JPS5886461A - 免疫試験用試薬、試験キツト及びそれらを用いる免疫試験法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、血清又はプラズマのような生物学的液体中の
ヨードチロエン類の測定用免疫試験に関する。特に１本
発明は、血清又はプラズマ試料中に存在するチロキシン
結合蛋白質（ＴＢＰ）とヨードチロエン類との結合に対
する遮断剤又は解離剤を用いて、血清又はプラズマの非
抽出試料中のヨードチロエン類を測定するための競争結
合免疫試験法、試薬、及び試験キットに関する。

ヨードチロエン類は、一般式： 〔式中、β１及びｌは、それぞれ、水素又はヨウ−を表
わす。〕を有する。臨床上、重要な１九る璽−ドチロニ
ン類は、上記式中、β１及びβ′力よ共に田つ素である
３、５，３’、　５’−テトラｌ−ドチロニン（チロキ
シン；τ−４）：上記式中、β１裟ヨウ素テあシ、β３
が水素である３、５．３’−）リョート°チロニ／（Ｔ
−３＃Ｘａ、単に「トリョードチロニン」）；上記式中
、β１が水素であってｐがヨウ素である３、Ｆ、　５’
　−）すｌ−ドチロニン（「逆Ｔ−３Ｊ）：及び上記式
中、β１及びβ３が共に水素である３、３’−ジｌ−ド
チロニンである。血液中の、種々のヨードチロエン類、
特に、ホルモンＴ−４及ヒＴ−３０濃度の定量的測定（
定量分析）は、甲状腺障害の診断においては重要な意義
がある。

血液中では、はとんどすべての循３Ｊｌヨード°チロニ
ン類は、アルブミン、チロキシン結合性プレアルブずン
、及“びチロキシン結合性グロブリン（ＴＢＧ）　　を
はじめとする種々の担体蛋白質と複合体を形成してお〉
、かかる担体蛋白質を、ここでは一般にチロキシン結合
性１１Ｂ質（Ｔ　Ｂ　Ｐ）と呼ぶ。血清又はプラズマの
ような血液試料中の全ヨード°チロニンの濃度を測定す
るためには、ＴＢｉ’ｌ−結合型のヨードチロニンを、
分析的に有意義な程度まで解離させ、得られた遊離ヨー
ド°チロニノの総置を測定しなければならない。ＴＢＰ
、特にＴＢＧ５゜らのヨードチロエン類の解離は、当初
、抽出法によって成し遂げられた（米国特許第３　、４
１４　、３８３号）。現在の技術水準の下では、ＴＢＰ
結合を遮断して、その解１ｗ！を惹起すると軽験的に認
められ良化合物の使用による、非抽出試料の免疫試験に
よって、ヨードチロエン類を測定すること力もで裏る。

現在の競争結合ヨードチロニン免疫試験においては、試
験試料を、測定されるべきヨード°チロニンに対する抗
体、かかるヨードチロニンの被標識体（例えば、放射線
標識化体）、及び１又はそれ以上のＴＢＰ迩断剤を含有
する試薬と合する。

ＴＢＰ　　と複合体を形成した試料−中のヨードチロ；
ンは、そこから解離し、標識ヨードチロニンと競争して
抗体と結合する。抗体とは結合せずに残った標識ヨード
チロニンに対する担体に結合し九標織目−ドチロニンの
　割合は、試料中のヨードチロニンの総濃度に依存し、
かつ、用いられた特定の免疫試験技術によって異なる広
汎な方法で測定できる。

テトラクロルチロニン〔ミッマ％　（Ｍｉ４ｓｕｍ亀＠
１ｍｌ　）、　　Ｊ、　ＣＩｉｎｏｇｎｄｅｅｒｉｎｏ
ｌｏＣｌｌｎｏ、３３巻：３６５頁（１９７１））、ジ
フェニルヒダントイン〔リービリツヒ及びニーティゲル
（Ｌｉｅｂｌｉｏｈ　ａｎｄＵｔｉｇ＠ｒ　）ｔ　Ｊ、
　Ｃ１１ｐ　Ｉｎｖｅｓｔ、　５０巻：６０＆頁（１８
７１））、サリチル酸塩〔ラーメン（Ｌａｒａｏｎ　）
。

Ｍ＠Ｌｍｂ、　２０巻：９７６頁（１９７１）］並びに
］ホランダーＨ・１１０通・り（米国特許第３，９２８
，５５３号）及びチョプラ（Ｃｋ＠ｐｒａ　）　　（米
国特許第３゜９１１．０９６号）Ｋよシ開示され九攬々
の材料、特に、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン
酸（ムＮｓ）をはじめとする種々の化合物が、有用なＴ
ＩＰ　ｉｌｌｌｌ色剤て発見されている。既知のＴＢｐ
Ｈ断剤の構造及び一般的な、性質は、極めて広範１１に
亘る多様なものである。いくつかのＴＢＧ遁断ｍｍが提
起されてはいるが〔ブラウン及びメセアニイ（Ｂｒｏｗ
ｎ　ａｎｄ　Ｍ＠ｔｈ＠ａｎｙ　）、　　Ｊ＋Ｐｈａｒ
ｍ、８ｏｉ。

６３巻：　１２１４頁（１９７４））、免疫試験におけ
るＴＢＰ　３１断剤として使用しうるための決定的な性
質、すなわち、抗体結合反応を著しく阻害しない場度の
低い濃度で、ＴＢＰ　　からヨードチロニンを十分に解
離させる能力は、単に、構造上の比較のみからは、通電
子ｌｌ１１できないと考えられている。

フェンクロフェナック（ｆｅｎｅｌ＠ｆｓｎｉｏ　）　
　〔２−（２，４〜ジクロルフエノキシ）フェニル酢釦
ハ、抗ｖニーーｒチ性活性を有するジフェニルエーテル
であり、甲状腺機能試験を妨害することが報告されティ
る〔Ｌ＊＊ｅ＊Ｌ　　１巻：２６７頁（１９８０年２月
２　日）、　Ｌａｍｅ＠ｔ　１巻＝４３２頁（１９８０
年２月２３日）、　ＬａｍｅＩ＆１巻＝４８７頁（１９
８０年３月１日）、キャッパ−等（Ｃａｐｐ＠ｒ　ｅＬ
　ｍｌ　）、　Ｃ１１ｍ。

Ｃｈａｗｒ、ムａｔｅ　　１１２巻ニア７頁（１９８１
）、及びクルツ等（Ｋａｒｔｓ　ｓＬ　ｍｌ　）、　Ｃ
ｌ１ｎ、ｇｎｄｅｅｒｉｍｏｌ。

１　ｓ％：　１１７頁（１９８１年）〕。続く研究１Ｆ
勢は、フェンクロフェナックが、甲状腺機能放射線免疫
試験におけるＴＢＧ逼断剤として適切でけないかとの問
題を提起している〔ラトクリッフェ等（Ｒａｔｅｌｉｆ
ｆ＠　　＊亀　　ｍｌ、　　Ｃｌ１ｍ、　　ｇｎｄｅｅ
ｒｉｍｏｌ、　　　１　３　　巻：５６９頁（１９８Ｇ
））。キャッパ−等（Ｃ畠ｐｐ＠ｒｉｔ畠１．前出〕　
はジクロフェナック（２−（２，６−シクロルフエニル
ア建〕）フェ風ル酢酸〕の効果について４研究した。

現在では、あるフェニル酸類及びその塩類が、ヨードチ
ロニン免疫試験に用いるための％に有利なＴＢＰ＠断剤
であることが、判っている。遮断剤となる化合物は、Ｔ
ＢＰ−複合体ヨードチロニンの、分析的に有意義な比率
の結合を解放かつ遮断するに十分な濃度で、好ましくは
５０％より＾く、かつ通常７０％よシ高いａｍで、しか
も抗体の璽−ドチオニ／との結合を着しく妨害しない程
度の低い濃度で、免疫試験反応混合物中に包含せしめら
れる。特定のヨードチロニン免疫分析に求められる遮断
剤の精確な濃度は、試験されるヨードチロニン及び採用
される免疫試験法並びにその他の要因によシ変化するが
、遮断剤となる化合物は、特に含有曹−ドチロニンが、
チロキシンの場合、普通、反応混合物中に、約０．１　
ミＩ）モ）ＫＷａＭ　）と約５　ｍＭの間の１１１度で
用いられる。本発明の連断剤は、試験反応混合物に、酸
又は分析的に許容されうるそれらの塩の形、例えば、ナ
トリウム塩、鵞すウム塩、リチウム塩及びアンモニウム
塩として添加される。

本発明の遮断剤、特に、フェンクロフェナックの、ある
予期し先なかつ良性質のためくいそれらは、試験反応混
合物中で、約３００ナノメートル（ｍＷｍ）よシ長くか
つ、通常７００１１ｍよシ短かい波長に、螢光発光又は
光吸収のような分光学的応答が発生するし、かつ、その
応答が試料中ヨードチロニンの濃度の関数である均一系
競争結合免疫試験において、ＴＢＰｉｌ断剤“とじて用
いるのに％に有利である１、本発明の遮断剤は、実質的
に３００１−より長い波長には、全く吸収を有しないこ
とが判っている。従って、分光学的応答が、螢光発光で
あるか、又は最終的に表わされないとしても、螢光発光
として開始される場合、本発明の化合物をＴＢＰ＠断剤
として用いるならば、かかゐ発光の減衰は認められない
が、これに対し、先行技術の試薬、特Ｋ　ムＮＢでは、
かな〕の減衰がおこり、望ましくない、又は、受容しが
たい試験性能特性、例えば、感度、再現性、精度の低下
等がおこる結果となる。

加うるに、特に１フエンクロフエナダクは、それが効果
的な　ＴＢＰＩＩ断剤である濃度では、多くの酵素類の
触媒活性に何ら実質的表妨害効果を示さないであろう。

従って、この化合物は、用いられ九標識が、酵素反応に
おける関与物、例えば、酵素基質、酵素阻害剤、酵素の
補欠分子族（ｐｒｅｓｔｋ＠ｔｉ＠ｇｒａｓｐ　）、補
酵素、又は＃嵩自身、又はその７ラグメントである均一
系競争結合免疫試験における’ｒｉｐ　遮断剤として更
に有利である。

先行技術のＴＩＩＰ　１１断剤、特にムＮ８は、酵素反
応に対しかな夛の妨害を惹起する可能性があシ、これＫ
よっても、試験性能の低下がおこる結果となる。

従って、本発明のフェニル酢酸類及びその塩は、一般に
１免疫試験のＴｉ１Ｐ　ｆｉ断剤としての新規な試験、
ｔｌｌｔＫ、　７エンクロフエナツクの場合、用いられ
九標繊が、酵素−触媒反応の関与物である分光分析によ
る均一系免疫試験に適用する際、特に有利である。本発
明は、又、新規な免疫試験を遂行するだめの試薬、特に
、臨床検査室で通常用いられるような試験キットの形体
をした試薬を提供する。

本発明のフェニル酢酸類は、通常、式：％式％ 〔式中、Ｙは０又はＮＨを表わし　Ｒ１及びＲ８の一方
は塩素を、他方は水素を表わす。〕で示され、ＴＩＰ　
ｊ１断剤として予期しえない特徴を有することが見出さ
れている。７エンクロフエナツク（Ｙ−〇かつｍ”＝　
ｃｔ　）　ｊ、この点において、具体的には、均−系ヨ
ードチロニン免疫試験において、特に有利であることが
見出されている。重要なもう１つの化合物は、ジクロフ
ェナック（ｄｉｃｌｏｒ・ｎｌｅ。

