DK169365B1

DK169365B1 - Fremgangsmåde til bestemmelse af koncentrationen af fri ligand i en biologisk væske

Info

Publication number: DK169365B1
Application number: DK219686A
Authority: DK
Inventors: A Said El Shami
Original assignee: Diagnostic Products Corp
Priority date: 1985-10-04
Filing date: 1986-05-12
Publication date: 1994-10-10
Also published as: IL79283A; ATE130435T1; EP0661540B1; DE3650437T2; CA1299984C; AU602864B2; FI863186A; DK219686A; ES555425A0; NO862278D0; FI863186A0; JPH07311200A; DE3650691D1; EP0218309A3; DE3650437D1; DE3650691T2; ATE169410T1; EP0661540A1; IE60715B1; NO168002C

Description

i DK 169365 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til bestemmelse af koncentrationen af fri ligand i en biologisk væske i nærværelse af bundet ligand og endogene bindingsproteiner uden at forstyrre ligevægten mellem fri ligand og proteinbundet ligand.

5 I adskillige årtier har ligevægtsdialysemetoder været de eneste til rådighed værende metoder til måling af frie hormoner i serum, og de har indtil for nylig været de eneste metoder, som blev betragtet som værende pålidelige. Ligevægtsdialysemetoder lider i denne sammenhæng 10 imidlertid af adskillige mangler omfattende ringe præcision og langsommelighed, men frem for alt er deres resultater meget afhængige af de anvendte sporstoffers renhed.

Ellis og Ekins, R. (Acta Endocr. (KBH.) Suppl. 177: 106, 1973) 15 fremlagde en direkte metode til bestemmelse af frit hormon i deres afhandling "Direct Measurement By Radioimmunoassay of the Free Thyroid Hormone Concentration in Serum". Denne metode repræsenterer en større forbedring i forhold til ligevægtsdialysemetoderne, fordi den tillader direkte måling af frie ligandindhold i serum-20 dialysaterne ved radioimmunanalyse (RIA), hvorved problemet med sporstoffets renhed omgås. Denne metode betragtes nu af mange som referencemetoden til målinger af frit hormon. Den er imidlertid stadig tidsforbrugende og operatørafhængig, og den er uanvendelig i de fleste små laboratorier.

25

Indirekte metoder, som blev introduceret kort derefter, til bestemmelse af koncentrationerne af frit hormon omfatter forholdet testosteron/steroidhormonbindingsglobulin (SHBG), forholdet thyroxin-(T4)/thyroidsbindingglobolin (TBG), fri T4-index (baseret 30 på triiodothyroninproduktoptagelse (T3) og T4) og fri androgen-index.

Ekins, R. (Free Thyroid Hormones; Proceedings fra det Internationale Symposium afholdt i Venedig, December 1978, Amsterdam: Excerpta 35 Medica, 1979, 72-92) introducerede begrebet "direkte dynamiske metoder", i hvilke et anti-fri-ligandantistof anvendes i direkte kontakt med den biologiske væske under dialysen. Dette udgør basis for såkaldte "immunoekstraktions"-metoder.

DK 169365 B1 2

En sådan metode er beskrevet i beskrivelsen til US patent nr. 4.046.870, ved hvilken en to-rørs immunoanalysemetode måler overføringshastigheden af T4 fra bindingsproteiner til T4-specifikt antistof. Denne metode lider af adskillige analytiske og kliniske 5 mangler, som i realiteten gør den til kun en anden fri T4-indexanalyse.

En anden fremgangsmåde, som blev introduceret af Clinical Assays (Cambridge, MA 02139), er en ægte immunoekstrakti onsfremgangsmåde.

10 Den anvendte en enkelt-rørs, to-trins sekvensmetode (tilbageti trering). Ifølge denne fremgangsmåde inkuberes en serumprøve med immobil i seret antistof, og derpå bliver uudfyldte steder på det immobil i serede antistof efter et vasketrin "tilbagetitreret" ved anvendelse af en mærket ligand. Ved denne fremgangsmåde er serumet 15 aldrig i kontakt med den mærkede ligand. Selv om metoden teoretisk er i orden, lider den af ringe følsomhed og præcision, og begge reaktioner kræver eksakt tidskontrol.

Enkelttrins-immunoekstraktionsfremgangsmåder til bestemmelse af fri 20 ligandkoncentrationer i biologiske prøver var det selvfølgelige næste trin i udviklingen af fri ligandanalysesystemer. Disse fremgangsmåder afhænger snarere af kemisk end af fysisk separering af den mærkede ligand fra endogene bindemidler. Til opnåelse af dette mål kan der vælges adskillige fremgangsmåder, som beskrevet 25 nedenfor.

Hidtil kendt teknik beskriver, at en given ligands binding til endogene bindemidler reduceres eller mindskes ved kemisk ændring af dens struktur. Dette er blevet vist i rigt omfang for steroid-30 hormoner. (Se omtalen af frit testosteron nedenfor.). I tilfældet med thyroidhormoner, har Ross, J.E. og Tapley, D.F. vist (Effect of various analogues on the binding of labeled thyroxine to thyroxinebinding globulin and prealbumin, Endocrinology, 79: 493, 1966), at bindingen af TBG (thyroidbindingsglobulin) til T4 inhiberes, hvis 35 der foretages en forholdsvis voluminøs substitution i T4-molekyles 3'-position. Yderligere har Schall, R.F., et al. (An enzyme-label!ed immunoassay for the measurement of unsaturated thyroid hormone binding capacity in serum and in plasma, Clin. Chem., 25:1078 (abstract)1979) og Kleinhammer, G., et al (Enzyme Immunoassay for DK 169365 B1 3 determination of thyroxine binding index, Clin. Chem., 24:1033, 1978) uafhængigt af hinanden vist, at TBG ikke bindes til konjugater, som er dannet ved mærkning af T4 med peberrodsperoxidase. Denne kendsgerning udgør basis for den 5 enkelt-trins immunoekstraktionsfremgangsmåde, som er beskrevet i beskrivelsen til US patent nr. 4.410.633 (overdraget til Corning Glass Works) til måling af fri thyroxin og fri 3,5,3'-triiodothy-ronin, ved hvilken fremgangsmåde peberrodsperoxidase kemisk bindes til T4 og T3 og senere mærkes radioaktivt.

10

Ydermere beskriver hidtil kendt teknik også, at T3 og T4 skal have følgende molekylestruktur for maksimal binding til endogene bindeproteiner, nemlig TBG, thyroidbindende præ-albumin (TBPA), albumin: Snyder, S.M., et al. (Binding of thyroid hormones and their 15 analogues to thyroxine-globulin in human serum, J. Biol. Chem. 251: 6489, 1976), og Sterling, K., et al (Equilibrium dialysis studies of the binding of thyroxine by human serum albumin, J. Clin. Invest., 41: 1021, 1962): 20 1. L-alaninsidekædekonfiguration, 2. Tilstedeværelse af 4'-hydroxylgruppe (hovedsageligt til TBPA- og albuminbinding), og 25 3. Tilstedeværelse af to substituenter (halogen) i den indre og ydre ring (positionerne 3,5,3' og 5')

Adskillige hundrede T3 og T4 analoger er blevet syntetiseret og undersøgt for deres evne til at binde til thyroidhormonbinde- 30 proteiner.

