JPS6283666A - 生物学的液体中の遊離リガンドの測定方法および測定用キツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は、例えば、血液中の遊離ホルモン量など、生物
学的液体中の遊離リガンド量を正確かつ高い信頼性で測
定することのできる測定方法および測定用キットに関す
るものである。

「従来の技術および問題点」 ごの数年間、平衡透析法は血清中の遊離ホルモンの測定
に用い得る唯一の方法であり、しかち、最近に至るまで
信頼性のある唯一の方法でもあった。この平衡透析法は
、前記測定において、正確度の低さ、煩雑さ等のいくつ
かの欠点を免れなかった。しかも、特に、この方法の結
果は、用いたトレーサーの純度に大きく依存するもので
ある。

ＥｌｌｉｓとＥｋｉｎｓ、Ｒ，は、彼等の論文［Ｄｉｒ
ｅｃｔ　Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｂｙ　Ｒａｄｉｏｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｆｒｅｅ　Ｔｈ
ｙｒ。

ｉｄ　Ｉ（ｏｒｍｏｎｅ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
　ｉｎ　Ｓｅｒｕｍ、（Ａｃｔａ　Ｅｎｄ。

ｃｒ、　（ＫｂＨ，）　５ｕｐｐ１．１７７：１０６，
１９７３）］において、遊離ホルモン決定の直接法を明
らかにした。この論文は、平衡透析法に大きな進歩をも
たらせた。

すなわち−１この論文により、血清透析物中の遊離リガ
ンドレベルをラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で直接に
測定できるようになり、その結果、トレーサーの純度上
の問題点を解決することが可能となった。この方法は、
今や多くの人により遊離ホルモン測定の頼りとなる方法
と考えられている。

しかしながら、この方法においても、まだ測定に長時間
を要し、操作者依存的であり、この方法はほとんどの小
規模実験室では実用に適さないものである。

ここで、遊離ホルモン濃度の決定に用いられる間接的な
方法を簡単に紹介すると、次のようである。すなわち、
テストステロン／ステロイドホルモン結合性グロブリン
（Ｓ）（Ｂに）比法、サイロキシン（Ｔ　４）／サイロ
イド結合性グロブリン（ＴＢＧ）比法、遊離Ｔ４インデ
ックス［トリヨードサイロニン（Ｔ３）アップティクと
Ｔ４に基づく］法および遊離アンドロジエンインデック
ス法である。

Ｅｋｉｎｓ、Ｒ，は、（Ｆｒｅｅ　Ｔｈｙｒｏｉｄ　Ｈ
ｏｒｍｏｎｅｓ；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈ
ｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
　ｈｅｌｄ　１ｎＶｅｎｉｃｅ、Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　１
９７９７２〜９２）におイテ、“ダイレクトダイナミッ
ク法”の概念を紹介している。

この方法では、抗遊離リガンド抗体か透析中の生物学的
液体と直接接触するように用いられている。

これは、いわゆる“イムノエキストラクション”法とよ
ばれるものの基礎を構成するものである。

このような方法の第１のものが、Ｕ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ
第４０４８８７０号で述べられている。この方法は、２
チユーブイムノアツセイ法によりＴ４の結合タンパクか
らＴ４特異抗体へのＴ４の転位率を測定する方法である
。この方法は、分析上および臨床上のいくつかの欠点を
免れず、これら欠点により他の遊離Ｔ４インデックス測
定法と実質的に差がない。

また、クリニカルアッセイ社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍ
Ａ　０２１３９）により提供された第２の方法は、本当
のイムノエキストラクション法である。この方法は、１
本のデユープを用いた２段階の連続的（逆滴定）技術で
ある。この゛方法では、血清試料は、固定化抗体とイン
キュベート（保温、保持）される。そして、続いて洗浄
ステップの後、固定化抗体中の非占有部位を標識したリ
ガンドを用いて“逆滴定“する。この方法では、血清は
け諏されたりガントと接触しない。しかし、この方法は
理論と違って低感度および正確さの低さを免れず、しか
も両反応とも正確なタイミングを必要とする。

生物学的試料中の遊離リガンド濃度の決定のために１段
階イムノエキストラクション法が遊離リガンド測定法の
発展の次のステップとして開発された。これらの方法で
は、標識リガンドの内因性結合体からの分離には物理的
分離法ではなく化学的分離法を用いる。この目的を成し
遂げるためにいくつかのアブローヂが採用された。その
詳細を以下に示す。

始めの技術は、与えられたリガンドの構造を化学的に変
化さ仕ることにより、このリガンドの内因性結合体との
結合を減少あるいは消滅さける方法である。この方法に
ついては、ステロイドホルモンに関して後に詳細に説明
する（後述の遊離テストステロンの説明部分を参照）。

また、甲状腺ホルモンの場合、Ｒｏｓｓ、Ｊ、Ｅ、とＴ
ａｐｌｅｙ、Ｄ、Ｆ、は、（Ｅ１’ｆｅｃｔ　　　ｏｆ
’　　　ｖａｒｉｏｕｓ　　　ａｎａｌｏｇｕｅｓ　　
　ｏｎ　　　ｔｈｅ　　　ｂｉｎｄｉｎｇ　　ｇｌｏｂ
ｕｌｉｎ　　ａｎｄ　　ｐｒｃａｌｂｕｍｉｎ、Ｅｎｄ
ｏｃｒｉｎｏＪｏｇｙ７９：４９３．１９６６）におい
ては、ＴＢＣ（サイロイド結合性グロブリン）のＴ４へ
の結合が、Ｔ’　４　分子上の３゛部位にかなり大きな
置換を行なえば、阻害されることを示した。これに加え
、５ｃｈａｌｌ、Ｒ，Ｆ、等は、（Ａｎ　ｅｎｚｙｍｅ
ｌａｂｅｌｅｄ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｔ
ｈｅ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　　ｏｒ　ｕｎｓａｔｕ
ｒａｔｅｄ　　ｔｈｙｒｏｉｄ　　ｈｏｒｍｏｎｅ　　
ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃａｐａｃｉｔｙ　ｉｎ　ｓｅｒｕｍ
　ａｎｄ　ｐｌａｓｍａ、Ｃ１１ｎ、Ｃｈｅｍ。

２５：１０７ｇ（ａｂｓｔｒａｃｔ）１９７９）におい
て、そして、Ｋｌｅｉｎｈａｍｍｅｒ、Ｇ、等は、（Ｅ
ｎｚｙｍｅ　　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　　ｆｏｒｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　　ｏｒｔｈｙｒｏｘｉｎｅ　
ｂｉｎｄｉｎｇ　１ｎｄｅｘＣ１ｉｎ、Ｃｈｅｍ、２４
：１０３３．１９７８）において、各々独立にＴＢＧは
ワサビダイコン（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）のペルオキ
シダーゼによって標識されたＴ４とは結合体形成ができ
ないことを示した。この事実はＣｏｒｎｉｎｇＧｌａｓ
ｓ　Ｗｏｒｋｓ社のＵ’、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、４
４１０６３３に示された１段階イムノエキストラクショ
ン法の基礎をなすものである。すなわち、これは、遊離
サイロキシン（Ｔ４）と、遊離３，５．３’−トリヨー
ドサイロニン（Ｔ３）の測定中にワサビダイコンのペル
オキシダーゼがＴ４、Ｔ３およびＴ３の放射標識体に化
学的に結合するためである。