Ｙ−ＮＨかつＲ”＝Ｃｔ）である。しかしながら、当業
者には、本発明の概念から逸脱することなしに上式の基
本的なジフェニル構造に種々の変更を加えてもよいこと
は明らかであろう。本発明のＴＢＰ鐘断遮断有利な特徴
を有する類縁体は、この特許請求の範囲の目的に照らし
均尋なものと考えられるであろう。例えば、オキシ又は
イミノ連結官能基は、これらに限定されるものではなく
、チオ、メチレン、及びケトのような基をはじめとする
適切な類似し九連結基と置き換えてもよい。更Ｋ、ジク
ロル置換基は、いずれかのフェニル環上の単−又は複数
の置換基と置き換えてもよく、かかる置換基は、４１１
に、塩素、臭素、及びヨウ素などのハ四ゲン；アルキル
基、通常、低級アルキル基（Ｃ２，）、例えば、メチル
基及びエチル基：並びに、アルコ中シ基、通常、低級ア
ルコキシ基、例えば、メトキシ基及びエトキシ基から選
ばれる。

又、酢酸塩置換基は、一連の酸基、例えば、カルボン酸
類及びスルホン酸類並びにそれらのアルキル同族体類、
特に低級アルカン酸同族体類を代表する４のでもよく、
かつ、かかる基は、式中のオルト位に加えて、メタ位又
はパラ位のいずれかの位置でフェニルＩＩＫ結合してい
てもよい。米国特許ｇ３１７６６．２６３号も参照され
たい。

本発明は、一般に１ヨードチロニ／免疫試験に適用され
る。この目的のために、免疫試験とは、抗原−抗体の相
互作用を基とした試験を意味すると理解されるであろう
し、かつ、抗体としてはすべての従来の、すなわち、単
一クローン抗体（例えば、ＩｆＧ、　Ｉｆｆ、　Ｉｆム
等のタイプの抗体）又は、それらの有効なフラグメント
（例えば、Ｆａｂ。

Ｆ（ａｂ’　）　噸ＩｒＧの７ラグメント）を意味する
と理解されるであろう。本発明を適用すると有利な最も
一般的なタイプの免疫試験は競争結合免疫試験である。

かかる、ヨードチロエン測定用免疫試験においては通常
、血清又はプラズマである体液の試験試料を、試験に供
されているヨードチロニンに対する抗体、ヨードチロニ
ンの被標識体、及びＴＢＰ結合に対する遮断剤と組み合
わせる。試料中の１−トチ■二ンと競争して抗体と結合
した標識ｌ−ドチロニンの、結合せずに残る標識ヨード
チロエンに対すゐ比率が、試料中のヨードチロエン濃度
と関連している。

均−系及び不均一系免疫試験法のどちらにも適用できる
が、前者が特に好ましい。不均一系免疫試験においては
、抗体と結合し九標繊ヨードチロ二ンを、当業者に公知
であるようＫ、非結合体から物理的に分離し、かつ、１
又はもう一方の分離相において、標識を測定する。放射
性同位体（例えば、米国特許第４，１１１，６５６号及
び第３，９１１゜ｏｓｓ号）、螢光体（例えば、米国特
許第４，２０１゜７６３号、第４．１’７１，３１１号
、第４，１３３，６３９号及５、び第３，９１１２１１
１３１号）、酵素（例えば、米国特許第３　、６５４　
、０１１０号）等をはじめとする種々様々な標識が、不
均一系免疫試験に用いるものとして公知である。冒−ド
チロニｙ類の放射線免疫試験においては、標識として、
放射線ヨウ素を用いてヨードチロエン中にもともと存在
し九ヨウ素の１個をこの放射１ＩＩｓつ素で置換すると
％に有利である。

おいては、抗体結合型＊＊ヨードチロニンは、非結合型
とは異なる性質を示し、従って、不均一系試験において
必要とされる分離工程を回避することができる。床机な
均一系免疫試験法が、尚業者に公知である。特に好まし
いものは、ヨードチロエンと化学的に複合体を生成する
標識が、酵素もしくは酵素７ラグメント、例えば補欠分
子族であるか、又は、酵素−触媒反応におりる関与物、
例えば、基質、補酵素、阻害剤、活性剤等であるもので
ある。

本発明は、試験反応混合物中で、約３００　ａｍよシ長
く、かつ、通常７　Ｑ　Ｑ　ｗａｓよシ短かい波長に、
分光学的応答が発生し、この応答が、試験試料中のヨー
ドチロニノ一度を表示するような均一系競争結合免疫試
験に、特に応用できる。本発明の遮断剤は、かかる波長
では、実質的に吸収を有しないことが判っている。□分
光学的応答とは、光学的−に検出しうる信号を意味し、
通常、単−又は複数の波長を選び、その波長で測定する
。かかる信号の例としては、発光、例えば、化学ルミネ
センス（生物発光を含む）及び螢光、並びＫ、光吸収又
は光反射、例えば、色調変化又は色調生成、並びに、可
視スペクトルにおける測定可能な吸収率又は反射率の変
化がある。次は、かかる試験型式の例である。

！、螢光の減衰Ｘ線増大 仁Ｏ系における標識複合体は、その標ｍ部分が′螢光体
からな〕、その螢光は、標ｔＩ＆ヨードチロニン複合体
供役体：・ｏｎｊｕｇａｔ・）が抗体と結合すると、測
定可能な程度に、減衰又は増大する。螢光標ｌ１社、通
常、直接に１糊定され、かつ、その４１光は検出しうる
信号である。この型式の試験系については、米国特許第
４，１６０，０１６号及び第３゜９４０．４７５号；英
国特許第１，５８３，８６９号明細豐；並びに　Ｊ、　
Ｃｌ１ｉｉ、　Ｐａｔｈ、　　３０巻：　５２６頁（１
１７７）ＫＩｅ域されている。

１　螢光偏光 この系の標識も又螢光体である；しかしながら、影響を
受ける特性は、標識複合体と抗体との結合による、螢光
偏光（偏シ）である。この型式の試験系については、Ｊ
、　１ｃｘｐ、　Ｍａｄ、　　１２２巻：　１０２９頁
（１９７５）Ｋ配賦されている。

１　＃素基質標鐵法 この系において社、標識複合体が、酵素に対する基質で
あり、かつ、基質標識複合体に対する酵素の作用力が、
標識複合体の抗体との結合によって、正又は負のいずれ
かの影響を受けるように、標識を選択する。基質標識複
合体に対する酵素の作用によって、生成物が生成され、
この生成物は、ある特徴、通常、指示薬反応における化
学反応性のような、又は、側光学的特性、例えば、螢光
もしくは光吸収（色）のような化学的もしく社物壇的特
黴において区別しうるものである。この型式の試験系に
ついては、１９７８年４月ｌＯ日出願の係属する米国特
許出願第８９４，８３６号（英Ｉ３ｉ％許第１，５５２
，６０７号明細書に＠当する）；並びに、ムｍａｌ、　
Ｃｈ＠ｗ、　４８巻：　１９３３頁（１９７６）。

ムｍａｌ、　Ｂｉｅ＠ｈｃｖａ、７７巻Ｓ５５頁（１９
７７）及びＣｌ１ｎ、　Ｃｈ＠ｗ、　　２３巻：　１４
０２頁（１９７７）に記載されている。かかる酵素基質
標識法においては、標識複合体、例えば、基質−分析対
象物複合体は、酵素による作用を受け、開裂又社変形に
よって、生成物を生成し、この生成物は、複合体を該複
合体から区別する検出可能な性質を有するという性質を
もつであろう。例えば、複合体は、試験条件下では非螢
光性であるが、酵素と反応すると螢光性生成物が生成さ
れる。種々の螢光原性基質伸繊−複合体が、かかる手法
に用いられていることは明らかである。例えば、標識複
合体は次式で示されるものであって屯よい： Ｇ−Ｄ−Ｒ−Ｌ ｃ式中、ａはリン酸エステル、カルボン酸エステル翫又
はグリコン（ｇｌｙ＠・ｎ・）を表わし、Ｄは、Ｇが除
去されると、螢光性生成物を生じる螢光原性染料部分（
ｆ１ｗ＊ｒｏｇ＊ｎｉａ　ｄｙｅ　ｍｏｉ＠＆ｙ　）　
　を表わＬ、ｆｌＪＬｔｆ、Ｄａウンベリフェロン、フ
ルオレセイン、ローダミン及びそれらの銹導体類であっ
てもよ＜、”ｈ連結基を表わし、Ｌは結合成分、通常、
分析対象物（例えば、ヨードチロニン）又はその誘導体
を表わす。〕標識複合体の酵素による開裂（例えば、ホ
スファターゼ、カルボキシラーゼ、グリコシダーゼ等に
よる）は、抗体等の複合体のＬ部分への結合によって、
影響される。米国特許第４，２７９，９９２号を参照さ
れたい。特に好ましい基質標識試験法では、大型： で示される標識複合体が用いられる。

式中、ＲＦｉ連結基を表わし、かつ、Ｌは結合成分例え
ば、分析対象物又はその類縁体を表わし、これＫよシ、
複合体を開裂しその螢光によシ判別されうる生成物を生
じさせるβ−ガラクトシダーイ酵素の能力が、複合体と
抗体との結合によシ阻害される。

他の有用な基質標識複合体は、式： で示される複合体である。

式中、ａは酵素によ如開裂しうる連結基、例えば、リン
酸エステル、カルボン酸エステル等を表わし、Ｌは上述
の結合成分を表わし、かつ、Ｄは上述の螢光原性染料部
分を表わし、Ｒが開裂すると、螢光性指示薬を解放する
。特に好ましい方法では、式ｍ菖 ３ で示される標識複合体が用いられる。

〔式中　Ｒ１は、標識成分りを開裂しうるリン酸エステ
ルに連結する結合もしくは鎖を表わし、かつ、Ｒ１は、
水素もしくは例えば−メチル基及びエチル基の低級アル
キル基のような置換基、Ｎ−アルキルアミド基、又はＮ
−（水酸基置換低級アルキル）アミド基、例えば−Ｃｏ
ＮＨ−（ＣＭ、ｉ　０■（式中、聰＝２−６）を表わす
（米国特許第４，２７３，７１５号。

参照されたい）。〕ウンベリフェロン残基は、他Ｏ又は
追加の置換基を有してもよい〔人ｎａ１．ｃｋ＠ｍ。

４０巻−８０３頁（１９６ｇ）を参照されたい〕。ホス
ホジェステラーゼによるＭ裂は、複合体のＬ部分への抗
体の結合により影響される。

表　エネルギー移動 この系においては、標識は、エネルギー移動の供与体−
受容体対の一方であシ、かつ、抗体は、かかる対の他方
と複合体を形成している。従って標識複合体が抗体と結
合すると、その対の供与体成分のエネルギー表示が受容
体成分への移動により変化する。通常、供与体は螢光体
であり、かつ、受容体はその螢光体に対する減衰剤（ｑ
ｕ＠ｎｅｈｅｒ　）であシ、この減衰剤も螢光体でおっ
てもなくてもよい。かかる実施態様においては、検出信
号は螢光であるが、しかし他の検出系も又、可能である
。

