JPH0430800A - 突然変異の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、核酸プローブを用いる方法に関するものであ
る。詳しくは、特定の塩基配列を含む核酸を取得し、又
は特定の塩基配列中の変異の有無を検出する方法に関す
るものである。

（従来の技術） 近年、遺伝子工学の進歩に伴い、動物、植物、細菌、ウ
ィルス等の生物の遺伝情報が明らかになりつつある。人
間の遺伝子に対する解析も例外ではない。

例えば、核酸の特定の塩基配列中に１塩基の変異か生し
ることにより、特定の遺伝病や癌等の疾患が生しること
が報告されている。また、高血圧症や糖尿病等の疾患も
、遺伝学的な要因、即ち核酸中の特定の塩パ配列に変異
が生じることにより引き起こされると考えられるように
なっている。

以上のように、遺伝子の解析は純粋な遺伝学的見地ばか
りでなく、疾患の早期発見、治療という医学的見地から
いっても重要になっている。

従来、遺伝子の解析は、例えばサザンブロッ！・ハイブ
リダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーンヨン法
、フォルムアミド勾配電気泳導法、テトラアルキルアン
モニウム塩を用いた温度勾配法や、ポリメレースチェー
ンリアクション法（ＰＣＲ法）により増幅した試料核酸
について直接その塩基配列を決定する方法等により行わ
れている。

（従来技術の課題） サザンブロットハイプリダイゼーション法等に代表され
る制限酵素を使用する方法では、操作が複雑で時間がか
かるうえ、核酸中に生じた変異が必ずしも制限酵素によ
る切断パターンとして出現しない、という課題がある。

−回の操作に時間がかかるという課題は単一の試料に対
して実施するうえではさほど課題とはならないが、多数
の試料について測定を実施する場合には大きな課題とな
る。

テトラアルキルアンモニウム塩を用いた温度勾配法等の
、試料核酸とそれに対する核酸プローブを使用し、微妙
な温度の差によりハイブリッドの安定性の違いを測定す
る方法では、厳重に温度管理された７１ｐ３定室等の環
境が必要であり、しかも温度勾配を実現するために比較
的高価で複雑な装置を使用しなければならないという課
題がある。

ドツトハイブリダイゼーション法等では、イオン強度を
変化させ、試料核酸と核酸プローブのハイブリッドの安
定性の違いを測定するものであるが、核酸試料を固定化
するためにイオン強度を変化させる操作が面倒であると
いう課題がある。

以上のような課題に鑑みて本発明者らが鋭意検討した結
果、核酸プローブを適当な固相に固定化し、これをカラ
ムに充填して使用することで試料核酸とプローブのハイ
ブリダイゼーション等を容易に実施できることが見知さ
れた。

（課題を解決するための手段） 前記の見知に基づきなされた本発明は、即ち、特定の塩
基配列を含む核酸の取得方法であり、以下の［１］〜［
５］の操作を含む方法である。

■特定の塩基配列を含む核酸が二本鎖である場合に、こ
の核酸を一本鎖核酸（試料核酸）とする操作、 ■特定の塩基配列部分とハイブリダイズし得る、固相に
固定化された核酸プローブと前記試料核酸を当該固相を
充填したカラム内で混合し、最終的にこれらが安定して
ハイブリッドを形成し得る条件下で放置する操作、 ■必要に応じて、カラムに洗浄液を添加して核酸プロー
ブとハイブリッドを形成していない核酸を除去する操作
、 ■ハイブリッドが安定な温度条件下で、ハイブリッドの
安定性を低下させる因子のうちの少なくとも一を変化さ
せた展開液をカラムに添加して、核酸プローブから試料
核酸を遊離させる操作、 ■遊離しカラムから溶出した試料核酸を取得する操作。

更に本発明は、前記見知に基づきなされた、カラム中で
核酸プローブとハイブリダイズした試料核酸を、当該ハ
イブリッドの安定性を低下させる因子を変化させた展開
液をカラムに添加することで溶出させ、溶出の際の当該
因子又は因子に関連した時間を７Ｊ？＋定することで試
料核酸中の変異を検出する方法である。即ち、特定の塩
基配列中の変異の有無の検出方法であり、以下の［１］
〜［５］の操作を含む方法を提供するものである。

■特定の塩基配列を含む核酸が二本鎖である場合に、こ
の核酸を一本鎖核酸（試料核酸）とする操作、 ■特定の塩基配列と相補的であるか又は特定配列中に変
異が生じている場合のこの含変異特定配列と相補的であ
る固相に固定化された核酸プローブと前記試料核酸を当
該固相を充填したカラム内で混合し、最終的にこれらが
安定してハイブリッドを形成し得る条件下で放置する操
作、 ■必要に応じて、カラムに洗浄液を添加して核酸プロー
ブとハイブリッドを形成していない核酸を除去する操作
、 ■ハイブリッドが安定な温度条件下で、ハイブリッドの
安定性を低下させる因子のうちの少なくとも一を変化さ
せた展開液をカラムに添加して、核酸プローブから試料
核酸を遊離させる操作、 ■前記［４］の操作により核酸プローブから遊離し、カ
ラムから試料核酸が溶出した際の前記因子の値又はこの
因子の値に関連した時間、を−ｔ１定する操作。

