WO2007015502A1

WO2007015502A1 - 往復循環クロマトグラフィーを用いた生体高分子の単離方法

Info

Publication number: WO2007015502A1
Application number: PCT/JP2006/315271
Authority: WO
Inventors: Tsutomu Suzuki; Kenjyo Miyauchi
Original assignee: The University Of Tokyo
Priority date: 2005-08-03
Filing date: 2006-08-02
Publication date: 2007-02-08
Also published as: US20100047921A1; JPWO2007015502A1

Abstract

　本発明の目的は、多種類の生体高分子を同一の生体試料から同時に同じ条件で単離することを可能とする生体高分子の単離方法を提供することである。本発明によれば、（１）標的生体高分子と親和性を有する物質を保持した担体を含む容器を少なくとも２個以上用意し、標的生体高分子を含有する１つの試料溶液を上記少なくとも２個以上の容器内に同時に導入して、上記担体に上記試料溶液を接触させることによって標的生体高分子を上記担体に吸着させる工程；（２）上記容器から上記試料溶液を排出する工程；及び（３）排出した試料溶液を攪拌する工程；から成る工程を少なくとも２回以上繰り返すことを含む、生体高分子の単離方法が提供される。

Description

往復循環クロマトグラフィーを用いた生体高分子の単離方法技術分野

[0001] 本発明は、往復循環クロマトグラフィーを用いた生体高分子の単離方法に関する。

背景技術

[0002] 細胞内には DNA、 RNA及びタンパク質などの多数の生体高分子が存在し、生命活動を維持するための様々な役割を担っている。複雑な生命現象はこれらの生体高分子間の相互作用や情報交換によって生み出されている。ヒトゲノム配列の解析が完了し、タンパク質をコードする遺伝子の総数が約 22000個と見積もられた。この数は、従来の予測数である 30000〜35000個を大幅に下回るものであり、ショウジヨウバエの遺伝子数（20000個）と大差ないものであった。また、ヒトゲノムの 98%を占めるタンパク質をコードしない非コーディング領域から大量の転写産物が見つ力つたことは、ヒトゲノム解析のもう一つの成果である。実にこれらの領域の 2/3から RNAが転写されてヽることが判明している (Cawley S, Bekiranov S, Ng HH, Kapranov P, Sekinger EA, Ka mpa D, Piccolboni A, Sementchenko V, Cheng J, Williams AJ, Wheeler R, Wong B, Drenkow J, Yamanaka M, Patel S, Brubaker S, Tammana H, Helt G, Struhl K, Ginge ras TR. Cell. 2004 Feb 20;116(4):499- 509.)。これらの非コーディング RNA(ncRNA)は、タンパク質に翻訳されることなく存在し、機能性 RNAとして振舞うことが、最近の研究で明らかになりつつある。生命の複雑さとゲノムに存在する非コーディング領域の増加には明確な相関が見られ (Taft, R.J. and Mattick, J.S. (2003) [online]http://arXiv. org/abs/q-bio/0401020),高度な生命現象の源は ncRNAが担って!/、る可能性が指摘されている。マイクロ RNA (miRNA)は、 ncRNAの中で最も解析が進んでいる機能性 RNAである。 miRNAは特定の mRNAの 3 '非翻訳領域に相補的に結合し、 mRNAの翻訳抑制と RNA干渉 (RNAi; RNA interference)による分解を誘導し、発生のタイミングや分化の方向性を決定する重要な分子として注目されている (He L, Hannon GJ. Micro RNAs: small RNAs with a Dig role in gene regulation. Nat Rev Genet. 2004 Jul;5(7): 522-31.)。また、核内に存在する ncRNA力 ¾NAのメチル化やクロマチン修飾を誘導し、ェピジェネティックな遺伝子発現の制御に大きな役割を果たして、ることが明らかになりつつある (Matzke MA, Birchler JA. RNAi— mediated pathways in the nucleus. Nat Rev Genet. 2005 Jan;6(l):24- 35.)。このように、 ncRNAは、遺伝子発現において翻訳制御のみならず、転写レベルでの制御にも積極的に関与していることが明ら力となり、 DNA→RNA→タンパク質という古典的なセントラルドグマが大きく塗り替えられようとしている。大量に存在する ncRNAの中には未知の機能性 RNAが存在している。複雑な生命活動を分子レベルで理解するためには、これら新規な機能性 RNAの探索とその解析が重要な鍵を握っているはずである。 RNA研究は今や、次世代の生命科学におけるパラダイムの形成に根幹的な役割を担いつつある。

[0003] 機能性 RNAの研究には、 RNAを単なる配列情報として解析する従来型の研究手法では不十分である。 RNAは転写後に、様々な転写後修飾が施されて成熟し始めてその本来の機能を発揮することが知られて、る。現在までに約 100種類の RNA修飾が報告されており (http：〃 medstat.med.utah.edu/RNAmods/)、 RNAが機能する上でこれらの RNA修飾は見過ごすことのできな、重要な質的情報である。 RNA修飾の果たす役割としては、細胞内局在の決定、立体構造の安定化、 RNA結合タンパク質との相互作用、遺伝情報の修飾と解読などが知られている (Suzuki, T. (2005) Biosynthesi s and function of tRNA wobble modifications. In Fine-tuning of RNA functions by mo dification and editing Topics in Current Genetics, vol. 12, Springer— Verlag, NY pg 2 4- 69)が、その機能と生合成は未解明な部分が多く残されている。 RNAの機能を正しく理解するためには、 RNAを"情報"として捉える従来型の解析手法では不十分であり、 RNA分子をタンパク質と同様に"もの"として捉える新しい方法論の確立が不可欠である。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] ポストゲノム時代を迎え、タンパク質や RNAなどの生体高分子の網羅的な解析が生命科学や医療 ·診断などの幅広い分野において重要な研究対象になりつつある。これら生体高分子の機能を明らかにするためには、生体内に存在する微量なタンパク質や RNAを全自動で単離精製するための手法の確立が不可欠である。しかしながら、微量の RNAの単離精製は難易度が高ぐ一般的な手法は存在しない。本発明は、多種類の生体高分子を同一の生体試料力同時に同じ条件で単離することを可能とする生体高分子の単離方法を提供することを解決すべき課題とした。

課題を解決するための手段

[0005] 本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、往復循環クロマトグラフィーという新しい概念に想到し、本発明を完成するに至った。

[0006] 即ち、本発明によれば、（1)標的生体高分子と親和性を有する物質を保持した担体を含む容器を少なくとも 2個以上用意し、標的生体高分子を含有する 1つの試料溶液を上記少なくとも 2個以上の容器内に同時に導入して、上記担体に上記試料溶液を接触させることによって標的生体高分子を上記担体に吸着させる工程；