これに加え、上記初期の技術は、下記報告においてＴ３
とＴ４が内因性結合タンパクと最もよく結合するには、
以下の！、２．３．に示す分子構造を必要とすることも
明らかにした。ここで内因性結合タンパクとは、ＴＢＧ
、サイロイド結合性プレアルブミン（ＴＢＰＡ）、アル
ブミンである。５ｎｙｃｌｅｒ、Ｓ、Ｍ、等（Ｂｉｎｄ
ｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅｓ　ａ
ｎｄｔｈｅｉｒ　ａｎａｌｏｇｕｅｓ　ｔｏ　ｔｈｙｒ
ｏｘｉｎｅ−ｇｌｏｂｕｌｌｉｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　
ｓｅｒｕｍ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、２５１：６９８
９，１９７６）：　Ｓｔｅｒｉｎｇ、に、等（Ｅｑｕｉ
ｌｉｂｒｉｕｍ　ｄｉａｌｙｓｉｓ　５ｔｕｄｉｅｓ　
ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｆ’　ｔｈｙｒｏｘ
ｉｎｅ　ｂｙ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉ
ｎ、Ｊ。

Ｃ１１ｎ、ＩｎｖｅｓＬ４１：１０２１，１９６２）１
、Ｌ−アラニン側鎖構造 ２４゛−ヒドロキシル基の存在（主にＴＢＰＡとアルブ
ミンの結合） ３　内側と外側のリング（３，５，３’および５゛部位
）における２個所のハロゲン置換の存在 数百のＴ３およびＴ４アナログ（類似化合物）が合成さ
れ、甲状腺ホルモン結合性クンバクとの結合活性が調べ
られた。

Ｕ、Ｓ、ＰａＬｅｎｔ　Ｎｏ、４３６６１４３と、この
パテントのヨーロッパでの対応パテントＮＯ，００２６
１０３では、幅広く、これらのアナログを、遊離ホルモ
ンを測定するための抗体の連続的滴定にではなく、同時
に用いる単純なイムノエキストラクンボンにおけるトレ
ーサーとして使用する用法が記されている（以下、これ
らのパテントをアマ−ジャム・パテントと記す）。

活性なアラニン側鎖は、Ｔ４とＴ３のＴＢＧへの最適結
合に必要とされる。すなわち、アラニン側鎖のアミノ基
か必要不可欠である。−Ｆ記アマ−ジャム・パテントに
占かれているアナログは、アラニン側鎖を修飾したＴ３
およびＴ４である。理論上は、これらのアナログのＴＢ
Ｇへの結合は無視できるが、Ｔ３とＴ４分子上の４°−
ヒドロキシル基が活性で残されている限り、アルブミン
とＴＢＰＡとに有色に結合する。アルブミンとＴＢＰＡ
のサイロニンへの結合が特に生理的条件下では定置面で
あることは、下記において既に確立されている。

ＳＬｅｒｉｎｇ、に、　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　５ｔｒ
ｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｙｒｏｘｉｎｅ　ｉｎ　ｒｅ
ｌａｔｉｎ　ｔｏ　ｉｔｓ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｂｙ　ｈ
ｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、
ＩｎｖｅｓＬ４３：１７２１，１９６４）、およびＰａ
ｇｅｓ等（Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｆｔｈｙｒｏｘｉｎｅ　
ａｎｄ　ｔｈｙｒｏｘｉｎｅ　ａｎａｌｏｇｓ　ｔｏ　
ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｌｎｐｒｅａｌｂｕｍｉｎ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、１２＋２７７３、１９７３）。

前記アマ−ジャムのパテントがアルブミンとＴＢＰＡと
のサイロニンへの結合の重要さを認識しなかったことが
、このパテントの技術を生物学的液体中の遊離Ｔ３、遊
離Ｔ４の真の測定には不適当なしのにしている。事実、
このパテントに則った市販試薬では、遊離ホルモンの測
定結果の読み間違いと不正確さが見られる。これは特に
、血液中のアルブミン１ノベルにおける顕著な変化によ
り特徴づけられるいくつかの病理状態で著しい。

最近の文献により、アルブミン濃度が前記アマ−ジャム
の測定法により得られた遊離Ｔ４ｉ１１度と直接に関連
していることが示されている。さろに、前記アマ−ジャ
ムの方法は、妊娠第３期やひとい非甲状腺疾患にかかっ
ている患者では誤った低値の遊離Ｔ　４の結果を与えろ
ことがよく報告され、一方、遺伝性異アルブミン過すイ
ロキンン血症の場合、Ｔ４が異常に血流中のアルブミン
に結合するため１．誤った高目の遊離Ｔ４レベルが得ら
れることがよく報告されている。

妊娠中、特に第３期においては、血流中のアルブミンは
正常時より低い。アマーノヤムの標識Ｔ４アナログトレ
ーサーは、アルブミンとＴＢＰＡに非常に多くの量（９
９％以上）結合するため、アマーンヤムの測定法では、
第３期期間中において、正常の遊離Ｔ４値よりも低い値
が得られろ。つまり、Ｔ４抗体と結合し得るより多くの
アナログトレーサーが存在し、その結果、高い結合を産
み、見掛けの値が低くなる。

非エステル化遊離脂肪酸は、アルブミンに結合している
標識アナログと置換し得る。そして、さらに、これらは
、妊娠中において正常値より高い濃度で循環している。

これは、前記アマ−ジャム法で測定した妊娠中の遊離Ｔ
４値が所期の値より低くなることを説明している。そし
て、見掛は上の遊離Ｔ４レヘルは、アルブミンの標識ア
ナログへの結合が存在する場合には期待されるよりもず
っと低い値であることになる。

この状況はヘパリン療法の場合にもよ（示されており、
この場合は非エステル化遊離脂肪酸が有意に上昇してい
る。アマ−ジャム法によりヘパリン処理した憶者で測定
した場合、遊離Ｔ４とＴ３のレベルは正常レベルより低
（示される。

同じ問題は、非甲状腺性の疾患でも起こり、この場合、
アマ−ジャム法で得られた遊離Ｔ３とＴ４の値は、直接
平衡透析法と比べた場合、正常甲状腺群における値より
有意に低くなる。

このアマ−ジャムのパテントの手法は、遊離リガンドレ
ベルの測定において、誤りと不正確な方法であると明ら
かにされることにより研究者達によって不充分な技術で
あるとされている。

「問題点を解決するための手段」 本願発明者は、」二足問題点を解決するために鋭意研究
を重ねたところ、リガンドアナログトレーザーと、ある
種の内因性タンパク、例えば生物学的液体中のアルブミ
ン、との結合から生じる問題を解明した。そして、この
問題は、特定の化学的結合阻害試薬の使用により克服さ
れることを知見した。

本発明は上記知見に基づいてなされたもので、技術上に
大きな進歩をもたらすものであり、本発明により始めて
より真実に近い遊離リガンドの濃度が測定可能となる。

まず、本願の第１の発明は、生物学的液体中に内因性結
合タンパクとそれに結合したりガントが存在する場合に
、遊離リガンドと結合リガンドの平衡をくずすことなく
、遊離リガンドのみを測定する方法であって、以下の（
ａ）（ｂ）（ｃ）の手順を含むことを特徴とする生物学
的液体中の遊離リガンドの測定方法である。すなイつち
、 （ａ）試料となる生物学的液体を、次の（ｉ　）（ｉｉ
　Ｘ１ｉｉ　）の物質とともに保持する。（１）その化
学的構造のために特定の前記内因性タンパクと結合され
ないリガンドのアナログトレーサー、（１１）特異的リ
ガンド結合体（リガンドに対して特異的に結合する化合
物）、（ｉｉｉ）前記リガンドのアナログトレーサーが
前記特定の内因性結合タンパク以外の内因性結合タンパ
クと結合するのを阻害する少なくとも一種の特異的な化
学物質。

（ｂ）　　ｍ記特異的な結合体と結合した前記リガンド
のアナログトレーサーと、（同特異的リガンド結合体と
）結合しなかったアナログトレーサーとを分離する。

（ｃ）　　前記生物学的液体中の前記特異的な結合体と
結合した前記リガンドのアナログトレーサーを既知の遊
離リガンド標準液中の結合アナログトレーサーと比較し
て前記生物学的液体中の遊離リガンドの濃度を決定する
。

