分注される時、それは半球形のビ
ーズとして固化し、これは表面から容易に分離されPCR
反応チューブに分注される（例えばピンセットで）。

【０１１４】表面が冷たいほどそこから蝋またはグリー
スビーズを分離しやすい。便利な受け器は、多くの科学
機器会社から販売されている使い捨て評量ボートてあ
る。いったん蝋またはグリースペレットと適当な容量の
PCR 試薬サブセットの水溶液をPCR チューブに分注すれ
ば、チューブにキャップをして、約１分間蝋またはグリ
ースを溶かすのに必要な温度まで加熱して、室温に冷却
し水層の上に蝋またはグリースバリアーをシールさせ
る。

【０１１５】プラスチック製マイクロピペットチップ
は、PCR 反応チューブについて前述したように、例えば
コロナ放電または表面コーティングにより親水性にすれ
ば、蝋の分注にはより適したものとすることができる。
そうすればプラスチックチップの空気排除サンプラーは
蝋分注に充分正確なものとなる。プラスチックチップの
空気排除サンプラーの蝋分注の精度は、蝋をその融点の
少なくとも30℃高い温度まで加熱することにより改良す
ることができる。蝋の自動分注に好適なのは、マイクロ
プロセッサー制御多チップ空気排除サンプラーで、パー
キンエルマーシータスインストルメンス（Perkin Elmer
Cetus Instuments)のプロペッテラボラトリーロボット
（ProPette laboratory robot)がある。

【０１１６】自動または半自動の１回での多くの蝋ビー
ズの急速かつ正確な製造は、溶融した蝋をその融点より
約５〜15℃高い温度で、空気作動加熱型液体分注器（例
えばイワシタエンジニアリング（Iwashita Engineering
Incorporated)のアキュラ１レギュレーター（Accura 1
regulator) による制御下で）で分注し、回転冷却ドラ
ム上に蝋ビーズを集めここから固化後トレー中にはがし
取ることによりなされる。例えばドラムは単に２〜３リ
ットルのガラス瓶で、直径 100〜300mm で、氷が充填さ
れており、約１〜３rpm でカルチャーボトルローラーの
上を回転しているものでもよい（ウィートンインスツル
メンツ（Wheaton Instruments Inc.））。

【０１１７】これまでの説明は熱サイクリング前に相補
的PCR 試薬サブセットの分離を可能にするための蝋また
はグリースバリアーの作成を強調してきたが、PCR で使
用されてきた鉱物油蒸気バリアーに対して蝋は改良であ
り、熱サイクリング前に反応物を分離しようと思わない
場合でも、蒸気の蝋バリアーの調製および最適化法はPC
R 反応で有用であることを認識すべきである。この場合
蝋、すべてのPCR 試薬、および試料は反応チューブ中で
単に混合される（好ましくは熱サイクリング開始の数分
以内）のみである。最初のサイクルで蝋が溶けたらす
ぐ、蝋は蒸気バリアーを形成して溶媒の蒸発を防ぐ。

【０１１８】熱サイクリングの最後に反応混合物が冷却
すると、固体バリアーを形成して不要なPCR 生成物の分
散の可能性を減少させ、このバリアーはPCR 生成物を取
るためにマイクロピペットで容易に貫通することができ
る。さらに、親水性内表面を有するか、または蝋または
グリース中に非イオン性界面活性剤を含む容器中で蝋ま
たはグリース蒸気バリアーを作成し使用する技術は、非
PCR への適用も可能にするような形で本明細書中に記載
されており、これは上記のすべての利点を含む。大きな
調整点は、好適な容器中で蝋またはグリースの量が水性
画分の漏出した表面を覆うようにしたものである。

【０１１９】本発明の利点の多くは、単にPCR 試薬サブ
セットを異なる容器に充填することにより達成される。
好適な実施態様において本発明のこの面は以下のものよ
りなるキットである：（ａ）一対のプライマー、核酸ポ
リメラーゼ（好ましくはTaqポリメラーゼ）、および適
当な緩衝液中の１つまたはそれ以上のデオキシリボヌク
レオシド３リン酸（好ましくはdATP、dGTP、dCTP、およ
びdTTP）、そして（ｂ）MgCl₂を含むチューブ（好まし
くは溶液）。このキットはもちろんこのキット成分を用
いてPCR 法を行うための説明書を含む。

【０１２０】特にこの説明書はチューブ（ａ）と（ｂ）
の内容物の試料との混合の仕方を説明する。最も好適な
実施態様においてこのようなキットは、（ａ）1.15マイ
クロモルのトリス−塩酸、pH8.3 ; ５マイクロモルのKC
l ; 17.25 ピコモルの各プライマー；21.6ナノモルの４
つのデオキシリボヌクレオシド３リン酸のそれぞれ；お
よび2.875 単位のTaq ポリメラーゼ（PECI) を含む１つ
のチューブ；および（ｂ）8.05mMのMgCl₂の１つのチュ
ーブ。このキットの典型的な説明書はユーザーに、まず
チューブ（ａ）の中の溶液の上に50μｌのMgCl₂を重層
させ、次に２滴の鉱物油を加え、そしてできるだけ早く
（30分未満）PECIサーマルサイクラー（Thermal Cycle
r) 中に試料を入れるように説明する。

【０１２１】本発明のさらに別の実施態様において、１
つの基本的なPCR 試薬（すなわちTaq ポリメラーゼ）を
含むゲルまたはマトリックスがPCR 混合物の他の成分
（試料以外）上に重層され、ゲルまたはマトリックス
は、試料の添加と加熱でゲルまたはマトリックスは溶解
して完全なPCR 混合物を復元するように作成されてい
る。ある実施態様において、ゲルはTaq ポリメラーゼを
含むアガロースである。