かかる試験系については、米国特許第３　、９９６　、
３４５号；第４，１７４，３８４号；及び第４，１９９
，５５９号並びに英国特許第２，０１８，４２４号明細
書中に記載されている。

＆　化学的励起螢光 との系においては、標識は再び、螢光体である。

しかし表から、螢光体標識が螢光を発するエネルギー状
態まで、化学的に励起される螢光体標識の能力は、標識
複合体と抗体との結合によシ影響をうける。標識の化学
的励起は通常、そ−の場で生成された高エネルギー化合
物に螢光標識がさらされるととによ〕完遂する。この型
式の試験系については米国特許第４，２３８，１９５号
に記載されている。

亀　二重抗体立体障害 別の試験系として米国特許第３，９３５，０７４号及゛
び９７４８，９９８，９４３号に記載されている二重抗
体免疫試験系がある。標識複合体は２個のエピトープ（
す１１・ｐ＠Ｉ）からな）、一方がリガンド及び抗−リ
ガント抗体との免疫学的反応に関与し、他方が第２の抗
体と結合しうるが、２個の抗体が、同時Ｋｌｌ［Ｉｌ！
複合体と結合することは妨けられるという制約を受けて
いる。第２のエピトープ杜、その螢光が第２の抗体の結
合によう−Ｃ［衰する螢光物質であってよく、又は、第
２の抗体と結合するための、第２のエピトープの標識形
との補助的競争れているように、種々の検出系がかかる
系には可能である。関連試験系は、米国特許第４，１３
０．４６２号及び第４，１６１，５１５号及び英国特許
第１，５６０．８５２号明細書に記載されている。

７、　補欠分子族標識法 この系においては、標識が酵素の補欠分子族であり、か
つ、触媒的に不活性なアポ酵素が補欠分子族標識と結合
し、活性酵素（ホロ酵素）を生成する能力は、標識複合
体と抗体との結合によシ影響される。結果として生じる
ホロ酵素の活性は、最終的に検出可能な信号を生じる従
来の検出系によって測定できる。この型式の試験系につ
いては、米国特許第４．２３８，５６５号に記載されて
いる。特Ｋ、好ましい補欠分子族標識試験では、標識と
して、フラビンアデニンジヌクレオチド（Ｆ’ＡＤ）を
、かつ、アポ酵素として、アポグルコースオキシダーゼ
が用いられる。Ｍｌとして生じるグルコースオキシダー
ゼの活性は、グルコース、ペルオキシダーゼ及び過酸化
水素に応答して色の変化を生じゐ指示薬系からなる比色
検出系により測定できる、適切な螢光原物質を用いて、
過酸化水素の螢光検出も又可能である。

８、補酵素標識法 この系の標識複合体は、その標識部分に補酵素活性を有
する官能基を有し、かつ、かかる補酵素標識の酵素反応
への関与能力は、標識複合体との結合によシ影響される
。結果として生じる酵素反応の速度は、最終的に検出し
うる信号を生じる従来の検出系によって測定できる。こ
の製式の試験系については、１９７８年４月１０日出願
の米国特許出願第８９４，８３６号（英国特許第１，５
５２，６０７巻！９５頁（１９７６）Ｋ記載されている
。

９、＃嵩活性調節基標識法 この系の標識被合体は、その標識部分に、酵素阻害剤又
は酵素促進剤のような酵素活性調節官能基を有し、かつ
かかる調節基標識体の、酵素活性を調節する能力は、標
識複合体と抗体との結合によシ影響される。結果として
生じる酵素反応の速度は、最終的に検出しうる信号を生
じる従来の検出系により測定できる。この型式の試験系
については、米国特許第４，１３４，７９２号及び第４
　、２７３　。

８６６号に記載されている。特に、好ましい試験では、
標識として、メトトレキセートを、調節される酵素とし
て、ジヒドロ葉酸エステルリダクターゼが用いられる。

１０、＃素標職法 との系において社、標識が酵素であり、かつ、酵素標識
の活性は、標識複合体と抗体との結合により影譬される
。結果として生じる酵素活性は、最終的に検出しうる信
号、例えば、吸収又は螢光を生じる従来の検出系によシ
測定できる。このタイプの試験系については、米国特許
第３，８１７，８３７号及び第４　、０４３　、８７２
号に記載されている。

他の均−系競争結合免疫試験法本、本発明の概念を逸脱
することなしに用いることができる。

特に、フェンクロフェナックも、それがＴＢＰ總新剤と
して有効である濃度において、多くの酵素の触媒活性に
対して実質的には阻害効果を与えないので、本発明は、
酵素反応をはじめとする均一系免疫試験において、更に
有利である。かかる試験祉上述のように１酵素基質標識
法、補欠分子族標識法、補酵素標識法、酵素調節基ＷＡ
ｗＩｋ法及び酵素標識法を包含する。「酵素活性に対し
て実質的な阻害効果を与えない」というのは、触媒作用
速度が約７０に以上減少せず、より一般には、５０％未
満、好ましくは３０ｅＸ未満であることを意味する。

試験されるべき生物学的液体はその中で、興味の対象で
あるヨードチロニン（類）が結合蛋白質と望ましくなｈ
結合を生成しているものならいかなるものでもよい。通
常の場合、生物学的液体は、全血、血清又はプラズマの
ような血液試料である。

本発明の試薬は、本発明によって包含される所定のヨー
ドチロニン免疫試験法を行うのに必要とされるすべての
必須化学的な要素からなる。試薬は、試験具の形で、試
薬間での両立ができる範囲で組成物もしくは混合物とし
て、又は、試験キット、即ち、盛会な試薬を保管する１
又はそれ以上の容器の箱詰め組み合わせとして、箱詰状
の市販品の形で提供される。

試薬中には、所定の結合反応系に適合し、かつ、丁ＢＰ
遁新剤として本発明の化合物、例えば、フェンクロフェ
ナックを有する試薬が含まれる。かかる結合反応試薬は
、Ａ常、遮断剤の他に、標識ヨードチロニン複合体、試
験に供されるヨードチロニンに対する抗体を含有し、か
つ、必１’に応じて他のＴＢＰ　３１断剤を含有するこ
ともありうる。

もちろん、この試薬は業界では公知の、かつ、緩衝剤、
稀釈剤、標準液等の商業的及びユーザーの立場から望ま
しい他の物質を含有してもよい。

（ａ）　１１定されるべきヨードチロニンに対する抗体
、（司抗体と結合すると、その検出可能な特性が変化す
る標識ヨードチロニン複合体、及びＴＩＩＰ　＠新剤と
しての本発明の化合物とからなる均一系競争結合免疫試
験用の試験キットが特に好ましい。上述のように、用い
られる％異的標識は、採用される手法に依存する。ヨー
ドチロニ／抗体、抗淋と結合すると、その検出しうる特
性が変化する標繊璽−ドチロニン複合体、及びＴＢＰ　
＠新剤としての本発明の化合物とを含有する試薬組成物
、並びに、この試薬組成物を包含せしめ九固体状担体材
からなる試験具も又好ましい。かかる試験具の稙々の形
態は、参考としてここに包含されている１９８０年１０
月３０日出願の米国特許出願第２０２゜３７８号に記載
されている。

次に本発明を次の実施例によって説明するが、本発明は
、これＫよって制限されるもので杜ない。

実施例 ！　フェンクロフェナック及びジクロフェナックを用い
る、人間の血清からのチロキシンの解離約３ミリリツト
ル（ｗｔｆの人間の血清を、放射性璽−ド橡識チロキシ
ン〔アマーシャムーサール、アーリントン・ハイツ、イ
リノイ、アメリカ会衆ａ　（ムｍ＠ｒｓｈｅｓ−８＠ａ
ｒｌｓ、　　ムｒｌｉｉＩｇｔ＊ｎ　　Ｍ＠ｉｇｈｔｇ
。

＄１１１＋ａ・１番、ＵＳＡ）よシ入手した　・Ｉ−チ
ロキシン〕と約８時間平衡化させた。

次に、この血清の１００マイクロ）Ｊットル（μｔ）量
を、種々の濃度のフェンフロツェナ・ツクを含有する、
０．１モル濃度ＣＭ〕リン酸ナト１ノウ五緩衝液（ｐＨ
６１）の３００μを量と混合した（英国特許第１、！１
０８，３２７号；実施例６）。次に、これらの混合物の
それぞれの１８０μＬ量を、０．１ＭＩＪン酸ナトリウ
ム緩衝−ｆ［（−６，５）で平衡化した８ｅｐｈａｄ＠
ｘＬＨ−２０（セファデックスＬＨ−２０，商品名）〔
７アーｉシア・ファイン・ケミカルス、ビスカッタウェ
ー、ニュージャーシイ、アメリカ合衆国（Ｐｈａｒｍａ
ａ＋ｉａ　　Ｆｉｎｓ　　Ｃｈ＠ｍ１ｅａｌｓ、　　Ｐ
ｉａｅｓｔａｗａｙ、ＮＥＷＪ＠ｒｓｅｙ、　ＵＳＡ）
　）の２−カラムに施した。カラム上の放射能を測定し
、次いで、５ｗｔの緩衝液でカラムを洗浄した。各カラ
ムの放射能を再びａｌｌ定し、その結果（第１表に示し
た）を、血清蛋白質力）ら解離したチロキシンの推定値
として用いた。

第１表 ０　　　　　　　　　１９ ｏ、ｚｓ　　　　　　　　ｓ。

Ｏ，５０７２ １，０７ｇ ２、ＯｇＢ ５．０　　　　　　　１００ 第２の実験は、フェンクロフェナック及びジクロフェナ
ックの解離特性を比較するために行われ九。放射性ヨー
ド標識チロキシン〔アマーシャムーサール、アーリント
ン・ハイツ、イリノイ、アメリカ合衆国（Ａｍｒｒｓｈ
ａｍ−８ｅａｒｌｓ、　ＡｒＡｒ１１ｎ＊ｎＨ＠１ｇｈ
ｔｓ、　ＩＬ、　ＵＳＡ）よシ入手したＩｌｌニーチロ
キシン〕を４８時間、４℃で、５−の正常な人間の血清
と平衡化させ喪。この血清１００μを量を、釉々の濃度
の７エンクロフエナツク又はジクロ７エナツクを含有す
る（実施例１参照）０．１Ｍリン酸ナトリウＡ（ｐＨ７
，０）の３００　ｌｉｔに添加し、第１Ａ表に示した最
終濃度液を調製した。室温で５分間温筐後、その１６５
μを量を、Ｓ＠ｒａｌｕＬｅ■（セラルート、登録商標
）チロキシン試験キット〔マイルスーラボラトリーズ・
インコーホレーテッド、エイムズ・ディビジョン、エル
クハート、イ／ヂアナ、アメリカ合衆国（Ｍｉｌｅｓ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｏ。

、ムｓｅａ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　ＥｌｋｈａｒＬ、　
ＩＮ、　ＵＳＡ）：ｌからの、０、１　Ｍリン酸ナトリ
ウム液（＋！１７．０）と平衡状態にさせておいた　５
ｅｐｂ＊ｄ＠ｘ■（セファデックス、登録商標）カラム
に施した。カラムに施こされた総放射能を測定し、３ゴ
の緩衝液を用いて、非解離物質をカラムから洗い流した
。血清蛋白質から解離したチロキシンの比率を測定する
ために、カラムの放射能を計数した。