以下、本発明の特定の塩基配列を含む核酸の取得方法に
ついて説明する。

核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであっても良０゜本発明
においては、核酸と当該核酸中の特定の塩基配列に対し
てデザインされた核酸プローブとの親和性を利用するも
のであるため、核酸が二本鎖である場合にはまず一本鎖
とする操作を実施する。

二本鎖核酸を一本鎖とする操作は通常の方法に従えば良
いが、中でも核酸を適当な溶液に溶解し、７０℃程度以
上にして放置すると良い。以下、このような操作により
一本鎖となった核酸を本明細書中では試料核酸と呼ぶ。

本発明の取得方法は、特定の塩基配列を含む核酸を取１
町フするための方法であるか、ここで特定の塩基配列と
は、後に説明する核酸プローブと相補的（はぼ相補的）
な塩基部分を意味する。しかしながら、特定の塩入（配
列として選択された部分が、遺伝子中で繰り返しく頻繁
）に出現するような部分であると、結果として異なる種
類の試料核酸が取１１ノされることになる。従って、単
一の核酸を取得しようとする場合には、試料核酸中の、
当該取前しようとする核酸に特異的な塩基配列部分を特
定配列として選択し、プローブを調製すると良い。

一本鎖とされた試料核酸を、特定配列に対して相補的（
はぼ相補的）に調製された核酸プローブを固定化する固
相が充填されたカラムに添加する。このとき、もとの核
酸が二本鎖であった場合には、分離した相補鎖が二本鎖
に戻らない条件下でカラムに添加することが好ましい。

例えば、前記操作と同様の温度においてカラムに添加す
るなどすると良い。試料核酸をカラムに添加した後、核
酸が安定してハイブリットを形成し得る条件下にカラム
を放置し、核酸プローブと試料核酸をハイブリダイズさ
せる。以上の操作をより簡便に実施するため、試料核酸
のカラムへの添加を、核酸ハイブリッドが可逆的に一本
鎖状態に分離する条件下で行うことが好ましい。例えば
７０’Ｃ程度の温度条件下では、核酸ハイブリットは可
逆的に一本鎖状態及び二本鎖状態で存在する。

前記したように、核酸プローブは塩１１１シようとする
試料核酸中の特定塩基配列と相補的（はぼ相補的）に調
製する。より正確に取得しようとする核酸を得るために
は、核酸プローブを特定塩基配列に対して相補的とする
と良い。更に、このような１°１的で核酸プローブの特
定塩基配列への特異性を高めるためには、１ｏ塩基以上
の核酸プロブを使用すると良い。また、ＤＮＡ−ＤＮＡ
のハイブリダイズに比較してＲＮＡ−ＲＮＡのハイブリ
ダイズは強力であることがら、ＲＮＡに対して本発明を
適用する場合には核酸プローブとしてＲＮＡを使用する
ことも有用である。ところで、核酸は４種類の塩基によ
り（１４成されていることがら、核酸プローブの長さ（
塩基数：ｎ）を調節することでその特異性を決定するこ
とができ、４ｎで示される。人のＤＮＡは３×１０９　
　塩基対と言われていることから、４ｎ〉３×ｌｏ９　
　となるように［１の値を決定すれば、設計した核酸プ
ローブと相補的である塩基配列が偶然出現する可能性は
ほぼなくなるのである。実際には、ｎを１６とすること
で実に４×１０９　　種類の塩基配列を讃別することか
可能となり、上記の値より大きくなる。本発明において
も１６塩基以上の核酸プローブを使用することか好まし
いが、本発明を実施する目的や現実の特定配列の様子を
考慮し、通常］、、　Ｏ−８０塩基程度、好ましくは１
５−６０塩基程度どすると良い。この程度のプローブで
あれば、容易に合成することも可能である。

核酸プローブは、例えば、好ましく天然又は合成ポリマ
ー等の、水溶液に対して不溶性のものであれば特別の制
限なく選択される固相に固定化される。なかでも核酸の
非特異的吸容を少なくするため、表面に親水基を有する
固相が好ましい。

また、同相は分解能等の面がら粒子径のＪｕｉｉったも
のが好ましく、このような観点がら合成ポリマが好適で
ある。固相への核酸プローブの固定化は、核酸プローブ
が試料核酸とハイブリダイズ可能に行う必要があるが、
このためには末端固定とすると良い。核酸の固定化法は
従来公知であるが、例えば、−ＣＯＮＨ−、−０ＣＯＮ
Ｈ−、ＣＨ２−ＮＨ−結合等を利用すれば良い。一方、
固相を充填するカラムは、添加する試料核酸の容量に対
して１００倍程度の容量を有するものが好ましい。

