FI92878B - Menetelmä vapaiden ligandien mittaamiseksi biologisissa nesteissä - Google Patents

Description

, 92878

Menetelmä vapaiden ligandien mittaamiseksi biologisissa nesteissä. - Förfarande för mätning av fri ligander i biologiska vätskor.

"asapainodialyysitekniikat olivat useita vuosikymmeniä ainoa käytettävissä oleva menetelmä vapaiden hormoonien mittaamiseksi seerumissa, ja viime aikoihin asti ainoita luotettavaksi katsottuja menetelmiä.

Tässä yhteydessä on tasapainodialyysimenetelmiilä useita haittoja, mukaanlukien huono tarkkuus, aikaavievyys jne.; mutta ennen kaikkea niiden tulokset riippuvat voimakkaasti käytettyjen merkkiaineiden puhtaudesta.

Ellis ja Ekins, R. (Acta Endocr. (Kbtf.) Suppl. 177:106, 1973), julk;isivat suoran menetelmän vapaiden hormonien määrittämiseksi artikkelissaan "Direct Measurement By Radioimmunoassay of the Free Thyroid Hormone Concentration in Serium." Tämä merkitsi huomattavaa parannusta tasapainodialyysimenetelmiin verrattuna, koska se mahdollisti seerumidialysaateissa olevien vapaiden ligandien määrän suoran mittaamisen RIA-menetelmallä (radioimmunoassay), millä kierrettiin merkkiaineiden puhtaudesta johtuva ongelma. Monet pitävät nykyään tätä menetelmää vapaiden hormonien mittausten referenssimenetelmänä. Se on kuitenkin yhä aikaavievä ja tekijästä riippuvainen, eikä se sovi kaikkein pienimpiin laboratorioihin.

: Epäsuoriin menetelmiin, joilla määritetään vapaiden hormonien konsen- traatiot, ja jotka tuotiin esiin lyhyen ajan kuluttua tämän jälkeen, kuuluvat SHBG-suhde (testosterone/steroid hormone binding globulin), TBG-suhde (thyroxine (T4)/thyroid binding globulin), vapaa T4-indeksi (perustuu trijodityroniinin (T3)äoton ja T4:n tulon) ja vapaa androgeeni- indeksi .

Ekins, R. (Free Thyroid Hormones; Proceedings of the International Symposium held in Venice, December 1978, Amsterdam: Ecerpta Medica, 1979 72-92), toi esiin käsitteen "suorat dynaamiset menetelmät", joissa käytetään anti-vapaata ligandin vasta-ainetta suorassa kosketuk- 2 92S78 sessa biologisen nesteen kanssa dialyysin aikana. Tämä muodostaa perustan nk. "immunouuttomenetelmille".

Eräs tällainen menetelmä on esitetty US-patentissa 4,046,870, jossa kahden koeputken immunomääritysmenetelmä mittaa T4:n siirtymisnopeu-den sitomisproteiinei^ta T4-spesifiseen vasta-aineeseen. Tällä menetelmällä on useita analyyttisiä ja kliinisiä puutteita, jotka tekevät sen käytännöllisesti katsoen vain toiseksi vapaa T4-indeksimäärityk-seksi.

Clinical Assays (Cambridge, MA 02139) esiintuoma toinen menetelmä oli todellinen immunouuttomenetelmä. Siinä käytettiin yhden koeputken kaksivaiheista, peräkkäin tapahtuvaa (takaisintitraus) tekniikkaa.

Tässä menetelmässä inkuboidaan seeruminäytettä immobilisoidun vasta-aineen kanssa; pesuvaiheen jälkeen immobilisoidun vasta-aineen vapaat kohdat "takaisintitrataan" käyttämällä leimattua ligandia. Tässä tavassa seerumi ei ole milloinkaan kosketuksessa leimatun ligandin kanssa. Vaikkakin menetelmä on teoreettisesti terve, sillä on haittana heikko herkkyys ja tarkkuus, ja kummatkin reaktiot vaativat tarkkaa ajoittamista.

Yksivaiheiset immunouuttomenetelmät, joilla määritetään vapaan ligandin konsentraatiot biologisissa näytteissä, olivat ilmeinen seuraava vaihe vapaiden ligandien määritysjärjestelmien kehittämisessä. Nämä menetelmät perustuvat pikemminkin fysikaaliseen kuin kemialliseen leimatun ligandin erottamiseen endogeenisistä sideaineista. Tämän tavoitteen saavuttamiseksi voidaan soveltaa useita tapoja, joita on seuraavassa esitetty yksityiskohtaisesti.