第１Ａ表 ０　　　　　　９　　　　　　９ ０．２５　　　　　４０　　　　　　　４８０．５０　
　　　　６１　　　　　　　６１１．００７１７３ ２．００　　　　　７５　　　　　　　７７４．００　
　　　　７９　　　　　　　８０８．００　　　　　８
１　　　　　　　８２従って、ｌ−ドチロニン免疫分析
反応混合物中の０．２５論Ｍ７エンクロフエナツクは、
約４０〜５０にの蛋白質結合四−ドチロニンの、結合を
解放し、かつ、速断することが期待され、ｏ、ｓｏｍＭ
では６０〜７０％が期待される。第２の実験は、両解離
剤が、免疫試験反応において、血清蛋白質からヨードチ
ロニンを解離するのに等しく効果的であることを示した
。

１、チロキシンと抗体との結合に対するフェンクロフェ
ナックＯ影響 種々の濃度の７エンクロフエナツクを含有し、最終容量
６−の一連の抗体結合反応が、０．１ＭＩＪン酸ナトジ
ナトリウム緩衝液６．５）中で行われた。

各反応は　！−チロキシン、２０μｔの正常なウサギＯ
免疫グロブリン、及び２μｔのチロキシンに対する抗体
を含有した。混合物を、室温で約３時間態量し、次いで
、４００８１０５０　％　（ｗ／ｖ　）ポリエチレング
リコールを添加した。沈澱蛋白質を遠心分離によ〕採集
し、かつ各沈澱物の放射能を測定し丸。結果は、７エン
クロ７エナツクを含まない沈澱の放射能に対するパーセ
ントとして第２表に示しである。

嬉２表 ０　　　　　　　　　　　　　　　　１０００．２　　
　　　　　　　　　　　　９７ｏ、ｓ　　　　　　　　
　　　　　　　ｓ。

１．０　　　　　　　　　　　　　　　　６９２．５　
　　　　　　　　　　　　　　６１５．０　　　　　　
　　　　　　　　４３データは、約５　ｍＭ以下の濃度
の７エンクロフエナツクでは抗体結合反応を僅かに約５
０％、かつ、約２．５　ｍＭ以下の撫度では僅かに約４
０％妨害するに過ぎないことを示している。このデータ
及び実施例■のデータに基づくと、チロキシン免疫試験
反応混合物における７エンクロフエナツタの好ましい鹸
度は、０．２５〜１．０　ｍＭの範囲となるであろう。

璽、チロキシンの放射性免疫試験 血清チロキシンの放射性免疫試験を、ＴＢＰ３Ｊａ断剤
として７エンクロフエナツクを用いて行った。

既知濃度のチロキシンを含有する標準血清１００μＬ量
を、０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，５）２９
０ｆｉｔ１最終試験混合物中に０．６７１ＥＩＭ濃度と
なル量のフェンクロフェナック、チロキシンに対スるウ
サギの抗体２μを及び１ニーチロキシンの一定量（最終
容積において、ｉｏｏμを当シ１分間に約３４．Ｇｏｏ
カウント）と混合した。室温で２時間態量後、！ＩＯに
（−／マ）ポリエチレングリコール４００μｔを添加し
、かつ、得られた沈澱を遠心分離によって採集した。次
Ｋ、各沈澱物の放射能を測定した。結果を第３表に示す
。

第３表 ０　　　　　　　　　　　　　２３．７００１．０　　
　　　２１，８００ ２．５　　　　　　　　　　１７，３００５．０　　　
　　　　　　　１４，４００１０．０　　　　　　　　
　　１０，０００２０．０　　　　　　　　　　　　７
，５０Ｇデータは、血清試料中のチロキシン濃度が増加
すると、抗体と結合した標識チロキシンの量が減少した
ことを示している。従って、フェンクロフェナックが、
血清中のヨードチロニン・チロキシン測定用の競争結合
免疫試験において、有効に用いられることを実証した。

■、フェンクロフェナック及びジクロフェナックの光学
的吸収スペクトル 種水酸化ナトリウム溶液に７エンクロフエナツクを加え
て、５０ＩＩｌ１Ｍ溶液を調製し、可視色を有しないこ
とを観察した。０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（４６
，５）中の０．５ｍＭ溶液の光学的吸収スペクトルを記
録したが、３００ナノメートル（ｍｅｎ　）以上では、
有意の吸収を全く示さなかった。従って、フェンクロフ
ェナックは、かかる波長に発生する分光学的信号に、有
意の影響を与えることはないであろう。

これに対し、梃来用いられた遮断剤　ムＮシ　は、３　
Ｑ　Ｑ　ｍａ＋に有意の吸収を有する。０．１　Ｍ　Ｉ
Ｊン酸塩緩衝液（−７，０）中の５０μＭＡＮＳｆｉ液
は、約ｓ　ｓ　ｏ　ａｍで、０．５のピークを伴う３０
０〜４００ｍｍの広域吸収帯を示した。このように、ム
Ｎ８が遮断剤として、通常、用いられる濃度（１，ｍＭ
付近）よ〕はるかに低い濃度で、有意な吸収を行う。

第２の実験では、７エンクロフエナツク及びジクロ７エ
ナツクの溶液を、Ｑ、１Ｍ水酸化ナトリウム溶液中に溶
解することにより調製し、ＢａｕＩｈ＆　Ｌａｍｂ　８
ｐ＠＠ｔｙ＠ｍｉｓ　　２０００　　（バラシューアン
ドロム・スペクトロニック２０００．　　商品名）二重
光線走査分光光度針を用いてスペクトルをとった。

＠３ｊＬ表 ６９ λ謙ｌ鳳　　　　　　　　　２５７　　　　　　　　　
　　　２４８Ｍ−”ｃ１ｍ−’で表わされている。

両物質は、近紫外吸収スペクトルを有するが、いずれも
３２６　ａｍ以上には吸収を有しない。いずれの化合物
も、これ以上の波長に、分光学的に発生する信号に対し
ては妨害を及はさないであろう。

Ｖ、ＦＡＤ標識複合体によるアポグルコースオキシダー
ゼの活性化に及ばすフェンクロフェナックの影響 一連のアポ酵素の再活性化測定を、種々の濃度の７エン
クロフエナツクを用いて行った。試験は３７℃で行われ
、Ｏ９ロ１ン酸塩緩衝液（４７，０）中の最終的な試薬
濃度は、１．０ｎＭＦムＤ標繊複合体（米国特許第４，
２３８，５６５号に記載されているようなＦＡＤ−テオ
フィリン複合体）　、５０ｍＭアポグルコースオキシダ
ーゼ（米国特許第４．ｚ６１１．６３１号）、ｚ、ｓμ
ｔ／−抗（グルコースオキシダーゼ）抗血清、２ｍ１Ｍ
　　ジクロルヒドロキシベンゼンスルホン酸ナトリウム
（ＤＨ８Ａ）、０．２１６Ｍ　４−アミノアンチピリン
、０．１Ｍグルコース、２０μｆ／−ペルオキシダーゼ
、及び０．１　％　（ｗ／ｖ）仔ウシの血清アルブミン
である。アポ酵素及び抗（グルコースオキシダーゼ）は
予備態量され１２次いで、同時に他の試薬に混合するこ
とによシ、反応が開始され九。反応混合物を５分間態量
し、次いで、２１２０１１ｍ１Ｋシける吸光度を読み取
った。第４表に示した結果によると、活性グルコースオ
キシダーゼの発生に対して、７エンクロ７エナツクの濃
度が関連していることを示している。

第４表 １００ ０．８　　　　　　　８１ １．０　　　　　　　６６ １、！ｌ　　　　　　　　６１ ２．０　　　　　　　５４ ２．５　　　　　　　４７ データは、７エンクロ７エナツクの濃度が２．５ｗ＆未
満ならば、アポグルコースオキシダーゼとＦＡＤ−標識
複合体の再結合が、補欠分子族標識免疫試験（米国特許
第４，２３８，５６５号）を用いるのに十分な速度です
すむことができることを示している。

比較の目的のために、一連のアポ酵素再活性化測定を、
種々の鎖変の、従来用いられた遮断剤ムＮ８　を用いて
行った。次の試薬を調製した：試薬五　　０．１０５Ｍ
　　　り巧浚ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）０１０５
Ｍ　　グルコース ２．２１０Ｍ　　　　ＤＨＳム ２１　ｆｉｔ／−ペルオキシダーゼ １．１％（Ｗ：Ｖ）　　仔ウシ血清アルブミン１２６ｍ
Ｍ　　ＦＡＤ標識複合体（前出）試薬Ｂ　　４　μＭ　
　　　アポグルコースオキシダーゼ（前出）３０％（Ｗ
　：　Ｖ）　　グリセロール５０１ＢＭ　　　　リン酸
塩緩衝液（ｐａ４７．０　）８ｍＭ４−アミノアンチピ
リン 別々に分は九試薬ムに、第５表に示した濃度で五Ｎ８　
　を直接溶解した。アポ酵素の活性は、５０ＳｔＯ試薬
Ｂをキュベツトに入れ、次いで１．９０−の試薬ムを添
加して反応を開始させるととくより測定した。試験反応
物を室温で１０分間温態量、ｓ　ｚ　ｏ　ａｍでの吸収
率を記録した。結果を第５表に示す。

第５表 ０　　　　　　１００ ０・１６４ ０．２　　　　　４６ ０．５　　　　　１３ １、ＯＯ データは、ムＮＢ＠度が約１．０　ＩＩＩＭよシ大きい
と、再結合反応が完全に妨害されることを示している。

１１断剤の目的に対ｔして祉、この濃度付近の　ムＮＳ
が必要とされるので、ムＮ８を免疫試験に用いることは
できないであろう。

第２の実験においては、　ＦＡＤ−ヨードチロニン（Ｔ
−４）複合体によるアポグルコースオキシダー（の活性
化に対するフェンクロフェナックの影響について研究し
九。アポグルコースオキシダーゼの活性化は、種々の濃
度の７エンクロフエナツクを用い、３７℃で行った。９
６ｍＭリン酸ナトリウム（Ｆｉｔ　７．０　）　、９５
ｍＭグルコース、１．　Ｏｎ＋Ｍジクロルヒドロキシベ
ンゼンスルホン酸ナトリウム（ＤＨ８ム）、１９μｒ７
ｔペルオキシダーゼ及び種々の濃度の７エンクロフエナ
ツクナトリウムを含有する２組の試験物を最＃！濃度が
、それぞれ１００ｍＭ、１００μＭ、５μ都−となるア
ポグルコースオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン及
び抗グルコースオキシダーゼに、又、最終濃度が２１　
ｍＭとなるＦＡＤ−チロキシン複合体に添加し九。

３７℃で５分間の試験媒質の予備態量後、ＦＡＤ−チロ
キシン複合体又はアポグルコースオキシダーゼ試薬を適
切な試験セットに添加した。３３０秒の態量後、５２０
ｉｕａでの吸収率を記録した。データは、フェンクロフ
ェナックが存在しない場合に記録された吸収率に対する
比率として与えられている。

第４Ａ表 ０　　　　　　　　　　　　　　１００　　　　　　　
　　　　１０００．１＠　　　　　Ｚｏｏ　　　　　　
９７０．３１　　　　　９８　　　　　９２０．６３　
　　　　９７　　　　　９４１、２５　　　　　９３　
　　　　９５鵞、ｓ　　　　　　　ｓｏ　　　　　　ｓ
ｓ！ｌｔ、０　　　　　　７８　　　　　７４１０．０
　　　　　　５３　　　　　５４実際の曹−ドチ四エン
免疫分析に用いられる条件下で、ＦムＤ−チロキシン複
合体がアポグルコースオキシダーゼを活性化するのに用
いられた際、比色応答は約２ｍＭフェンクロ７エナツク
では僅か８〜１０％しか減少しなかった。