(2)上記容器から上記試料溶液を排出する工程;及び

(3)排出した試料溶液を攪拌する工程；

力成る工程を少なくとも 2回以上繰り返すことを含む、生体高分子の単離方法が提供される。

[0007] 好ましくは、本発明の生体高分子の単離方法は、上記（1)〜（3)の工程を少なくとも 2回以上繰り返した後に、上記担体を洗浄液で洗浄し、さらに溶出液を流すことによって標的生体高分子を回収することを含む。

[0008] 好ましくは、少なくとも 8個以上の容器を使用する。

好ましくは、標的生体高分子と親和性を有する物質として複数種の異なる物質を使用する。

好ましくは、標的生体高分子は、核酸又はタンパク質である。

好ましくは、上記（1)〜（3)の工程を少なくとも 10回以上繰り返す。

好ましくは、上記工程（3)において、ピペッティング、攪拌子の使用、又は容器の振盪の何れかの手段により排出した試料溶液を攪拌する。

好ましくは、ピペッティングにより、上記工程（2)と（3)を同時に行う。

好ましくは、容器はチップ又はカラムである。

[0009] 本発明の別の側面によれば、標的生体高分子と親和性を有する物質を保持した担体を収容するための少なくとも 2個以上の担体収容容器；標的生体高分子を含有する 1つの試料溶液を収容するための試料収容容器；試料溶液を担体収容容器内に導入するための手段；

担体収容容器内に導入された試料溶液を担体収容容器外に排出するための手段；及び試料収容容器内の試料溶液を攪拌する手段；

を含む、本発明の方法によって生体高分子を単離するための装置が提供される。発明を実施するための最良の形態

[0010] 以下、本発明の実施の形態についてさらに詳細に説明する。

(1)往復循環クロマトグラフィー

本発明による生体高分子の単離方法は、（1)標的生体高分子と親和性を有する物質を保持した担体を含む容器を少なくとも 2個以上用意し、標的生体高分子を含有する 1つの試料溶液を上記少なくとも 2個以上の容器内に同時に導入して、上記担体に上記試料溶液を接触させることによって標的生体高分子を上記担体に吸着させる工程；

(2)上記容器から上記試料溶液を排出する工程;及び

(3)排出した試料溶液を攪拌する工程；

力成る工程を少なくとも 2回以上繰り返すことを含むことを特徴とする。

[0011] 本発明の方法は、往復循環クロマトグラフィーに基づくものである。往復循環クロマトグラフィ一の概要を図 1に示す。本発明の往復循環クロマトグラフィーは、マルチピぺッターが搭載された自動分注機を用い、試料を多検体のァフィユティーチップで同時に吸引、吐出、攪拌を繰り返すことで、全ての試料溶液を全てのァフィ-ティーチップに均一に循環させることを基本原理としている。異なる標的分子に対する複数のァフィユティーチップ (RNAの精製には DNA固相化榭脂）をマルチピぺッターに装着することで、試料溶液を同時に複数のァフィユティーチップに導入することが可能である。また、吸引と吐出後に試料溶液を撹拌させることで、原理的に吸引吐出量の数十倍の試料溶液からの精製が可能となる。また、本発明の方法は、ァフィ-ティーチップの作成が容易である点、吸着、洗浄、溶出の全工程の自動化が可能である点が特に優れている。さらに、マルチピぺッターの本数を増やすことで同時に精製する検体数の拡張が容易である点が挙げられる。本明細書中後記する実施例では、 8検体用自動分注機をベースとし、 DNA固相化榭脂を詰めたチップカラムを用いることにより、全自動 RNA精製装置を用いている。モデルを立てて往復循環クロマトグラフィーの理論式 (本明細書中において後述する）を構築したところ、カラムに固相化したリガンド (DNAや抗体)と標的分子 (RNAやタンパク質）とのァフィユティー (平衡定数)により、最終的な収率と充分な精製に必要な往復循環の回数を見積もることが可能である。一度に吸引する量やチップカラムの本数などを変化させた場合でも必要回数などの算出が容易である。このモデルの妥当性は実験的に確かめられて、る。

[0012] 本発明で用いる標的生体高分子と親和性を有する物質とは、標的生体高分子が特異的に結合する物質である。例えば、核酸の塩基配列、タンパク質サブユニット、酵素阻害剤、ホルモン、神経伝達物質等の種々の薬剤等が挙げられる。標的生体高分子と親和性を有する物質の担体への結合は、ァフィユティークロマトグラフィーの担体の作成に関して通常行われる方法によって行うことができる。

[0013] 本発明の方法は、ァフィ二ティークロマトグラフィーに基づいている。ァフィ二ティークロマトグラフィーは、通常には、試料中の標的生体高分子を、親和性による結合が生じる条件で、担体に結合させたリガンド (即ち、標的生体高分子と親和性を有する物質）に接触させ、担体を洗浄して夾雑物を除去した後、リガンドに結合した標的生体高分子を溶出 (脱離)させることによって行うことができる。ここで、洗浄および溶出は、通常、カラムに担体を充填して洗浄液および溶出液をカラムに流すことによって行われる。洗浄液および溶出液を流すことによりカラム力流出する液を分取し、各画分に含まれる標的生体高分子を定量することによりクロマトグラムが作成される。ク口マトグラムは、通常、縦軸に標的生体高分子量 (相対量であってもよい）、横軸に溶出液量 (溶出液量が時間に依存する場合には溶出時間であってもよい）をとつて作成することができる。

[0014] 生体高分子としては、特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、蛋白質、リポ蛋白、糖蛋白、ポリペプチド、脂質、多糖類、リポ多糖類、核酸又はこれらの複合体などが挙げられる。

[0015] 標的生体高分子を含有する試料溶液の種類は特に限定されないが、例えば、生体力分離された体液 (例えば、血液、唾液など）、生体組織の抽出液、細胞抽出液、又はこれらの処理物などが挙げられる。

[0016] (2)往復循環クロマトグラフィーの理論式の説明

往復循環の回数と最終的な収率との関係を調べるために、往復循環クロマトグラフィ一のモデルを立て、理論式を構築した。必要なピペッティング回数の見積を行うために、「物理的に液が循環する効率」 +「結合の速さ、効率」を考慮した理論式をたてた。最終的に、 n回ピペッティングした後のチップへの結合量 Nn、（あるいはチップの被覆率 θ n)に関する漸ィ匕式が得られた。各パラメータ一は以下のように設定した。

[0017] L：全サンプルの液量（リザーバーに入れた量）

1： 1回の操作で 1つのチップが吸う液量

n：ピペッティングの回数

Nn： n回後のチップへの結合量

Nmax：チップの最大結合量

Cn： n回後の溶液の濃度 (取りたい物質の濃度）

Cn'(t)： n回目のピペッティング中、吸引された溶液の濃度

(時間変化する Cn (0)=Cn-l)