【０１２２】この開示はPCR 性能の改良に焦点をあてて
きたが、本発明は核酸の酵素的複製の他の方法、例えば
転写を基礎とした増幅系（ウォー（Kwoh）ら、Proc. Na
tl.Acad. Sci. USA 87 巻；1874）、核酸リガーゼに基
づく増幅系（ウーとウォレス（Wu and Wallace) 、198
9, Genomics 第４巻： 560頁、およびバリンジャー(Ba
rringer) ら、1990，Gene第89巻： 117頁）、および核
酸標的にアニーリングされるDNA −RNA −DNA プローブ
のリボヌクレアーゼＨ切断に基づく増幅系にも適用でき
る。本発明の応用により特異性が改良されるインビトロ
の核酸増幅系または検出系の特徴は以下のようなもので
ある：

【０１２３】（ａ）核酸プライマーまたはプローブ（普
通オリゴヌクレオチド）は標的核酸配列にアニーリング
しなければならない；（ｂ）このようなアニーリングの最大の、または「厳し
い」（“stringent ”）温度は、周囲温度以上（約20〜
30℃）でなければならない；（ｃ）触媒（普通酵素）はアニーリングされた核酸複合
体に作用しなければならない；（ｄ）触媒は厳しいアニーリング温度で活性がなければ
ならない；（ｅ）触媒は周囲温度または、反応物を撹拌するのに最
も便利な温度でかなりの活性を保持していなければなら
ない。

【０１２４】許容される温度と溶媒条件でプライマーま
たはプローブが非標的配列とアニーリングしたり、シグ
ナル依存性触媒が標的配列が存在しないところでも作用
する場合、これらの条件下で核酸複製または検出反応は
副生成物の生成の影響を受け安い。本発明は反応前に反
応物質を分離しておき、温度が厳しい条件になった時反
応物質が混合するようにすることで、このような副反応
を減少させている。この場合、少なくとも厳しい条件に
達するまでは蝋またはグリースが溶けないように、蝋ま
たはグリースを調整しなければならない。

【０１２５】しかしさらに一般的に言えば、溶媒または
他の試薬の蒸発を最小にするために蒸気バリアーが必要
な場合や、蒸気バリアーが低温度では固化して高温度で
は流動化することが機能的に有利な場合は、本発明は任
意の水性反応に有用である。これまでの説明と以下の例
により、当業者は、以下の請求の範囲により示される本
発明の広範囲な面を認識することができるであろう。

【０１２６】例１．PCR 試薬の保存安定性へのMgCl₂分
離の効果 PCR 試薬の２つの混合物（「プレミックス」）を脱イオ
ン水中で調製し、 500μｌのエッペンドルフマイクロフ
ュージチューブ中で50μｌずつ分注して−20℃で保存し
た。プレミックスＡは大腸菌中でクローン化し発現した
0.055酵素単位／μｌのサームスアクアティクス（Ther
mus aquaticus) (Taq) DNA ポリメラーゼＩ（パーキン
エルマーシータスインスツルメンツ（Perkin Elmer Cet
us Instruments) のアンプリタク（AmpliTaq) ）；４つ
の共通dNTPをそれぞれ0.11mM（ナトリウム塩、ファルマ
シア（Pharmacia)）；HLA DQα遺伝子の239 または242
ヌクレオチド配列を増幅するように設計された２つのPC
R プライマーをそれぞれ0.33μＭ（サイキ(Saiki) ら、
（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第86巻：6230〜6234
頁））；22mMのトリス−塩酸、pH8.3 ；および 110mMの
KCl を含有していた。プレミックスＢはプレミックスＡ
と同じ成分以外に8.05mMのMgCl₂を含有していた。

【０１２７】５日間のいくつかの時点で、各プレミック
スを含む４つのチューブを溶解させて、室温で気密なス
クリューキャップのついたプライマー容器中に入れた。
この期間の最後に以下のようにチューブを処理した：
（ａ）プレミックスＢを含む各チューブに50μｌの脱イ
オン水を加えた；（ｂ）プレミックスＡを含む各チュー
ブに8.05mMのMgCl₂を50μｌ加えた；（ｃ）各チューブ
に２滴の鉱物油を加えた；そして（ｄ）10μｌの脱イオ
ン水中のヒト細胞株WT51からの精製ヒトゲノムDNA の
0.3または 1.0ngを各チューブに加えた。

【０１２８】チューブにキャップをして、以下の手順を
32回繰り返すようにプログラムしたパーキンエルマーシ
ータスインスツルメンツ（Perkin Elmer Cetus Instrum
ents) サーマルサイクラー中に入れた：温度のジャンプ
はできるだけ早くして94℃１分、60℃30秒、72℃30秒、
そして最後のサイクルの72℃のインキュベートで７分の
延長。

【０１２９】このPCR 増幅の後、増幅したDNA を室温
で、 3.0ｇのNuSieve アガロースと 1.0ｇのSeaKemアガ
ロース（エフエムシーコーポレーション（FMC Corporat
ion)）、および 100mlのTBE 緩衝液を含むゲル中でアガ
ロースゲル電気泳動で分析した。電気泳動用緩衝液はTB
E であった。 150Ｖで約50ミリアンペアで２時間分離を
行った。電気泳動後TBE 緩衝液中の 0.5μｇ／mlのエチ
ジウムブロマイド中でゲルを15分染色し、H₂O 中で15分
脱色した。

【０１３０】DNA のエチジウム染色した電気泳動帯を 3
00nmの紫外線照射管で肉眼観察した。プレミックスＡと
Ｂを含むチューブはPCR を行う前に室温で４つの異なる
時間でインキュベートした： 1.5時間、６時間、１日
間、および５日間。 0.3ngのヒトゲノムDNA を加える前
に室温で 1.5時間インキュベートしたものを除いてプレ
ミックスＡのすべての試料は、予想された 240塩基対PC
R 生成物帯を示し、ほんのわずかのプライマーダイマー
を示していた。