荀、７エンク四７エナツクによる螢光減衰についての検
討 螢光測定は、アミンコ・バウマン（ムｃｎｉｍｏ・Ｂｅ
ｗａ＊ａｎ　）螢光針〔アメリカン・インストルメンツ
、シルバー・スプリングス、メリーランド、アメＪ力会
衆１ｍ（ムｍ＠ｒｉｅａｍ　Ｉｎｓｔｒｓｓｍａｎｔａ
、　５ｉｌｖｅｒ　　８ｐ−ｒｉｍｇｓ、　Ｍａｒｙｌ
ａｎｄ、　Ｕ８ム）〕、　及び４００　ｍＷでの励起及
び４５０　！１ｍｌでの発光を用いて、５０１１ｍＭ１
１Ｍパイシンｉｌ（Ｎ、Ｎ−ビス−（２−ヒドロキシエ
チル）グリシン、カルビオケムーベーリング、ラジ璽う
、カリフォルニア、アメリカ合衆国（Ｃａ１ｂｉ・ｓｋ
ｉｍ　−Ｂ＠ｈｒｉｍｇ、　ＬａＪｅｌｌａ、　Ｃａ１
ｉｆｏｒｎｉａ、　Ｕ８ム）中で行われ九。上記の励起
及び発光は、米国特許第４，２７９．９９２号に記載の
β−ガラクトシルーウ／ベリフエロン酵素基質標識螢光
免疫試験（８ＬＦＩム）用の螢光条件である。これらの
条件下で、１０ｍＭフェンクロ７エナツクは螢光を示さ
なかった。

減衰についての研究は、種々の濃度のフェンクロフェナ
ックの存在下で、２−（７−ヒドロキシ−３−カルボキ
シアミドクマリン〕エタノール（米ａｔ％許第４，２７
３，７１５号）Ｏｔ３μＭ溶液の螢光を測定することに
より行われた。フェンクロ７エナツクが存在しない場合
の螢光（Ｆｅ）対実測された螢光りの比がフェンクロフ
ェナック一度に対して算出され、第６表に示されている
。

第６表 ６　　　　　１．００ ０．２　　　　１．００ １．０　　　　１．Ｏｆ ！、０　　　　１．Ｇ。

８．０　　　　１．Ｇ。

１０　　　　　１．０２ データは、フェンクロフェナックが、８ＬＦＩム法に用
いられたウンベリフェロン螢光体を実質的に減衰させな
いことを示しておシ、従ってかかる均一系免疫試験法（
米ＩｉＩ特許第４，２７９，９９２号）において、ＴＲ
ＩＰ　線断剤として用いるのに非常に適切であることを
示している。

１、ジヒドロ葉酸エステルリダクターゼ酵素の活性に対
する７エンクロフエナツクの影響種々の濃度の７エンク
ロフエナツク並びに、３７’ＣＫｓＩ−いて、最終容積
１−中に、０３　ｍＭチアゾールブルー、ｏ、ｓｔｓＭ
ジヒドロ葉酸エステルｏ、５ｍＭ　ＮＡＤＰＨ、及び０
．０１２　単位／ｓｇ　　（”　”　７ｙｄ）、ジヒド
ロ葉酸エステルリダクターゼを含有するように１試験混
合物を調製した。３７℃で１０分間の電量期間に亘って
、ｓｓｏｍｍＫおける各反応混合物の吸光度を読み取っ
た。結果を第７表に示す。

第７表 ０　　　　　　０．３６０ ０．１　　　　０．３５９ ０．２　　　　０．３６５ ０．５　　　　０．３５５ １、　ＯＯ，３３２ ２，５０，２７３ ５，００，１１８ データは、フェンクロフェナックが、血清蛋白質からチ
ロキシンを解離させるのに効果的な１．０鳳Ｍ未満の濃
度において、酵素活性を実質的に阻害することがなく、
従って酵素調節基標識均一系免疫試験（米ｆｆｉ％許第
４，１３４，７９２号）において、Ｔ！ＩｐＨＩ断剤と
して用新剤のに非常に適切であることを示している。

１．チロキシンについての酵素阻害剤標識免疫試験 血清中のチロキシンについての、酵素阻害剤標識免疫試
験（米！！４１許ｊ１４　、１３４　、７９２号）を、
ＴｌＰ値断剤新剤て、フェンクロフェナックを用いて行
った。既知浸度のチロキシンを含有する４０声を量の血
清標準液を、０．３Ｍ塩化カリウム、Ｏ，ＯＳ％アジ化
ナトナトリウムびＯ，Ｓ　ｍＭフェンクロ７エナツクを
含有するＯＩＭのリン酸ナトリウム緩衝液（４１り１−
中にチロキシ／に対する、ウナギ抗血清２１μｔを加え
たものからなる抗体試薬０．２−と混合した。３０秒間
の態量後、各混合物中ＫＩＯｍＶ炭酸ナトリウム緩衝液
（−９，５）にＯｌ・ｓｓｙ／ｓｇ　ＮＡＤＰＨ（０，
６５！ＩＩＭ）、及び０．０１７５μＭのメトトレキセ
ート−チロキシン複合体〔参考の丸めに、とこに包含さ
れる出願であり、メトトレキセート標識ヨードチロ票ン
複合体（丈書査号第Ｍ８−　Ｉ　Ｚ　１０号）という題
名の米国特許出願に記載されているようにして調製した
〕を加えたも３０秒温態量九後に、各混合物に、ｏ、５
％（ｗ：Ｖ）ゼラチン及びｏ、ｏｏｓに（ｗ　：　ｖ）
クロルヘキシジン〔クグトケミカル、セントルイス、電
ズリ−、アメリカ会衆１ｉ１　（５１ｇｎ５　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ、　８ＬＬ＠ｍｌａ、　Ｍｉｍｓｅｍｒｉ、　
Ｕ８ム）〕　を含有するＯＩＭＴｙｌｉ−Ｈ≧緩衝液（
トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（ｔ
ｒｉｓ−（ｈｙｄｒｓｘｙａ＊４ｈｙｌ　）ａｍｉｍ＊
ｏ＊＊ｔｋａｍｓ　ｈｙｓｌｒ＠ｅｋｌａｒｉｓ　５ａ
ｌｔ　）、　カルビオケムーベーリング、ラジ曹う、カ
リフォルニア、アメリカ会衆１ｉ　（Ｃａｌｂｉｏｅｈ
＊ｍ−Ｂ＠ｈｒｉｎｇ、　ＬｍＪｓｌｌａ、　Ｃａ１ｉ
ｆ＠ｒｍ１ａ、　ＵＳム）　）　　（ｐＨ８，５）中に
、２７．５１１Ｍのメトトレキセート結合部位を有する
濃度で、ジヒドロ葉酸塩りダクターゼを含有する酵素試
薬０、２−を添加した。４５秒後、３４０　ａｍにおけ
る各Ｓ＊の吸光度を１分間に亘って読み取った。

結果を＃１８表に示す。

第８表 ０　　　　０、１６８２ １、０　　　０．１６５９ ２．５　　　０．１６４８ １０　　　　０、１５７１ ２０　　　　０、１４９８ 従って、血清試料中のチロキシン濃度が増加すると、阻
害剤−チロキシン複合体による＃素阻害量が増加した。

゛フェンクロ７エナツクは３４０　ａｍＫｓＰける分光
学的応答も酵素反応も、実質的Ｖｃｉｌｌｉ害しなかっ
た。

鷹、チロキシンについての、酵素基質積繊免疫試験ム、
標識複合体の合成−５−（チロキシンアミド）ペンチル
、４−メチルウンヘリフエロン、水素リン酸エステル ＣＭ。

１２ｓ−の乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に１
７３　ｆ　（１０ｍｍ＊ｔ）のＮ−）リフルオル７セチ
ルーＬ−チロキシン１．１３３Ｆ　（１１ｍｍ＠ｔ）Ｏ
Ｓ−アミノ−１−ペンタノール、及び１７ｆ（！　Ｏｍ
ｍｅＡ）の１−ヒドロキシベンゾトリアゾ−ルを加えた
溶液を、アルゴン雰囲気下で攪拌しながら一５℃まで冷
却した。これに、２．２８ｆ（１１謙■・ｇのジクロル
へキシルカルボジイミドを添加し九。冷却浴を取り外し
、反応物を室温になるまで放置し、かつ３時間攪拌し九
。溶媒を減圧下で留去した。残留物を２５０−の酢酸エ
チル中にとＤ、濾過し、かつ、１５０−の重炭酸ナトリ
ウムの飽和水溶液及び５％のクエン酸水溶液で洗浄した
。この残留物を、５：１（ｖ／ｖ）塩化メチレン：アセ
トンを用いて溶出する、シリカゲルカラムでの調製用液
体クロマトグラフィによって精製した。６．５？（収率
６７Ｘ）のＮ−）リフルオルアセチルチロキシンのＮ−
（５−ヒドロキシペンチル）アミドが白色固体、融点２
０２〜２０３℃として得られ九。

分析：計算値（Ｃ！！馬、　Ｆ、　Ｉ、　Ｎ、　Ｏ，と
して）：Ｃ，２７，５８：Ｈ，λ２１：Ｎ、２．９２実
験値言Ｃ，２７，８９：Ｈ，！、１８：Ｎ、　３．３６
とのＮ−）リフルオルアセチルチロキシンのＮ−（５−
ヒドロキシペンチルアミド）（１７５ｔ。

＠ｍｖｍ・ｔ）及び２．０１　Ｆ　（６ｍｍｏＡ）の４
−メチルウンベリフェロン−リン酸塩のピリジン塩を、
７５−の乾燥ＤＭＦ中で懸濁させた。混合物を、真空ポ
ンプと連結した回転式蒸発器（ロータリーエバポレータ
）で、体積的２５−まで濃縮した。更に２０−の乾燥Ｄ
ＭＦ’を添加し、次いで、３０−の乾燥ピリジンを添加
した。次に゛、固体ジシクロへキシルカルボジイミド（
２，４８ｆ、　　１２　ｍｍ＠ｔ）を添加し、かつ反応
物を、アルゴン雰囲気下、室温で２４時間攪拌した。溶
媒を減圧下で留去し、かつ、残留物を３００−のＱ、　
Ｉ　Ｍ　）リエチルアンモニウム炭酸水素塩水溶液と共
に１時間攪拌した。

白色沈澱をろ別し、次いで、３００−のエーテル中で３
０分間攪拌し、ろ過したところ、ジシクロヘキシル尿素
が混入した目的生成物８ｔを得た。

この残留物（１，６Ｆ）をメタノール中に溶かしく幾分
かの不溶物はろ過により除去した）、かつＢ＠ｐｂａｄ
＊ｘ　　Ｌｆ（−２０（セファデックスＬＨ−２０゜商
品名　６０５　Ｘ　５　ａｍ）を用いてクロマトグラフ
にかけ、メタノールで溶出した。流速は０．５ｖｔｅ／
分であシ、１０−の画分を採集した。

画分６９〜７６をひとまとめにし、かつ蒸発せしめて白
色ガラス状固体として、３９０１９の５−ＣＮ−（）リ
フルオルアセトアミド）チロキシ／アミド〕ペンチル、
４−メチル水素リン酸エステルトリエチルアンモニウム
塩を得た。