θ n： n回後の被覆率チップの結合可能サイトのうち、結合している割合（ 0 n = Nn / Nmax, 0 0 = 0)

ka, kd：速度定数， K:平衡定数

[0018] 理論式 1；迅速に平衡に達することを仮定した場合

図 2に示したように、リザーバーに濃度 Cn,液量 Lの液があり、チップにはすでに θ n の割合で目的物が結合している。そこから、液量 1をチップに吸引する。実際にはチップの吸引速度、所要時間等も結合率に影響すると考えられるが、数式ィ匕が難しいため、榭脂と吸引した液が均一に混ざっている状態に置き換えて近似した。液量 1の液中に濃度 Cn'の目的物と結合率が θ nの榭脂があり、目的物の結合反応が進行していく。 Cnと θ nは時間により変化する値である。このまま、反応速度式をたてて計算していくことも可能である力ここでは迅速に平衡に達することを仮定し、簡便に式を導出する。液量えを吸引し榭脂の中で平衡に達した後、液量 1で濃度 Cn'の溶液を吐出すると、吐出された溶液とリザーバーに残った液が混合し、最終的に濃度 Cn、液量 Lの溶液ができる（式 1)。

[0019] [化 1]

(式 1 ) し

L

[0020] 次に Cnと Cn-1、または θ nと θ n-1の関係式を求める。まず、吸引中の樹脂と液が混合した状態について、平衡を仮定して反応式をたてると (式 2)のようになる。平衡定数を Kとすると式 3が得られる。また、チップ中に吸引された液に関する収支力も Cn' の式 (式 4)が得られ、全体の収支力 Cnと θ nの関係式 5が得られる。また、最初は何も結合してヽな、ので Θ =0である（式 6)。

0

[0021] [化 2]

(式 2 )

RNA/protein + Ligand ^ Complex

Κ

(式 3 )

(式 4 )

£Cn、= £Cn - ϊ + Ν θη _ I— Ν

(式 5 )

(式 6 )

^₀ = 0

[0022] 式 3に式 4と 5を代入すると 2次方程式になり、 0 nについて解くと最終的に次のような式になる（式 7)。 2解のうち大きい方は、 1より大なので 1つの解に定まる。 Bnを以下のように定義した (式 8)。（これは n回目の吸引中にチップ中に存在する目的物の合計量を表している）

[化 3]

(式 7 )

(式 8 )

Bn― し η ~ \ + Ν ταακ θη - Ι

[0024] チップの最大結合量 (Nmax)と平衡定数 Κがわかれば、 θ η-1から θ ηが計算できるので、各回の結合量が計算できる。

Κ→∞とすると、吸った物が 100%結合する場合の θ ηの式が得られる（結合の最大値) [0025] [化 4]

Bn≥Nmaxのとき (¾ = 1

Bnく Nmaxのとき & = &ー ι + C" - i/N max

[0026] 平衡定数 Kにより必要な回数、取れる量が変化する。図 3はチップ結合量とサンプル中の目的物の量が等しい場合の Kによる変化である。（サンプルの量を過剰にして、チップの結合最大量 Nmaxを見積もったあと、サンプル量を適当な値にして操作を行えば Kの値を求めることができる）平衡定数 Kは操作の条件等も含めた見かけの値であり、厳密な平衡定数とは異なる力チップへの結合力を見積もることは可能である。

[0027] 理論式 2；反応速度を考慮した場合

反応速度を考慮する場合 (モデルは同じ）

平衡ではなく反応速度を考慮する場合は、以下のような反応式になる。（式 9) 式 9から反応速度式をたてると式 10が得られる。

[0028] [化 5] ka

RN A/protein + Ligand ' 4 Complex

(probe) kd

Cn，(t) 1-ΘΆ{Χ) ^(t)

(式 10)

[0029] 以下は収支と初期条件に関する式

[0030] [化 6]

(式 11)

(式 12)

(式 13) Ν皿 6n(f)

[0031] 式 10の微分方程式を n回目の吸引中について解く。収支の関係式を代入し、 Θについて解くと次のような式になる。

[0032] [化 7]

(式 14)

^ ) {θ,η-θη- l)bn e pjy N max(««一 bn)t)一 η η -θη-l)

( η— θη 1) exp{y Ν max(an― bn)t]—ゆ n— θη -])

[0033] an、 bn、 Bnは以下のように定義した。

Bnは n回目の吸引中にチップ中に存在する目的物の合計量を表して、る。

bnは n回目中に達成できる最大の Θを表している。 [0034] [化 8]

[0035] [化 9]

(式 1 5 )

+ N + ） + ^β" + N + ²— 4N max

(式 1 6 )

(式 1 7 ) " = ^ " i + N匪 - i = C。 + (卜 " 1

[0036] (3)本発明の利用

本発明によれば、単一検体ある!、は多検体を用いて全自動ァフィ-ティカラム精製を行うことが可能である。抗体やリガンドをカラムに固定ィ匕することにより、タンパク質（転写因子、ガン遺伝子産物、アポトーシス関連タンパク質など)の多検体の同時精製が可能である。相補的な DNAや RNAをカラムに固定化することにより、 RNA(non-codi ng RNA, mRNA)や DNAの多検体同時精製が可能である。また、チップカラム先端をアレイィ匕することにより、大量なサンプルを用いたマイクロアレイ解析が可能である。また、タンパク質、 RNA、 DNAをカラムに固定ィ匕することにより相互作用するタンパク質複合体、 RNA結合タンパク質、 DNA結合タンパク質を多検体同時に精製することが可能である。あるいは、各種レクチンタンパク質をカラムに固定ィ匕することにより、糖鎖、糖タンパク質、糖脂質の多検体同時精製が可能である。各種糖鎖をカラムに固定化することにより相互作用するタンパク質を多検体同時に精製することも可能である。以上の方法を用いることにより、疾患、組織、発生や分化で変動する細胞の時系列的な解析が可能である。

[0037] さらに、化合物ライブラリーを固定ィ匕することにより相互作用するタンパク質を解析する（ケミカルターゲティングプロテオーム)ことができる。また、修飾ヒストン、転写因子、核内タンパク質などに対する抗体を固定ィ匕することにより、多検体同時クロマチン免疫沈降 (マルチ ChIP)が可能であり、それを応用したェピジェネティックアレイも可能である。また、 RNA結合タンパク質に対する抗体を固定ィ匕し、精製したタンパク質に結合している RNAを解析することができる。また、単一タンパク質に結合する抗体やリガンドを固相化することによりリガンド間の結合能比較解析が可能である。