I beskrivelsen til US patent nr. 4.366.143 og dets modsvarende EP patent nr. 26.103 er der i store træk beskrevet anvendelse af disse analoger som sporstoffer ved en enkelt immunoekstraktion under 35 anvendelse af samtidig titrering i stedet for sekventiel titrering af antistof til måling af frie hormoner. (For nemheds skyld vil der i det følgende blive refereret samlet til disse patenter som "Amer-sham" patentet).

DK 169365 B1 4

Der kræves en intakt alaninsidekæde ved optimal binding af T4 og T3 til TBG, dvs. al aninsidekædens aminogruppe er den væsentlige bestanddel. De analoger, som er beskrevet i Amersham patentet, er T3- og T4-molekyler, som er modificeret ved al aninsidekæden. Selv om 5 disse analoger teoretisk ikke binder TBG i noget væsentligt omfang, binder de uden tvivl albumin og TBPA i væsentlig grad, idet 4'-hydroxyl gruppen på T3- og T4-molekylerne er efterladt intakt. Det er almindeligt anerkendt, at binding af albumin og TBPA til thyroniner er kvantitativ især under fysiologiske forhold: Sterling, K. (Mole-10 cular structure of thyroxine in relation to its binding by human serum albumin, J. Cl i n. Invest., 43: 1721, 1964), og Pages, et al. (Binding of thyroxine and thyroxine analogs to human serum prealbumin, Biochem, 12: 2773, 1973).

15 Amersham patentets manglende erkendelse af vigtigheden af albumin-og TBPA-binding til thyroniner gør de fremgangsmåder, som er beskrevet i patentet, utilstrækkelige til sand måling af fri T3 og fri T4 i biologiske væsker. Faktisk giver kommercielt tilgængelige reagenser, som er baseret på fremgangsmåden ifølge patentet, 20 vildledende og unøjagtige fri hormonresultater. Dette gør sig særligt gældende ved adskillige patologiske forhold, som er ejendommelige ved væsentlige forandringer i det cirkulerende albuminindhold.

25 I nyere litteratur er det beskrevet, at albuminkoncentrationen korrelerer direkte med fri T4-koncentrationer, som er frembragt af Amersham-analysesystemet. Ydermere er det veldokumenteret, at Amersham-fremgangsmåden konsekvent giver fejlagtigt formindskede fri T4-resultater i 3. trimester graviditeter og i patienter, som lider 30 af alvorlig ikke-thyroidal sygdom, medens den giver forhøjede fri T4-indhold i tilfælde med familiær dysal buminemisk hyperthyroxinæmi, en tilstand ved hvilken T4 bindes anormalt til cirkulerende albumin.

Under graviditeten cirkulerer albumin i koncentrationer, som er 35 lavere end normalt især i det 3. trimester. Idet Amershams mærket T4-analogsporstof binder albumin og TBPA i et væsentligt omfang (mere end 99%), kunne man forvente, at Amersham-analysesystemet ville give lavere fri T4-resultater end normalt i det 3. trimester: mere analogsporstof er til rådighed til at binde T4-antistof, DK 169365 B1 5 hvilket resulterer i højere binding og lavere tilsyneladende dosis.

Ikke-esterificerede frie fedtsyrer er i stand til at fortrænge en mærket analog fra albumin; ydermere cirkulerer de i højere 5 koncentrationer end normalt under graviditeten. Dette kan forklare de lavere fri T4-værdier end forventet, som man støder på under graviditeten, når der analyseres efter Amersham-metoden, åbenbart vil fri T4-koncentrationer være væsentligt lavere end forventet, hvis albuminbindingen til den mærkede analog er væsentlig.

10

Denne situation er også vel dokumenteret i tilfældet med heparin-terapi, hvor der forekommer en væsentlig forhøjelse af ikke-esterificerede frie fedtsyrer. Fri T4- og fri T3-koncentrationer, når de måles efter Amershams metode på 15 hepari nbehandlede patienter, viser koncentrationer, som er lavere end normalt.

Det samme problem forekommer ved ikke-thyroidale sygdomme, hvor fri T3- og T4-værdier, som er frembragt ved Amersham-metoden, har vist 20 sig at være væsentligt lavere end for en euthyroidpopulation, når der sammenlignes med en direkte ligevægtsdialysemetode.

Proceduren ifølge Amersham-patentet er fundet mangelfuld af fagfolk inden for området, hvilket har manifesteret sig ved observationen af 25 forkerte og urigtige målinger af fri ligandindhold. Opfinderen til den foreliggende opfindelse har nu opdaget, at problemet hidrører fra binding af ligandanalogsporstoffet til visse endogene proteiner, f.eks. albumin, i biologiske væsker. Det har yderligere vist sig, at problemet kan overvindes ved anvendelse af specifikke kemiske 30 inhiberings-reagenser.

Med den foreliggende opfindelse afhjælpes således de mangler, som man støder på ved Amersham-patentets fremgangsmåde, hvorved der opnås en nøjagtigere bestemmelse af frie ligander i biologiske 35 væsker.

Dette opnås med fremgangsmåden ifølge opfindelsen til bestemmelse af koncentrationen af frie ligander i en biologisk væske i nærværelse af bundet ligand og endogene bindingsproteiner uden at forstyrre DK 169365 B1 6 ligevægten mel 1 em fri ligand og protein-bundet ligand, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved: a) at en prøve af den biologiske væske inkuberes med: 5 i) et ligandanalogsporstof, som på grund af sin kemiske struktur ikke binder til nogle af de endogene bindingsproteiner, 10 ii) en specifik ligandbinder med en affinitetskonstant på c mindst ca. 5 x 10 1/mol, og i i i) mindst ét specifikt kemisk inhiberingsreagens, som hæmmer binding af ligandanalogsporstoffet til andre endogene 15 bindingsproteiner, hvilket specifikt kemisk inhiberingsreagens forekommer i en koncentration, som er tilstrækkelig til at fortrænge ligandanalogsporstoffet fra mindst ét andet endogent bindingsprotein uden at fortrænge den naturlige ligand fra de endogene bindingsproteiner, 20 b) at det til den specifikke binder bundne ligandanalogsporstof adskilles fra ubundet sporstof, og c) at koncentrationen af fri ligand i den biologiske væske 25 bestemmes.

Den foreliggende opfindelse anvender ifølge en udførelsesform mærkede analoger til T3 og T4, som er modificeret ved alaninsidekæden. Især er alfa-aminogruppen modificeret til forhindring af 30 deres binding til TBG. Imidlertid er der foretaget skridt for at forhindre disse mærkede analoger i binding til albumin og TBPA.

Dette opnås ved omhyggeligt at udvælge et exogent kemisk reagens eller reagenser, som alene eller i kombination med andre er i stand til at bindes til uudfyldte bindingssteder på albumin- og TBPA- 35 molekyler, og derved mætter disse bindeproteiner og effektivt eliminerer deres evne til binding til thyroninanal oger og til andre endogene stoffer, såsom ikke-esterificerede frie fedtsyrer. Disse exogene kemikalier bør ikke bindes til TBG, og deres koncentration bør være en sådan, at der ikke sker fortrængning af noget bundet DK 169365 B1 7 hormon fra albumin eller TBPA.

Associationkonstanten for albumin og T4 er ca. 500.000. (Dette estimat er baseret på den antagelse, at antallet af tilgængelige 5 bindingssteder på albuminmolekylet for thyroxin svarer til 1, og at den tilsyneladende associationskonstant i liter pr. mol - d.v.s. ligevægtskonstanten i retningen af kompleksdannelse - er 5 x 105.). Tilsvarende er associationskonstanten for albumin og T3 ca. 24.600.