以上の操作により、カラム内では固相に固定化された核
酸プローブに対して試料核酸がハイブリッドを形成する
。

続いて、カラム内に核酸プローブとハイブリダイズして
いない、遊離の核酸が存在することが予想される場合等
には、適当な洗浄液を添加することでこれら遊離の核酸
を溶出、除去させる。洗浄液は核酸プローブと試料核酸
のハイブリッドの安定性を低下させないものであれば特
別の制限はない。一般的にハイブリッドは、温度条件（
４０７０℃程度）、イオン強度（０，０５−１０）　、
Ｉ）　Ｈ（中性付近）の範囲では安定であることが知ら
れているから、例えば洗浄液として、０．７５　Ｍ　　
Ｎ　ａ　Ｃ１を含む０．０７５ＭＮａ−Ｃ１ｔｒａｔｅ
　（ｐＨ７゜０）等の緩衝液を使用することが例示出来
る。

次に、ハイブリッドが安定な温度条件下で、その安定性
を低下させる因子のうちの少なくとも一を変化させた溶
離液をカラムに添加し、核酸プローブから試料核酸を遊
離させる。このような因子としては、例えばイオン強度
、フォルムアミドのような薬剤、ｐＨ等が例示できる。

即ち、イオン強度を低下させ、薬剤濃度を上昇させ、又
はｐＨを上げる操作を実施すれば良い。この操作は前記
因子を勾配を付して変化させる必要はなく、般的にステ
ップ法とよばれるように段階的に変化させても良い。

カラムから溶出した試料核酸は、例えば吸光度を測定し
て核酸の溶出を確認し、これを回収する等して取得すれ
ば良い。

続いて、特定の塩基配列中の変異の有無の検出方法につ
いて説明する。

本発明の検出方法は、前記した取得方法において、カラ
ムから溶出する試料核酸を取得する操作に代えて、カラ
ムから試料核酸が溶出した際の、変化させた因子の値又
は因子に関連した時間をΔＦＪ定する操作を実施するも
のである。

試料核酸の核酸プローブからの遊離、カラムからの溶出
を引き起こす因子の値（例えば因子を勾配を付して経時
的に変化させた場合には因子の値を直接測定しなくとも
、因子の変化を開始してからの時間を測定することで間
接的に因子の値を知ることができるが）は、これらのハ
イブリッドの安定性を示すものであり、換言すればハイ
ブリッド中にミスマツチがあるか無いかを示すものであ
る。

従って、同一の核酸プローブを用いて二の試料核酸につ
いて当該方法を実施すれば、それら試料核酸中の特定配
列が同一の塩基配列か又は部分的に異なるかを知ること
が出来る。この方法は、一方が特定の塩基配列を有して
いることが確実で、他方がこれと同一か又は変異を有し
ているのか不明な場合に有用である。

なお、本方法で使用する核酸プローブは、特定の塩基配
列に対して相補的であるか又は特定配列中に変異が生じ
ている場合のこの含変異特定配列と相補的であるものが
都合が良い。ここで、特定配列に変異が生じている場合
とは、例えば、特定の塩基配列中の特定の塩基について
変異（置換、消失又はその部位への他の塩基の挿入）が
生しることが知られている場合等である。このような場
合について一例を列挙すれば、組状赤血球貧血症、家族
性ニューロバチ−１高コレステロール血症あるいは癌遺
伝子の活性化（例えばｒａｓ遺伝子）等がある。

核酸プローブに、特定の塩基配列と相補的であるものを
使用すれば、■試料核酸が変異を有していない場合には
これらは完全に相補的となり、■試料核酸が変異を有し
ている場合には不完全に相補的となる。従って、これら
のハイブリッドはその安定性が異なるから、安定性の低
い■のハイブリッドは安定性を低下させる因子を変化さ
せた場合に■に比較してより早い時期に核酸プローブか
らの試料核酸の遊離、試料核酸のカラムからの溶出が起
こるのである。反対に、特定の塩基配列に変異が生じて
いる場合にこの含変異特定配列と相補的である核酸プロ
ーブを使用すれば、特定の塩基配列中に変異を有してい
ない試料核酸のカラムからの溶出が比較的早期に起こる
のである。

本発明の検出方法として、より具体的に以下に説明する
ような標準核酸を用いる方法を記載することが出来る。

この方法では、先に説明した変異の検出方法を実施する
のと同時に又は別途に、標準核酸が核酸プローブ（試料
核酸について変異の検出を実施したのと同一のプローブ
）から遊離し、カラムから溶出する隙の因子の値又は因
子の値に関連した時間を、１＃１定してこれを試料核酸
の値（関連した時間）と比較するのである。

−本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡが標準核酸として使用できる
が、標準核酸は試料核酸との比較のために特定配列と同
一の塩基配列を含んだ核酸であるか又は前記したように
特定配列中に変異が生じている場合のこの含変異特定配
列と同一の塩基配列を含む核酸を使用すると良い。

標準核酸についての操作は、前述のように試料核酸につ
いての操作を実施するのと同時に行うことも可能である
。これは、一般に内部標準、と呼ばれる手法である。即
ち、試料核酸と標準核酸を混合したものについて、先に
説明したような変異の検出方法を実施するのである。こ
の手法によれば、カラムからの試料核酸及び標準核酸の
溶出を一回の操作で測定でき、かつ、核酸の溶出が２の
ピークを示すか否かａｌｌｌ定する操作のみで、試料核
酸と標準核酸との関係を結論できるのである。