(4)往復循環クロマトグラフィーを利用したマルチ ChIP法

本発明のもう一つのアプリケーションは、往復循環クロマトグラフィーの利点を生かし、ゲノムワイドなェピジェネティックス制御系を解析するための新、手法 (ェピジエネティックアレイ）を開発することにある。個体を形成するすべての細胞が同一の遺伝情報を保持しながら、いかにして異なった形質を獲得する力を明らかにすることは、ポストゲノム時代における最重要課題の一つである。ェピジェネティックスとは DNA配列の変化を伴わな、遺伝子機能の変化を研究する学問領域である。主に DNAのメチルイ匕とヒストン修飾によるクロマチンの構造変化がゲノムワイドな遺伝子の発現制御をコントロールすることが知られている。クロマチンは、ヌクレオノームの繰り返し構造力 Sらせん状につながったものである。ヌクレオソームは 4種類のヒストンタンパク質 (H2 A, H2B, H3, H4)がそれぞれ 2分子力なるヒストンォクタマーに 146塩基対の DNAが約 2回転巻き付、た構造をとつて、る。ヒストンはヌクレオノームの中心部を形成するコアヒストンと N末端のヒストンテール力成っており、ヒストンテール部分に様々な翻訳後修飾を受けることでクロマチンの構造変化を誘起し、遺伝子発現を制御して、ることが知られている（図 4)。例えば、ヒストン H3の K9と K14のァセチル化は、転写誘導と密接な相関があることが知られており、逆に K9のメチル化は遺伝子のサイレンシングに関わっている。さら〖こ、ヒストンはァセチルイ匕以外にもメチルイ匕やリン酸ィ匕さらにはュビキチンィ匕などの様々な修飾を受け、転写の制御、サイレンシング、クロマチン凝縮などに関わっている。現在までに、ヒストンテール部分に約 30種類の修飾が報告されている（図 4)。また最近、コアヒストン部分にもさらに 30種類程度の修飾が見出されている。どのヒストンのどのアミノ酸残基がどのような修飾を受けている力、さらにその組み合わせによって、複雑な遺伝子の発現制御が発揮されると考えられている（ヒストン暗号仮説)。また最近の研究で、 RNAiがヒストン修飾に深く関わっていることが明らかになりつつあり、拡大する RNA研究とェピジェネティックス制御系が融合しつつある。

クロマチン免疫沈降法（ChIP法； chromatin immunoprecipitation)は、様々なヒストン修飾を指標にヌクレオソームを免疫沈降法で精製し、巻きついている DNAを解析する手法であり、遺伝子発現調節やクロマチンの構造変換などを解析する上で不可欠な方法である。抗修飾ヒストン抗体に加え、様々な DNA結合性転写因子や非結合性タンパク質に対する抗体も用いることができ、クロマチン上でのヒストンの修飾状態の変化や局在するタンパク質の解析が可能である。現在は、抗修飾ヒストン抗体を榭脂に固定ィ匕し、断片化したヌクレオソームをバッチ法で精製する手法が一般的である。この方法は簡便ではあるものの、原理的に吸着や洗浄の条件を一定に保つことが難しく高い再現性や定量性を重視した解析には不向きである。そこで我々は、往復循環クロマトグラフィーを用いた、全自動多検体クロマチン免疫沈降法 (マルチ ChIP法）

(図 5)の開発を目指して、る。 ChIP法を自動化することで温度や時間の制御が容易になり、高い再現性と定量性が期待できる。さらに、同一試料力も複数種類の標的分子を単離できると、う往復循環クロマトグラフィーの特徴を生かし、異なる抗修飾ヒストン抗体を固相化したァフィユティーチップを用い、同一の試料から複数種類の修飾ヌクレオソームを単離できるという大きなメリットがある。例えば、 48検体用の往復循環ク口マトグラフィーを用い、 48種類の抗修飾ヒストン抗体のァフィユティーチップを搭載すれば、ほぼ全種類の修飾ヌクレオノームが同時にかつ同条件で精製できることが期待できる。患者由来の細胞や組織など限られた試料カゝら多種類のヌクレオソームが全自動で精製可能である点はこの手法の最大のメリットである。単離した各ヌクレォソームカも卷きついている DNAを引き離し、疾患関連遺伝子や発生'分化に関与する遺伝子のプロモーター領域を増幅するプライマーセットで PCRを行えば、ゲノムワイドにクロマチンの修飾状態や対象遺伝子の発現変動をモニターすることができる

(図 5)。あるいは、精製したヌクレオノームの DNAを増幅後に蛍光標識を行うことで、ゲノムタイリングアレイなど DNAチップ上での検出も可能である。マルチ ChIP法とァレィを組み合わせるこの新し、方法は、ェピジェネティックアレイとも称する。 [0040] (5)本発明の特徴

ゲノムプロジェクトの成果により、全遺伝子の発現変動を網羅的に解析するための新ヽ手法やツールが開発されて、る。 DNAチップに代表されるトランスクリプトーム解析は全 mRNAの発現変動解析を行う手段として有効である。 ncRNAにつ!/、ても網羅的な発現変動解析を行うためのマイクロアレイ技術 (ゲノムタイリングアレイも含む）が開発されつつある。し力し、これらの手法は、それぞれ mRNAや ncRNAの発現量を解析する手法であり、あくまでも「量的な変化」を捉えるものある。ところが、前述したように機能性 RNAは修飾により機能を獲得することがしられており、「質的な変化」を捉える新し、手法の開発が必要である。 RNA分子を精製することは質的な解析を行うための第一歩であるが、微量な RNAを精製するための方法は存在しない。本発明の方法によれば、微量な RNAを単離精製し、解析することができる。本発明による往復循環クロマトグラフィーに基づ、た生体高分子の単離方法によれば、全自動機能性 RN A精製装置を実現することができる。また、 ChIP法はすでに確立された技術であるが、同一の試料から多種類のヌクレオソームを単離精製する技術は存在しない。本発明による往復循環クロマトグラフィーを応用したマルチ ChIP法とェピジェネティックァレイは、ゲノムワイドなクロマチンの構造変化を捉える完全に新規な技術であり、研究ツールのみならず医療の分野における診断装置などの開発につながるものである。

[0041] 以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明する力本発明は実施例によつて限定されるものではない。

実施例

[0042] 実施例 1：往復循環クロマトグラフィーによる 3種類の大腸菌トランスファー RNA(tRNA) の同時精製

(1)チップの作成

各 tRNAの配列に相補的な 3'末ビォチン化 DNAプローブを Streptavidin Sepharose HP (アマシャム)榭脂に定法に従、結合させた。

[0043] 用いたプローブの配列

tRNA^Lys用： TGGGTCGTGCAGGATTCGAACCTGCGACCA (配列番号 1) tRNA ^lu用： CGTCCCCTAGGGGATTCGAACCCCTGTTA (配列番号 2) tRNA^Asp用： CGGAACGGACGGGACTCGAACCCGCGACCC (配列番号 3)