分析二計算値（Ｃ，、ｋｌ、１Ｆ、　Ｉ、　ＰＮ、　０
．。とじて）：Ｃ，３５，１８；Ｈ，３，３４：Ｎ、　
３．２４実験＠　：　Ｃ，３７，０１１，３，６３；Ｎ
、　３．３６Ｎ−）リフルオルアセトアミドで保護した
リン酸ジエステル２００ｑ部を、５０％メタノール水溶
液に溶解しくＩＩＨ１２）、３時間反応させた。０．５
−の酢酸で反応を止め、次いで、減圧−Ｆで濃縮し、乾
燥した。残留物を、少量の水酸化アンモニウムを含有す
るメタノール中に溶かし、２．５ｔのシリカゲルを添加
し、次いで、溶媒を除去した。１０冨ｓ　ｓ　ｔ　　（
Ｖ／Ｖ／Ｖ）のクロロホルム：メタノール：濃水酸化ア
ンモニウム中で製造したシリカゲル２５１０カラムの頂
部に、との含浸吸着体を施ヒし良。カラムを、この溶媒
で溶出し、９−ずつの両分を採集した。

画分１０〜２１をひとまとめＫＬ、かつ、蒸発せしめて
１００ｑの５−　（チロキシンアミド）ペンチル、４−
／？ルウンベリフエロン、水素リン酸エステルを、融点
１９１〜１９２℃の白色微結晶性固体として得た（１８
８℃より黒ずむ）。

分析：計算値（ｃｓ。”＊＊　”４　ＰＩＩＩｌ　Ｏｅ
・Ｈ！０として）二〇、　３１２２：Ｈ，２，７９：Ｎ
、　２．５０実験値：　Ｃ，３２，３７：Ｈ，２，７１
：Ｎ、　２．４６Ｂ、試験法 次の試薬を調製したＪ 試薬ム：０．１にアジ化ナトリウムを含む５０鵬蓋のバ
イシン緩衝液、（−８，５） 試薬Ｂ寞ａ、！ＩＮ水酸化す）ＩＪウム中の６０ｍＭ７
エンクロフエナツク に薬Ｃ：チロキシンを含まない血清にチロキシン（シグ
マ）を添加することによ って調製した０、　２．４．６．８．１０．１２゜１６
及び２０ｆｉｆ／ｄｉ濃度のチロキシ／標準液。

試薬Ｄ＝バイシン緩衝液中に、１−当り５０岸りの抗血
清及び１−当り０．１２岸 位（［ＪｎｉＬｍ　）のリン酸ジェステラーゼ（シグマ
、■型）を含有する抗体 ／酵素試薬。

試薬Ｅ　：　５　Ｋ１１Ｍギ酸エステル、０．１％アジ
化ナトリウム緩衝液（ｐＨ３，５）中１．２４ＡＩＭ　
Ｏ標識複合体（上記五において製造したもの）。

試験方法としては、７５μｔの試薬Ｂ及び０．５−の試
薬ムをキュベツトに加え、次に７５μｔの適切な試薬Ｃ
及び更に、Ｏ，Ｓ−の試薬Ａを添加し、最後に７５μｔ
の試薬り及び３回目の試薬ム０．５−を添加した。室温
で１時間温室後、７５ＩＩＩＩｔ　の試薬Ｅ及び０．５
−の試薬ムをキュベツトに添加することＫよシ、試験反
応を開始した。試薬Ｅの添加２０分後Ｋ、螢光（励起＝
３６０ｍ町発光＝４５Ｏｎ”　）　を１１定した。

Ｃ３結果 試薬Ｃの各々に対し、試験が行われ、その結果は第９表
に示した通りである。

第９表 ０　　　　　　　　　２４、　９ ２　　　　　　　　　２５．５ ４　　　　　　　　　　２６．４ ＩＩ　　　　　　　　　　　２７．２ ＩＩＩ　　　　　　　　　　２６．７ １０　　　　　　　　　２７．１ １２　　　　　　　　　３０．０ １６　　　　　　　　　３０．１ ２０　　　　　　　　　　３０．８ チロキシン淡度が増加するに従い、螢光発光が増加した
。従って、試験はチロキシンに対し有効であることが確
認された。

ｘ、血清チロキシンについてのアポ酵素再活性化免疫試
験系におけるフェンクロフェナック又はジクロフェナッ
クの使用 ギルフォード・クリニカル・ケミストリー・アナライザ
ー・システム（Ｇｉｌｆｏｒｄ　ｅｌｉｎｆｏａｌ　Ｃ
ｈ＊　−ｍｌｓｔｒｙ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　ｇｙｓＬ＠
ｍ）　２０３−８　　（ギルフォード・インストルメン
ト・ラボラトリーズ、オウバーリン、オハイオ、アメリ
カ合衆国（Ｇｉｌｆ＠ｒｄＩｍｓｔｒｓｉｍ＠ｎＬ　　
ＬａｂＩｒａｔ＠ｒｉｅｓ、　　Ｏｂ＠ｒｌｉｍ、　　
ＯＨ，Ｕ８ム）　〕を用いる半自動化試験方法を用いて
、血清チロキシンに対する標準曲線を得た。９６ｍＭリ
ン酸ナトリウム（ｌｌＨ７，０）　、２．１　ｍＷジク
ロルヒドロキシベンゼンスルホン酸塩（ＤＨＳム）、２
１μｙ／ｌ　ヘルオキシダーゼ、１０５１ｍＭグルコー
ス及ヒ２　ｔｍＭフェンクロフェナックナトリウム塩、
又はジクロ７：Ｌナックナトリウム塩からなる緩衝液を
３７℃に予備加熱した後、その０．８−を、ヒト血清を
含マない’ｒ４．　　Ｔｓ　〔ニーエムエフ・バイオロ
ジカル・アンド・ダイアグノスティック・プロダク名シ
ークウィン、テキサス、アメリカ合衆国（ＡＭＦＢｌｅ
ｌｓｇｌｓａｌ　　＊＊ａ　　Ｄ１ｍｇｍ＊ｓｔｌ＠　
ＰｒｅｄｕｏＬｍ、　　８ｓｑｕｉｎ。

’Ｉ’Ｘ、Ｕ８ム）〕　の２００ｆｉＬ／ｌｕｔチロキ
シン標準液、ｘｏｏｓｔ７ｖａｇＫ＜グルコースオキシ
ダーゼ）抗血清、ＩＩμ々−抗チロキシン抗血清、０．
０３Ｍリン酸ナトリウム（４７，０）の０．０５−　を
含有する反応容器に添加した。ＦＡＤ−チロキシン複合
体〔０１Ｍ　ＩＪ　ｙ酸ナトリウＡ（ｐＨ７，０）中に
４０１１Ｍ。

０．０１％　　テｒ１４＠ｍ　Ｘ−１００（）ライドン
ｘ−ｔｏｏ。

商品名））０．０５−量を反応容器に添加し、かつ、３
０秒間平衡化させた。１．０μＭアポグルコースオキシ
ダーゼ、２ＷＩＭ４−７ミノアンチビリン、１２％グリ
セロール、８０ｆｆ１Ｍリン酸ナトリウム（ａ７．０）
の０．１０−を添加することによシ、反応を開始し九。

８分間の湿量後、５２０１１１１における吸収率を記鍮
した。

第１θ表 ０　　　０．７９７　　　　　０．６１９２Ｂ　　　　
０．８２３　　　　　０．６２０？５　　　０．８９３
　　　　０．６４７１！！　　　　０．９６５　　　　
　０．６７８２０Ｇ　　　　１．０７８　　　　　０．
７１９１−ドチロニンの解離剤として、フェンクロフェ
ナック又はジクロフェナックを使用し、吸収率読み取シ
と血清中のチロキシン濃度との相関関係を均一系アポ酵
素再活性化免疫試験系を用いて実測することができる。

１、血清蛋白質からのヨードチロニンの解離に対する−
の影響 実施例Ｉの第２実験において述べたカラム操作を用いて
、０．１ＭＩＪン酸す）　ＩＪウム液の−を変化させ、
かつ、解離剤の濃度を２．０　ｍＭと一定に保つ丸。カ
ラムを、解離剤を含有する、一定一の緩衝液と平衡化さ
せ、一定一（前述と同じ）の緩衝液で稀釈し九血清１６
５　ｆｉｔをカラムに施した。総カラントラ測定し、次
いで、一定一の緩衝液でカラムを洗浄した。カラムに残
るカウントは、解離ヨードチロニンの比率を示す。

第１１表 ６．０　　　　　１４　　　　　６６ ＠、ｓ８４　　　　　１６ ７・０　　　　　８６　　　　　　ｆｉ１５７．５　　
　　　８５　　　　　８５ ８．０　　　　　８３　　　　　８５ ７ｘンクロ７エナツク又はジクロフェナッ／による、血
清蛋白質からのヨードチロニンの解離は、免疫試験の電
量が行われるー（６，０〜８．０の範囲に１って）Ｋは
依存しない。

夏、ジクロ７エナツクの製造 日本特許公開公報第８０−７９，３５２号（Ｃｈｅｗ。

ムｈａ、、９４１１１！１９１１３２Ｕ頁）に従い、２
−ヨード安息香酸を塩化チオニル及びジメチルアミンで
処１１Ｌ、Ｎ、Ｎ−ジメチル−２−ヨードフェニルアセ
トアミドを得る。日本特許公開公報第８０−８７゜７４
８号（ｃｈ・臘、ムｂｓ、、ｓ４巻：　３０３７８１％
頁）Ｋ従い、炭酸カリウムの存在下で、２，６−ジクロ
ルアニリンと加熱して、Ｎ、Ｎ−ジメチル−〇−Ｃ２ｔ
・−ジクロルフェニルアミノコフェニルアセドア電ドを
得る。１５％水酸化カリウムにより加水分解すると（英
国特許出願第２，０２７，０２８号）ジクロフェナック
（０−（２，６−シクロルフエニルアｉ〕）フェニル酢
酸〕を得る。

第１頁の続き 優先権主張　＠１９８２年９月３日［相］米国（ＵＳ）
ス アメリカ合衆国インヂアナ４６５１ ４エルクハート・ロング・ドラ イブ２３２７４ 手続補正書 昭和５７年１２月　８９ 特許庁畏官　若　杉　和　夫　　　殿 １、事件の表示 昭和ｓ７年特許　願第　１９１９５４　号用い為免疫試
験法 ３、補正をする者 事件どの関係　特許出願人 ５、補正命令の日付　自発 ６、補正により増加する発明の数　ｔＬ７、補正の対象
　明細書の特許請求の範ｌｌＯ欄８、補正の内容別紙の
とお） ［別紙〕 特許請求の範囲 （補正後） １、　生物学的液体中のヨードチロニンの測定用免疫試
験法において、該生物学的液体中のチロキシン結合蛋白
質への該ヨードチロニンの結合に対する遮断剤として、
式： 〔式中、Ｙは０又はＮＨを表わし、Ｒ１及びＲ２の一方
は塩素を、かつ、他方は水素を表わす。〕で示される化
合物又はその塩を用いることを特徴とする試験法。