Det er velkendt at albumin har en højere affinitet til fri T3 og T4 10 og deres analoger end til aioniske farvestoffer, men en meget højere affinitet til frie fedtsyrer end til T3 og T4 og deres analoger.

Albumin har en relativt lav associationskonstant til enkle aromatiske forbindelser; de højeste associationskonstanter er til 2,4-di-15 nitrophenol (11.000) and salicylat (2.800).

For at opretholde nøjagtige ligevægtsforhold in vitro under immunoekstraktionsreaktionen er det nødvendigt at opretholde nøjagtige fysiologiske forhold, hvilket medfører anvendelse af pH = 20 7,4. Ved dette pH har thyron i nmolekylerne tre ladede grupper: den anioniske carboxyl ati on, den kationiske alfa-aminogruppe og den anioniske phenolation. (Den sidstnævnte er 82% ioniseret). Tilstedeværelse af albumin eller TBPA under disse fysiologiske forhold giver et meget ladet albumin med et relativt stort antal kationiske 25 aminogrupper. Disse kationiske aminogrupper på albuminmolekylet binder den anioniske phenolation på thyroninmolekylerne. En sådan vekselvirkning er hovedårsagen til albuminbinding til den mærkede analog ved både fremgangsmåden ifølge Amersham-patentet og fremgangsmåden ifølge Corning-patentet.

30

Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse anvendes det faktum, at 2,4-dinitrophenol (DNP) og natriumsalicyl at med deres relativt høje associationskonstanter til albumin og TBPA også vil være ioniserede og ladede under disse fysiologiske pH-forhold 35 givende en ladet anionisk phenolation, som er i stand til vekselvirkning med ladningerne på albumin- og TBPA-molekyler. Når enten 2,4-dinitrophenol eller natriumsalicyl at eller begge er tilstede i overskud, elimineres bindingen af mærkede T3- og T4-analoger til albumin og TBPA i realiteten. Denne fremgangsmåde DK 169365 B1 8 med blokering af albumin og TBPA med passende koncentrationer af 2,4-dinitrophenol og/eller natriumsalicyl at er et virkningsfuldt middel til eliminering af de fejlagtige analyseresultater, som er forårsaget af albumin ved fri thyroidhormonekstraktionsanalog 5 fremgangsmåderne.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er anvendelig i forbindelse med en lang række andre kemiske inhiberingsreagenser, d.v.s. reagenser, som er i stand til at blokerer uønsket reaktion af 10 ligandanalogsporstoffet til cirkulerende endogene bindeproteiner. Et eksempel er substituerede organiske monoarylforbindel ser. Sub-stituenterne på disse forbindelser omfatter nitro, carboxyl, carboxylsalte og lignende. Monoarylforbindel ser med en phenolisk hydroxyl gruppe er især anvendelig. Andre egnede katagorier er 15 farvestoffer, såsom sulfobromphthalin, orangerødt, bromcresyl-blåt og lignende. De højere fedtsyrer (over ca. 5 kul stofatomer), såsom oleinsyre, er også anvendelige. Endnu andre forbindelser vil være åbenbare for fagfolk inden for området. F.eks. har mange aminosyrer en høj affinitet over for albumin og er således anvendelige ved 20 udøvelse af nærværende opfindelse, f.eks. tryptophan. Andre egnede katagorier er T3-, T4- eller testosteronanal oger, som fortrænger mærket analog fra endogene proteiner uden, at bindes til antistoffet eller andet specifikt ligandbindemiddel.

25 Fremgangsmåden ifølge nærværende opfindelse kan anvendes til at påvise koncentrationen af en hvilken som helst af de frie ligander, som normalt findes i humani egernsvæsker. F.eks. kan den fri ligand være thyroxin, triiodothyroxin, testosteron, cortisol, progesteron, østradiol, hormoner og steroider, og også medikamenter og produkter 30 fra medikamentmetabolismen, vitaminer såsom B12, toxiner og lignende.

Almindeligvis er det specifikke ligandbindemiddel et, som kopier eller bindes til den frie ligand, og det kan være et specifikt 35 antistof til den fri ligand eller andre bindemidler. Almindeligvis er de specifikke ligandbindemidler, som er passende til de forskellige fri-ligander, kendte og behøver ikke at blive yderligere beskrevet.

DK 169365 B1 9

Ligandanalogsporstoffet er på én eller anden måde mærket, således at det kan detekteres eller observeres. Radioaktive mærkningsstoffer er velkendte og anvendelige såvel som andre mærkningsmidler, som tidligere er blevet anvendt inden for området, herunder enzymer, 5 flourophorer, chromophorer and kemi 1 uminescentgrupper, som kan forbindes med ligandanalogsporstofmolekylet.

Frie thvroid hormoner 10 Antistoffer til både L-thyroxin og 3,5,3'-triiodothyronin blev fremstillet i kaniner ifølge veletablerede traditionelle fremgangsmåder under anvendelse af kvægserumalbumin-T4 og -T3 som antigener.

Analoger af diiodothyronin (T2) og T3 blev fremstillet ved 15 succinilering af alfa-aminogruppen på al aninsidekæde til frembringelse af N-L-diiodthyroninsuccinimid henholdsvis N-L-triiodthyronin, som derpå blev iodbehandlet ved traditionelle i odbehandlingsprocedurer til frembringelse af N- I-L-triiodthy- 125 roninsuccinimid henholdsvis N- I-L-thyroxinsuccinimid. Sporings-20 midlerne blev derefter blandet i 0,01M HEPES (N-2-hydroxyethyl- piperazin-N'-2-ethanesulfonsyre) puffer, pH 7,4, og 0,01% natrium-acid. 0,1% Kul absorberet humanserumalbumin (CAHSA), som var fri for alt tilsyneladende T3 eller T4, og blokeringsmidler blev tilsat som beskrevet i de specifikke eksempler nedenfor. Forskellige mængder T3 25 eller T4 blev sat til humanserum, som var fri for alt tilsyneladende T3 og/eller T4, kalibreret udtrykt ved direkte ligevægtsdialyse og tildelt værdier fra hvert niveau.

T3- og T4-antistoffer blev immobiliseret på indersiderne af 12x75 mm 30 polypropyl enerør ved passiv adsorption, som beskrevet af Catt, K., et al. (Solid phase radioimmunoassay in antibody-coated tubes, Science, 158: 1570, 1967).

Ved analyse af fri T4 afpipetteres 50 ml calibrator eller patient-35 prøve i anti-T4-antistofbelagte rør fulgt af 1,0 ml mærket 74- analog. Rørene inkuberes derpå i 60 minutter ved 37°C. Efter denne inkubation dekanteres rørene, og den bundne radioaktivitet tælles. Resultaterne beregnes ud fra kalibreringskurven og udtrykkes i ng/dl.

DK 169365 B1 10

Til fri T3-analyse afpipetteres 100 ml kalibrator eller patientprøve i anti-T3-antistof belagte rør fulgt af 1,0 ml mærket T3-analog-sporstof. Rørene inkuberes i tre timer ved 37°C, dekanteres derpå og radioaktiviteten tælles. Resultaterne beregnes som ved fri T4 og 5 udtrykkes i pg/ml.