また、本願の第２の発明は、その中に内因性結合タンパ
クとこの内因性結合タンパクに結合したリガンドが存在
する生物学的液体に添加、保持されしことにより前記生
物学的液体中の遊離リガンドと結合リガンドの平衡をく
ずすことなく、遊離リガンドのみを測定可能とする測定
用キットであって、に）その化学的構造のために特定の
前記内因性タンパクと結合しないリガントのアナログト
レーサーと、（ｉｉ）特異的リガンド結合体（リガンド
に対して特異的に結合する化合物）と、（ｉｉｉ）前記
リガンドのアナログトレーサーが前記特定の内因性結合
タンパク以外の内因性結合タンパクと結合するのを阻害
する少なくとも一種の特異的な化学物質と、から構成さ
れることを特徴とするものである。

以下、この発明をさらに詳しく説明する。

この発明は、アマ−ジャムのパテントの欠点に注目し、
そのアナログ法で生じる遊離甲状腺ホルモン測定におけ
る矛盾を効果的に解決しようとしたものである。

この発明では、アラニン側鎖が修飾されているＴ３およ
びＴ４の標識されたアナログを用いる。特に、ＴＢＧと
結合しないようにα−アミノ基が修飾されている。さら
に、これらの標識アナログがアルブミンおよびＴＢＰＡ
と結合するのを妨げるようなステップが加えられ−でい
る。このことは、注は深く選ばれた一つまたは複数の外
因性化学物質により達仕られる。これらの物質は単独ま
たは組み合わせでアルブミンおよびＴＢＰＡの未結合部
位に結合して、これらの結合タンパクの結合部位を飽和
させ、サイロニンアナログや非エステル化遊離脂肪酸等
の他の内因性因子との結合能力を無くしてしまうことが
できる。これらの化学物質は、ＴＢＧとは結合せず、し
かも、その濃度をこれらの化学物質がアルブミンまたは
ＴＢＰＡに結合しているどのようなホルモンとも置き変
わらないように設定しなければならない。

アルブミンとＴ４の結合定数は、約５０００００である
（この数字は、アルブミン分子中のＴ４の結合部位が１
ケ所であること、見掛は上の結合定数、すなわち、複合
体生成方向への平衡定数が５　ｘ　１０５ｆ２１モルで
あること、という仮定に基づいて計算したものである）
。同様にして求めたアルブミンとＴ３との結合定数は、
約２４６００である。アルブミンは、アニオン性の色素
より遊離Ｔ３、Ｔ４あるいはそれらのアナログに対して
強い親和性を持つこと、さらに、Ｔ３、Ｔ４またはそれ
らのアナログより遊離脂肪酸の方に強い親和性を持つこ
とがよく知られている。

アルブミンの単環芳香族化合物に対する結合定数は比較
的低く、高いものでも、１１０００（２、４−ジニトロ
フェ２ノール）、２８００（サリチル酸塩）などである
。

イムノエクストラクションにおいて、生体内（ｉｎｖｉ
ｖｏ）での平衡状聾を試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で
厳密に保持するためには、生理的状態を厳密に保つ必要
がある。このためには、Ｉ）Ｈは７．４でなければなら
ない。このｐ　＋（で、サイロニン分子は３つのイオン
基を持っている。すなわち、カルボキシル陰イオン、α
−アミノ陽イオン基、フェノール陰イオンである（この
う゛ちフェノール陰イオンは、８２％がイオン化してい
る）。このような生理的条件下にアルブミンまたはＴＢ
ＰＡが置かれた場合、比較的多数のアミノ陽イオン基を
持つ電荷の高いアルブミンができる。このアルブミン分
子中のアミノ陽イオン基が、サイロニン分子中のフェノ
ール陰イオンと結合する。このような相互作用が、前記
アマ−ジャムやコーニングの特許の方法における標識ア
ナログがアルブミンと結合してしまう主な原因である。

この発明においては、アルブミンとＴＢＰＡへの比較的
高い結合定数を有する２、４−ジニトロフェノール（Ｄ
　Ｎ　Ｐ　）とサリチル酸ナトリウムがこれらの生理的
ｐＨ条件下でイオン化され、アルブミンやＴＢＰＡ分子
中のイオンと相互作用できるフェノール陰イオンを供給
するようにしたものである。２．４−ジニトロフェノー
ルまたはサリチル酸ナトリウムまたはこの両方が過剰に
存在した場合、標識Ｔ３とＴ４のアナログのアルブミン
やＴＢＰＡへの結合は、実質的に不可能になる。２゜４
−ジニトロフェノールおよび／またはサリチル酸ナトリ
ウムの適切な濃度設定によるアルブミンやＴＢＰＡへの
標識Ｔ３とＴ４のアナログの結合を妨害する方法は、遊
離甲状腺ホルモンのイムノエクストラクツ゛ヨンアナロ
グ法において、アルブミンによって引き起こされろ誤っ
た測定結果を除く効果的な手段である。

この発明では、池の多くの化学的結合阻害剤も適用可能
である。すなわち、リガンドのアナログトレーサーと循
環している内因性の結合タンパクとの好ましくない反応
を阻害できろ試薬として適用可能である。例えば、モノ
アリル化合物に様々な置換基をつけたしのが利用できる
。このような化合物の置換基としては、ニトロ基、カル
ボキシル基、カル糸キシル塩等が含まれる。特に、フェ
ノール性水酸基を有するモノアリル化合物が有効である
。他のよい化合物群としては、スルホブロモフタレイン
、オレンジレッド、プロモクレンルブルーなどの色素を
挙げることができる。オレイン酸などの炭素数５以上の
高級脂肪酸し有効である。さらに、この他の化合物も、
この手法に利用可能である。例えば、多くのアミノ酸（
例えば、トリプトファンなど）は、アルブミンに高い親
和性を持つので、この発明の実施に有効である。他の適
切な化合物としては、内因性タンパクから標識アナログ
を置換する一方、他の特異的な結合タンパクには結合し
ないようなＴ３アナログ、Ｔ４アナログ、テストステロ
ンアナログがある。

この発明は、ヒト体液中に普通に見られる遊離リガンド
のどうようなものに対しても、その濃度測定に利用する
ことができる。このようなａ離すガンドとしては、例え
ば、サイロキシン、トリヨードサイロニン、テストステ
ロン、コルチゾー　ル、プロゲステロン、エストラジオ
ール、その他のホルモンおよびステロイド、または薬物
あるいは薬物の代謝産物、ビタミンＢ１２等のビタミン
、毒素などが挙げられる。

リガンドの特異的結合体は、遊離のりガントに結合でき
る。この特異的結合体は、ａ離すガンドの特異的抗体ま
たは他の結合物質である。また、様々の遊離リガンドに
対する特異的なリガンド結合物質は、一般によく知られ
ており、ここでは詳しく記載しない。

リガンドのアナログトレーサーは、検出し、測定できる
ように標識されている。放射性標識は、良く知られ、利
用可能であり、その他に、このような実験にこれまで（
り用されてきた標識、例えば、酵素、蛍光物質、色素、
化学発光物質など、リカンドのアナログトレーサー分子
内に入れられるものは総て利用可能である。

以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。

「実施例Ｉ」 まず、遊離リガンドが遊離甲状腺ホルモンの場合につい
て、全般的に、説明し、続いて、各々の実施例（１〜７
）を示す。

Ｌ−サイロキシン（Ｔ４）と３．５．３°−トリヨード
サイロニン（Ｔ３）に対する抗体は、既知の方法、例え
ば、牛血清アルブミンにＴ４とＴ　３を結合させたしの
を免疫原として用いて兎から得ることができる。