標準核酸についての変異の検出方法の実施を、試料核酸
についての実施とは別途行った場合には、温度条件や因
子の変化等には以上のように同時に行う方法と比較して
より厳密な条件管理が要求される。従って、標準核酸を
使用する変異の検出方法は、試料核酸についての実施と
同時に行うことが好ましいが、標準核酸についてのデー
タ、即ち標準核酸がカラムから溶出する際の因子の値又
はそれに関連した時間は条件（変化させる因子も含む）
が一定である限り同一であるから、−旦これを知ること
が出来れば、後は同一条件下で試料核酸のみを扱えば良
いことになる。

使用する核酸プローブ、標準核酸、試料核酸中の変異の
有無と溶出の様子の関係は、以下の表の通りとなる。な
お、表は特定の塩ハ配列に対して説明されているため、
例えば「同一」は特定の塩基配列に対して同一であるこ
とを意味する。また、試料核酸の欄は標準核酸との溶出
の差を示すものである。

核酸プローブ　　標準核酸　　変異　試料核酸量− 有り 無し 異なる 同− 相補的 異なる 有り　　同− 無し　　異なる 同− 有り 無し 異なる 同一 はぼ相補的 異なる　　有り　　同− 無し　　異なる カラムからの核酸、特に標準核酸の溶出は、：Ｊｔ料核
酸の溶出と同様に例えばＵＶを測定する′、ツの操作に
より容易に実施することが可能である。

とくに、試料核酸と標準核酸について同時に変異の検出
方法を実施できれば、前記したように両者のカラムから
の溶出の様子を１ｌｐＩ定するのみで、表のような両者
の関係、更には特定配列中の変異の有無を結論すること
ができるのである。

ちなみに、例えば試料核酸や標準核酸に検出可能な標識
を付しておくことで、これらのカラムからの溶出はより
簡単に検知することが可能である。特に標準核酸は、特
定の塩基配列又はそれが変異を含んでいる場合に予想さ
れる含変異特定塩基配列をもとに人工的に合成されるこ
とが多いため、このような標識を付すことは容易である
。

近年、一般にＰＣＲ法と呼ばれる、ＤＮＡボリメレース
等の核酸合成酵素と適当なブライマーを使用した、核酸
の増幅方法が知られるようになった。この方法によれば
、１〜２時間の操作により、希望する核酸の量を数千倍
に増幅可能である。

本発明の方法においても、そのそれぞれの操作に先立っ
てＰＣＲ法により試料核酸を増幅しておくとより精度の
高い検出が可能となる。ＰＣＲ法は、例えば５ｃｉｅｎ
ｃｅ、２３９．ｐ４８７−４９１．１９８８　　等に記
載されている。また、この操作の際、核酸の構成物とし
て適当な標識を付した基質を使用することで、試料核酸
をも標識することが可能である。

ＰＣＲ法の適用は、試料核酸に対してのみ向けられるも
のではない。例えば前記した様に、標準核酸と試料核酸
を同時に変異の検出方法に使用する場合には、試料核酸
と標準核酸を混合した後にＰＣＲ法を実施することで両
者を増幅し、より検出精度を高めることが出来る。

ＰＣＲ法による増幅は、試料核酸（標準核酸）の全体に
対して実施する必要はない。即ち適当なブライマーを使
用することで、目的である特定の塩基配列を含む部分を
増幅できれば良いのである。

ただし、本発明の特定の塩基配列を含む核酸の取得方法
においては、目的とする試料核酸部分について選択的に
増幅を行う必要がある。

（発明の効果） 本発明では、核酸プローブを固定化した固相を充填した
カラムを使用する方法であるから、同一のカラムを使用
して繰り返し実施することが可能である。従って、従来
の例えばフィルター等を使用する方法等の場合では、−
回の操作ごとに試料核酸を固定化する等の、時間がかか
り、しかも繁雑である操作を省略することが出来るので
ある。

しかも、特に本発明の変異の検出方法では、核酸プロー
ブの固定化が良好に行われていないとしても、例えば標
準核酸と試料核酸とのカラムからの溶出さえ測定可能で
ありさえすれば実施可能である。また、特に標準核酸と
試料核酸を同時に使用する変異の検出方法では、実施条
件を厳密に管理する必要もない。また、その実施に先立
って、例えばフィルターハイブリダイゼーション法では
十分な予備実験を繰り返し実施する必要があったが、本
発明ではその必要がない。即ち、例えば因子の変化を勾
配を付して実施すれば、連続的に変化する因子の値によ
り、必ず個々の核酸の核酸プローブからの遊離が引き起
こされるし、しかも、安定性の異なるハイブリッドにつ
いては異なる値でそれが起こるのである。