Frie thvroid hormonprøver

Eksempel 1: 10

Valget af antistoffer til fri T3- og fri T4-analysesystemer blev bestemt ud fra det faktum, at frit hormon er i fysiologisk ligevægt med dets transportproteiner. Denne ligevægt bør opretholdes, når et antistof, som er rettet mod hormonet, tilsættes systemet. Det er 15 væsentligt at udvælge et antistof, som er passende med hensyn til dets affinitetskontant og dets specificitet over for det fri analyt. Disse antistoffer bør også have langsom reaktionskinetik for at undgå, at for tidlig reaktion finder sted inden tilsætning og sammenblanding af alle reaktanter.

20

Til fri thyroxin (T4) blev der udvalgt et antistof med et arbejds-titer eller en fortynding på 1:250.000 (2,0 ng IgG/rør). For at undersøge virkningen af sporingsmiddel binding til antistoffet under tilstedeværelse og mangel på albumin og albumin-blokerende midler, 25 blev der fremstillet antistof-belagte rør under anvendelse af ti tre på 1:250.000 ((2,0 ng IgG/rør) and 1:25.000 (20,0 ng IgG/rør). Maksimumbindinger blev bestemt ved at følge proceduren for fri T4, som beskrevet ovenfor. Resultaterne er angivet nedenfor i tabel 1.

30 35 DK 169365 B1 11

Tabel 1. Fri T4 % B/T

CA Titer; 1:25.000 1:250.000

Sporingsmiddel A 60,8% 63,3% uden CAHSA: ingen nul 5 kalibrator (system fri for albumin)

Sporingsmiddel B 18,1% 2,6% uden CAHSA: 1,0 mg albumin/rør bidraget fra nul kalibratoren 10 (50 /zl)

Sporingsmiddel C 15,0% 1,4% med 1 mg CAHSA/rør: ingen nul kalibrator

Sporingsmiddel D 9,4% 0,7% med lmg CAHSA/rør + 50 μ] nul kalibrator 15 Sporingsmiddel E 39,1% 23,2% med 1 mg CAHSA/rør + 50 /il nul kalibrator + 0,5 mg/ml natriumsalicyl at

Sporingsmiddel F 53,5% 49,2% med 1 ml CAHSA/rør + 20 50 /il nul kalibrator + 5,0 mg/ml natriumsalicyl at

Sporingsmiddel G 51,2% 39,5% med 1 mg CAHSA/rør + 50 /il nul kalibrator + 25 1 mg/ml natriumsal i cylat + 1 mg/ml 2,4-dinitrophenol

Sporingsmiddel H 58,2% 38,6% med 1 mg CAHSA/rør + 50 /il nul kalibrator + 30 25 mg/ml natriumsal i cylat + 0,15 mg/ml 2,4-dinitrophenol 10 mangel på albumin eller et hvert andet protein er binding af 125 35 I-T4-analogsporingsmidlet til antistoffet ved begge antistoftitre af samme størrelse. Under tilstedeværelse af albumin- 2 mg albumin/ rør, bidraget i forening af sporingsmidlet og nul kalibratoren -binder analogsporingsmidlet ikke til antistoffet med høj titer, medens der kun er binding på 9,4% (sporingsmiddel D) til antistof DK 169365 B1 12 med lavere titer. Under tilstedeværelse af kun 1 mg albumin/rør er binding af sporingsmidlerne B og C til antistof med høj titer forsvindende - 2,6¾ henholdsvis 1,4% - hvorimod binding til antistoffet med lavere titer er væsentlig - 18,1% henholdsvis 15,0%.

5

Der kan uddrages følgende konklusioner af disse eksperimenters resultater:

1. Albumin i koncentrationer på 1-2 mg/rør bindes i det væsentlige 10 til sporingsmiddel anal ogen under tilstedeværelse af 2,0 ng IgG

antistof/rør.

2. 2,0 ng IgG antistof/rør har en lavere affinitet end albumin til analogsporingsmidlet.

15 3. Under tilstedeværelse af albuminblokeringsmidler genoprettes binding af mærket T4-analog til antistoffet.

De samme eksperimenter blev også udført for frie T3-analyser. De 20 nedenfor anførte resultater støtter også lignende konklusioner (tabel 2).

25 30 35 DK 169365 B1 13

Tabel 2. Fri T3 % B/T

CA Titer: 1:9.000 1:90.000

Sporingsmiddel A 70,6% 46,3% uden CAHSA: ingen nul kalibrator (system fri for albumin)

Sporingsmiddel B 6,0% 1,0% uden CAHSA: med nul kalibrator (100 μΐ)

Sporingsmiddel C 6,3% 1,2% med 1,0 mg/ml CAHSA/rør: ingen nul kalibrator

Sporingsmiddel D 5,4% 0,9% med 1,0 mg/ml CAHSA/rør + 100 /ti nul kalibrator

Sporingsmiddel E 42,9% 22,5% med 1,0 mg/ml CAHSA/rør + 100 ml nul kalibrator +1,0 mg/ml natriumsalicyl at

Sporingsmiddel F 59,2% 35,0% med 1,0 mg/ml CAHSA/rør + 100 μΐ nul kalibrator + 5 mg/ml natriumsalicyl at

Sporingsmiddel G 46,0% 23,1% med 1,0 mg/ml CAHSA/rør + 100 μΐ nul kalibrator +1,0 mg/ml natriumsalicyl at + 1,0 mg/ml 2,4-dinitrophenol DK 169365 B1 14

Sporingsmiddel H 57,7% 28,5% med 1,0 mg/ml CAHSA/rør + 100 ml nul kalibrator + 25 5 mg/ml natriumsali cyl at + 0,15 mg/ml 2,4-dinitrophenol

Koncentrationen af det antistof, som anvendes i fri hormonanalyse, 10 er således kritisk og må justeres omhyggeligt for ikke at fjerne bundet analyt fra endogene proteiner. Læren ifølge Amersham- og Corning patenterne omtaler ikke de antistofkoncentrationer, som anvendes til bestemmelse af fri T3 og fri T4. På basis af de ovenfor anførte eksperimenter kan det imidlertid antages, at der i frem-15 gangsmåderne ifølge Amersham- og Corning patentet må være anvendt væsentlige højere antistofkoncentrationer for at opnå rimelig binding mellem antistoffet og analogsporingsmidlet, idet der i fremgangsmåderne ifølge patenterne ikke benyttes blokeringsmidler.

20 Eksempel 2:

De fungerende antistofkoncentrationer, som fastsættes på basis af eksempel 1 ovenfor, er 5,5 og 2,0 ng IgG/rør T3-antistof henholdsvis T4-antistof. For at bestemme det passende albuminblokeringsmiddel 25 eller midler til anvendelse i fri T3- og fri T4-analysesystemer, blev de følgende forbindelser sat til analogsporingsmidlerne i de specificerede koncentrationer. (Hvert sporingsmiddel indeholdt også 1 mg/ml kulabsorberet humanserumalbumin). Der blev bestemt maksimal binding for hvert sporingsmiddel. Der blev også tilsat nul 30 kalibrator til hvert sæt maksimum bindingsrør.

Det skal understreges, at rækkevidden af den foreliggende opfindelse ikke er begrænset til de eksempler, som er anført i tabel 3 - 11. De er tilstede her for at vise, at binding af analogsporingsmidler ved 35 de udvalgte antistofkoncentrationer vil forøges med stigende mængder af tilsat albuminblokeringsreagenser, indtil der nås et plateau. Dette viser også, at binding af T3 og T4 mærket analog elimineres ved anvendelse af en passende koncentration af specifikke albuminblokeringsmidler.