【０１３１】プレミックスＢの試料のうち、１ngのDNA
を加える前の室温で 1.5時間インキュベートしたものの
みが 240塩基対生成物を示していた。プレミックスＢで
はプライマーダイマーとプライマーオリゴマーは順に増
加しており、PCR 前に室温で試料をインキュベートした
時間に比例していた。PCR の前にPCR 試薬の完全な混合
物の室温での比較的短時間のインキュベートでも、混合
物を不活性化することをデータは示していた。この不活
性化は、プライマーダイマーの蓄積に関係しているかも
知れない。一方マグネシウムのないPCR 試薬サブセット
は、室温で５日間後も完全な活性を保持していた。本例
はまた、増幅の前に相補的試薬サブセットを混合する時
PCR を行うことの合理性を示している。

【０１３２】実質的に上記したように設計した実施した
他の実験で、プレミックスＡ（マグネシウムを含まな
い）は、 0.3ngと１ngのヒトゲノムDNA から 240塩基対
のHLADQα標的の効率的な再現性のある増幅を示し、−2
0℃，４℃，25℃、および37℃で12日間の保存の後もプ
ライマーダイマーはほとんど産生しないかあってもほん
のわずかであった。同じ実験で試薬サブセットを重層し
ないで増幅前にMgCl₂を含むプレミックスＡを激しく撹
拌するとプライマーダイマーの収率が増加し、特異的生
成物の収率は減少していた。さらに別の実験で、プレミ
ックスＡは 445℃で２ヵ月間完全な保存安定性を示し
た。プレミックスＢは室温で数日間後に検出できるだけ
の増幅された特異的PCR 生成物を産生しなかった。

【０１３３】例２．PCR 特異性へのMgCl₂分離の完全性
の影響すべてのPCR 反応で、例１に規定されたプレミックスＡ
を使用し、反応混合物は増幅の少し前に8.05mMのMgCl₂
に調整した。プレミックスを含むチューブは使用の少し
前まで凍結して保存した。試料は、RS−２細胞株からの
0.1ng／mlの精製DNA よりなっていた；各反応チューブ
に10μｌの試料と50μｌのMgCl₂を加えてから、注意し
て50μｌの鉱物油を上に重層した。３つの条件のそれぞ
れで６本の反応チューブをセットアップした：（ａ）氷
浴中でプレミックスを０℃に冷却した；上に50μｌのMg
Cl₂を注意して重層した；MgCl₂の上に10μｌのDNA を
注意して重層した；（ｂ）（ａ）のように重層したが、
プレミックスは30℃であった、そして（ｃ）30℃でプレ
ミックスの上にDNA を重層し、次にMgCl₂を重層した。

【０１３４】セットアップの直後に、すべてのチューブ
をパーキンエルマーシータスインスツルメンツ（Perkin
Elmer Cetus Instruments) サーマルサイクラーに移
し、以下のプログラムをした：98℃で１分、60℃で30
秒、72℃で30秒を２サイクル；94℃で１分、60℃で30
秒、72℃で30秒を35サイクル；そして72℃で最後の10
分。アガロースゲル電気泳動とエチジウム染色は基本的
に例１に記載の方法と同じである。

【０１３５】すべてのチューブは予想される 240塩基対
HLA DQα生成物帯を示したが、重層条件（ａ）は条件
（ｂ）より量が少なく、（ｂ）は条件（ｃ）より量が少
なかった。重層条件（ａ）は条件（ｂ）よりプライマー
ダイマーの量が多く、（ｂ）は条件（ｃ）より量が多か
った。最も重要なことは重層条件（ａ）と（ｂ）では分
子量で特異的生成物よりもプライマーダイマーに近い第
２の非特異的生成物を与え、これは重層条件（ｃ）では
完全に欠如していた。

【０１３６】DNA を添加しなかった同様の実験では、第
２の非特異的生成物は全く見られず、これはプライマー
オリゴマー化ではなくヒトゲノムDNA のミスプライミン
グに起因することを示唆していた。ミスプライミングは
最初のPCR サイクルの間のDNA 変性の前に起きるはずで
あり、その存在は試料のヒトゲノムDNA はかなりの部分
が１本鎖であることを示している。この非特異的生成物
の電気泳動移動度を、φＸ174RFDNAのHaeIII消化物（ベ
セスダリサーチラボラトリーズ（Bethesda Research La
boratories) からのサイズスタンダード）からの断片と
比較すると、非特異的生成物のサイズは約91塩基対であ
った。プライマーダイマーのサイズは約68塩基対であっ
た。

【０１３７】この実験は、PCR 熱サイクリングの実際の
開始まで相補的PCR 試薬サブセットからマグネシウムを
分離することの価値を確認した。２つの試薬サブセット
の間に10μｌのPCR 試薬のない試料の層を置くことだけ
でも、プラスチックダイマーの形成を減少させ非特異的
生成物のミスプライミング依存性増幅を防止するのに有
用であった。驚くべきことに０℃での重層は室温での重
層よりも多くのプライマーダイマーを与えた。TaqDNAポ
リメラーゼＩは０℃でさえもプライマーダイマー生成を
触媒するようである。