本発明では、カラム中での核酸プローブからの核酸の遊
離を温度変化に頼らないため、温度条件の厳密な管理は
必要なく、しかもカラム中でのハイブリッドの形成時の
湿度と大きく変わらない温度条件下で全ての操作を実施
可能であるから、カラム内に充填された固相の温度変化
による劣化も少ないという効果もある。温度変化を伴わ
ないということは、操作事態の繁雑さが解消できると供
に、操作にかかる時間を短くてきることも意味している
。現に本発明では、試料核酸等をカラムに添加した後は
一回の実施の時間はカラムクロマトグラフィーを実施す
るのと同じくらい（３０〜６０分程度）で実施可能であ
る。

本発明では、特に特殊な装置等を使用する必要もなく、
例えば今や通常の実験において頬繁に使用されている液
体クロマトグラフィー装置等を転用するのみで良い。

本発明の、変異を検出する方法においては、特筆すべき
ことに、後に実施例で説明されるように特定の塩基配列
中に発生したわずか１塩試の変異であっても検出するこ
とが可能である。このことは、例えばある特定の疾患で
は、特定の塩基配列中の特定塩Ｕに変異が生じることが
知られている場合等に、この疾患の早期発見、早期治療
を可能とすることを意味している。

（実施例） 以下に、本発明を更に詳細に説明するために本発明の実
施例を記載するが、これら実施例は一例に過ぎず、本発
明はこれらに限定されるものではない。

実施例　１ （核酸プローブの固相への固定化） ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
社）を使用して、以下に示すような、５°末端にアミノ
基を有するオリゴヌクレオチド誘導体を合成した。

５°　Ｎ１１２−ＴＧＴ　ＡＣＡ　ＣＡＣＴＴＧ　ＧＣ
ＣＣＣＣＡＡＴ　３続いて、トレシル基を表面に有する
固相（ＴＲＥＳＹＬ−５ＰＷ　；東ソー（株）製）と合
成オリゴヌクレオチド誘導体５°末端のアミノ基を反応
させ、これを固定化した。なお、固定化されたプローブ
の濃度は固相当たり１μｇ／ｓｇ　（乾燥重量）であっ
た。

（試料核酸の合成） 先に合成した核酸プローブと相補的な塩基配列からなる
核酸■と、５゛側から１１番目の塩基が変異した塩基配
列からなる核酸■を前記同様に合成した。

■３°ＡＣＡ　ＴＧＴ　ＣＴＧ　ＡＡＣＣＧＧ　（、Ｃ
ＯＴＴＡ５゜■　３°　ＡＣＡ　　ＴＧＴ　　ＣＴＧ　
　ＡＴＣＣＧＧ　　ＧＧＧ　　ＴＴＡ　　３’＊ なお、これら核酸について言及すれば、一方は本発明で
いう試料核酸又は変異を有さない特定塩基配列を含む試
料核酸であり、他方は標準核酸又は変異を有する含変異
特定塩基配列を含む核酸試料である。また、核酸プロー
ブについていうならば、核酸■を試料核酸とした場合に
は当該プローブは試料核酸に相補的なプローブであり、
試料核酸を核酸■とするならば、含変異特定塩基配列に
相補的なプローブである。

（変異の検出） 核酸プローブを固定化した固相を、カラム（Φ６ｘ４０
ａｍ）に充填し、６０℃の温浴槽に浸した後、５ＸＳＳ
Ｃ溶液（０，７５Ｍ　ＮａＣ１，７５ｍＭ　Ｎａ−Ｃ１
ｔｒａｔｅを含むｐ１１７．０の水溶液）を流速０．５
ｍｌ／ｓｉｎでカラムに添加し平衝化した。なお、本実
施例では一本鎖合成りＮＡを試料核酸として使用してい
るため、二本鎖核酸を一本鎖核酸にする操作等は実施し
ていない。

各１μｇずつの核酸■及び■を同時に添加し、核酸プロ
ーブと核酸の安定性を低下させる因子としてイオン強度
を選択し、以下に示す条件でＮａＣｌ濃度を低下させて
イオン強度を低下させた。なお操作は流速０．５ｗｌ／
ｍ１ｎで実施した。

；勾配条件 溶Ｍ液Ａ　；　０．７５Ｍ　ＮａＣｌ、　１５ｅＭ　Ｎ
ａ−ＣＪｔｒａｌｅ（ｐＨ７，０） 溶離液Ｂ；Ｉ＋２０ 添加開始；溶離液Ａ　＋　１００％ １５分後　；溶Ｍ液Ｂ　：　１００％ ４５分後　；溶Ｍ液Ｂ　：　１００％ ４６分後　；溶Ｉｌｌ戚Ａ　：　１００　％以上の勾配
条件で、カラムから溶出した核酸を２０Ｏｎｍの波長で
ｔ−１定した。結果を図１に示す。、カラムからの核酸
の溶出は２つのピークを示し、先に溶出した核酸につい
て塩基配列を調査したところ核酸■であった。このこと
は、２１塩基からなる特定配列中に生じたわずか１塩基
のミスマツチが本発明の方法により分離され、取得され
たことを示すものである。

実施例　２ （核酸プローブの固相への固定化） ＤＮＡ合成装置を使用して、以下に示すような、５′末
端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチド誘導体を合成
した。