DK 169365 B1

Tabel 3. Fri T3 15

2.4-dinitrophenol % B/T

10 mg/ml 1,0% 50 1,4% 100 2,6% 150 4,3% 200 5,3% 400 10,0% 800 16,3% 1000 17,2% 3000 28,2% 3500 27,5% 4000 27,3%

Tabel 4. Fri T3

Oleinsvre % B/T

0,0125 mmol/1 1,2% 0,025 1,3% 0,05 1,3% 0,125 1,7% 0,25 3,5% 0,375 12,5% 0,50 17,6% 0,75 16,0% 1,0 15,5%

Tabel 5. Fri T3 DK 169365 B1 16

natriumsalicvlat % B/T

0,25 mg/rnl 8,8% 0,50 14,0% 1.0 21,3% 2.0 26,7% 5.0 35,8% 10.0 36,7% 20.0 33,3% 25.0 30,4% 30.0 27,8%

Tabel 6. Fri T3

natriumsalicvlat 2.4-dinitrophenol % B/T

1.0 mg/ml 1,0 mg/ml 20,3% 5.0 1,0 29,8% 5.0 8,0 31,6% 5.0 4,0 34,2% 5.0 0,15 33,2% 10.0 0,15 35,0% 25.0 0,15 26,8%

Tabel 7. Fri T4

2,4-dinitrophenol % B/T

10 μg/ml 2,4% 50 4,5% 100 8,0% 150 11,0% 200 13,3% 400 22,9% 800 31,8% 1000 34,1% 1500 41,4% 2000 45,2% 2500 43,5%

Tabel 8. Fri T4 DK 169365 B1 17

oleinsvre % B/T

0,00625 mmol/1 1,7% 0,0125 1,7% 0,025 1,9% 0,0625 2,3% 0,125 3,5% 0,1875 6,8% 0,25 14,3% 0,375 30,5% 0,50 32,7% 0,75 32,9% 1,00 31,0%

Tabel 9. Fri T4

natriumsalicvlat % B/T

0,05 mg/ml 5,3% 0,075 7,2% 0,10 8,5% 0,15 11,7% 0,25 15,6% 0,50 22,0% 1.0 28,3% 2.0 37,3% 5.0 46,0% 10.0 45,4% 20.0 45,0% 25.0 44,0% 30.0 40,0% DK 169365 B1 18

Tabel 10. Fri T4

natriumsalicvlat 2,4-dinitrophenol % B/T

1.0 mg/ml 1,0 mg/ml 44,1% 5.0 1,0 49,8% 5 5,0 0,8 48,1% 5.0 0,4 48,2% 5.0 0,15 46,4% 10.0 0,15 48,8% 25.0 0,15 42,6% 10

Eksempel 3:

Det følgende forsøg blev designet til at vise, at albumin ikke har nogen effekt på fri T3- og fri T4-analysesystemer.

15 10 prøver - 5 fra normale individer og 5 fra kvinder i graviditetens 3. trimester - blev hver delt i 4 lige store dele. Til 3 af disse dele blev der tilsat frysetørret kul-absorberet humanserumalbumin i koncentrationer på 10, 20 og 50 mg/ml. De 4 lige store dele blev 20 derpå behandlet i 2 eksemplarer, som beskrevet ovenfor, i fri T3- og fri T4-analyser, under anvendelse af 4 forskellige sporingsmidler. Gennemsnitsværdien for hver albuminkoncentration (N = 5) blev derefter afbildet for hvert sporingsmiddel (fig. 1-16). For fri T3 og fri T4 var sporingsmidlerne som følger: 25

Tabel 11. Fri T4 Sporinosmidler Sporingsmiddel I indeholder 0,5 mg/ml natriumsalicyl at

Sporingsmiddel II indeholder 1 mg/ml natriumsalicyl at og 1 mg/ml 30 2,4-dinitrophenol

Sporingsmiddel III indeholder 5 mg/ml natriumsalicylat

Sporingsmiddel IV indeholder 25 mg/ml natriumsalicylat og 0,15 mg/ml 2,4-dinitrophenol 35 Tabel 12. Fri T3 Sporinosmidler

Sporingsmiddel I indeholder 1 mg/ml natriumsalicylat

Sporingsmiddel II indeholder 1 mg/ml natriumsalicylat og 1 mg/ml 2,4-dinitrophenol

Sporingsmiddel III indeholder 5 mg/ml natriumsalicylat DK 169365 B1 19

Sporingsmiddel IV indeholder 25 mg/ml natriumsalicyl at og 0,15 mg/ml 2,4-dinitrophenol.

Det er tydeligt ud fra udfaldet af disse forsøg, at resultater, som 5 er frembragt af sporingsmidlet IV for både fri T3 og fri T4, er u-påvirket af al bumi nti Isætning på op til 5,0 g/dl til en total albumi nkoncentration på ca. 8,0 g/dl.

Eksempel 4: 10

For at bestemme hvor vidt thyroidbindeglobulin (TBG) vil binde de mærkede fri T3- og fri T4~analogsporingsmidler, blev følgende forsøg udført under anvendelse af sporingsmidlet IV fra eksempel 3. TBG-harpiks, som var fri for al tilsyneladende T4 og T3, blev sat 15 til den respektive nul kalibrator til hver fri T4 og fri T3-analyse i de nedenfor specificerede koncentrationer. De observerede procent-bundne værdier (B/Bq) er vist i følgende tabel.

20 Tabel 13 % B/Bo FT4 FT3 nul kalibrator 100% 100% + 10 mg/ml 95% 99% 25 + 20 mg/ml 96% 99% + 50 mg/ml 94% 95%

Eksempel 4a: 30 Dette forsøg var designet til at afprøve virkningen af albumintilsætning til nul kalibratoren under anvendelse af sporingsmidlet IV fra eksempel 3. Humanserumalbumin blev kul absorberet for at fjerne alt tilsyneladende T3 og T4 og blev sat til den respektive nul kalibrator for hver fri T3 og T4 i de angivne koncentrationer.

35 Igen blev procentbundne værdier kontrolleret.

DK 169365 B1 20

Tabel 14 % B/Bo

Eli FT3 nul kalibrator 100% 100% 5 +10 mg/ml 97% 97% + 20 mg/ml 98% 100% + 50 mg/ml 95% 95%

Det fremgår tydeligt af eksemplerne 4 og 4a at hverken albumin eller 10 TBG binder analogsporingsmidlerne under de specificerede forhold.

Eksempel 5:

Ved høje koncentrationer er sulfobromphthalein - en farve som er i 15 stand til at bindes til albumin - i stand til at fjerne T3 og T4 fra albuminmolekylet. Sulfobromphthalein er i lave koncentrationer uvirksomme i blokering af T3 og T4 analogsporingsmidler fra binding til albumin. En iodineret T4-analog blev blandet, som beskrevet ovenfor, og delt i 5 lige store dele. Til hver del blev sat følgende 20 reagenser.

Tabel 15

Sporingsmiddel 1 25 mg/ml natriumsalicyl at + 0,15 mg/ml 25 2,4-dinitrophenol (w/v)

Sporingsmiddel 2 0,25 mg/ml sulfobromphthalein

Sporingsmiddel 3 0,5 mg/ml sulfobromphthalein

Sporingsmiddel 4 1,0 mg/ml sulfobromphthalein

Sporingsmiddel 5 1,0 mmol/l oleinsyre.

30

Hvert sporingsmiddel blev anvendt i en seperat analyse til bestemmelse af fri T4 i 20 prøver under identiske forsøgsforhold.