ジ・ヨードサイロニン（Ｔ２）とＴ３のアナログは、ア
ラニン側鎖のα−アミノ基をスタンニル化し、て各々Ｎ
−［、−ジ・ヨードサイロニンコハク酸アミドと、Ｎ−
Ｌ−１リヨードサイロニンコハク酸アミドをつくり、こ
れらに通常の方法のヨード化を行ない、各々Ｎ　　”Ｊ
　　ｒ−ｈリョードサイロニンコハク酸アミドと、Ｎ　
　１２５Ｉ　　Ｌ−サイロキノンコハク酸アミドとする
ことによって調製される。続いて、これらのトレーサー
をＯ，ＯＩＭ　ＩＩＥＰＥＳ（Ｎ−２−ハイドロキシエ
ヂルピペラジン−Ｎ′−エタンスルポン酸）緩衝液ｐＨ
７，４と、Ｑ、０１％アジ化ナトリウムに混合する。そ
して、Ｔ３、Ｔ４が検出されない０．１％活性炭吸着ヒ
ト血清アルブミン（ＣＡＨＳＡ）と、後に示すような結
合阻害剤を加える。

標準液の調製は、様々の量のＴ３またはＴ４をＴ３およ
び／またはＴ４の全く検出されないヒト血清に加え、平
衡透析法に対応させて濃度を測定して各々の量を決定す
る。

Ｔ３とＴ４の抗血清は、ポリプロピレンチューブ（１２
Ｘ７５ｍｍ）の壁面にＣａｔＬに、等によって（Ｓｏｌ
ｉｄ　ｐｈａｓｅｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　
ｉｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｏａｔｅｄ　ｔｕｂｅｓ、
５ｃｉｅｎｃｅ　１５８：１５７０．１９６７）に記載
された方法によって吸着（固定化）さ仕る。

遊離Ｔ４の測定の場合は、５０μＱの標学液または患者
検体を抗Ｔ　４抗体を塗布したチューブにピペットで入
れ、このチューブに１．Ｏｍ＆の標識Ｔ４アナログ溶液
を加える。そして、このチューブを３７℃で６０分間保
持する。その後、このチューブ中の液を捨て、チューブ
に結合した放射能を測定する。結果は、検量線より計算
し、ｎ９／ｄＱで表示される。

遊離Ｔ３の測定の場合は、１００μＱの標錦液または患
者検体を抗Ｔ３抗体を塗布したチューブにピペットで入
れ、Ｉ　、　ＯｍＱのＴ３の標識アナログ溶液を加える
。このチューブを３７℃で３時間保持し、チューブ内の
液を捨て、放射能を測定する。結果を遊離Ｔ４の場合と
同様に計算し、ｐｉｔ／　ｍＱ、で表示される。

（実施例■−１） 遊離Ｔ３または遊離Ｔ４の測定系における抗体は、遊離
ホルモンと、その輸送ホルモンの生理的平衡に影響を与
えないものでなければならない。この平衡は、その特異
抗体を測定系に加えた場合にら保持されなければならな
い。従って、抗体は遊離の測定物との親和定数および特
異性を考慮して選定することが必須である。このような
抗体はゆっくりした反応動力学を持つべきである。

遊離Ｔ４の場合、２５００００倍に希釈した抗体（２，
Ｏｎｇ　ＩｇＧ／チューブ）を用いた。アルブミンとア
ルブミン阻害剤の存在下および非存在下でのトレーサー
の抗体への結合の影響を見るために、２５００００倍希
釈（２，Ｏｎ９１ｇＧ／ｎ９一 Ｏｎｙ　ＩｇＧ／チューブ）の抗体塗布チューブを用意
した。最大結合率は、前記遊離Ｔ　４の操作手順に従っ
て決定した。その結果を表１に示す。

（以下、余白） 含まず（アルブミンを全く含まない系）。

・トレーサーＢは、Ｃ　Ａ　Ｉ　Ｓ　Ａを添加什ず、５
０μＱのＯ標準液由来１．０ｍｇのアルブミン／チュー
ブを含む。

・トレーサーＣは、１ｍｇのＣＡｌ−１９Ａ／チユーブ
を含み、０標め液を含まず。

・トレーサーＤは、１　ｍｆＢｌ）　Ｃ　Ａ　Ｈ　Ｓ　
Ａ　／　チューブと５０μｇの０標準液を含む。

・トレーサーＥは、Ｉ　Ｒ９（Ｄ　Ｃ　Ａ　Ｈ　Ｓ　Ａ
　／　チューブと５０μＱのＯ標準液と０．５ｍｇ７ｍ
（ｌサリヂル酸ナトリウムを含む。

・トレーサーＦは、Ｉ　Ｒｇ（１）　Ｃ　Ａ　Ｉ　Ｓ　
Ａ　／　チューブと５０μＱの０標準液と５．０ｍ９／
ｍＱザリチル酸ナトリウムを含む。

・トレーサー〇　ハ、ＩＨのＣＡＨ３Ａ／ヂューブラム
と！朽／！ｌσ２，４−ジニトロフェノールを含む。

・トレーサー■］は、ｌｕのＣＡＨＳＡ／チューブと５
０μりの○標準液と２５ｔｔｒｑ／ｍＱサリチル酸ナト
リウムとＧ、１５ａ９／ｍ（１２，４−ジニトロフェノ
ールを含む。

アルブミンまたは他のタンパクが存在しない場合、抗体
の量はどちらでも、１２５Ｉ　　Ｔ４・アナログトレー
サーの抗体への結合は同等である。トレーサーＤに見ら
れろように、トレーサーと０濃度標隼液に由来するアル
ブミンが２Ｉｌ＋９／チユーブ存在する場合、アナログ
トレーサーは、低濃度の抗体には結合せず、高濃度の抗
体にのみわずか９．４％結合する。アルブミンが１１９
／チユーブだけ存在する場合、すなわち、トレーサーＢ
とトレーサーＣとでは、低濃度抗体への結合は、それぞ
れ２゜６％、１．４％と無視できるぐらい低い。ところ
が、高濃度抗体に対しては、１８．１％、１５０％と明
らかに結合している。これらの実験から以下の結論が得
られる。

１　、２．Ｏｒ＋９／チューブのＩｇＧ抗体か存在して
も、実質的に１〜２ｍｇ／チューブのアルブミンはアナ
ログトレーサーと結合する。

２　、２．０ｎ９／ヂコーブのＩｇＧ抗体は、そのアナ
ログトレーサーに対する親和性かアルブミンのそれより
低い。

３　アルブミン阻害剤が存在すると、標識されたＴ４の
アナログトレーサーの抗体への結合が回復する。

同様の実験を遊離Ｔ３の測定に対しても行なった。その
結果を表２に示す。この表から明らかなように、遊離Ｔ
４の場合と同様の結論が導かれる。

［表２］ 含まず（アルブミンを全く含まない系）。

・トレーサーＢは、ＣＡ　ＨＳ　Ａを含まず、１００μ
りの０標準液を含む。

・トレーサーＣは、１．ＯｍｇのＣＡ　ＨＳ　Ａ　／チ
ューブを含み、０標準液を含まず。

・トレーサーＤは、Ｌ、ＯｍｇのＣＡＨＳＡ／チューブ
と１００μＱの０標準液を含む。

・トレーサーＥは、１．Ｏ’ｍ９のＣＡ　Ｉ（Ｓ　Ａ　
／チューブと１００μ夕の０標め液とり、Ｏｍｇ／ｒｙ
ｔρサリチル酸ナトリウムを含む。

・トレーサーＦは、１　ｍｑ／ｍＱのＣＡ　ＨＳ　Ａ　
／チューブと１００μＱの０標孕液と５．Ｏｍｇ／ｍρ
ザリチル酸ナトリウムを含む。

・トレーサーＧは、１　、Ｏｍｇ／次ＱのＣＡ　Ｉ（Ｓ
　Ａ　／デユープと１００μｍ２のＯ標弗液と１．０ｍ
９／ｐＱサリヂル酸ナトリウムと１．０ｍｇ／ｍＱ、　
２．４−ジニトロフェノールを含む。