[0044] tRNA^Lys用： 1.20 A260unit / 50 μ \榭脂

tRNA^Glu用： 1.13 A260unit / 50 μ \榭脂

tRNA^Asp用： 0.40 A260unit / 50 μ \榭脂

[0045] それぞれ 300 μ 1チップにフィルターを詰め、それぞれのプローブが結合済みの榭脂を 50 1詰めた。その上にもう 1枚上部用のフィルターをやや隙間がある程度にはめた。

[0046] (2)榭脂への結合

試料溶液として、大腸菌の total RNAをイオン交換クロマトグラフィーで部分精製した RNA混合溶液を用いた。 3つのチップを 8連の手動ピペットに装着し、 6xNHE buffer (20xNHEの組成は、 lOOmM HEPES- KOH (pH7.5)、 50mM EDTA、 4M NaClである）に漬けて数回ピペッティングを行い、平衡化した。試料溶液は金属製の恒温槽に入れ 70°Cに加熱した。チップを 70°Cに保った試料溶液中に漬け、 15回、 200 /z lの吸引、吐出を繰り返した。 1サイクルごとに容器を振り攪拌を行った。

[0047] (3)洗浄

O. lxNHE buffer 4mlを入れた容器にチップを漬け、手動で 5回吸引、吐出を繰り返した。更に、丸底プレートに O. lxNHE buffer 200 μ 1を各チップに対し、それぞれ 8ゥエル分ずつ用意し、各チップ個別の液にて washを行った。各ゥヱルごとに 2回のピぺッティングを行った。

[0048] (4)溶出

溶出は各チップ別々に行った。金属製の恒温槽で 65°Cに保たれた O. lxNHE buffer lmlにチップを漬け、 6回吸引、吐出を繰り返した。更に 300 1の O. lxNHE bufferで洗い、溶出液に合わせた。溶出後は、 Mgイオン存在下でアニーリングを行って構造の巻き戻しを行い、エタノール沈澱で精製物を回収した。

[0049] (5)精製できた量

tRNA^Lys: 0.226 Au

tRNA^Glu: 0.421 Au

tRNA^Asp: 0.324 Au [0050] それぞれの精製度をポリアクリルアミドゲル電気泳動 (図 6)とアミノアシルイ匕の活性で確認し、ほぼ単一に精製できてヽることが確認できた。

[0051] 実施例 2：大腸菌の 8種の tRNAの同時自動単離精製

往復循環クロマトグラフィー装置を用いて、大腸菌の tRNAの 8種にっ、て同時自動単離精製を行った。大腸菌 tRNA^M tRNA^Met、 tRNA^Phe、 tRNA"™¹ tRNA^Pro2、 tRNA"™³ 、 tRNA^S∞、 tRNA^Trpをターゲットとした。

[0052] (1)往復循環クロマトグラフィー装置の作成につ！、て

往復循環クロマトグラフィー装置は、 8連マルチチャンネル分注機 NSP-mini (二チリヨ一）を元に、以下の部品を組み合わせて作成した。

サンプル攪拌用ポンプ： PSP170AAペリスタルティックポンプ (ADVANTEC) 水補給用ポンプ： QVG50- H1CTC- LF型 FMIポンプ（山善）

温度制御装置：バイオセル温度制御装置 BSTC-1型および BSTC-2型 (インテックス、坂口技研）

プログラム作成用パソコン（Windows)

[0053] PSP170AAは、外部からの信号で ON、 OFFの制御が可能である。 I/Oターミナルを NSP-miniの I/Oコネクタと接続し、分注機側のプログラムでポンプの送液方向および ON、 OFFを制御できるようにした。

バイオセル温度制御装置は、 96穴のヒートブロック 2個（坂口技研）、 2ml往復循環恒温槽 (坂口技研） 1個を温度制御装置に接続できるようになつている。 96穴ヒートブロックには 1.1mlチューブ、往復循環恒温槽にはプラスチック製 2mlリザーバーを装着できるようになっている。

FMIポンプは、蒸発した水を補うためのポンプで、往復循環槽に水を供給する。必要に応じて手動で動作させた。

動作プログラムはパソコン上で NSS-miniエディター（二チリョー）を用いて作成し、分注機側に転送した。

[0054] 使用した buffer:

20 X NHE Buffer

4M NaCl lOOmM HEPES-KOH (pH7.5)

50mM EDTA (pH8.0)

[0055] 6 X NHE、 2 X NHE、 0.5 X NHE、 0.1 X NHEは、上記 20 X NHEを希釈して使用した。

tRNAを含む溶液には、ジチオスレィトール（DTT)を 0.5%になるように加えた。また、チップを保存する場合は、アジィ匕ナトリウムを濃度が 0.1 %になるように加えて保存した。

[0056] (2)チップカラムの作成

RNAを結合させるチップは、市販の榭脂を詰めて作成した。

300 μ 1チップ (Axygen)の先に石英綿を少し詰め、水を通した後、 Streptavidin Sep harose HP (アマシャム）の 50%懸濁液 70 μ 1を入れた。しばらく静置し、榭脂が沈んだ後、チップに液が満ちるように bufferを入れ、更に空気が入らないように石英綿を少量乗せ、棒で軽く押し込み榭脂の上下を石英綿ではさむ形にした。榭脂ゃ石英綿が上方に抜けないようにシリコンチューブ（内径 2mm、外径 4mm)を長さ l〜2mmに切ったものを上力詰め、石英綿に密着させた。チップに 6 X NHEを通して bufferを置換し、液が枯れないよう適当な量の bufferが常にチップの上方にある状態にして次の段階に進んだ。

[0057] (3)プローブの固定ィ匕

プローブは、 3 '-ピオチン修飾された 30merのオリゴ DNA (北海道システムサイエンス )を用い、アビジンとピオチンの相互作用を利用して榭脂と結合した。配列は各 tRNA に相補的なものを、それぞれの tRNAにできるだけ特異的なものとなるようにデザインした。

<用いたプローブの配列 >

Met TGGCTACGACGGGATTCGAACCTGTGACCC (配列番号 4)

IMet GTTATGAGCCCGACGAGCTACCAGGCTGCT (配列番号 5)

Phe TGCCCGGACTCGGAATCGAACCAAGGACAC (配列番号 6)

Prol CCTTCGTCCCGAACGAAGTGCGCTACCAGG (配列番号 7)

Pro2 CCCGACACCCCATGACGGTGCGCTACCAGG (配列番号 8)

Pro3 CACTGGTCCCAAACCAGTTGCGCTACCAAG (配列番号 9) Sec CGGAAGATCACAGGAGTCGAACCTGCCCGG (配列番号 10)