Tekniikan tason mukaista on, että muuttamalla kemiallisesti tietyn ligandin rakennetta alennetaan tai pienennetään sen sitoutumista endogeenisiin sideaineisiin. Tämä on runsain mitoin osoitettu steroidi-hormooneille. (Kts. jäljempänä oleva tarkastelu vapaista testosteroneista). Ross, J.E. ja Tapley, D.F. (Effect of various analoques on the binding of labeled thyroxine to thyroxine-binding globulin and prealbumin, Endocrinology 79:493, 1966), ovat kilpirauhashormonien 11 3 92878 tapauksessa osoittaneet, että TBG:n sitoutuminen (thyroid binding globulin) T4:än estyy, jos T4-molekyylin 3'-kohtaan tehdään jokseenkin isokokoinen substituutio. Schall, R.F., et ai (An enzyme-labeled immunoassay for the measurement of unsaturated thyroid hormone binding capacity in serum and plasma, Clin. Chem. 25:1978 (abstract) 1979), ja Kleinhammer, G., et al (Enzyme immunoassay for determination of thyroxine binding index, Clin. Chem. 24:1033, 1978), osoittivat lisäksi toisistaan riippumatta, että TBG ei sitoudu konjugaatteihin, jotka on muodostettu leimaamalla T4-piparjuuriperoksidaasilla. Tämä seikka muodostaa perustan US-patentissa 4,410,633 (Corning Glass Works) kuvatulle yksivaiheiselle immunouuttomenetelmälle, jossa mitataan vapaa tyroksiini ja vapaa 3,5,3-trijodityroniini ja jossa piparjuuriperoksidasi on kemiallisesti kiinnitetty T4:än ja T3:een ja jälkimmäinen on leimattu radioaktiivisesti.

Tekniikan tason mukaisesti on lisäksi esitetty, että T3 ja T4 vaativat seuraavan molekyylirakenteen, jotta sitoutuminen endogeenisiin sitoviin proteiineihin olisi maksimaalista, viz. TUG, TBPA (thyroid binding pre-albumin), albumiini, Snyder, S.M, et ai (Binding of thyroid hormones and their analogues to thvroxine-globulin in human serum, .1. Biol. Chem. 251:6489, 1976); Sterling, K., et al ((Equilibrium dialysis studies of the binding of thyroxine by human serum albumin, J. Clin. Invest. 41:1021, 1962): 1. L-alaniini-sivuketjukonfiguraatio; 2. 4'-hydroksyyliryhmän mukanaolo (pääasiallisesti TBPA- ja albumiini-sitoutuminen); ja 3. Kahden (halogeeni) substituentin mukanaolo sisemmässä ja ulommassa renkaassa (asemat 3,5,3' ja 5').

Useita satoja T3- ja T4-analogeja on syntetisoitu ja niistä on tutkittu niiden kyky sitoutua kilpirauhashormonia sitoviin proteiineihin.

US-patentissa 4,366,143 ja sen eurooppalaisessa vastineessa, patentissa n:o 00 26 103, on laajalti kuvattu tällaisten analogien käyttö 4 92878 merkkiaineina yksivaiheisessa immunouutossa käyttämällä vapaiden hormonien mittaamiseen vasta-aineen samanaikaista titraamista peräkkäisen titraamisen asemesta. (Yksinkertaisuuden vuoksi käytetään näistä patenteista yhdessä jäljempänä nimitystä "Amersham"-patentti).

T4:n ja T3:n optimaalinen sitoutuminen TBG:en vaatii ehjää alaniini-sivuketjua: Alaniinisivuketjussa oleva aminoryhmä on oleellinen komponentti. Amersham-patentissa kuvatut analogit ovat T3- ja T4-molekyylejä, joita on modifioitu alaniinisivuketjussa. Vaikkakin nämä analogit eivät teoriassa sido TBG:tä missään merkittävässä määrin, ne epäilemättä sitovat merkitsevästi albumiinia ja TBPA:ta, koska T3- ja T4-molekyylien 4'-hydroksyyliryhmä on yhä ehjä. On hyvin osoitettu, että albumiinin ja TBPA:n sitoutuminen tyroniineihin on kvantitatiivinen, erityisesti fysiologisissa olosuhteissa, Sterling, K. (Molecular structure of thyroxine in relation to its binding by human serum albumin, J. Clin Invest. 43:1721, 1964), ja Pages, et al (Binding of thyroxne and thyroxine analogs to human serum prealbumin, Biochem 12:2773, 1973).

Koska Amersham-patentissa ei ole oivallettu albumiinin ja TBPA:n tyroniineihin sitoutumisen tärkeyttä, tämän patentin tiedot eivät riitä vapaan T3:n ja vapaan T4:n todelliseen mittaamiseen biologisissa nesteissä. Itse asiassa kaupallisesti saatavissa olevat, patenttiin perustuvat reagenssit antavat vapaasta hormonista tuloksia, jotka ovat harhaanjohtavia ja epätarkkoja. Näin on asianlaita erityisesti vaikeissa patologisissa tiloissa, joille on tunnusomaista merkittävät vaihtelut kiertävän albumiinin määrässä.