【０１３８】例３．グリースまたは蝋蒸気バリアーの効
果 PCR 試薬プレミックスＡと保存8.05mMのMgCl₂は例１に
記載したように調製した。試料として使用したヒトゲノ
ムDNA は細胞株HL−60から精製し、水で 0.3ng／mlの濃
度で調製した。50μｌのプレミックスＡを含むPCR 反応
チューブに、以下の蝋またはグリース40mgを加えた：パ
ラプラスト（Paraplast)（モノジェクトインダストリー
ズ（Monoject Industries)）、58〜60℃融解性パラフィ
ン（アルドリッチケミカル（Aldrich Chemical Co.)
）、オクタコサン（アルドリッチケミカル（Aldrich C
hemical Co.) ）、ワセリンペトロレウムゼリー（Vasel
ine Petroleum Jelly) （チーズボローポンズ（Cheeseb
orough Ponds)）、ペンタエリスリトールテトラベヘネ
ート（リポケミカルズ（Lipo Chemicals) ）、およびベ
スクエア175 (BeSquare)（カルワックスコーポレーショ
ン（Calwax Corporation) ）。50μｌのプレミックスＡ
を含む他のいくつかの反応チューブには75μｌの軽鉱物
油（シグマケミカルズ（Sigma Chemical Co.））を加え
た。すべてのチューブにキャップをして85℃の水浴中で
90〜120 秒間インキュベートし（プレミックスの上で蝋
が溶けて層になるまで）、次に室温に冷却した。

【０１３９】各蝋、グリース、油層の上に、50μｌの8.
05mMのMgCl₂と10μｌの 0.3ng／mlの精製ヒトゲノムDN
A を含む混合物を加えた。油の上に加えた混合物はすぐ
油を貫通してプレミックスと一緒になった。すべてのチ
ューブを、すでに90℃に加熱してあったパーキンエルマ
ーシータスインスツルメンツ（Perkin Elmer Cetus Ins
truments) サーマルサイクラーに移した。90℃で90秒の
後、以下のプログラムで35サイクルを行った：95℃で30
秒、55℃で30秒、72℃で30秒、72℃で最後の７分の延
長。温度間の熱ジャンプはできるだけ早く行った。

【０１４０】PCR 生成物は基本的に例１に記載したよう
に、エチジウム染色アガロースゲル電気泳動で分析し
た。上記の蝋と油バリアーとのすべての反応は特異的な
240塩基対のPCR 生成物を与えた。パラプラスト、オク
タコサン、およびペンタエリスリトールテトラベヘネー
トは、鉱物油に匹敵する収率で特異的PCR 生成物を与え
た。種々の蝋は、ほとんどなしから多量までの範囲でプ
ライマーダイマーを与えたが、鉱物油は少量のプライマ
ーダイマーを与えた。他のある種の蝋、例えばエイコサ
ン（アルドリッチケミカル（Aldrich Chemical Co.)
）、トリコサン（アルドリッチケミカル（Aldrich Che
mical Co.) ）、テトラコサン（アルドリッチケミカル
（Aldrich Chemical Co.) ）、およびカルマウバ蝋（ca
rnauba wax) （カルワックスコーポレーション（Calwax
Corporation））による同じ設計の予備実験では、PCR
生成物はなかった。

【０１４１】しかし後の実験は、40〜50mgの範囲の蝋層
は誤差が多かった；ときどきMgCl₂とDNA 混合物が溶け
た蝋から簡単に落ちて、プレミックスとよく混合するこ
ともしないこともあった。従ってこのような大きな蝋と
の１回だけの反応がうまくいってもいかなくても、増幅
の信頼性とか均一性は予測できなかった。例えば後の実
験では、エイコサンはパラプラストやパラフィンと同様
に作用し、鉱物油蒸気バリアーに匹敵する特異的生成物
とプライマーダイマーの収率を与えた。

【０１４２】セチルパルミテート）（サーババイオケミ
カルズ（Serva Biochemicals) ）やウルトラフレックス
（カルワックスコーポレーション（Calwax Corporatio
n) ）も、液体バリアーとして役立ち、有効量の特異的
生成物とほんのわずかの量のプライマーダイマーを与え
た。鉱物油はパラフィンやパラプラストと25％（重量）
までの濃度で混合して液体バリアーを与え、これは鉱物
油単独の場合と同様の特異的増幅を与え、プライマーダ
イマーの収率は低かった。これらの混合物はPCR特異性
や収率は蝋単独の場合よりよいということはないが、こ
れらはよりやわらかくてサンプラーチップを貫通させて
電気泳動分析のためにPCR 生成物を取り出すことがより
容易であった。

【０１４３】例４．蝋蒸気バリアーの量を最小にする例３と関連実験において、40mgの蝋を50μｌのプレミッ
クスＡの上に重層し；MgCl₂とDNA の混合物60μｌを蝋
の上にのせた。従って蝋の下の最終液量は 110μｌであ
った。これらの量により熱サイクリング前の蝋液体バリ
アーによる被覆は完全であったが、得られた蝋層が厚す
ぎてPCR 後にマイクロピペットチップを貫通させること
が不便であり、しっかり調節しなければならなかった。
蝋を破るために必要な圧力をかけると急に貫通してPCR
反応混合物（増幅された核酸を含む）がマイクロピペッ
トチップから噴出して、研究室環境をPCR 生成物で汚染
する恐れがあり、これは後に逆汚染する可能性があっ
た。

【０１４４】100μｌの水を完全に覆うためのパラフィ
ンの最小量を試験するための実験では、液体バリアーと
して完全に覆うのに30〜35mgの蝋が必要であった。一方
蒸気バリアーの有効性（水蒸発の減少）は25〜30mgで完
全に思えた。PCR 反応チューブは、コスター（CoStar)
製造の 500μｌの標準的なコーティングされてないマイ
クロ遠心分離チューブであった。これらの実験は熱サイ
クリングを必要とせず、低倍率で蝋層を観察してホール
を検出し閉じたチューブを99℃に10分間加熱してから壁
とチューブのキャップ内に凝縮した水の量を測定した。