Under betragtning af sporingsmiddel 1 som reference og under 35 sammenligning af de andre med denne blev der opnået følgende resultater.

DK 169365 B1 21 s« in co #» i- 00

0) ID

Ό O CO 1 CO Cd O f"'

ti CO 55 $5 O' „ _r _r _T

•r O in *3- £T> 00 t-HOO o g f> »> »t »*

(/> O O O O CM

σ id co i co c •r- ί ο

Q

CO

M- 'φ .

-o r—I M" -Q »* M" CO O C·^ •i- in o »·>» * £ UD I— I—I CM O O ·“<

M CO 55 55 OI

D co m σ» > ·>- in o r»» o co 5- in cm i ~ o co o co oo co i—

CO 01 SS

r-, -S CO CO CM

Ό CO *· r-l CO O ·“

I— -I— —I p·» CT> „ r, r. I—I

tu εσ>δ$δ5σ> esjoo jo w in co co σι · ro σ i— c oo o co o i-t r~ in CM I *

S- CO

o co o

CO

CM

"φ SS

Ό 'ΓΓ' "Ο *» ^ ε cm co ^ Μ 00 55 55 θ' · c σ >—ι ιο ι-- σ» *£ ΤΙ C ~ ~ ~ «d- COCMO ιο «ο •r-σιοοοο - ---- ~ S. ιη ·—< co ι—ιοο ο Φ ο co +> ο Τ ^ * 0) c f—ι ΛΓ~ r— -D 00 +f 5 co ®

g= CO

co to h·*. 1 *— υ

Cf-HLOcocr> co \ o co o co •I- Λ ·> *» c* »> 0¾ *» r. ·*. ^ * S- CO O CO O LO COJOO ·—« ^ O LO CO I CO 5 q S- r— -ac.

(/) r— (D Ό J2

t *—* Ό -P 4- \ C

(/) q \ ^ <ΰ W O

σ> oo a> c , c TT

c ^ c = . -¾ -r- 00 CL *r— S- fu o L ^ Ο CO) r- c_) η) rx 0¾ co > a) x s-ajcnc ,— co o m "σ ι -ι- φ s- »r <o cn co sz ·γ- ·<β S- σ o. ο +J Ζ Ζ S- I— S— 1—I S 55 55 55 C ^ o me*· -X o o σ φ o i— 6?sS i^oo m cm in co cdcm x

Tabel 17. Regressioner DK 169365 B1 22

Sporingsmiddel 2 = 0,42 Sporingsmiddel 1 + 1,17 r = -0,4914 Sporingsmiddel 3 = 0,81 Sporingsmiddel 1 + 0,14 r = 0,945 5 Sporingsmiddel 4 = 1,52 Sporingsmiddel 1-0,36 r = 0,956

Sporingsmiddel 5 = 0,11 Sporingsmiddel 1 + 0,51 r = 0,268

Resultaterne fra anvendelse af sporingsmiddel 3 med 0,05% sulfo-bromphthalein korrelerer signifikant med de, som opnås under anven-10 del se af sporingsmidlet 1. De resultater, som frembringes under anvendelse af sporingsmiddel 3, er imidlertid ca. 20% lavere, end de som frembringes under anvendelse af sporingsmiddel 1. Selvom sporingsmiddel 4 korrelerer godt med sporingsmiddel 1, giver det signifikant højerer fri T4-værdier formodentlig på grund af fri-15 givel se af albuminbundet T4 ved den høje sulfobromphthalinkoncen tration (0,1%).

Den oleinsyre, som er tilsat sporingsmidlet 5, er i stand til at fjerne analogsporingsmidlet fra albumin. Imidlertid viser 20 patientdata, som er frembragt med dette sporingsmiddel, dårlig korrelation med data, som er frembragt med sporingsmidlet 1, givet oleinsyre i denne koncentration. Høje koncentrationer af oleinsyre i sporingsmidlet - koncentrationer på større end 1,0 mmol/1 - fjerner bundet umærket T4 fra albumin.

25

Eksempel 6:

For at undersøge virkningerne af ikke esterificerede frie fede syrer på fri T4- og fri-T3 analysesystemer blev patientprøver delt i lige 30 store dele, frysetørret og derpå genfortyndet med forskellige koncentrationer af oleinsyre i destilleret vand. De genfortyndede prøver blev analyseret for fri T3 og fri T4 i overensstemmelse med den ovenfor beskrevne procedure under anvendelse af samme fire sporingsmidler, som beskrevet i eksempel 3. De resultater, som er 35 angivet i tabel 18, indicerer klart, at sporingsmiddel 1 til fri T4 hovedsagelig er bundet til albumin, og at tilsætning af oleinsyre fjerner sporingsmidlet fra albumin og frembringer derved falske lave fri T4-resultater. Sporingsmidlerne II og III er også bundet til albumin men i en meget mindre grad. Sporingsmidlet IV er imidlertid DK 169365 B1 23 i det væsentlige upåvirket af albumin som vist i eksempel 3; desuden har oleinsyre ingen signifikant virkning på fri T4-værdier.

Resultaterne af fri T3 svarer til de for fri T4, idet de viser, at 5 sporingsmidlet IV i det væsentlige er upåvirket af ikke esterifi-cerede frie fede syrer, hvilket igen bekræfter de resultater, som blev opnået i eksempel 3.

10 15 20 25 30 35 DK 169365 B1 24 CO ΓΟ CO LO r—1 *J- r- ϊ' || i—i in in in in in c 'tu Ό

XJ

•r·

B

in o h w s n w ^ ta- S M ** #**»♦»*» || •r-»—i^· ro ta- «a- ta- c ί ο

Q

CO

ί ο s-

> CO

«ο i— to cm m 03 o co C i-* *· — — — — I!

•r- -r- HH in CO CM CM CO C

CD i- i— Ll_

O

n-

CO

O CO ti· N CSI CO CO

C fv «» «« #» ||

»—ILO N CsJ fO CO C

c i- > « co ta- co co co cm *a-

i—i > — ---- II

HH i—1 ι-H i—1 i—H i—t C

*Φ

JO

te f— i—

CD

Ό Ό

•H

£ i—l ι-H t—l i—I CM taco HH — — — — — II

O HH i—H i—Η »-H i—Η i—H C

C

•Γ- ί- Ο

Q

CO

ta- l— o <n σι os n co

HH — - II

Γ— HH r—i O O O O C

S-LL.

hh μ ta- to co ta- — — — — — ro

pH O O O O II

IH C

N o CO r— O LO - c: - o - - o o cm ε in c- hh CC + £ + + + DK 169365 B1 25

Eksempel 7:

For at vise, at de resultater, som frembringes ved den fri T4-analyse, som beskrevet ovenfor, er upåvirket af graviditet og 5 ikke-thyroidal sygdom, blev 185 euthyroide prøver analyseret under anvendelse af sporingsmiddel IV, som er beskrevet i eksempel 3 ovenfor, og sammenlignet med 25 graviditetsprøver for 1.trimester og 49 fra 3.trimester samt 14 prøver fra patienter med ikke-thyoroidal sygdom. Resultaterne, som er anført i tabel 19 og fig. 17-20, viser, 10 at der ikke er nogen statistisk eller klinisk signifikante forskelle i fri T4-værdier under graviditeten eller ikke-thyroidal sygdom i sammenligning med en euthyroid population.

Dette bekræfter igen det faktum, at når der anvendes passende 15 albuminblokeringsreagenser, så er den fri T4-analyse uændret af in vivo forandringer i albuminkoncentrationer.