２、　該化合物が、２−（２，４−ジクロルフェノキシ
）フェニル酢酸又はその塩である特許請求の範囲第１項
記載の試験法。

３、　２−（ｚ、４−ジクロルフェノキ／）フェニル酢
酸又はその塩が、試験反応混合物中に、約０．２５ｍＭ
より高い濃度で存在する特許請求の範囲第２項記載の試
験法。

４、　２−（ｚ、４−シフ白ルフエノキシ）フェニル酢
酸又はその塩が、試験反応混合物中に、約０．２５ｍＭ
ないし約２．５　ｍＭの濃度で存在する特許請求の範囲
第３項記載の試験法。

５、　　該−ｉ−トチロニンカ、チロキシン（Ｔ−４）
である特許請求の範囲第・１項記載の試験法。

６、該ヨートチロニンカ、トリョードチロニン（Ｔ−３
）である特許請求の範囲第１項記載の試験法。

７６　　該試験法が競争結合免疫試験法であシ、そこに
おいて該生物学的液体の試料が、該ヨードヂロニンに対
する抗体、該ヨードチロニンの被標識体、及び該試料中
のチロキシン結合蛋白質（Ｔ　Ｂ　Ｐ）への該ヨードチ
ロニンの結合に対する遮断剤と混合されており、かつ、
結合しないまま残る標識ヨードチロニンに対する該抗体
と結合する標識ヨードチロニンの比率が該試料中の該ヨ
ードチロニン濃度と関連Ｉ７ている特許請求の範囲第１
項〜第６項のいずれかに記載の試験法。

８　該標識ヨードチロニンの標識が、放射性ヨウ素であ
る特許請求の範囲第７偵記載の試験法。

９、該標識ヨードチロニノが、酵素−触媒反応における
酵素又は関与物と化学的に結合した該ヨードチロニンの
複合体からなる特許請求の範囲第７項記載の試験法。

１０、該標識が、酵素基質、酵素阻止剤、又は酵素の補
欠分子族である特許請求の範囲第９項記載の試験法。

１１、該試料、並びに該ヨードチロニンに対する抗・　
体、標識ヨードチロニン複合体、及びＴＢＰｆｉ断剤か
ら新剤試薬とを混合することにより反応混合物が生成さ
れ、かつ、分光学的応答が、該反応混合物中に、約３　
Ｑ　Ｑ　ｎｍより長い波長で生じ、この応答が、該試料
中の該ヨードチロニンの濃度と関連している、非抽出血
清又はプラズマの試料中のヨードチロニンの測定用均一
系競争結合免疫試験法において、３０Ｑｎｍよシ長い波
長では、実質的に吸収を有しない式： 〔式中、Ｙが０又は定を表わし　Ｒ１及びＲ２の一方が
塩素、他方が水素を表わすコで示される化合物又はその
塩を、該ＴＢＰｆｉ断剤とし新剤いる特許請求の範囲第
７項記載の試験法。

１２、該化合物が、２−（２，４−ジクロルフェノキシ
）フェニル酢酸又はその塩である特許請求の範囲第１１
項記載の試験法。

１３、　２−　（２，４−ジクロルフェノキシ）フェニ
ル酢酸又はその塩が、試験反応混合物中に、約０．２５
蛎　よシ高い濃度で存在する特許請求の範囲第１２項記
載の試験法。　　　　　　　　　　　　　＼１４、　２
−　（２，４−ジクロルフェノキシ）フェニル酢酸又は
その塩が、試験反応混合物中に、約０．２５ｍＭ々いし
約２．５　ｍＭの濃度で存在する特許請求の範囲第１２
項記載の試験法。

１５．該分光学的応答が、螢光発光である特許請求の範
囲第１Ｉ項記載の試験法。

１６、該螢光発光の強度が、該試料中の該ヨードチロキ
シンの関数として測定される特許請求の範囲第１５項記
載の試験法。

１７、該標識ヨードチロニン複合体が螢光体からなる特
許請求の範囲第１６項記載の試験法。

１８、該分光学的応答が、光吸収である特許請求の範囲
第１１項記載の試験法。

１９、該標識複合体が、酵素反応の関与物からなり、該
酵素反応が該分光学的応答を発生する検出可能生成物を
生成するものである特許請求の範囲第１１項記載の試験
法。

２０、該標識ヨードチロニン複合体が、酵素との相互反
応で螢光性生成物を解放する螢光原性酵素基質からなり
、かかる螢光性生成物を解放する該酵素の能力が、該標
識複合体と該抗体との結合により変化する特許請求の範
囲第１９項記載の試験法。

２１、該標識ヨードチロニン複合体が、アポ酵素と結合
して活性酵素を生成する酵素補欠分子族からなり、この
活性酵素の活性度が約３００　ｎｍより長い該波長での
特性螢光又は吸収を有する生成物を生成する反応を触媒
する能力によって測定されるものであり、該標識複合体
中の該補欠分子族との該アポ酵素の結合力が、該抗体と
該標識複合体との結合により変化する特許請求の範囲第
１９項記載の試験法。

２２、該標識ヨードチロニン複合体が、約３　Ｑ　Ｑ　
ｎｍよシ長い該波長での特性螢光又は吸収を有する生成
物を生成する反応を触媒する酵素からなり、かかる反応
を触媒する該酵素の能力が、該抗体と該標識複合体との
結合により変化する特許請求の範囲第１９項記載の試験
法。

２３、該標識ヨードチロニン複合体が、酵素を阻害する
酵素阻害剤からなシ、この酵素の活性度は約３００ｎｍ
より長い該波長での特性螢光又は吸収を有する生成物を
生成する反応を触媒する能力によって測定され、該阻害
剤の該酵素を阻害する能力が、該抗体と該標識複合体と
の結合により変化する特許請求の範囲第１９項記載の試
験法。

２４、　該ヨートチロニンが、チロキシン（Ｔ−４）　
テある特許請求の範囲第１１項記載の試験法。

２５、　該ヨートチロニンカ、トリョードチロニン（Ｔ
−３）である特許請求の範囲第１１項記載の試験法。

２６、該分光学的応答が、約７ＱＱｎｒｎより短い波長
にある特許請求の範囲第１１．１５及び１７項のいずれ
かに記載の試験法。

２７、Ｖ血液試料中のヨードチロニンの免疫試験測定用
試薬において、該血液試料中のチロキシン結合蛋白質へ
の該ヨードチロキシンの結合に対する遮断剤として、式
： 〔式中、ＹはＯ又はＮｕを表わし、Ｒ１及びＲ２の一方
は塩素を、かつ、他方は水素を表わす。〕で示される化
合物、又はその塩からなることを特徴とする試薬。

２８、該化合物が、２−（・′２，４−ジクロルフェノ
キシ）フェニル酢酸又はその塩である特許請求の範囲第
２７項記載の試薬。

２９、該ヨードチロニンが、チロキシンである特許請求
の範囲第２７項記載の試薬。

３０、該ヨートチロニンカ、トリョードチロニノである
特許請求の範囲第２７項記載の試薬。

３１、更に該ヨードチロニンに対する抗体及び該ヨード
チロニンの被標識体からなる特許請求の範囲第２７項記
載の試薬。

３２、固体担体部材に包含せしめた、均一系免疫試験用
の試験具の形をした特許請求の範囲第２７項畠絹し第３
．１項のいずれかに記載の試薬。

３３、試薬が、 （ａ）　　該ヨードチロニンに対する抗体、０１１）該
抗体と結合すると変化する検出されうる特性を有する標
識ヨードチロニン複合体、及び （Ｃ）　　該遮断剤化合物又はその塩 からなる特許請求の範囲第３２項記載の試薬。

３４．該標ａ複合体が、酵素−触媒反応における酵素又
は関与物と化学的に結合した該ヨードチロニンからなる
特許請求の範囲第３３項記載の試薬。

３５、　（ａ）　　ヨードチロニンに対する抗体、（ｂ
）　　該抗体と結合すると変化する検出されうる特性を
有する標識ヨードチロニン複合体、及び （ｃ）　　ＴＢＰ　遮断剤として、式：％式％ 〔式中、ＹはＯ又は■を表わし、Ｒ１及びＲ２の一方は
塩素を、かつ、他方は水素を表わす。〕で示される化合
物又はその塩からなることを特徴とする血清又はプラズ
マ試料中のヨードチロニンの均−悼競争結合免疫試験測
定用の試験キット。

３６、該化合物が、２−（２，４−ジクロルフェノキシ
）フェニル酢酸又はその塩である特許請求の範囲第３５
項記載の試験キット。

３７、該検出しうる特性が、約３００　ｎｍより長い波
長での分光学的応答を発生する能力である特許請求の範
囲第３５項記載の試験キット。

３８、該分光学的応答が、螢光発光である特許請求の範
囲第３７項記載の試験キット。

３９、該標識ヨードチロニン複合体が螢光体か−らなる
特許請求の範囲第３８項記載の試験キット。

４０、該分光学的応答が、光吸収である特許請求の範囲
第３７項記載の試験キット。

４１、該標識複合体が、酵素反応の関与物からなり、こ
の酵素反応は該分光学的応答を発生する検出可能生成物
を生成するものである特許請求の範囲第３７項記載の試
験キット。

４２、該標識ヨードチロニン複合体が、酵素との相互反
応で螢光性生成物を解放する螢光性酵素基質からなり、
かかる螢光性生成物を解放する該酵素の能力が、該標識
複合体と該抗体との結合により変化する特許請求の範囲
第４１項記載の試験キット。

４３、該標識ヨードチロニン複合体が、アポ酵素と結合
して活性酵素を生成する酵素補欠分子族からなり、この
活性酵素の活性度が約３ＱＱｎｍより長い該波長での特
性螢光又は吸収を有する生成物を生成する反応を触媒す
る能力によって測定されるものであり、該標識複合体中
の該補欠分子族との該アポ酵素の結合力が、該抗体と該
標識複合体との結合により変化する特許請求の範囲第４
１項記載の試験キット。

４４、該標識ヨードチロニン複合体が、約３００ｎｍよ
り長い該波長での特性螢光又は吸収を有する生成物を生
成する反応を触媒する酵素からなり、かかる反応を触媒
する該酵素の能力が該抗体と該標識複合体との結合によ
り変化する特許請求の範囲第４１項記載の試験キット。

４５、該標識ヨードチロニン複合体が、酵素を阻害する
酵素阻害剤からなり、この酵素の活性度は約３０　Ｑ　
ｕｍより長い該波長での特性螢光又は吸収を有する生成
物を生成する反応を触媒する能力によって測定され、該
阻害剤の該酵素を阻害する能力が、該抗体と該標識複合
体との結合により変化する特許請求の範囲第４１項記載
の試験キット。