【０１４５】蝋は鉱物油と同様に、層を形成するとき、
下に水性画分があるとき下を向いた凹面のメニスカスを
形成し、上に空気があるとき上を向いた凹面のメニスカ
スを形成するため、多量の蝋の構造上の制約がある。従
ってチューブのまん中を完全に覆うためにはチューブの
壁でははるかに厚い層が必要である。蝋層を実用的に薄
くするために、薄い層で完全な被覆を与える、メニスカ
スの深さを減少させ、水性画分の上に蝋を均一に分布さ
せる組成物に焦点が当てられてきた。これらのすべてで
パラフィンが使用されてきた。他の蝋もパラフィンと同
様の半定量的な挙動を示さなければならないが、これら
の定量的要求性は少し異なる。

【０１４６】パラフィン中に１％のBrij52（ジエチレン
グリコールモノセチルエーテル、サーバファインバイオ
ケミカルズ（Serva Fine Biochemicals)）、Brij30（ト
リエチレングリコールモノラウリルエーテル、サーバフ
ァインバイオケミカルズ（Serva Fine Biochemical
s)）、またはポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテ
ル（シグマケミカル（Sigma Chemical Co.) ）を含有さ
せると、完全な被覆に必要な蝋の最小量が30〜35mgから
20〜25mgに減少したが、マイクロピペットチップの貫通
はまだ困難であった。

【０１４７】蝋中に 200〜400 メッシュのポリスチレン
−ジビニルベンゼンビーズ（バイオラッドSM−Z8、バイ
オラッドラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories) ）を
10または20重量％で含有させると、蝋の最小有効量が25
〜30mgに減少した。さらに有利なことにマイクロピペッ
トチップの貫通は力がいらず、サンプラーのチップを詰
まらせることなく蝋を破ることができた。ビーズの濃度
５％、30％、40％では30mgの蝋で完全な被覆はできなか
った。パラフィン中のワセリンベトロレウムゼリーの10
％、20％、40％（重量）については、完全な被覆に必要
な蝋の最小量に対する効果について試験しなかったが、
これらの混合物40mg（最小量より少し上）では、蝋は少
し柔らかくマイクロピペットチップの貫通は簡単であっ
た。

【０１４８】しかしこの蝋はいくつかのサンプラーチッ
プを詰まらせがちであった。わずか10mgのパラフィンに
約 0.5mgの直径３mmのポリプロピレンモノフィラメント
メッシュ（プロピルテックス(Propyltex) 絹性スクリー
ニング繊維；テトココーポレーション（Tetko Corporat
ion)）を含有させると、コーティングしてないポリプロ
ピレンマイクロ遠心分離チューブ中の50μｌの水を完全
に被覆した。７mgの蝋でこの実験を繰り返しても完全な
被覆は得られなかった。前記の試験で使用される 100μ
ｌの水を覆うにはもう少し多量の蝋が必要であるが、こ
の量は、メッシュまたは界面活性剤のない場合に必要で
あった30〜35mgに必ずしも近いことはない。

【０１４９】PCR 反応チューブを界面活性剤でコーティ
ングすることの効果を試験するために、以下の６つの界
面活性剤のそれぞれの１−プロパノール中に５％溶液を
含有する 500μｌのマイクロ遠心分離チューブを室温で
30分間インキュベートした：ポリオキシエチレン−９−
ラウリルエーテル、スパン40（ソルビタンモノパルミテ
ート；シグマケミカル（Sigma Chemical Co.) ）、Brij
30、ツイーン85（ポリオキシエチルソルビタントリオレ
ート；シグマケミカル（Sigma Chemical Co.)）、スパ
ン80（ソルビタンモノオレエート；シグマケミカル（Si
gma Chemical Co.) ）、およびBrij52。

【０１５０】チューブから界面活性剤溶液を排除してか
ら、チューブを空気乾燥した。各チューブ中のH₂O 中0.
06ＭのKCl 50μｌの上に種々のパラフィン（7.5, 11.3
および18.8ｇ）を重層した。蝋層が固化し、低倍率でホ
ールを観察してから、H₂O 中0.1％メチレンブルーの50
μｌで被覆した。チューブにキャップをして室温で 3.5
日間保存してから、上層から下層に漏れがないかどうか
を肉眼で観察した。次にこれらを95〜97℃の水浴に２分
間浸漬し、室温で空気冷却し、一緒になった水層 100μ
ｌを覆う蝋にホールがないかどうかを再度チェックし
た。加熱の間、溶けた蝋の色素の貫通のタイミングと完
全さ、そして下の水層との混合物についても観察した。

【０１５１】わずか15mgの蝋で50μｌの水層を完全に覆
うことにおいて、２つの界面活性剤（ツイーン85とスパ
ン80）がコーティングしていないチューブに対して大幅
に改良された性能を示した(3.5日後もホールも色素の漏
れもなかった）が、ツイーン85のみが 100μｌを完全に
被覆した。他の２つの界面活性剤（ポリオキシエチレン
−９−ラウリルエーテルとBrij30）はコーティングして
いないチューブに対して部分的な改良を示した；50μｌ
を覆う蝋にホールは見られず、加熱前に色素の通過は直
ちには起きなかったが、数日間のインキュベートが必要
であった。この試験でスパン80は種々の理由で問題があ
ると判定された。

【０１５２】これだけが95〜97℃に加熱したとき上の水
層の通過と混合を妨げるようであった。従って他の試験
した界面活性剤または被覆に対してツイーン85が特に優
れた利点を示し、 100μｌの水を完全に覆うのに必要な
パラフィンの量を30〜35mgから約15mgへ低下させた。さ
らに 100μｌの水層を覆う15mgの蝋の層は、マイクロピ
ペットチップにより極めて容易に貫通された。しかし試
験したものは市販の何百とある化合物のうちほんの一部
であるから、試験していないもののなかにこの性能に匹
敵するかまたは越えるものがあると考えられる。