・トレーサーＨは、１　、Ｏｍｙ／ｍＱのＣＡＨＳＡ／
ヂコ。

−ブと１００μＱの０標準液と２５ｍｇ／ｍＱサリチル
酸ナトリウムと０．１５Ｂ／肩Ｑ２．４−ジニトロフェ
ノールを含む。

このように、遊離ホルモンの測定に用いられる抗体の濃
度が重要であるから、抗体がホルモンを内因性タンパク
から奪わないように注色深く濃度を決定しなければなら
ない。アマ−ジャムとコーニングの特許においては、ａ
離Ｔ３、遊離Ｔ４の測定に用いられる抗体のＱｒＸが示
されていない。しかしながら、雨音の特許には、アルブ
ミンの阻害剤について言及していないので、前記実験か
ら推察すると、雨音の特許では、抗体とアナログトレー
サーをうまく結合させるために、かなり高濃度の抗体を
使用しすいるものと考えられる。

（実施例ｌ−２） 実施例１−１に基づいて、Ｔ３抗体およびＴ４抗体の濃
度は、各々５．５ｎ９／チユーブ、２．０口９／チユー
ブと決定した。次に、遊離Ｔ３と遊離Ｔ４法で使用する
アルブミン阻害剤の至適濃度を決めろため、以下の表３
〜１０に示す化合物を各表に示すように様々な濃度でア
ナログトレーサーに添加した［各々ノドレーサーはｌ　
ｍ９／　ｍＱのＣＡ　ＨＳ　、八（活性炭吸着ヒト血清
アルブミン）を含んでいる］。そして、０標早液を各々
のチューブに加え、最大結合率を測定した。

本発明は、もちろん表３〜１０の例に限定されるもので
はない。抗体濃度が一定の場合、トレーサーの結合率は
、アルブミン阻害剤の濃度の増加に伴って、プラトーに
達するまで増加する。このことは、適当な濃度のアルブ
ミン阻害剤の使用により、Ｔ３およびＴ４標識アナログ
のアルブミンへの結合を排除できることを示している。

（実施例■−３） この遊離Ｔ３、Ｔ　４の測定系においては、アルブミン
が影響を及ぼさないことを示すため、以下の実験を行な
った。

５人の健常者および５人の妊娠第３三月期の女性よりな
る１０人分の血清を集め、各々を４分割した。そのうち
３つには、活性炭吸着ヒト血清アルブミン（ＣＡＩＳＡ
）のの凍結乾燥物を各々終濃度１０．２０．５０Ｂ／　
Ｒｆ２となるように添加した。この４つをさらに２分割
し、遊離Ｔ３と遊離Ｔ４を４種の異なるトレーサー（表
１１および１２）を用いて二重測定を行なった。

そして、健常者（Ｎ＝５）のアルブミン濃度の各々の平
均をとり、４種の添加したアルブミン濃度に対してトレ
ーサー毎にプロットした（第１図ないし第１６図）。

以上の実験により、遊離Ｔ３、遊離Ｔ４の測定において
、トレーサー■の条件で測定を行なえば、５．０ｇ／ｄ
Ｑまでのアルブミンの添加（全量としては約８９／ｄＱ
）でら全く影響を受けないことが明らかとなった。

（実施例ｌ−４） 前記標識された遊離Ｔ３、遊離Ｔ４アナログトレーサー
にＴＢＣ；（サイロイド結合グロブリン）か結合するか
どうかを決定するため、実施例３で述べたトレーサー■
を用いて以下の実験を行なった。

Ｔ３とＴ４を全く含まないＴ　Ｂ　Ｇを各々０標準液に
所定濃度加え、各遊離Ｔ３、遊離Ｔ４を測定した。

測定された結合率（Ｂ／Ｂｏ）を表１３に示す。

［表１３］ （実施例ｒ　−４ａ） 実施例３のトレーサー■を用い、０漂学液へのアルブミ
ンの添加の影響を確認した。Ｔ３とＴ４を全く含まない
ＣＡＨＳＡを各遊離Ｔ３とＴ４に対オる０標準液に所定
濃度添加した。表１４に測定した結合率（Ｂ　／Ｂ　ｏ
）を示す。

［表１４］ 実施例４および４ａからトレーサー■を用いれば、アナ
ログトレーサーは、ＴＢＧにもアルブミンにも結合しな
いことが示された。

（実施例ｌ−５） アルブミン結合性の色素であるスルホブロモフタレイン
も高濃度では、Ｔ３、Ｔ４からアルブミン分子を奪うこ
とができる。低濃度のスルホブロモフタレインは、Ｔ３
およびＴ４のアナログトレーサーのアルブミンへの結合
を阻止できない。ヨード化したＴ４アナログを上記のよ
うに調製した後、５つに分割し、その各々に表１５に示
す色素を添加した。

各々の測定は同一条件下で、２０検体で行なった。

トレーサー１を標県として各トレーサーの実験データを
表示した（表１６．１７）。

０．０５％のスルホブロモフタレインを用いたトレーサ
ー３の結果は、トレーサーｌの結果とよく相関している
。ただし、ｉレーサー１の場合と比べて２０％程低値と
なる。トレーサー４を用いると、トレーサーＩの場合と
よい相関をとるが、遊離Ｔ４値はかなり高くなる。これ
は高濃度のスルホブロモフタレインによってアルブミン
からＴ４の遊離が起きているためと推察される。

（以下、余白） トレーサー５で用いたオレイン酸もアルブミンとトレー
ザー結合を阻止することが部分的には可能である。しか
し、このトレーサーを用いた検体の測定は、トレーサー
ｌの場合とあまりよい相関を示さない。オレイン酸は高
濃度（１ｘｔｔｔｏ（１／Ｑ以上）では、アルブミンに
結合した内因性のＴ４を遊離させしまう。

（実施例■−６） 遊離Ｔ３と遊離Ｔ４の測定系における遊離脂肪酸の影響
を調べるため、患者検体を凍結乾燥し、様々の濃度のオ
レイン酸を加えた蒸留水で再構成した。これらの検体に
対し遊離Ｔ３、遊離Ｔ４を一ヒ記操作法に従って測定し
た。この時、実施例Ｉ−３に記載した４種のトレーサー
の各々について測定を行なった。表１８−１．１８−２
にデータを要約したが、遊離Ｔ４の測定では、ｌ・レー
サー１は明らかにアルブミンに結合しており、オレイン
酸によってアルブミン上のトレーサーが置き変わり、遊
離Ｔ４値が見掛は上代値となっていることが判る。

トレーサー■と■もアルブミンへの結合が起こりている
が、その程度は低い。しかしながら、トレーサー■は実
施例＞３でも示したように、アルブミンの影響を全く受
けず、従って、オレイン酸の影響も全く受けないことが
判る。

遊ＭＴ３でも遊１　Ｔ　４と同様の結果が得られ、トレ
ーサー■では、非エステル化遊離脂肪酸の影響を全く受
けないことから実施例Ｉ−３の結果を確認することがで
きた。

［表１８−１］ ［表１８−２］ （実施例ｌ−７） 上記の遊離Ｔ４の測定結果が妊娠および非甲状腺疾徂に
影響されないことを示すため、１８５人の甲状腺正常者
、２５人の妊娠第１三ケ月期、４９人の第３三ケ月期お
よび１４人の非甲状腺疾憶患者について、実施例３のト
レーサー■を用いて測定を行なった。表１９および第１
７〜２０図に要約ｌ、たように、統計的にも臨床的にも
妊婦および非甲状腺疾低弘者と甲状腺正常者とは、遊離
Ｔ４に変化がなかった。

このことから、適当なアルブミン阻害剤の添加により生
体内でのアルブミン量の変化に影響を受けずに遊ＭＴ４
値を測定できることが確認された。

［表１９コ なお、前記実施例■では、遊離リガンドが遊離甲状腺ホ
ルモンの場合で、そのアナログトレーサーとしてＮ−１
２５Ｉ−Ｌ−トリヨードサイロニンコハク酸アミドとＮ
　　ｌ　２５　Ｉ　　Ｌ−ザイロキシンコハク酸アミド
とを用いたが、同様にして、Ｎ−＋２５ｒ　　Ｌ　　ｈ
リョードサイロニンコハク酸イミドとＮ　　１２５Ｉ　
　Ｌ−サイロギシンコハク酸イミドも使用可能である。