Viime aikainen kirjallisuus on osoittanut, että albumiinin konsentraatio korreloi suoraan Amersham’in määrityssysteemin muodostamien vapaan T4:n konsentraatioiden kanssa. Lisäksi on hyvin dokumentoitu, että raskauksien viimeisellä kolmanneksella ja potilailla, joilla on vaikea non-thyroidal-sairaus, Amersham'in menetelmä antaa johdonmukaisesti virheellisellä tavalla pienentyneitä tuloksia vapaasta T4:stä.

Sen sijan menetelmä antaa väärällä tavalla kohonneita vapaan T4:n määriä perheettäisessä dysalbumineemisessä kilpirauhasen liikatoimin- il 5 92878 nassa, so. tilassa, jossa T4 on epänormaalisti sitoutunut kiertävään albumiiniin.

Raskauden aikana albumiinia kiertää normaalia alhaisemmat määrät, erityisesti kolmannen kolmanneksen aikana. Koska Amersham'in leimattu analogi T4-merkkiaine sitoo merkittävästi (yli 99 %) albumiinin ja TBPA:n, Amersham'in määrityssysteemin olettaisi antavan normaalia alhaisempia vapaan T4:n määriä kolmannen kolmanneksen aikana: T4-vasta-aineen sitomiseen on käytettävissä enemmän analogi-merkkiainetta, jolloin seurauksena on suurempi sitoutuminen ja alhaisempi näennäis-annos .

Esteröitymättömät vapaat rasvahapot kykenevät siirtämään leimatun analogin albumiinista; lisäksi niitä kiertää normaalia korkeampia konsentraatioita raskauden aikana. Tämä saattaa selittää raskauden aikana havaitut oletettua alhaisemmat vapaan TA:n määrät, kun määritys suoritetaan Amersham'in menetelmällä; vapaan T4:n näennäiset määrät olisivat merkittävästi oletettua alhaisemmat, jos albumiinin sitoutuminen leimattuun analogiin on huomattavaa.

Tämä tilanne on myös hyvin dokumentoitu hepariinihoitotapauksissa, joissa esteröitymättömien vapaiden rasvahappojen määrä on merkittävästi kohonnut. Amersham'in menetelmällä mitatut, hepariinilla hoidettujen potilaiden vapaan TA:n ja vapaan T3:n määrät ovat normaalia määriä alhaisemmat.

Sama ongelma esiintyy non-thyroidal-sairaudessa, jossa Amersham'in menetelmällä saatujen vapaan T3:n ja T4:n arvojen on osoitettu olevan merkitsevästi alhaisempia kuin kilpirauhastoiminnaltaan normaalilla populaatiolla verrattuna suoraan tasapainodialyysi-menetelmään.

Alan työntekijät ovat havainneet Amersham-patentin menetelmässä olevan toivomisen varaa, mistä on osoituksena vapaiden ligandien määrien havaitut väärät ja virheelliset mittaukset. Esillä olevan patentin hakija on havainnut, että ongelman takana on ligandianalogi-merkkiaineen sitoutuminen tiettyihin endogeenisiin proteiineihin, 6 92S78 esimerkiksi albumiinin, biologisissa nesteissä. Olemme havainneet, että tämä ongelma voidaan välttää käyttämällä spesifisiä kemiallisia inhi-biittorirenensseja. Tämä havainto on tärkeä edistysaskel alalla, ja sen uskotaan olevan patentin arvoinen.

Keksinnön kohteena on menetelmä vapaan ligandin konsentraation mittaamiseksi biologisista nesteistä sitoutuneen ligandin ja endogeenisten sitovien proteiinien läsnäollessa vaikuttamatta vapaan ligandin ja proteiinin sitoutuneen ligandin väliseen tasapainoon, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että menetelmässä (a) inkuboidaan biologisen nesteen näytettä yhdessä (i) ligandianalogi-merkkiaineen kanssa, joka kemiallisen rakenteensa vuoksi ei sitoudu joihinkin endogeenisiin sitoviin proteiineihin, mutta sitoutuu ainakin yhteen muuhun endogeeniseen sideproteiiniin, (ii) spesifisen ligandisideaineen kanssa, jonka affiniteettivakio on korkeintaan noin 5 x 105 1/mol, ja (iii) ainakin yhden spesifisen kemiallisen inhibiittorireagenssin kanssa, joka estää ligandianalogi-merkkiaineen sitoutumisen mainittuun aiankin yhteen muuhun endogeeniseen sitovaan proteiiniin, jota inhi-biittorireagenssia on läsnä määrä, joka on riittävä syrjäyttämään ligandianalogi-merkkiaineen ainakin yhdestä muusta endogeenisesta sitovasta proteiinista syrjäyttämättä luonnonligandi mainitusta endogeenisesta sideproteiinista; (b) erotetaan spesifiseen sideaineeseen sitoutunut ligandianalogi-merkkiaine sitoutumattomasta merkkiaineesta; ja (c) määritetään vapaan ligandin konsentraatio mainitussa biologisessa nesteessä.