【０１５３】ツイーン85でコーティングしたチューブの
別の試験で、前述した界面活性剤コーティングスクリー
ニングのように、０％、0.34％そして 1.2％のツイーン
85を含有する 7.5mg、11.3mgそして15mgのパラフィン層
を用いた。今度は99℃で10分間に上の壁とチューブのキ
ャップに留出した水の量を測定した。この最後の基準は
蝋中のツイーン85のみからでも顕著な利点を示した（ツ
イーン85はまたチューブをコーティングしている）。界
面活性剤はまた、 7.5mgの蝋で50μｌの水溶液を完全に
覆うのを助けたが、11.3mgまたは 7.5mgで 100μｌを完
全に覆うことはできなかった。

【０１５４】同様の実験デザインを用いるツイーン85の
さらに別の実験で、56〜61℃融解性パラフィン中の１％
のツイーン85は、ツイーン85コーティングまたは非コー
ティングチューブとほぼ同様に作用した。しかしこの試
験では数日間の保存と実際のPCR 増幅を行なわなかっ
た。いずれの条件も蝋中ツイーン85のないツイーン85コ
ーティングチューブを使用するよりも良好な被覆を与
え、蝋中ツイーン85のない未処理のチューブを使用する
よりははるかに良好な被覆を与えた。

【０１５５】マイクロピペットの貫通と完全な被覆（蝋
中にホールがなく、熱サイクリング中に反応混合物から
の水の蒸発が最小である）という両方の基準によると、
パラフィンが１％のツイーン85を含む場合下の水層の容
量に対して好ましい蝋の量の組合せは以下の通りであ
る：25μｌの水に対してmg、50μｌの水に対して12mg、
75μｌの水に対して16mg、 100μｌの水に対して18mg、
150μｌの水に対して22mg、 200μｌの水に対して26m
g。これらの量は最小有効量より数mg多いが、分注され
る蝋の量と得られる性能にはばらつきがあるため、すべ
てのチューブが良好に作用することを保証してくれる。

【０１５６】例５．改良された蝋のPCR 増幅への効果ツイーン85を１−プロパノールに１重量％になるように
溶解した。このツイーン85−プロパノール溶液の約 0.5
mlを 500μｌのマイクロ遠心分離チューブに加え、室温
で約30分間インキュベートしてから、ガラスのパスツー
ルピペットで排水した。チューブを真空下（22インチH
g）で室温で30分間乾燥させた。56〜61℃融解性パラフ
ィン（アルドリッチケミカル（Aldrich Chemical Co.)
）中に70〜90℃でツイーン85を１％濃度で溶解した。

【０１５７】パラフィン中１％のツイーン85の14mgをSM
I マイクロ／ペッターで70〜90℃で溶解させた蝋から氷
の上のポリエチレン氷量ボートに分注した。硬化した蝋
の各14mgのペレットをそれぞれ別のツイーン85コーティ
ングした反応チューブに入れた。蝋含有チューブに50μ
ｌのプレミックスＡ（例１）を加え、これを70〜80℃で
約２分間インキュベートし、室温で空気冷却した。すべ
ての蝋層にホールはなかった。その上に6.71mMのMgCl₂
と充分量の30ゲノムコピーを含む精製ヒトゲノムDNA
(0.1ng) の60μｌを加えた。

【０１５８】これらの完了した反応チューブはパーキン
エルマーシータスインスツルメンツ（Perkin Elmer Cet
us Instruments) サーマルサイクラー中で以下の増幅プ
ログラムにかけた：98℃で１分、60℃で30秒、72℃で30
秒を２サイクル；94℃で１分、60℃で30秒、72℃で30秒
を35サイクル、そのあと72℃で10分間のインキュベー
ト。温度間の熱ジャンプはできるだけ早く行った。エチ
ジウム染色ゲル電気泳動は基本的に例１に記載した方法
である。16個の重複実験を行った。別の６つのチューブ
は蝋の代わりに鉱物油を含有していた；ここに60μｌの
DNA とMgCl₂をチューブへの添加と同時に直ちに50μｌ
のプレミックスＡと混合した。

【０１５９】もう１つの対照チューブは蝋を使用したが
DNA は添加せず、もう１つは油を使用したがDNA は添加
しなかった。ゲル電気泳動は、16個の蝋で覆った増幅は
予想された 240塩基対の特異的PCR 生成物と相当量のプ
ライマーダイマーを産生していることを示していた。６
つの対照は、うまく行った蝋で覆った増幅よりもわずか
に高い収率で特異的生成物を示していたが、蝋を使用し
た場合には全くなかった。例２に記載した91塩基対のミ
スプライミング非特異的生成物を示していた。試料DNA
を省略すると、プライマーダイマーの収率は正常にな
り、 240塩基対または91塩基対の生成物は検出されなか
った。蝋は油よりも幾分大きいプライマーダイマーを与
え、プライマーダイマーの収率もいくぶん高かった。

【０１６０】この実験は１％のツイーン85を含むパラフ
ィン14mgを 100μｌ（約80mg）の鉱物油の代わりに用い
ると、再現性のあるPCR 増幅が得られること、そして最
初の増幅サイクルまでMgCl₂と試料をPCR 試薬から分離
することができることを示していた。この増幅は例１〜
３に記載のものより有意に感度が高く、少なくとも 100
ゲノムコピーのHLA DQαDNA で開始した。