次に、遊離リガンドが遊離テストステロンである場合の
実施例を示す。

「実施例■」 ステロイド分子は、分子中のＡＲＢ環の両方または一方
が結合タンパクと結合していることが既に知られている
（ＦｏｒｅｓＬＭ、等ｉｎ″Ｐｈｙｓ　ｉｏｌＯｇｉｃ
ａｌＰｅｐｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｎｅｗ　Ｔｒｅｎｄｓ
　ｉｎ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ。

”　Ｃ，、Ａ、Ｂｉｚｏｌｌｏｎ、ｅｄ、、　Ａｍｓｔ
ｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／ＮｏｒｔｈＨｏｌｌａ
ｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ、１９８１
．ｐ２４９−２６６）。Ａ環とＢ環の一方または両方を
化学的に変化されることにより、殆どのステロイド（テ
ストステロン、プロゲステロン、エストラジオールなど
）を内因性の結合体への結合を阻止することができる。

以下、テストステロンをこれらの一例として選んで説明
する。

テストステロンのアナログである６−ハイドロキシテス
トステロン−１９−カルボキシメチルエーテルヒスタミ
ンは、通常の手法により合成され、１２５Ｉで標識され
る。このアナログトレーサーを、Ｉｙｎｇ／ｌｎＱの活
性炭吸着ヒト血清アルブミン（ＣＡ１−Ｉ　Ｓ　Ａ　）
と、０．０１％のアジ化ナトリウムを含む０．ＯＬＭ　
　ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐｉ−１７，４に溶解する。これに
以下の実施例に示すように阻害剤を添加した。

抗テストステロン抗体は、テストステロン−１９−カル
ボキシメチルエーテルを牛血清アルブミンに結合させた
ものを免疫原として兎の中で作製し、遊離Ｔ４および遊
離Ｔ３の項で説明したのと同様の方法で、Ｌ２Ｘ７５＋
＋＋ｘのポリプロピレンチューブの管壁に固定化する。

遊離テストステロンの標準液は、様々な量のテストステ
ロンをテストステロンを含まないヒト血清に添加し、直
接平衡透析法により遊離テストステロン値を測定してｐ
ｇ／　ｍρの単位で表した。遊離テストステロンの測定
には、５０μＱの標準液または弘者検体を抗テストステ
ロン抗体を塗布したチューブに入れ、続いて１．ＯｘＱ
のヨード化した６−ハドロキシテストステロンー１９−
カルボキシメチルエーテルヒスタミン・アナログ溶液を
加える。このチューブを３７℃で４時間保持し、その後
、内容液を捨てて、チューブに付着した放射能を測定す
る。結果は標準曲線より計算する。

（実施例■−１） 阻害剤の遊離テストステロン測定に対する効果を調べる
ため、２０検体を上記の方法で測定した。

スルホブロモフタレイン（ＳＢＰ）の添加または無添加
に対し、サリチル酸ナトリウム、２．４−ジニトロフェ
ノール（Ｄ　Ｎ　Ｐ　）、８−アニリノ−１−ナフタレ
ンスルホン酸（Ａ　Ｎ　Ｓ　）を様々の濃度で加えて測
定を行なった。各のトレーサーに対する測定値（平均）
を表２０に示した。また、トレーサー間の相関について
表２１に示した。

［表２１］ この結果よりスルホブロモフタレイン（ＳＢＰ）を添加
しない場合、遊離テストステロン値が１４％程上昇する
ことが判る（ＡおよびＡ’）。これは、ＳＢＰがアルブ
ミン結合したテストステロンを奪うことなく、アナログ
トレーサーのアルブミンへの結合を阻害するからである
。さらに重要な点としてサリチル酸（塩）、２．４−ジ
ニトロフェノール、ＡＮＳは、アルブミンおよび／また
はＳ　ＨＢ　Ｇ　（ＳｅｘＨｏｒｍｏｎ　Ｂｉｎｄｉｎ
ｇ　Ｇｌｏｂｕｌｉｎ；性ホルモン結合性グロブリン）
からテストステロンを奪ってしまうことも判った。

（実施例■−２） 遊離テストステロン測定におけるアナログトレーサーの
効率をチェックするため、アナログトレーサーであるヨ
ウ素化された６−ハイドロキシテストステロン−１９−
カルボキシメチルエーテルヒスタミンと、通常のトレー
サーであるヨウ素化されたテストステロン−１９−カル
ボキシメチルエーテルヒスタミンとを遊離テストステロ
ン測定について患者検体を用いて比較を行なった。

トレーサーは前記のように、１０μ９／ＩＩＩＱのスル
ホブロモフタレインを加えて調製した。両トレーサーが
同等の感度を示すように、ポリプロピレンチューブ内壁
に固定化する抗体の量を調節した。

患者の検体数は２０であり、そのテストステロン平均値
（ｐｇ／Ｉｌ＋＋２）と両者の相関式を表２２に示す。

［表２２］ この結集は、アナログトレーサーである６−ハイドロキ
シテストステロシー１９−カルボキノメチルエーテルヒ
スタミン−１２５■が内因性の結合物（ＳＨＢＧ等）に
結合せず、一方、テストステロン−１９−カルボキシメ
チルエーテルヒスタミン−１２５■は結合することを示
している。従って、アナログトレーサーに比べ、通常の
トレーサーでは、約５０％高いテストステロン測定値と
なる。

（実施例■−３） 遊離テストステロン測定系における性ホルモン結合性グ
ロブリン（ＳＨＢＧ）レベルの影響を調べるため、活性
炭処理したヒト血清にＳ　ＨＢ　Ｇを４００μｇ／ｍｃ
（正常値の１０倍レベル）加えて測定を行なった。上記
の方法で遊離テストステロンを測定すると、結合率Ｂ／
Ｂｏは９９％であった。

活性炭により血清中のテストステロンは完全に吸収され
るので、遊離テストステロン値は０となる。従って、Ｂ
／ＢＯは５ＨＢＧの有無と無関係に１００％となるはず
である。この結果は、前記アナログトレーサーが高濃度
の５ＨＢＧに結合しないことを示している。

（実施例■−４） 血清中のアルブミン濃度が上昇した場合の遊離テストス
テロン測定に対する影響を調べるため、３種の凍結乾燥
した検体をｏ　、Ｌｏ、２．０．３．０９／　ｄＱのア
ルブミン水溶液で再溶解した。すべての検体は実施例Ｔ
ｌ−３と同じトレーサーを用い、同時に測定し、表２３
の結果を得た。

この結果は、この遊離テストステロン測定系は、アルブ
ミンのレベルが大きく上昇しても臨床上なんら影響を受
けないことを示している。３　、０９／　ｄＱのアルブ
ミンを加えた試料では、全測定系で７９／ｄＱという非
常に高いレベルのアルブミンを含んでいることが注目さ
れる。

（実施例■−５） いくつかの患者検体に対して、実施例ｌｌ−３と同じト
レーサーを用い、遊離テストステロンを活性炭処理前と
処理後で測定した。表２４には処理面の遊離テストステ
ロン濃度をｐｇ／　ｘρで、処理後の遊離テストステロ
ン濃度を結合率（％Ｂ　／　Ｂ　ｏ　）で表した。

［表２４］ この結果、検体の活性炭処理により遊離テストステロン
値は、アナログ法で測定した場合、はとんど０、つまり
、はぼ１００％の結合率（Ｂ　／Ｂ　ｏ）となっている
ことが判る。活性炭処理は、テストステロンをはじめど
する他のステロイド類および低分子物質を取り除き、ア
ルブミン、Ｓ　ｌ−ｊ　Ｂ　Ｇや他の結合タンパクは除
かない。従って、この実験は、アナログ法による遊離テ
ストステロンの測定が結合タンパク等のレベルに影響さ
れないことを示している。