Trp CAGGGGCGGAGAGACTCGAACTCCCAACAC (配列番号 11)

[0058] チップへのプローブの結合は分注機で行った。

分注機上に、 96穴丸底プレートを置き、 1列目にそれぞれのプローブ 2 OD unitを終濃度 2 X NHE、液量 240 1となるように調製した。また、洗浄用に 96穴ヒートブロックに、 2 X NHEを 400 1ずつ分注し、 40°Cに加熱しておく。（チップ 1本あたり 12本の 2 X NHEを使用する。 )平衡ィ匕用リザーバーに 2 X NHEを入れた。

[0059] 次に、次のようなプログラムを作成し、分注機に実行させた。

(i)平衡化：リザーバーで 2 X NHEを 3回ピペッティング

(ii)結合：プレートのプローブ溶液を 20回ピペッティング

(iii)洗浄： 40°Cで 400 1の 2 X NHEを 3回ピペッティング（洗浄は、新しいチューブに移動して全部で 12回繰り返し）

[0060] 各画分につき、吸光度を測定し洗浄が十分かを確認するとともに、プローブの結合量を算出した。結果を以下に示す。

[0061] [表 1]

[0062] (4)往復循環による tRNAの精製

往復循環槽には大腸菌 tRNA (ロシュ） 400 OD unitを終濃度 6 X NHE 0.5%DTT、液量 2mlになるように調製した。片方のヒートブロックには、洗浄用の 0.5 X NHE 0.5% DTTを 400 μ 1ずつ 96本、もう片方には溶出用の 0.1 X NHE 0.5%DTTを 400 μ 1ずつ 48 本分注した。リザーバーには 6 Χ ΝΗΕ 0.5%DTTを用意した。往復循環槽は 70°C、洗浄用のヒートブロックは 40°C、溶出用は 68°Cに設定した。攪拌用のペリスタポンプ、チユーブを設置し、チューブの片側を往復循環槽に、もう片側を溶液を一時的に貯める容器につないだ。攪拌時には往復循環槽の溶液を一度もう一方の容器に全て移し、溶液を均一化させる。その後、ペリスタポンプを逆回転させ溶液を元の往復循環槽へ戻す。また、水補給用のポンプを攪拌時に使用する容器に水を供給するように接続した。往復循環槽に tRNA溶液がある間、なるべく液量が変化しないように適当な速度でポンプを運転させた。

次に、次のようなプログラムを作成し分注機に実行させた。

[0063] (i)平衡化：リザーバーで 6 X NHEを 3回ピペッティング

(ii)往復循環: tRNA溶液を 40回ピペッティング、 1回ピペッティングするごとに溶液をペリスタポンプで吸って戻し、攪拌する。溶液温度が 66°C程度を維持するように待ち時間を設定した。

(iii)洗浄： 40°Cで 400 μ 1の 0.5 X ΝΗΕを 3回ずっピペッティング（順次新 U、チューブに移動し、全部で 12回繰り返す）

(iv)溶出： 68°Cで 400 1の 0.1 X NHEを 3回ずっピペッティング（順次新、チューブに移動し、全部で 6回繰り返す）

[0064] 各画分につき、吸光度を測定し洗浄が十分かを確認した後、溶出された各 RNAをエタノール沈殿を行って回収し、吸光度を測定した。結果を以下に示す。

[0065] [表 2]

[0066] ポリアクリルアミド電気泳動を行、、 tRNA ^を除きほぼ単一に近、精製度で各 RNA が得られていることを確認した。さらにポリアクリルアミドゲルカも切り出し精製し、 RNa se T1消化を行った物を LC/MSで解析し、目的物であることを確認した。

[0067] 実施例 3：出芽酵母の 8種の非コード RNAの同時自動単離精製

往復循環クロマトグラフィー装置を用いて、出芽酵母 (S. cerevisiae)の非コード RNA( non-coding RNA)の 8種について同時自動単離精製を行った。 U4 RNA、 U6 RNA、 7 SL RNA (SCR1)、 SNR5、 SNR9、 SNR128、 SNR190、ミトコンドリア tRNA^Metをターゲットとした。

[0068] <用いたプローブの配列 > U4 RNA CACTGATATGCGTATTTCCCGTGCATAAGG (配列番号 12) U6 RNA CATCCTTATGCAGGGGAACTGCTGATCATC (配列番号 13) SCR1 ACGCTGGATAAAACTCCCCTAACAGCGGTG (配列番号 14)

SNR5 TATAGACATATGGAGGCGTGATGTCTTAAG (配列番号 15)

SNR9 GACTAATGATAGGTGGGTCAGGATATCAGC (配列番号 16)

SNR128 CCGTGGAAACTGCGAATGTTAAGGAACCAG (配列番号 17) SNR190 GCTCAGATCTGCATGTGTTGTATAACACTG (配列番号 18) mt tRNA^Met TTATTTATTTATGAGACAAATGTTTTAACC (配列番号 19)

[0069] (1)チップカラムの作成

実施例 2と同様に作成した。

[0070] (2)プローブの固定ィ匕

実施例 2と同様にチップにプローブを固定ィヒした。結合量の測定結果を以下に示す。

[0071] [表 3]

[0072] (3)往復循環による tRNAの精製

RNA溶液は酵母を培養し、フエノール抽出した後、陰イオン交換カラムクロマトダラフィ一で粗精製したものを用いた。往復循環槽に、 200 OD unitを終濃度 3 X NHE 0.5 mM DTT、液量 2mlになるように調製し、温度は 50°Cに設定した。その他の設定は実施例 2と同様である。

[0073] 次に、次のようなプログラムを作成し分注機に実行させた。

(i)平衡化：リザーバーで 6 X NHEを 3回ピペッティング

(ii)往復循環： 3 X NHE、 50°C、 tRNA溶液を 50回ピペッティング、 1回ピペッティングするごとに溶液をペリスタポンプで吸って戻し、攪拌する。溶液温度が設定温度に戻るように待ち時間を設定した。

[0074] 各画分につき、吸光度を測定し洗浄が十分かを確認した後、溶出された各 RNAをエタノール沈殿法で回収した。ポリアクリルアミド電気泳動を行い、各 RNAが精製されていることを確認した（図 7)。さらにポリアクリルアミドゲルカ切り出し精製し、 RNase T1消化を行った物を LC/MSで解析し、目的物であることを確認した。

[0075] 実施例 4 :往復循環クロマトグラフィーを利用したマルチ ChIP法

往復循環クロマトグラフィー装置に、 5種類の抗修飾ヒストン抗体及び抗 RNAポリメラーゼ II抗体を固相化したチップカラムを搭載し、 HeLa細胞由来のクロマチンを精製した。精製後の評価は、 GAPDH遺伝子のプロモーター領域をリアルタイム PCRで定量することで行った。