５°　Ｎｉ１２ＣＧＣＡＧＡ　ＴにＩＣＡＣＡ　ＡＡＡ
　ＧＣＣＣＴＣ３続いて、トレシル基を表面に有する固
相（Ｔ１？ＥｓＹ１．−ＮＰＩ？　；東ソー（株）製）
と合成オリゴヌクレオチド誘導体５°末端のアミノ基を
反応させ、これを固定化した。なお、固定化されたプロ
ーブの濃度は、固相当たり　０．８μｇ／ｍｇ　（乾燥
重量）であった。

（試料核酸の合成） 先に合成した核酸プローブと相補的な塩基配列からなる
核酸■と、５°側から１２番目の塩基が変異した塩基配
列からなる核酸■を前記同様に合成した。

■５’　ＧＧＡ　ＧＧＧ　ＣＴＴ　ＴＴＴ　ＴＣＣＡＴ
ＣＴＧＣＧＣＡ　３゜■５°ＧＧＡ　ＧＧＧ　ＣＴＴ　
ＴＴＧ　ＴＣＣＡＴＣＴＧＣＧＣＡ　３本 （変異の検出） 核酸プローブを固定化した固相を、カラム（Φ４．５　
Ｘ　５０ｍｍ）に充填し、６０℃の温浴槽に浸した後、
２０１Ｍリン酸緩衝液（ＩＭ　ＮａＣＬ、ｐＨ７，０）
を流速０．５ｓｌ／ｓ１ｎでカラムに添加し平衝化した
。

各０．５μｇずつの核酸■及び■を、同時にカラムに添
加し、核酸プローブと核酸の安定性を低下させる因子と
してイオン強度を選択し、以下に示す条件でＮａＣ１濃
度を低下させてイオン強度を低下させた。なお、これら
の操作は流速０．５１７ｗ１ｎで実施した。

；勾配条件 溶離液Ａ　；　ＩＭ　ＮａＣ１，２０５Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０） 溶離液Ｂ　；　ｌ（１％　ｅｌ１３ ＣＮ、９０％１１２ 添加開始；溶離液Ａ　：　１００％ １５分後　；溶離液Ｂ　：　１００％ ４５分後　；溶離液Ｂ　：　１００％ ４０分後　；溶離液Ａ　：　１００％ 以上の勾配条件で、カラムから溶出した核酸を２６００
■の波長で測定した。結果を図２に示す。、カラムから
の核酸の溶出は２つのピークを示し、先に溶出した核酸
について塩基配列を調査したところ核酸■であった。こ
のことは、２４塩基からなる核酸中の、２１塩基の特定
塩基配列中に生じたわずか１塩基のミスマツチが本発明
の方法により分離され、取得されたことを示すものであ
る。

実施例　３ （ブライマーの調製） ＤＮＡ合成装置を使用して、以下に示すような、５°末
端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチド誘導体及びオ
リゴヌクレオチドを調製した。

■５°ＣＴＴＧＴＣＣＡＡＧＡＧＴＧＣＡＴＧＧＴＧＣ
ＡＴ　３■５’　ＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＣＣＴＣＣ
ＡＣＡＣ３■５°　Ｎ１１２−ＣＴＧＡＡＡＴＴＴＴＡ
ＡＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧ　３５゛末端にアミノ基を
有するオリゴヌクレオチド誘導体■について、蛍光標識
を導入した。

３００ｇｇのオリゴヌクレオチド誘導体■を２３０μｍ
の２００５Ｍ炭酸綬衝液（ｐＨ９，０）に溶解し、これ
に２０μｍのＰＩＴＣ溶液（ＩＯＢ／ｍｌ　Ｎ、Ｎ’旧
ｍ　ｅ　ｔ　ｈ　ｙ１’ｏｒｓａｍ１ｄｅ）を添加し、
室温で３０分間反応させた。

続いて未反応のＩ’ｌＴＣをゲル濾過（５ｈｅｐｈａｄ
ｅｘ　Ｇ−１５、ファルマシア製を使用）により除去し
、標識が付されたものを逆相クロマトグラフ（ＯＤＳ−
１２０Ｔカラム、東ソー（株）製）で精製し、真空濃縮
器を使用して濃縮した。

（試料核酸の調製） 天然型（同等変異を有していない）ヒトプロウロキナー
ゼ遺伝子を有するプラスミド、ｐｓＶ２０Ｋ（ＷＴ）　
（Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、ＣｈｅＩｌｌ、５２（２）、
１）３２９−３３６．１９８９年）及び変異型ヒトウロ
キナーゼ遺伝子を有するプラスミド、ｐｓＶ２ＵＫ　（
ＭＵ）　（同上）カラ、ツレツレヒトウロキナーゼ構造
遺伝子の４９１〜７１０番口の塩基配列を含むＤＮＡ断
片を調製した。