Tabel 19. Fri T4

20 95% Median N

Euthyroide 0,8 - 2,0 1,3 185

Graviditet 1. trimester 0,9 - 2,2 1,5 25 25 3. trimester 0,7-2,1 1,5 49 NTI 0,8 - 1,9° 1,2 14 0 Absolut område

Fri testosteron 30

Det er almindeligt anerkendt fra hidtil kendt teknik, at steorid-molekyler binder til deres naturlige bindemidler gennem molekylets A og/ eller B-ring. Se Forest, M., et al og referencer deri (Free and bound steroids in plasma: methodology and physiopathological impli-cations, i: Physiological Peptides and New Trends in Radioimmunolo-gy, C.A. Bizollon, ed., Amsterdam: Elsevier /North-Holland Biochemical Press, 1981, 249-266), Kemisk ændring af A og/eller B-ringen vil inhibere de fleste steroider - inklusiv testosteron, progeste-ron, oestradiol, cortisol o.s.v. - fra binding til endogene bindemidler. Testosteron blev udvalgt som et representativt medlem DK 169365 B1 26 af denne familie. En testosteronanalog, 6-hydroxytestosteron-19-carboxymethyletherhistamin, blev syntetiseret og radioaktivt mærket med iod 125 ved traditionelle metoder. Dette analogsporingsmiddel blev efterfølgende blandet i 0,01M HEPES-puffer, pH = 7,4, indehol-5 dende 1 mg/ml kul absorberet humanserum-albumin og 0,01% natriumacid.

Der blev tilsat blokeringsmidler, som beskrevet i de specifikke eksempler nedenfor.

Antistoffer til testosteron blev produceret i kaniner under an-10 vendel se af testosteron-19-carboxymethylether-kvægserumalbumin som antigen og immobiliseret på indersiderne af 12x75 mm polyprophylen-rør mm/rør, som beskrevet ovenfor for fri T4 og fri T3. Fri testosteronkali bratorer, som er fremstillet ved at tilsætte forskellige mængder testosteron til humanserum fri for alt tilsyneladende tes-15 tosteron, blev kalibreret ved direkte ligevægtsdialyse og givet fri testosteronværdier i pg/ml. Til analyse af fri testosteron afpippe-teres 50 ml kalibrator eller patientprøve i antitestosteron antistofbelagte rør fulgt af tilsætning af 1,0 ml i odi behandl et 6-hydroxy-testosteron-19-carboxymethyletherhi stami nanal og. Rørene 20 inkuberes i 4 timer ved 37°C, dekanteres derpå og radioaktiviteten tælles. Resultaterne beregnes ved interpolation fra kalibreringskurven.

Eksempler nå fri testosteron 25

Eksempel 1: For at undersøge virkningen af blokeringsmidler på fri testosteronresultater blev 20 prøver undersøgt for fri testosteron ved anvendelse af iodbehandl et analog - blandet som beskrevet ovenfor -både med og uden sulfobromphthaelin (SBP) samt med 30 forskellige mængder af natriumsalicyl at, 2,4-dinitrophenol (DNP) og 8-anilin-l-naphthalensulfonsyre (ANS). Gennemsnitsværdier for hvert sporingsmiddel i pg/ml er anført nedenfor.

35 DK 169365 B1 27

o cT o * 00 ^ ' cvj Z h- O

4· lo

i—H rH

O LU U_ r. '-* 1 rt 1/1 O) 00 z + < CO Φ

rH rH

ro lu ixi r. Q_ o z «o- m Q r λ + co ro

r*H i—I

IT) '---> *· i—i Q_ Ω Ω - z '— —· O Q to 00 + O Ot

rH

O 4-> CU «0 »

I— >5 O O

O) O U —" —1 2 3 4 5 X) r-1 ·- CO «*· ΠΪ I— r r I— + tO H3- «0- 00 +->

CO

>) —> CJ r-r. ^

-I- 00 CO

tO O i—t m oo ~ ro ro

4* fH rH

i- ^ ^ ® < < \ cn t o> ·. ·» E r-~

CD

-o 2

"O

3 •1“ £ V) Q.

Di CQ CL

C 00 CQ

4 •r- 00 5 c

O CD TJ

Q. "O CD OO DE

DK 169365 B1 28

Nedenfor er angivet regressionsligninger mellem korresponderende sporingsmidler.

Tabel 21 5 A = 1,14 A' - 0,21 r = 0,991 B = 1,00 B7 - 0,11 r = 0,997 C = 1,02 C' - 0,31 r = 0,998 D = 1,11 D' - 0,30 r - 0,996 10 E - 1,03 E7 - 0,52 r = 0,997 F = 1,13 F' - 0,05 r = 0,996 G = 1,19 G' - 0,26 r = 0,997 A'= 2,76 F7 - 2,70 r = 0,966 A7= 2,34 G7 - 1,58 r = 0,987 15

Det fremgår af ovennævnte eksempel, at mangel på sulfobromphthaelin vil forøge tilsyneladende fri testosteronniveauer med 14%, idet sulfobromphthaelin inhiberer binding af analogsporingsmidlet til albumin uden at fjerne det testosteron, som er bundet til albumin.

20 Det fremgår også, og dette er af stor betydning, at salicylat, 2,4-dinitrophenol og ANS fjerner testosteron fra albumin og/ eller SHBG og derved forøger tilsyneladende fri testosteron som målt ved denne fremgangsmåde.

25 Eksempel 2:

For at kontrollere virkningen af analogsporings midlet i den fri testosteronanalyse blev iodbehandlet 6-hydroxytestosteron-19-car-boxymethyl etherhistamin (analogsporingsmiddel) sammenlignet med 30 iodbehandlet testosteron-19-carboxymethyl etherhistamin (regulært sporingsmiddel) i analysei for fri testosteron i patientprøver.

Sporingsmidlerne blev blandet med 10 mg/ml sulfobromphthaelin som beskrevet ovenfor. For at opretholde tilsvarende sensitivitet blev 35 der udført justeringer for hvert sporingsmiddel i den antistof mængde, som immobil i seredes på indersiden af propylenrørene.

20 patientprøver blev analyseret ved at følge den allerede beskrevne procedure for fri testosteron under anvendelse af de to DK 169365 B1 29 sporingsmidler, som er nævnt ovenfor. De gennemsnitlige fri testosteronværdier i pg/ml og regressionsligningen er anført nedenfor.

5 10 15 20 25 30 35 DK 169365 B1 30

M

ml

cvjI

i—h| c

E

Π3

+J

tO

•i~ r^.

-£= CQ

i cn o tn » —i o I Γ".

C r*H II

O

i- S- <u

+J

to 0

+J

to

<D

4- >

CVJ

Csl ·—1| ml

r— CM

<U *-H|

JO I

« C

I— -r- ε « to M"

r- CM

-C

1 i—t CT> λ —I < + c: co o o

5- CO

aj t—i *t·

4-> rH

to t—I

o

+> II

to

Q) C

+-> :>

X

o s.

•Ό ·>

SI

to o CM I— II 0) c tJ —

"O

•i- -P

E ·-to C O to = E

•r- Q) i. C o c a tu to] tn DK 169365 B1 31

Resultaterne indicerer klart, at 6-hydroxytestosteron-19-his- 125 tamin- I-analogsporingsmidlet ikke binder til endogene binder, 125 medens testosteron-19-histamin- I-sporingsmidlet gør og derved giver ca 50% højerer fri testosteronværdier i sammenligning med 5 analogsporingsmidlet under identiske forsøgsforhold.