[0076] (1) HeLa細胞の培養

HeLa細胞は 10% Fatal Bovine Serumを含む DMEM培地で、 37°C、 5%CO の

2 条件で培養したものを用いた。

[0077] (2)抗体

ChIPに用いた全ての抗体は Upstateから購入した。 Anti- RNA polymerase II (05-6 23)は 2 1を、 Anti- monomethy Histone H3 (Lys4) (07-436), Anti-dimethyl-Hist one H3 (Lys4) (07-441), Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) (07-473), Anti- phosph o-Histone H3 (SerlO) (05—817), Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys27) (07—449), Norm al mouse IgG (12-371)はそれぞれ 5 1を、使用した。

[0078] (3)クロマチン溶液の調製

4.5x 10⁷個の HeLa細胞に終濃度 1%になるようにホルムアルデヒドを加え 10分間室温で静置した後、終濃度 0.125Mになるようにグリシン溶液を加え 5分間室温で処理した。 PBSで洗った後、 PBS I 1 mM PMSFを 1 mlを加え、セルスクレイパーで搔き取り、 1,000 g, 4分間遠心した。得られた細胞に 1,800 μ 1の Lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0), 1% SDS) I ImM PMSF I 1 μ g/ml aproti ninを加え、氷上で 10分間静置した後、 300 μ 1ずつ 1.5 mlエツペンに分注しソ-ケーシヨンを行った。ソ-ケーシヨンは Bransonの Sonifierを使い、出力 3、 5 sec、 33 % 、 2 minの条件で行い、ゲノム DNA断片が EtBr染色で 200— 800 bpに最も多く見られるようにした。これを 20,000 g, 15 min, 8°Cで遠心し、その上清の 9倍量になる 16.2 mlの ChIP dilution buffer (16.7mM Tris-HCl (pH8.0), 1.2 mM EDTA (pH 8.0), 167 mM NaCl, 0.01 % SDS, 1.1 % Triton X— 100)を加え、さらに 500 1の Protein G Agarose/salmon sperm DNA (upstate 16-201)でプレクリアしたものをクロマチン溶液とした。 ChIPをエツペンで行う場合は、まず 500 1のクロマチン溶液に抗体をカロえ、ー晚、 4°Cでインキュベートした後、 40 ^ 1の Protein G Agarose/salmon sperm DNA を加え 1時間、 4°Cでインキュベーションする。次いで、この Protein G Agarose/salmo n sperm DNAを 1 mlの Low salt buffer, High salt buffer, LiCl bufferで 1回ずつ洗い、 TE bufferで 2回洗う。そして、 300 mlの Elution bufferを加え、室温で 30分間強く攪拌し、溶出する。続きは、後記の (7)免沈画分の精製、を参照。

[0079] (4)チップカラムの作成

シリコナイズした石英綿を TE bufferまたは PBS (架橋する場合）に浸しておき、 300 μ 1 tip (AXYGEN T- 350- C- L- R)に詰め、その上に 40 μ 1の Protein G Agarose/sal mon sperm DNA、さらにその上に石英綿を重層し、最後にシリコンチューブ（2mm x 4mm)を乗せ固定した。また、榭脂が乾かないように TE bufferあるいは PBSで tip を満たしておく。

[0080] (5)往復循環とセパレイトの比較

チップカラムを往復循環装置の 8連ピペットにつけ、プログラムを実行した。セパレイトおよび往復循環のプログラムを以下に記す。セパレイトとは往復循環クロマトグラフィ一との比較対象のため、それぞれのチップカラムには別々のチューブにクロマチン溶液をセットし、操作の過程でお互いの溶液が混じらないように行う操作を指す。また、往復循環ではクロマチン溶液をピペッティングする度にペリスタポンプによる攪拌を行った。セパレイトではチップあたり 500 し往復循環では全体で 2.0 mlのクロマチン溶液を使用した。プログラムで使用するノッファーの組成をプログラムの次に記す。 [0081] [表 4]

Cross-linking buffer "- 0. 2 M Sodium Borate (pH 8. 0)

Blocking buffer ： 0. 1 M ethanol amine (pH 8. 1)

Low salt buffer ： 20 mM Tris - HC1 (pH8. 0) , 2 mM EDTA (pH8. 0) , 150 mM NaCl,

1. 0 % Triton X— 100， 0. 1 % SDS

High salt buffer ： 20 mM Tris- HC1 (pH8. 0) , 2 mM EDTA (pH8. 0) , 500 tnM NaCl,

1. 0 % Triton X- 100, 0. 1 % SDS

LiCl buffer ： 10 mM Tris— HC1 (pH 8. 0)， 1 mM EDTA (pH 8. 0)， 250 mM LiCl,

1. 0 % NP-40, 1 % Deoxycholate

Elution buffer ： 1 % SDS, 0. 1 M NaHC0₃

[0082] (6)抗体と榭脂の架橋効果

先のセパレイトや往復循環と異なり DSSによる架橋反応を行う操作が加わっている。架橋により抗体と榭脂をより強固に結合させ、抗体がチップ力も流出することを防ぐ。

[0083] [表 5] 順番緩衝液など Volume ( μ 1) ピぺッティング回数

1 PBS x 2 times 500 10

2 PBS + antibody 300 60

3 Cross-linking buffer 500 10

4 Cross—linking— bufter + 500 60

DSS (2. 5 niM)

5 Blocking buffer 500 10

6 Blocking buffer 500 60

7 Low salt buffer 500 10

8 High salt buffer 500 10

9 し iCl buffer 500 10

10 Lysis . buffer + ChIP 500 10 dilution buffer : 9 ) x2

11 クロマチン溶液 500 60

12 low salt buffer x 3 500 10

13 High salt buffer x 3 500 10

14 LiCl buffer x3 500 10

15 TE buffer x 5 500 10

16 Elution buffer 300 30

[0084] (7)免沈画分の精製

得られた 300 μ 1の免沈画分に 12 1の 5 M NaClを加え、 65°Cで 6時間以上インキュペートした。また、インプットとして 30 1のクロマチン溶液をとり、これに 270 1 の Elution bufferをカ卩え同様の処理を行った。次に、 10 mg/ mlの RNase Aを 1.5 μ 1 加え 37°Cで 1時間処理した後、 proteinase K処理（1.5 1の 10 mg/ ml proteinase K、 12 1 Tris-HCl (ρΗ6.5)、 6 μ 1 0.5Μ EDTAを加える）を 45°Cで 1時間行った。得られた溶液から DNAを QIAquick spin column (QIAGEN)により精製、 50 1の mill iQで溶出し、これを PCR用の铸型とした。