調製は、先に調製した合成オリゴヌクレオチド■、■及
び市販のＰＣＲキット（宝酒造（株）製、ＧｃｎｃＡｍ
ｐキット）を使用し、同キットに添イ；ｊのプロトコル
及びポリメレースチェーンリアクショ：／（ＰＣＲ）法
（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９．ｐ４８７−４９１．１９８
ｇ　）を参照して行った。

次に、増幅した約２００塩基のＤＮＡ断片について、非
対象ＰＣＲを実施した。該ＤＮＡ断片をゲル濾過（Ｇ　
３０００５ＶＸＬ　、東ソー（株）製）により精製・濃
縮し、先に調製したＴ’ｌＴＣ標識合成オリゴヌクレオ
チド誘導体■をブライマーとして添加した後に前述のＰ
ＣＲキットを使用し、ＤＮＡ断片を鋳型として一方のＤ
ＮＡ鎖（Ｈ塩基配列からなる）のみを増幅した。なお、
この操作に当たっては、非対象ＰＣＲ法（Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、＾ｃａｄ　、　Ｓｃ　Ｉ　、　Ｌ！ＳＡ８５、
ｐ７６５２−７Ｇ５１３．１９８８　）を参照した。

最終的に得られたＤＮＡ断片は、約８０塩基からなり、
それぞれ天然型、変異型ヒトプロウロキナーゼ遺伝子の
４９１番目から５６８番目の部分を含むものである。な
お、変異型ヒトプロウロキナーゼ遺伝子は、天然型の遺
伝子の塩基配列中、５３０番目の塩基が変異したもので
ある（ＡがＣに置換している；前記文献参照）。

（変異の検出） 実施例２において使用したものと同一の核酸プローブを
固定化した固相を充填したカラムを使用して変異の検出
を実施した。なお、本実施例においては、天然型遺伝子
断片（本発明における標準核酸に該当する）及び変異型
遺伝子断片（試料核酸に該当）をＰＣＲ法により増幅す
る際、ＰＩＴｅ標識ブライマーを使用しているため、こ
れらのカラムからの溶出は蛍光測定により検出した。測
定条件は、励起光波長４９０ｎｍ、測定波長５２０ｎｍ
である。

結果を図３に示す。本実施例において使用した核酸プロ
ーブは、変異型ヒトプロウロキナーゼの５２０番目から
５４０番目の含変異特定塩基配列に対して相補的となる
ようにデザインされているため、天然型の５２０番目か
ら　５４０番目の特定の塩〃配列に対してはｌミスマツ
チを有している。このため、天然型と核酸プローブとの
ハイブリッドは変異型とプローブのハイブリッドに比較
して安定性が低く、より早くカラムから溶出されている
。

分かる。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明の実施例１の結果を示すものである。縦軸
は２Ｂ０ｎｓｌこおける吸光度又は電気伝導度（イオン
強度の強弱と相関している）を示し、横軸は溶離液中の
塩濃度を変化させ、ハイブリッドの安定性を低下させる
因子であるイオン強度を低下させ始めてからの時間を示
している。図中、上部の一連の曲線は、溶離液の電気伝
導度を示し、下部の一連の曲線は２８０　ｎｔａの吸光
度の変化を測定した結果を示している。２　Ｂ　Ｏｎ　
ｍの吸光度のピークは、それぞれＡ：実施例中の核酸■
（リテンションタイム２１分）、Ｂ：核酸■の溶出（リ
テンションタイム２３分）を示すものである。これらの
ピークの前方のピークは、イオン強度の変化に伴って溶
出した、非特異的にカラム内に残留した核酸の溶出ピー
クである。 図１には、２１塩基からなる特定の塩基配列中の１塩基
のミスマツチであっても本発明の方法により分離された
ことが示されている。 図２は本発明の実施例２の結果を示すものである。図の
縦軸、横軸及び図中の曲線は図１と同様の意味を示して
いる。図中、２ＢＯｎｓの吸光度のピークは、それぞれ
Ａ：実施例中の核酸■（リテンションタイム１４分）、
Ｂ：核酸■の溶出（リテンションタイム１９分）を示す
ものである。これらのピークの前方のピークは、イオン
強度の変化に伴って溶出した、非特異的にカラム内に残
留した核酸の溶出ピークである。 図２によれば、　塩基からなる核酸中の　塩基の特定の
塩基配列中の１塩基のミスマツチであっても本発明の方
法により分離されたことが示されている。 図３は本発明の実施例３の結果を示すものである。縦軸
は２相対的な蛍光強度又は電気伝導度（イオン強度の強
弱と）ｌ関している）を示し、横軸は溶離液中の塩濃度
を変化させ、ハイブリッドの安定性を低下させる因子で
あるイオン強度を低下させ始めてからの時間を示してい
る。図中、上部の一連の曲線は、溶離液の電気伝導度を
示し、下部の一連の曲線は相対的蛍光強度の変化を７１
１１１定した結果を示している。蛍光強度のピークは、
それぞれＡ：実施例中の天然型プロウロキナーゼ遺伝子
に由来する核酸（変異を有さない特定の塩基配列を含む
；リテンションタイム１０分）、Ｂ：変異Ｗリブロウロ
キナーゼ遺伝子に由来する核酸（天然型に比較して１塩
基の変異を有する、含変異特定塩乱配列を含む；リテン
ションタイム１８分）を示すものである。これらのピー
クの前方のピークは、イオン強度の変化に伴って溶出し
た、非特異的にカラム内に残留した核酸の溶出ピークで
あり、非対象ＰＣＲ反応に使用した過剰のＦＩＴＣ蛍光
標識ブライマーである。 図３には、７８塩基からなる核酸中の、２１塩基の特定
の塩基配列中の１塩基のミスマツチであっても本発明の
方法により分離されたことが示されている。 特許出願人　　　東ソー株式会社 第２図 時間（分） 第３図 手続補正書 （方式） １事件の表示 平成２年特許願第１３５４００号 ２発明の名称 突然変異の検出方法 ３補正をする者 事件との関係