（実施例ｎ−６） 非エステル化遊離ｌ旨肪酸（ＮＦＥＡ）は、アルブミン
に対する結合定数かテストステロンより大きい。このこ
とを様々の量のオレイン酸を３種類の検体に添加する実
験で確認した。遊離テストステロン測定に対するこの効
果について表２５に示した。

［表２５］ 「発明の効果」 以上説明したように、本願の第１の発明は、生物学的液
体中に内因性結合タンパクとそれに結合したリガンドが
存在する場合に、遊離リガントと。

結合リガンドの平衡をくずすことなく、遊離リガンドの
みを測定する方法であって、以下の（ａ）　（ｂ）（ｃ
）の手順を含むことを特徴とする生物学的液体中の遊離
リガンドの測定方法である。すなわち、（ａ）試料とな
る生物学的液体を、次の（ｉ　）（ｉｉ　）（ｉｉｉ　
）の物質とともに保持する。い）その化学的構造のため
に特定の前記内因性タンパクと結合されないリガンドの
アナログトレーサー、（１１）特異的リガンド結合体（
リガンドに対して特異的に結合する化合物）、（ｉｉｉ
）前記リガンドのアナログトレーサーが前記特定の内因
性結合タンパク以外の内因性結合タンパクと結合するの
を阻害する少なくと乙一種の特異的な化学物質。

（ｂ）　　前記特異的な結合体と結合した前記リガンド
のアナログトレーサーと、同特異的リガンド結合体と結
合しなかったアナログトレーサーとを分離する。

（ｃ）　　前記生物学的液体中の前記特異的な結合体と
結合した前記リガンドのアナログトレーサーを既知のＭ
離すガント標卆液中の結合アナログトレーサーと比較し
て前記生物学的液体中の遊離リガンドの濃度を決定する
。

また、本願の第２の発明は、その中に内因性結合タンパ
クとこの内因性結合タンパクに結合したりガントが存在
する生物学的液体に添加、保持されることに３１−〇前
記生物学的液体中の遊離リガンドと結合リガンドの平衡
をくずすことなく、遊離リガンドのみを測定可能とする
測定用キットであって、（１）その化学的構造のために
特定の前記内因性タンパクと結合されないリガン）・の
アナログ１、レーサーと、（１１）特異的リカント結合
体（リガンドに対して特異的に結合する化合物）と、（
ｉｉｉ）前記リガンドのアナログトレーサーが酸Ａ２特
定の内因性結合タンパク以外の内因性結合タンパクと結
合するのを阻害する少なくとし一種の特７ｄ的な化学物
質と、から構成されることを特徴と′４−ろらのである
。

従って、本発明の生物学的液体中の遊離リガンドの測定
方法および測定用キットは、例えば、サイロキシン、ト
リヨードサイロニン、テストステロン、コルチゾール、
プロゲステロン、エストラノオール、その他のホルモン
およびステロイド、または薬物あるいは薬物の代謝産物
、ビタミンＢ１２等のビタミン、毒素などの人体液中に
普通に見られる遊離リガンドのどうようなものに対して
ら、その正確な濃度測定に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図ないし第１６図は、遊離Ｔ３、遊離Ｔ　４の測定
系においては、アルブミンが影響を及ぼさないことを示
す本発明の実施例＞３を説明するためのもので、ｈ々購
軸にＣＡ　Ｉ−Ｉ　Ｓ　Ａ　（活性炭吸着ヒト血清アル
ブミン）濃度（ｍｇ／　＊（１’）を取り、縦軸に遊離
Ｔ３濃度（ｐｈ／　ｍＱ）または遁ＩＴ４濃度（ｎｙ／
　、＋Ｑ）を取って示したグラフ、第１７図ないし第２
０図は、遊離１゛４の測定結果が妊娠および非甲状腺疾
患に影響されないことを示す本発明の実施例１−７を説
明するためのらので、横軸に遊離Ｔ４濃度を取り、縦軸
に頻度を取って示したグラフである。 出願人　　ダイアグノスティック　ブロダクツコーボレ
ーンヨン 第１図 第２図 にＡｔ−１５ハ１ｍｃ］／ｍｌ 第３図 第４図 第５図 第６図 第７図 第８図 ＣＡＨ３Ａ、ｍｇ／ｍｌ 第９図 第１０図 第１１図 第１２図 第１３図 第１４図 ＣＡＨ８Ａ、ｍｇ／ｍｌ 第１５図 第１６図 第１．７図 第１８図 Ｔ４．　ｎｇ／ｄｌ

Claims (47)