[0085] (8)定量 PCR

定量 PCRは TAKARAの SYBR premixを用いて Rocheの LightCycler480で行つた。反応プログラムと反応組成は以下に記す。プライマーは GAPDH遺伝子のプロモーター及び転写開始点を含む約 120 bpの領域に設計したものを用いた。それらプライマーの配列は、 Fwは CGT AGC TCA GGC CTC AAG AC (配列番号 20) 、 Rvは GCT GCG GGC TCA ATT TAT AG (配列番号 21)である。抗体による回収率は、免疫沈降画分と Inputの Cp値の差力も算出した。算出は Cp値が 1違うと量的に 2倍の差があるとした上で行った。 [0086] 反応プログラム

変性 96°C、20秒

増幅反応 95°C、 6秒 60°C、 40秒を 45サイクル

[0087] 反応組成

2x SYBR premix 10.0 1

20 μ Μ primer Fw 0.4 μ 1

20 μ Μ primer Rv 0.4 μ 1

milliQ 4.6 μ 1

template 5.0 μ 1

total 20.0 μ 1

[0088] (9)結果

セパレイト、往復循環、そして架橋剤を用いた往復循環で ChIPを行い、各免沈画分あるいはインプットから精製したゲノム DNAを铸型とし GAPDH遺伝子のプロモーター領域についてそれぞれ定量 PCRを行いインプットと比較したのが以下の表と図 8である。

[0089] [表 6]

GAPDH遺伝子プロモーター領域の解析

[0090] 架橋剤処理することで往復循環クロマトグラフィーによるマルチ ChIP法でも従来法とほぼ変わらな、結果を得ることができた。

産業上の利用可能性

[0091] 本発明による生体高分子の単離方法は、往復循環クロマトグラフィーと!/、う全く新しい概念に基づいた生体高分子の精製法である。本発明の方法によれば、多種類の生体高分子を同一の生体試料から同時に同じ条件で単離することが可能である。また、本発明の方法は、精製行程が煩雑で条件設定の難しいァフィユティークロマトグラフィ一の自動化が可能であるという利点を有している。本発明の応用例としては、機能性 RNAの自動精製装置、自動マルチ IP (ィムノブレシピテーシヨン)装置、ゲノム全体の網羅的な発現制御を計測するマルチ ChIP (クロマチン免疫沈降法)とそれを活用したェピジェネティックアレイなどが可能である。

図面の簡単な説明

[図 1]図 1は、本発明の往復循環クロマトグラフィーの模式図を示す。ァフィ-ティーチップには、異なる種類の DNAプローブ、抗体などを各担体に結合しておく。

[図 2]図 2は、 n回目のピペッティングの直前の状態を示す。 Cn'は吸引中の溶液の濃度を示し、 Cnは、吐出され、他の液と混合された後の濃度（リザーバー濃度）を示す。

[図 3]図 3は、平衡定数による、必要な回数及び結合率の変化を示す。

[図 4]図 4は、ヒストンテールの修飾を示す。ヒストンテールの修飾は細胞ごとに時間的及び空間的に制御されている。

[図 5]図 5は、マルチ ChIP法とェピジェネティックアレイを示す。往復循環クロマトダラフィ一によるマルチ ChIPにより複数の修飾ヌクレオソームを精製し、発生'分化ゃ疾患によって変動する各遺伝子におけるヒストンの修飾状態を網羅的に解析する (ェピジェネティックアレイ)。

[図 6]図 6は、本発明によって同時に精製した tRNAを示す。 1,素通り画分、 2,洗浄画分、 3,溶出した tRNA 4,溶出した tRNA^au、 5,溶出した tRNA ;2,バンドに分離して!、るがコンフォーマーであり同一分子である。

[図 7]図 7は、往復循環クロマトによる酵母 ncRNAの精製例を示す。全 RNA画分より核内および核小体内の低分子 RNAなどマイナーな ncRNAを 8種類単離精製した。ァフィ-ティーチップの作成力も全て全自動で行った。

[図 8]図 8は、往復循環クロマトによるマルチ ChIP法の解析例を示す。 5種類の抗修飾ヒストン抗体、抗 RNAポリメラーゼ II抗体、未感作マウス IgG (コントロール)で精製したクロマチンを、 GAPDH遺伝子プロモーター領域における定量 PCRで評価した。縦軸は免沈されたゲノム量をインプットに対する割合（％)で表したもの。横は ChIPに用いた各抗体を表している。セパレイト (黒)、往復循環 (灰）、往復循環 +架橋（白）(

Claims

請求の範囲

[1] (1)標的生体高分子と親和性を有する物質を保持した担体を含む容器を少なくとも 2 個以上用意し、標的生体高分子を含有する 1つの試料溶液を上記少なくとも 2個以上の容器内に同時に導入して、上記担体に上記試料溶液を接触させることによって標的生体高分子を上記担体に吸着させる工程；

(2)上記容器から上記試料溶液を排出する工程;及び

(3)排出した試料溶液を攪拌する工程；

力成る工程を少なくとも 2回以上繰り返すことを含む、生体高分子の単離方法。

[2] 上記（1)〜（3)の工程を少なくとも 2回以上繰り返した後に、上記担体を洗浄液で洗浄し、さらに溶出液を流すことによって標的生体高分子を回収することを含む、請求項 1に記載の生体高分子の単離方法。

[3] 少なくとも 8個以上の容器を使用する、請求項 1又は 2に記載の生体高分子の単離方法。

[4] 標的生体高分子と親和性を有する物質として複数種の異なる物質を使用する、請求項 1から 3の何れかに記載の生体高分子の単離方法。

[5] 標的生体高分子が、核酸又はタンパク質である、請求項 1から 4の何れかに記載の生体高分子の単離方法。

[6] 上記（1)〜（3)の工程を少なくとも 10回以上繰り返す、請求項 1から 5の何れかに記載の生体高分子の単離方法。

[7] 上記工程 (3)にお、て、ピペッティング、攪拌子の使用、又は容器の振盪の何れかの手段により排出した試料溶液を攪拌する、請求項 1から 6の何れかに記載の生体高分子の単離方法。

[8] ピペッティングにより、上記工程（2)と（3)を同時に行う、請求項 1から 7の何れかに記載の生体高分子の単離方法。

[9] 容器がチップ又はカラムである、請求項 1から 8の何れかに記載の生体高分子の単離方法。

[10] 標的生体高分子と親和性を有する物質を保持した担体を収容するための少なくとも 2個以上の担体収容容器；標的生体高分子を含有する 1つの試料溶液を収容するための試料収容容器；試料溶液を担体収容容器内に導入するための手段；

担体収容容器内に導入された試料溶液を担体収容容器外に排出するための手段; 及び試料収容容器内の試料溶液を攪拌する手段；

を含む、請求項 1から 9の何れかに記載の方法によって生体高分子を単離するための装置。