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）特定の塩基配列を含む核酸の取得方法であり、以
   下の［１］〜［５］の操作を含む方法。 ［１］特定の塩基配列を含む核酸が二本鎖である場合に
   、この核酸を一本鎖核酸（試料核酸）とする操作、 ［２］特定の塩基配列部分とハイブリダイズし得る、固
   相に固定化された核酸プローブと前記試料核酸を当該固
   相を充填したカラム内で混合し、最終的にこれらが安定
   してハイブリッドを形成し得る条件下で放置する操作、 ［３］必要に応じて、カラムに洗浄液を添加して核酸プ
   ローブとハイブリッドを形成していない核酸を除去する
   操作、 ［４］ハイブリッドが安定な温度条件下で、ハイブリッ
   ドの安定性を低下させる因子のうちの少なくとも一を変
   化させた展開液をカラムに添加して、核酸プローブから
   試料核酸を遊離させる操作、 ［５］遊離しカラムから溶出した試料核酸を取得する操
   作。
2. （２）特定の塩基配列中の変異の有無の検出方法であり
   、以下の［１］〜［５］の操作を含む方法。 ［１］特定の塩基配列を含む核酸が二本鎖である場合に
   、この核酸を一本鎖核酸（試料核酸）とする操作、 ［２］特定の塩基配列と相補的であるか又は特定配列中
   に変異が生じている場合のこの含変異特定配列と相補的
   である固相に固定化された核酸プローブと前記試料核酸
   を当該固相を充填したカラム内で混合し、最終的にこれ
   らが安定してハイブリッドを形成し得る条件下で放置す
   る操作、 ［３］必要に応じて、カラムに洗浄液を添加して核酸プ
   ローブとハイブリッドを形成していない核酸を除去する
   操作、 ［４］ハイブリッドが安定な温度条件下で、ハイブリッ
   ドの安定性を低下させる因子のうちの少なくとも一を変
   化させた展開液をカラムに添加して、核酸プローブから
   試料核酸を遊離させる操作、 ［５］前記［４］の操作により核酸プローブから遊離し
   、カラムから試料核酸が溶出した際の前記因子の値又は
   この因子の値に関連した時間、を測定する操作。
3. （３）請求項第２項記載の方法であって、同時に又は別
   途以下の［１］〜［５］の操作を含むことを特徴とする
   特定の塩基配列中の変異の有無の検出方法。 ［１］試料核酸中の特定の塩基配列と同一の塩基配列を
   含むか又は特定配列中に変異が生じている場合のこの含
   変異特定配列と同一の塩基配列を含む一本鎖核酸（標準
   核酸）と前記固相に固定化された核酸プローブを当該固
   相を充填したカラム内で混合し、最終的にこれらが安定
   してハイブリッドを形成し得る条件下で放置する操作、 ［２］必要に応じて、カラムに洗浄液を添加して核酸プ
   ローブとハイブリッドを形成していない核酸を除去する
   操作、 ［３］ハイブリッドが安定な温度条件下で、ハイブリッ
   ドの安定性を低下させる因子のうちの少なくとも一を変
   化させた展開液をカラムに添加して、核酸プローブから
   標準核酸を遊離させる操作、 （ただし、本操作における温度条件及び変化させる因子
   は核酸プローブから試料核酸を遊離させる操作における
   温度条件、因子と同一である） ［４］前記［３］の操作により核酸プローブから遊離し
   、カラムから試料核酸が溶出した際の前記因子の値又は
   この因子の値に関連した時間、を測定する操作、 ［５］カラムから試料核酸が溶出した際の因子の値又は
   因子の値に関連した時間とカラムから標準核酸が溶出し
   た際の因子の値又は因子の値に関連した時間とを比較す
   る操作。
4. （４）標準核酸が検出可能な標識と結合しており、カラ
   ムから標準核酸が溶出した際の因子の値又は因子の値に
   関連した時間を測定する操作がこの標識を検出すること
   で達成されることを特徴とする請求項第３項記載の方法
   。
5. （５）核酸プローブと試料核酸を混合する操作に先立っ
   て、少なくとも試料核酸中の特定塩基配列を含む部分を
   ポリメレースを用いて増幅する操作を行うことを特徴と
   する請求項第１又は２項記載の方法。