４６該ヨードチロニンが、チロキシン（Ｔ−４）である
特許請求の範囲第３５項記載の試験キット。

４７　　該ヨー）”ｆ口二ンカ、トリョードチロニン（
Ｔ−３）である特許請求の範囲第３５項記載の試験キッ
ト。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生物学的液体中のヨードチロニ／の測定用免疫試験
   法において、諒生物学的液体中のチロキシン結合蛋白質
   への該ヨードチロニンの結合に対する線断剤として、式
   ： 〔式中、Ｙは０又は皿を表わし　Ｒ１及びＲ３の一方は
   塩素を、かつ、他方は水素を表わす。〕で示される化合
   物又はその塩を用いることを特徴とする試験法。 ｔｌＩＩＥ化合物が、２−（２，４−ジクロルフェノキ
   シ）−フェニル酢酸又はその塩である特許請求の範囲第
   １項記載の試験法。 ３、　２−Ｃ２，４−’）ｌロルフエノキシ）フェニル
   酢酸又はその塩が、試験反応混合物中Ｋ、約０．２５嘘
   より高い濃度で存在する特許請求の範囲第２項記載の試
   験法。 ４、　２−（２，４−ジクロルフェノキシ）フェニル酢
   酸又はその塩が、試験反応混合物中に１約０．２５蛎な
   いし約２．５　ｍＭの濃度で存在する特許請求の範囲第
   ３項記載の試験法。 ！ＬＡＷ−ドｆロニンカ、チロキシン（Ｔ　−４）であ
   ゐ特許請求の範囲第１項記載の試験法。 ６、該ヨートチロニンカ、トリョートチロニン（Ｔ−３
   ）である特許請求の範囲第１項記載の試験法。 ７、　該試験法が競争結合免疫試験法であり、そこにお
   いて該生物学的液体の試料が、該ヨードチロニンに対す
   る抗体、骸ヨードチロニンの被標識体、及び骸試料中の
   チロキシン結合蛋白質（ＴＢＰ）への該ヨードチロニン
   の結合に対する遮断剤と混合されており、かつ、結合し
   ないまま残る標識ｉｉ　−ドチロニンに対する該抗体と
   結合する標識ヨードチロニンの比率が骸試料中の該ヨー
   ドチロニン濃度と関連していゐ特許請求の範囲第１項〜
   第６項のいずれかに記載の試験法。 ｓ　　ｇ＊ｓ識四−ドチロニンの標識が、放射性ヨウ素
   である特許請求の範囲第７項記載の試験法。 Ｓ、該標識ヨードチロニンが、酵素−触媒反応における
   酵素又は関与物と化学的に結合した該ヨードチロニンの
   複合体からなる特許請求の範囲第７項記載の試験法。 １０、＃標識が、酵素基質、酵素阻止剤、又は酵素の補
   欠分子族である特許請求の範囲第９項記載の試験法。 １１、鋏試料、並びに皺ヨードチロニンに対する抗体、
   標識田−ドチロニン複合体、及びＴＩＰ遮断剤からなる
   試薬とを混合することによシ反応混合物が生成され、か
   つ、分光学的応答が、該反応混合物中に１約ｓ　ｏ　ｏ
   　ｍｍよシ長い波長で生じ、この応答が、該試料中の該
   ヨードチロニンの濃度と関連している、非抽出血清又は
   プラズマの試料中の曹−ドチロニンの測定用均一系競争
   結合免疫試験法において、３００　ａｍよシ長い波長で
   は、実質的Ｋｌ収を有しない式： 〔式中、Ｙが０又は洲を表わし　Ｒ１及びＲ８の一方が
   塩素、他方が水素を表わす〕で示される化合物又はその
   塩を、該ＴＢＰ迩断剤として用いる特許請求の範囲第７
   項記載の試験法。 １２、、該化合物が、２−（２，４−ジクロルフェノキ
   シ）フェニル酢酸又はその塩である特許請求の範囲第１
   １項記載の試験法。 １３、　２−　（２，４−ジクロルフェノキシ）フェニ
   ル酢酸又はその塩が、試験反応混合物中に、約０．２５
   蛎　よシ高い濃度で存在する特許請求の範囲第１２項記
   載の試験法。 １４、　２−　（２，４−ジクロルフェノキシ）フェニ
   ル酢酸又はその塩が、試験反応混合物中に、約０．２５
   ｍＭないし約２．５　ｍＭの濃度で存在する特許請求０
   １１８第１２項記載の試験法。 ！Ｌ鋏仕分光学的応答、螢光発光である特許請求の範囲
   第１１項記載の試験法。 １を該螢光発光の強度が、諌試料中の皺ヨードチロニン
   貴の関数として測定される特許請求の範囲第１１５項記
   載の試験法。 １７、皺標識冒−ドチロニン複合体が螢光体からなる特
   許請求の範囲第１６項記載の試験法。 １８、該分光学的応答が、光吸収である特許請求の範囲
   第１１項記載の試験法。 １９゜該標識複合体が、酵素反応の関与物からな抄、該
   酵素反応が該分光学的応答を発生する検出可能生成物を
   生成するものである特許請求の範囲第１１項記載の試験
   法。 ２Ｇ、該標識冒−ドチロニン豪合体が、酵素との相互反
   応で螢光性生成物を解放する螢光原性酵素基質からな夛
   、かかる螢光性生成物を解放する鋏酵素の能力が、皺標
   繊複合体と該抗体との結合により変化する特許請求の範
   囲第１９項記載の試験法。 ２１、該橡識璽−ドチロニン複合体が、アポ酵素と結合
   して活性酵素を生成する酵素補欠分子族からな夛、この
   活性酵素の活性度が約３　Ｑ　Ｑ　ａｍよシ長い該波長
   での特性螢光又は吸収を有する生成物を生成する反応を
   触媒する能力によって測定されるものであシ、＃欅謙複
   合体中の該補欠分子族との該アポ酵素の結合力が、該抗
   体と該標識複合体との結合によシ変化する特許請求の範
   囲第１９項記載の試験法。 ２２、該標識ヨードチロニン複合体が、約３００　ａｍ
   より長い骸波長での特性螢光又は吸収を有する生成物を
   生成する反応を触媒する酵素からなり、かかる反一応を
   触媒する該酵素の能力が、該抗体と該標識複合体との結
   合により変化する特許請求の範囲第１９項記載の試験法
   。 ２３、該標識ヨードチロニン複合体が、酵素を阻害する
   酵素阻害剤からなシ、この酵素の活性度は約３ＱＱｎａ
   ＋よシ長い該波長での特性螢光又は吸収を有する生成物
   を生成する反応を触媒する能力によって測定され、該阻
   害剤の該酵素を阻害する能力が、該抗体と該標識複合体
   との結合により変化する特許請求の範囲第１９項記載の
   試験法。 ２４．該真−１”ｆロニンカ、チロキシン（Ｔ−４）で
   ある４１ＦＦ請求の１！囲菖１１項記載の試験法。 ２Ｌ＃Ｍ−）’？Ｏニン＃、）！Ｊヨードチロニン（Ｔ
   　−３）である特許請求の範囲第１１項記載の試験法。 ２Ｌ皺分光学的応答が、約７００　ａｍよシ短い波長に
   ある特許請求の範囲第１１．１５及び１７項のいずれか
   に記載の試験法。 ２７、血液試料中のヨードチロニンの免疫試験測定用試
   薬にお込て、該血液試料中のチロキシン結合蛋白質への
   鋏ヨードチロキシンの結合に対する逓断剤として、式： 〔式中、ｙＦｉｏ又は皿を表わし　Ｒ１及びＶの一方は
   塩素を、かつ、他方は水素を表わす。〕で示される化合
   物、又はその塩からなることを特徴とする試薬。 ２８、核化合物が、２〜　（２，４−ジクロルフェノキ
   シ）フェニル酢酸又はその塩であ、る特許請求の範囲第
   ２７項記載の試薬。 ２９、該ヨードチロニンが、チロキシンである特許請求
   の範囲第２７項記載の試薬。 ３０、　骸ヨートチロニンが、トリョードチロニンであ
   る特１！ｆ＃ｌＩ求の範囲第２７項記載の試薬。 ３１、更に該ヨードチロニンに対する抗体及び該ヨード
   チロニンの被標識体からなる特許請求の範囲第２７項記
   載の試薬。 ３２固体担体部材に包含せしめた、均一系免疫試験用の
   試験具の形をした％杵請求の範囲第２７項記載の試薬。 ３３、試薬が、 （−）　　該ヨードチロニンに対する抗体、０）＃抗体
   と結合すると変化する検出されうる特性を有する。ｍｍ
   ヨードチロニン複合体、及び （６）　　ｌ＊遮断剤化合物又はその塩からなる特許請
   求の範囲第３２項記載の試薬。 ３４、＃標識複合体が、酵素−触媒反応における酵素又
   は関与物と化学的に結合した該ヨードチロニンからなる
   特許請求の範囲第３３項記載の試薬。 ＨＬ　（ａ）　　ｗｌ−ドチロニンに対する抗体、（ｂ
   Ｏ＃抗体と結合すると変化する検出されうる特性を有す
   る標識ヨードチロニン複合体、及び （６）　　ＴＢｐ　辿断剤として、式：〔式中、Ｙ紘０
   又は皿を表わし、Ｒ１及びＲ８の一方は塩素を、かつ、
   他方は水素を表わす。〕で示される化合物又はその塩か
   らなるこ−を特徴とする血清又はプラズマ試料中のヨー
   ドチロニンの均一系競争結合免疫試験測定用の試験キッ
   ト。 ３６、該化合物が、２−（２，４−ジクロルフェノキシ
   ）フェニル酢酸又はその塩である特許請求の範囲第３ｓ
   項記載の試験キット。 ３７、該検出しうる特性が、約３００　ｎｍより長い波
   長での分光学的応答を発生する能力である特許請求の範
   囲第３５項記載の試験キット。 ３＠、咳分光学的応答が、螢光発光である特許請求の範
   囲第３７項記載の試験キット。 ３９、咳標織ヨードチロニン複合体が螢光体からなる特
   許請求の範囲第３８項記載の試験キット。 ４Ｇ、　［分光学的応答が、光吸収である特許請求の範
   囲第３７項記載の試験キット。 ４１、該標識複合体が、酵素反応の関与物からな択この
   酵素反応は該分光学的応答を発生する検出可能生成物を
   生成するものである特許請求の範囲第　　゛３７項記載
   の試験キット。 ４２、該標識ヨードチロニ／複合体が、酵素との相互反
   応で螢光性生成物を解放する螢光性酵素基質からなシ、
   かかる螢光性生成物を解放する該酵素の能力が、骸標識
   複合体と該抗体との結合により襞化する特許請求の範囲
   第４１項記載の試験キット。 ４３、骸標識ヨードチロニン複合体が、アポ酵素と結合
   して活性酵素を生成する酵素補欠分子族からなシ、この
   活性酵素の活性度が約３００　ａｍよシ長い＃波長での
   特性螢光又は吸収を有する生成物を生成する反応を触媒
   する能力によって測定されるものでＴｏシ、誼標識複合
   体中の骸補欠分子族との該アポ酵素の結合力が、該抗体
   と骸標識複合体との結合により変化する特許請求の範囲
   第４１項記載の試験キット。 ４４、該標識目−ドチロニン複合体が、約３００　ｎｍ
   よシ長い該波長での特性螢光又り吸収を有する生成物を
   生成する反応を触媒する酵素からなり、かかる反応を触
   媒する該酵素の能力が該抗体と該標識複合体との結合に
   よυ変化する特許請求の範囲第４１項記載の試験キット
   。 ４１Ｌ該標識貰−ドチロニン複合体が、酵素を阻害する
   酵素阻害剤からなシ、この酵素の活性度は約３００　ｍ
   ｗ＊より長い咳波長での特性螢光又は吸収を有する生成
   物を生成する反応を触媒する能力によって測定され、該
   阻害剤の腋酵素を阻害する能力る特許請求の範囲＠４１
   項記載の試験キット。 ４６、＃ヨードチロニンカ、チロキシン（Ｔ　−４）で
   ある特許請求の範囲第３５項記載の試験キット。 ４７　　＠ミートチロニンカ、トリョードチロニン（Ｔ
   −３）である特許請求の範囲第３５項記載の試験キット
   。