Eksempel 3:

For at undersøge virkningen af sexhormonbindingsglobul inniveauer 10 (SHB6) på det fri testosteronanalysesystem blev en kul absorberet humanserumpulje tilsat 400 mg SHBG/ml, et niveau, som er ca. 10 gange det normale. Den SHBG-tilsatte pulje viste, når den blev analyseret ifølge fri testosteronproceduren, en procentbunden værdi på 99% B/Bq.

15

Idet kul absorbtionen fjerner testosteron fra serumpuljen, bør den have en fri (og total) testosteronkoncentrationer på nul -d.v.s. procentbundne værdier på ca. 100% B/Bq - både før og efter tilsætning. Resultaterne viser som ønsket, at analogsporingsmidlet, 6- 125 20 hydroxytestosteron-19-histamin- I, ikke binder til selv høje SHBG niveauer.

Eksempel 4: 25 For at undersøge virkningen af forhøjede albuminniveauer på fri testosteronproceduren, blev tre frysetørrede prøver genopløst med vandige opløsninger indeholdende 0, 1,0, 2,0 og 3,0 g/dl kul absorberet humanserumalbumin. Alle prøver blev undersøgt sideløbende under anvendelse af samme sporingsmiddel som i eksempel 3 med 30 følgende resultater.

35

Tabel 23 32 DK 169365 B1

Prøve Ikke tilsat Tilsat Albumin fg/dll 1.0 2,0 3,0 5 1 4,7 4,4 4,2 3,9 2 16,7 16,4 16,7 15,8 3 37,0 37,0 34,2 34,0 10 Gennemsnit 19,5 19,3 18,4 17,9

Genvundet - 99% 94% 92% 15 Resultaterne viser, at der ikke er nogen klinisk signifikant virkning på grund af selv meget stor stigning i albuminniveauet. Bemærk at prøver, som er tilsat 3,0 g/dl, repræsenterer et meget højt albumininhold i størrelsesordenen 7 g/dl.

20 Eksempel 5:

Adskillige patientprøver blev analyseret ifølge fri testosteronproceduren under anvendelse af samme sporingsmiddel som i eksempel 3 både før og efter kul absorbtion. Nedenfor er vist fri 25 testosteronkoncentrationer (i pg/ml) før kulabsorbtion og procent- bundneværdier (%B/Bq) efter kul absorbtionen.

Tabel 24 30 Normale mænd Normale kvinder 3. trimester før efter før efter før efter 21,24 96% 0,80 105% 4,75 99% 14,33 98% 2,32 104% 9,10 96% 19,91 99% 1,73 104% 3,58 96% 35 21,03 98% 3,47 104% 4,44 97% 15,01 95% 1,93 105% 3,86 96%

Resultaterne viser som ønsket at trækul absorbtion væsentligt reducerer tilsyneladende fri testosteronindhold i patientprøver målt DK 169365 B1 33 ved en analogprocedure til nul, d.v.s. procentbundneværdier på ca. 100% B/Bq. Idet kul absorbtionen fjerner testosteron sammen med andre steroider og små molekyler fra serumprøven medens den lader større molekyler, såsom albumin, SHB6 og andre bindingsproteiner tilbage, 5 hjælper dette forsøg til at bekræfte, at fri testosteronanalog- proceduren ikke som sådan influeres af transportproteinernes niveau.

Eksempel 6: 10 Idet ikke-esterificerede frie fede syrer (NEFA) har en højere associationskonstant til albumin end testosteron, bør tilsætning af NEFA fjerne fri testosteron fra albumin. Dette blev bekræftet ved et forsøg, i hvilket forskellige oleinsyremængder blev sat til hver af tre patientprøver. Virkningerne på tilsyneladende fri testosteron-15 niveauer er vist i tabel 25.

Tabel 25

Oleinsyre 20 tilsat Patient 1 Patient 2 Patient 3 Gennemsnit 0 mmol/1 6,2 3,3 10,0 6,5 2.5 7,3 4,7 11,6 7,9 5,0 111,6 11,1 21,8 14,8 7.5 21,2 16,0 32,3 23,2 25 10,0 30,3 17,9 47,8 32,0 30 35

Claims

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af koncentrationen af fri ligand i en biologisk væske i nærværelse af bundet ligand og endogene 5 bindingsproteiner uden at forstyrre ligevægten mellem fri ligand og proteinbundet ligand, kendetegnet ved: a) at en prøve af den biologiske væske inkuberes med: 10 i) et ligandanalogsporstof, som på grund af sin kemiske struktur ikke binder til nogle af de endogene bindingsproteiner, ii) en specifik ligandbinder med en affinitetskonstant på 5 15 mindst ca. 5 x 10 1/mol, og i i i) mindst ét specifikt kemisk inhiberingsreagens, som hæmmer binding af ligandanalogsporstoffet til andre endogene bindingsproteiner, hvilket specifikt kemisk inhiberings- 20 reagens forekommer i en koncentration, som er tilstræk kelig til at fortrænge ligandanalogsporstoffet fra mindst ét andet endogent bindingsprotein uden at fortrænge den naturlige ligand fra de endogene bindingsproteiner, 25 b) at det til den specifikke binder bundne ligandanalogsporstof adskilles fra ubundet sporstof, og c) at koncentrationen af fri ligand i den - biologiske væske bestemmes. 30

2. Fremgangsmåde til bestemmelse af koncentrationen af fri ligand i en biologisk væske i nærværelse af bundet ligand og endogene bindingsproteiner uden at forstyrre ligevægten mellem fri ligand og proteinbundet ligand, kendetegnet ved: 35 a) at en prøve af den biologiske væske inkuberes med: i) et ligandanalogsporstof, som på grund af sin kemiske struktur ikke binder til nogle af de endogene DK 169365 B1 bindingsproteiner, ii) en specifik ligandbinder med en affinitetskonstant på 5 mindst ca. 5 x 10 1/mol, og 5 i i i) specifikke kemiske inhiberingsreagenser, som alene eller i kombination hæmmer bindingen af ligandanalogsporstoffet til andre endogene bindingsproteiner, hvilke specifikke kemiske inhiberingsreagenser forekommer i en koncentra-10 tion, som er tilstrækkelig til at fortrænge ligandana logsporstoffet fra mindst ét andet endogent bindings-protein uden at fortrænge den naturlige ligand fra de endogene bindingsproteiner, 15 b) at det til den specifikke binder bundne ligandanalogsporstof adskilles fra ubundet sporstof, og c) at den bundne fraktion i denne prøve sammenlignes med den bundne fraktion i et givet sæt af fri ligandkalibratorer til 20 bestemmelse af koncentrationen af fri ligand i den biologiske væske.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, k e n d e t e g n e t ved, at det kemiske inhiberingsreagens er 2,4-dinitrophenol i en koncentration 25 på 5-10 mmol/1.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, k e n d e t e g n e t ved, at det kemiske inhiberingsreagens er natriumsalicyl at i en koncentration på 40-125 mmol/1. 30

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det kemiske inhiberingsreagens er sulfobromphtalin i en koncentration på fra 0,8 x 10"5M til 1,6 x 10‘5M.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, k e n d e t e g n e t ved, at det kemiske inhiberingsreagens er oliesyre i en koncentration på 0,4-0,8 mmol/1.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den DK 169365 B1 fri ligand er testosteron. 5 10 15 20 25 30 35