【特許請求の範囲】
1. （１）生物学的液体中に内因性結合タンパクとそれに結
   合したリガンドが存在する場合に、遊離リガンドと結合
   型リガンドの平衡をくずすことなく、遊離リガンドのみ
   を測定する方法であって、以下の（ａ）（ｂ）（ｃ）の
   手順を含むことを特徴とする生物学的液体中の遊離リガ
   ンドの測定方法。 （ａ）試料となる生物学的液体を、次の（ｉ）（ｉｉ）
   （ｉｉｉ）の物質とともに保持する。（ｉ）その化学的
   構造のために特定の前記内因性タンパクと結合されない
   リガンドのアナログトレーサー、（ｉｉ）特異的リガン
   ド結合体（リガンドに対して特異的に結合する化合物）
   、（ｉｉｉ）前記リガンドのアナログトレーサーが前記
   特定の内因性結合タンパク以外の内因性結合タンパクと
   結合するのを阻害する少なくとも一種の特異的な化学物
   質。 （ｂ）前記特異的な結合体と結合した前記リガンドのア
   ナログトレーサーと、同特異的リガンド結合体と結合し
   ていないアナログトレーサーとを分離する。 （ｃ）前記生物学的液体中の前記特異的な結合体と結合
   した前記リガンドのアナログトレーサーを既知の遊離リ
   ガンド標準液中の結合アナログトレーサーと比較して前
   記生物学的液体中の遊離リガンドの濃度を決定する。
2. （２）遊離リガンドがホルモン、ステロイド類、薬物、
   薬物の代謝産物、ポリペプチド、タンパク、ビタミン、
   抗原、毒素であることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項に記載の生物学的液体中の遊離リガンドの測定方法。
3. （３）遊離リガンドが甲状腺ホルモンであることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項に記載の生物学的液体中の
   遊離リガンドの測定方法。
4. （４）遊離リガンドが性ホルモンであることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項に記載の生物学的液体中の遊離
   リガンドの測定方法。
5. （５）遊離リガンドがテストステロンであることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項に記載の生物学的液体中の
   遊離リガンドの測定方法。
6. （６）リガンドのアナログトレーサーが、Ｎ−［＾１＾
   ２＾５Ｉ］−Ｌ−トリヨードサイロニンコハク酸アミド
   であることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
   生物学的液体中の遊離リガンドの測定方法。
7. （７）リガンドのアナログトレーサーが、Ｎ−［＾１＾
   ２＾５Ｉ］−Ｌ−サイロキシンコハク酸アミドであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の生物学的
   液体中の遊離リガンドの測定方法。
8. （８）リガンドのアナログトレーサーが、放射性原子、
   酵素、蛍光物質、あるいは化学的発光物質で標識されて
   いることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の生
   物学的液体中の遊離リガンドの測定方法。
9. （９）リガンドのアナログトレーサーが、少なくとも一
   つの放射性ヨウ素原子で標識されていることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項に記載の生物学的液体中の遊離
   リガンドの測定方法。
10. （１０）リガンドのアナログトレーサーが、ヨウ素化さ
    れた６−ハイドロキシテストステロン−１９−カルボキ
    シメチル・エーテルヒスタミンであることを特徴とする
    特許請求の範囲第１項に記載の生物学的液体中の遊離リ
    ガンドの測定方法。
11. （１１）特異的リガンド結合体が遊離リガンドの抗体で
    あることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の生
    物学的液体中の遊離リガンドの測定方法。
12. （１２）特異的リガンド結合体が固相に固定されている
    ことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の生物学
    的液体中の遊離リガンドの測定方法。
13. （１３）固相がポリプロピレンであることを特徴とする
    特許請求の範囲第１２項に記載の生物学的液体中の遊離
    リガンドの測定方法。
14. （１４）その他の内因性タンパクがアルブミンを含むこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の生物学的
    液体中の遊離リガンドの測定方法。
15. （１５）化学的結合阻害物質が置換基を持つモノアリル
    化合物であることを特徴とする特許請求の範囲第１項に
    記載の生物学的液体中の遊離リガンドの測定方法。
16. （１６）置換基を持つモノアリル化合物が２，４−ジニ
    トロフェノールであることを特徴とする特許請求の範囲
    第１５項に記載の生物学的液体中の遊離リガンドの測定
    方法。
17. （１７）置換基を持つモノアリル化合物がサリチル酸ナ
    トリウムであることを特徴とする特許請求の範囲第１５
    項に記載の生物学的液体中の遊離リガンドの測定方法。
18. （１８）化学的結合阻害物質が色素であることを特徴と
    する特許請求の範囲第１項に記載の生物学的液体中の遊
    離リガンドの測定方法。
19. （１９）色素がスルホブロモフタレインであることを特
    徴とする特許請求の範囲第１８項に記載の生物学的液体
    中の遊離リガンドの測定方法。
20. （２０）化学的結合阻害物質が脂肪酸であることを特徴
    とする特許請求の範囲第１項に記載の生物学的液体中の
    遊離リガンドの測定方法。
21. （２１）脂肪酸がオレイン酸であることを特徴とする特
    許請求の範囲第２０項に記載の生物学的液体中の遊離リ
    ガンドの測定方法。
22. （２２）化学的結合阻害物質がフェノール性水酸基を持
    つ化合物群であることを特徴とする特許請求の範囲第１
    項に記載の生物学的液体中の遊離リガンドの測定方法。
23. （２３）化学的結合阻害物質がアミノ酸であることを特
    徴とする特許請求の範囲第１項に記載の生物学的液体中
    の遊離リガンドの測定方法。
24. （２４）保持を３７℃で行なうことを特徴とする特許請
    求の範囲第１項に記載の生物学的液体中の遊離リガンド
    の測定方法。
25. （２５）反応をｐＨ７．４で行なうことを特徴とする特
    許請求の範囲第１項に記載の生物学的液体中の遊離リガ
    ンドの測定方法。
26. （２６）リガンドを除去したヒト血清に異なった量のリ
    ガンドを加え、これを平衡透析法によって遊離リガンド
    濃度を測定することにより既知の遊離リガンド標準液を
    調製することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載
    の生物学的液体中の遊離リガンドの測定方法。
27. （２７）その中に内因性結合タンパクとこの内因性結合
    タンパクに結合したリガンドが存在する生物学的液体に
    添加、保持されることにより、前記生物学的液体中の遊
    離リガンドと結合型リガンドの平衡をくずすことなく、
    遊離リガンドのみを測定可能とする測定用キットであっ
    て、 （ｉ）その化学的構造のために特定の前記内因性タンパ
    クと結合されないリガンドのアナログトレーサーと、 （ｉｉ）特異的リガンド結合体（リガンドに対して特異
    的に結合する化合物）と、 （ｉｉｉ）前記リガンドのアナログトレーサーが前記特
    定の内因性結合タンパク以外の内因性結合タンパクと結
    合するのを阻害する少なくとも一種の特異的な化学物質
    と、から構成されることを特徴とする生物学的液体中の
    遊離リガンドの測定用キット。
28. （２８）遊離リガンドがホルモン、ステロイド類、薬物
    、薬物の代謝産物、ポリペプチド、タンパク、ビタミン
    、抗原、毒素であることを特徴とする特許請求の範囲第
    ２７項に記載の生物学的液体中の遊離リガンドの測定用
    キット。
29. （２９）遊離リガンドが甲状腺ホルモンであることを特
    徴とする特許請求の範囲第２７項に記載の生物学的液体
    中の遊離リガンドの測定用キット。
30. （３０）遊離リガンドが性ホルモンであることを特徴と
    する特許請求の範囲第２７項に記載の生物学的液体中の
    遊離リガンドの測定用キット。
31. （３１）遊離リガンドがテストステロンであることを特
    徴とする特許請求の範囲第２７項に記載の生物学的液体
    中の遊離リガンドの測定用キット。
32. （３２）リガンドのアナログトレーサーが、Ｎ−［＾１
    ＾２＾５Ｉ］−Ｌ−トリヨードサイロニンコハク酸アミ
    ドであることを特徴とする特許請求の範囲第２７項に記
    載の生物学的液体中の遊離リガンドの測定用キット。
33. （３３）リガンドのアナログトレーサーが、Ｎ−［＾１
    ＾２＾５Ｉ］−Ｌ−サイロキシンコハク酸アミドである
    ことを特徴とする特許請求の範囲第２７項に記載の生物
    学的液体中の遊離リガンドの測定用キット。
34. （３４）リガンドのアナログトレーサーが、放射性原子
    、酵素、蛍光物質、あるいは化学的発光物質で標識され
    ていることを特徴とする特許請求の範囲第２７項に記載
    の生物学的液体中の遊離リガンドの測定用キット。
35. （３５）リガンドのアナログトレーサーが、少なくとも
    一つの放射性ヨウ素原子で標識されていることを特徴と
    する特許請求の範囲第２７項に記載の生物学的液体中の
    遊離リガンドの測定用キット。
36. （３６）リガンドのアナログトレーサーが、ヨウ素化さ
    れた６−ハイドロキシテストステロン−１９−カルボキ
    シメチル・エーテルヒスタミンであることを特徴とする
    特許請求の範囲第２７項に記載の生物学的液体中の遊離
    リガンドの測定用キット。
37. （３７）特異的リガンド結合体が遊離リガンドの抗体で
    あることを特徴とする特許請求の範囲第２７項に記載の
    生物学的液体中の遊離リガンドの測定用キット。
38. （３８）その他の内因性タンパクがアルブミンを含むこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第２７項に記載の生物学
    的液体中の遊離リガンドの測定用キット。
39. （３９）化学的結合阻害物質が置換基を持つモノアリル
    化合物であることを特徴とする特許請求の範囲第２７項
    に記載の生物学的液体中の遊離リガンドの測定用キット
    。
40. （４０）置換基を持つモノアリル化合物が２，４−ジニ
    トロフェノールであることを特徴とする特許請求の範囲
    第３９項に記載の生物学的液体中の遊離リガンドの測定
    用キット。
41. （４１）置換基を持つモノアリル化合物がサリチル酸ナ
    トリウムであることを特徴とする特許請求の範囲第３９
    項に記載の生物学的液体中の遊離リガンドの測定用キッ
    ト。
42. （４２）化学的結合阻害物質が色素であることを特徴と
    する特許請求の範囲第２７項に記載の生物学的液体中の
    遊離リガンドの測定用キット。
43. （４３）色素がスルホブロモフタレインであることを特
    徴とする特許請求の範囲第４２項に記載の生物学的液体
    中の遊離リガンドの測定用キット。
44. （４４）化学的結合阻害物質が脂肪酸であることを特徴
    とする特許請求の範囲第２７項に記載の生物学的液体中
    の遊離リガンドの測定用キット。
45. （４５）脂肪酸がオレイン酸であることを特徴とする特
    許請求の範囲第４４項に記載の生物学的液体中の遊離リ
    ガンドの測定用キット。
46. （４６）化学的結合阻害物質がフェノール性水酸基を持
    つ化合物群であることを特徴とする特許請求の範囲第２
    ７項に記載の生物学的液体中の遊離リガンドの測定用キ
    ット。
47. （４７）化学的結合阻害物質がアミノ酸であることを特
    徴とする特許請求の範囲第２７項に記載の生物学的液体
    中の遊離リガンドの測定用キット。