【０１６１】蝋の量を14から28mgに倍加させた同様の実
験では、特異的生成物の収率は低下しており、プライマ
ーダイマーの収率はほとんど正常であった。蝋の重層の
前に試料をプレミックスに加え蝋の上にMgCl₂のみをの
せた同様の実験（蝋14mg）では、特異的生成物の収率は
いくぶん高くかつ再現性があり、プライマーダイマーの
収率は低いようであったが、これは最初の１回または２
回のサイクルで試料が高温により長い時間さらされたた
めであろうと考えられる。蝋の上に60μｌの試料とMgCl
₂を置き50μｌのプレミックスを上に置いた同様の実験
でも、特異的生成物の収率は高く再現性があり、プライ
マーダイマーの収率は減少しているようであった。

【０１６２】これらの最後の反応ではより複雑な多種の
プライマーダイマーの収率を示し、油蒸気バリアーで見
られたものと似ていた。ツイーン85含有蝋を用いてツイ
ーン80コーティングチューブ中でMgCl₂と試料を他のPC
R 試薬から分離する通常の方法からのこれらの変更は、
蝋の量をさらに減らし、最初の熱サイクルが開始してか
ら反応物がさらに急速に混合するように蝋の融点を下げ
ることにより、さらに改良が可能であるかも知れないこ
とを示唆している。これらの変更や他の単純な変更（例
えば最初のサイクルの変性時間（現在98℃で１分）を延
ばす）も、最初のサイクルのDNA 変性を改良、従って収
率の増加に使用することができるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者レイモンド，ジョナサンアメリカ合衆国94602 カリフォルニア州オークランド，ロビンソンドライブ 3543 (72)発明者リード，アラン，アール. アメリカ合衆国94087 カリフォルニア州サニィベイル，ナンバーエイ，イー．レミントンドライブ 575

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】容器、PCR試薬のサブセットを含んで成
る第１の水性混合物、該第１の水性混合物中のPCR試薬
のサブセットに対して相補的な更なるPCR試薬のサブセ
ットを含んで成る第２の水性混合物、及び前記２つの水
性混合物を完全に分離するグリースまたは蝋の層を有す
る、PCR反応チューブ；但し、前記第１の水性混合物に
含まれる「 PCR 試薬のサブセット」は、ヌクレオシド３
リン酸、オリゴヌクレオチドプライマー、マグネシウム
化合物および DNA ポリメラーゼから成る試薬の組合わせ
であって、前記試薬の内少なくとも１種が欠けているも
のを意味し、そして前記第２の水性混合物に含まれる
「相補的な更なる PCR 試薬のサブセット」は、前記第１
の水生混合物に含まれる PCR 試薬のサブセットに欠けて
いる試薬を意味する。
【請求項２】核酸を含む試料を含んで成り、前記PCR
試薬の２つのサブセットのうちの１つと該試料とが混合
される、請求の範囲第１項に記載の反応チューブ。
【請求項３】前記PCR試薬の２つのサブセットの１つ
がマグネシウム化合物である、請求の範囲第１項又は２
項に記載の反応チューブ。
【請求項４】前記グリースが白色ペトロラタムを含ん
で成る、請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記
載の反応チューブ。
【請求項５】前記グリースまたは蝋が油と混合され、
得られる混合物が実質的にグリースまたは蝋の硬度を有
する、請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載
の反応チューブ。
【請求項６】グリースまたは蝋が非イオン性界面活性
剤と混合され、該グリースまたは蝋中の界面活性剤の濃
度が約 0.1重量％から１重量％の範囲である、請求の範
囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の反応チュー
ブ。
【請求項７】前記グリースまたは蝋がプラスチック粒
子と一緒にされ、該プラスチックの密度が約 0.6ｇ／ml
と約 1.1ｇ／mlの間であり、粒子の最大の大きさが約0.
01から１mmである、請求の範囲第１項〜第３項のいずれ
か１項に記載の反応チューブ。
【請求項８】前記グリースまたは蝋がプラスチックメ
ッシュと一緒にされ、該メッシュの孔の最大の大きさが
約0.01から１mmの範囲である、請求の範囲第１項〜第３
項のいずれか１項に記載の反応チューブ。
【請求項９】前記水性混合物の１つまたは両方が非イ
オン性界面活性剤を含む、請求の範囲第１項〜第８項の
いずれか１項に記載の反応チューブ。
【請求項１０】容器、ヌクレオシド３リン酸、オリゴ
ヌクレオチドプライマー、マグネシウム化合物および DN
A ポリメラーゼから成る群から選択される PCR試薬の水
性混合物、並びに該水性混合物をその上の空気から完全
に分離するのに充分な量のグリースまたは蝋を有する、
PCR反応チューブ。
【請求項１１】前記容器がプラスチックであり、該容
器の内表面が親水性である、請求の範囲第１項〜第10項
のいずれか１項に記載の反応チューブ。
【請求項１２】前記内表面が非イオン性界面活性剤で
コーティングすることにより親水性にされている、請求
の範囲第11項に記載の反応チューブ。
【請求項１３】前記プラスチックがポリプロピレンよ
りなる、請求の範囲第11項に記載の反応チューブ。
【請求項１４】前記グリースまたは蝋は、 PCR試薬の
サブセットの水溶液または懸濁液とのエマルジョンを含
んで成り、該グリースまたは蝋層の下の水性混合物は P
CR試薬の異なるサブセットを含む、請求の範囲第10項〜
第13項のいずれか１項に記載の反応チューブ。
【請求項１５】前記エマルジョン中の試薬のサブセッ
トがマグネシウム化合物である、請求の範囲第14項に記
載の反応チューブ。
【請求項１６】前記グリースまたは蝋が、蝋またはグ
リース中のマグネシウム及び脂肪酸の共役塩基の溶液を
含んで成り、該グリースまたは蝋層の下の水性混合物は
マグネシウムと異なる PCR試薬のサブセットを含んで成
る、請求の範囲第10項〜第15項のいずれか１項に記載の
反応チューブ。
【請求項１７】前記グリースまたは蝋が、グリースま
たは蝋中のヌクレオシド３リン酸の３級アルキルアンモ
ニウム塩の溶液を含んで成り、該グリースまたは蝋層の
下の水性混合物はグリースまたは蝋中に取り込まれた任
意のヌクレオシド３リン酸とは異なる PCR試薬のサブセ
ットを含んで成る、請求の範囲第10項〜第15項のいずれ
か１項に記載の反応チューブ。
【請求項１８】前記グリースまたは蝋が、グリースま
たは蝋中のオリゴヌクレオチドの３級アルキルアンモニ
ウム塩の溶液を含んで成り、該グリースまたは蝋層の下
の水性混合物はグリースまたは蝋中に取り込まれた任意
のオリゴヌクレオチドとは異なる PCR試薬のサブセット
を含んで成る、請求の範囲第10項〜第16項のいずれか１
項に記載の反応チューブ。
【請求項１９】前記グリースまたは蝋が、さらに非イ
オン性界面活性剤も含む、請求の範囲第10項〜18項のい
ずれか１項に記載の反応チューブ。
【請求項２０】前記水性混合物が、さらに試料も含
む、請求の範囲第10項〜第19項のいずれか１項に記載の
反応チューブ。
【請求項２１】（１）容器、（２）ヌクレオシド３リ
ン酸、オリゴヌクレオチドプライマー、マグネシウム化
合物および DNA ポリメラーゼから成る群から選択されるP
CR試薬、試料、および PCR生成物の水性混合物、（３）
水性混合物を完全に覆う蝋またはグリースの液体バリア
ー、並びに（４）蝋またはグリース層の上の第２の水性
混合物（ここで第２の混合物は PCR生成物と反応する試
薬であって修飾されたプライマー、内部プライマー、新
しい標的をめざしたプライマー、金属イオン、キレート
物質、新しい酵素、追加の核酸ポリメラ - ゼ、修飾また
は異常ヌクレオシド３リン酸、光試薬、増幅された核酸
に特異的に結合する剤、核酸プローブ、増幅されたまた
は１本鎖の核酸を捕捉、沈降または凝集させる剤、およ
び増幅された核酸の存在を知らせる分析信号の発生を助
ける剤から成る群から選択される試薬を含んで成る）を
有する、PCR反応チューブ。
【請求項２２】前記 PCR生成物と反応する試薬がイソ
ソラレン(isopsoralen)である、請求の範囲第21項に記
載の反応チューブ。
【請求項２３】前記第２の混合物が、さらにMg²⁺と結
合することができるキレート物質も含む、請求の範囲第
21項又は第22項に記載の反応チューブ。
【請求項２４】 PCR試薬の水性混合物を含有するプラ
スチック容器であって、該容器の内表面は親水性であ
り、該水性混合物は、該混合物をその上の空気から完全
に分離するのに充分な量のグリースまたは蝋の層により
覆われていることを特徴とするプラスチック容器。
【請求項２５】 PCR増幅のためのヌクレオシド３リン
酸、オリゴヌクレオチドプライマー、マグネシウム化合
物および DNA ポリメラーゼから成る群から選択されるPCR
試薬を含む１つまたはそれ以上の容器、及び容器中で行
われる PCR反応の露出された表面を覆うのに充分な量の
グリースまたは蝋を含むキット。
【請求項２６】ヌクレオシド３リン酸、オリゴヌクレ
オチドプライマー、マグネシウム化合物および DNA ポリ
メラーゼから成る試薬の組合わせであって、前記試薬の
内少なくとも１種が欠けているものである、PCR試薬の
１サブセットが導入されている、蝋またはグリースを含
んで成る組成物。
【請求項２７】容器に含まれる、ヌクレオシド３リン
酸、オリゴヌクレオチドプライマー、マグネシウム化合
物および DNA ポリメラーゼから成る群から選択されるPCR
試薬の水性混合物を、その上の雰囲気から分離するため
の蝋またはグリースの使用方法。
【請求項２８】総水性容量が約10から約 200μｌの間
の、PCR増幅中にヌクレオシド３リン酸、オリゴヌクレ
オチドプライマー、マグネシウム化合物および DNA ポリ
メラーゼから成る群から選択されるPCR試薬と試料を保
持するのに適した容器内に含有された、約５mgから約50
mgの範囲のグリースまたは蝋よりなる組成物。
【請求項２９】組成物は約40℃と約90℃の範囲で溶
け、界面活性剤は約 0.1％と約10％の間の濃度で蝋に溶
解される、非イオン性界面活性剤を混合した蝋よりなる
組成物：この組成物は第１の水性混合物と第２の水性混
合物とを分離するものであり、ここで、前記第１の水性
混合物は、ヌクレオシド３リン酸、オリゴヌクレオチド
プライマー、マグネシウム化合物および DNA ポリメラー
ゼから成る群から選択される試薬の組合わせであって、
前記試薬の内少なくとも１種が欠けている PCR 試薬の第
１のサブセットを含んで成り、そして前記第２の水性混
合物は、前記第１のサブセットで欠けている PCR 試薬の
第２のサブセットを含んで成る。
【請求項３０】混合物はヌクレオシド３リン酸、オ
リゴヌクレオチドプライマー、マグネシウム化合物およ
び DNA ポリメラーゼから成る群から選択されるPCR増幅に
必要な少なくとも１つの試薬を欠き、混合物は、約０℃
と約40℃の間の任意の温度で無菌で空気に対して遮断さ
れて保存される時少なくとも約１週間 PCRの実質的に完
全な活性を保持する、PCR試薬を含んでなる水性混合
物。