Tämän keksinnön tavoitteena on tuoda esiin uusi ja entistä parempi menetelmä, jolla mitataan vapaat ligandit biologisissa nesteissä.

Tarkemmin sanoen esillä olevan keksinnön tavoitteena on edelleen vapaiden ligandien oikeampi mittaaminen biologisessa nesteessä.

Nämä ja muut keksinnön tavoitteet ja edut käyvät ilmi seuraavasta yksityiskohtaisesta kuvauksesta.

Esillä oleva keksintö käsittelee Amersham-patentissa havaittuja puutteita ja korjaa tehokkaasti epäjohdonmukaisuudet Amersham'in analogi-menetelmän antamissa vapaan tyroidin tuloksissa.

Esillä olevassa keksinnössä käytetään T3:n ja T4:n leimattuja analogeja, jotka on modifioitu alaniinisivuketjussa. Tarkemmin sanoen a-aminoryhmä on modifioitu, jotta estettäisiin niiden sitoutuminen

II

^ 92878 TBG:en. Lisäksi eräin toimenpitein on estetty tällaisten leimattujen analogien sitoutuminen albumiiniin ja TBPA:han. Tämä toteutetaan valitsemalla huolellisesti eksogeeninen kemiallinen reagenssi (tai reagenssit), joka yksinään tai yhdistelmänä kykenee sitoutumaan albumiini- ja TBPA-molekyyleissä oleviin vapaisiin sitoutumiskohtiin, millä kyllästetään nämä sitovat proteiinit ja tehokkaasti poistetaan niiden kyky sitoutua tyroniinianalogeihin ja muihin endogeenisiin aineisiin, kuten esteröitymättömiin vapaisiin rasvahappoihin. Näiden eksogeenisten kemikaalien ei tulisi sitoutua TBG:en ja niiden konsen-traation tulisi olla sellainen, ettei korvata mitään sitoutunutta hormoonia albumiinista tai TBPA:sta.

Assosiaatiovakio albumiinille ja TA:lie on noin 500.000. (Tämä arvio perustuu olettamukseen, että tyroksiinille käytettävissä olevien sitoutumiskohtien määrä albumiinimolekyylissä on 1, ja että näennäinen assosiaatiovakio litroina moolia kohti - so. tasapainovakio kompleksin muodostumisen suunnassa - on 5 x 10^). Assosiaatiovakio albumiinille ja T3:lle on samoin noin 24.600. On hyvin osoitettu, että albumiinilla on suurempi affiniteetti vapaan T3:n ja T4:n ja niiden analogien suhteen kuin anionisille väreille, mutta paljon suurempi affiniteetti vapaille rasvahapoille kuin T3:lle ja T4:lle ja niiden analogeille.

Albumiinilla on suhteellisen alhainen assosiaatiovakio yksittäisille aromaattisille yhdisteille; korkeimmat assosiaatiovakiot ovat 2,4-dinitrofenolille (11.000) ja salisylaatille (2.800).

Jotta immunouuttoreaktion aikana voitaisiin ylläpitää tiukat tasapaino-olosuhteet in vitro, on ylläpidettävä tiukat fysiologiset olosuhteet; tämä merkitsee pH-arvon 7,4 käyttämistä. Tyroniinimolekyyleillä on kolme varautunutta ryhmää tässä pH-arvossa: anioninen karboksylaatti-ioni, kationinen α-aminoryhmä ja anioninen fenolaatti-ioni. (Jälkimmäinen on ionisoitunut 82-prosenttisesti). Albumiinin tai TBPArn läsnäolo näissä* fysiologisissa olosuhteissa tuottaa erittäin varautuneen albumiinin, jossa on suhteellisen suuri määrä kationisia aminoryhmiä.

Nämä kationiset aminoryhmät albumiinimolekyyIissä sitovat anionisen fenolaatti-ionin tyroniinimolekyyleihin. Tällainen vuorovaikutus on pääsyy albumiinin sitoutumiseen leimattuun analogiin sekä Amersham- 8 92878 patentin menetelmässä että Corning-patentin menetelmässä.

Esillä olevassa keksinnössä käytetään hyödyksi sitä, että 2,A-nitrofenoli (DNP) ja natriumsalisylaatti, joilla on suhteelliset korkeat assosiaatio-vakiot albumiinille ja TBPArlle, ovat myös ionisoituja ja varautuneita pH-arvon näissä fysiologisissa olosuhteissa, jolloin saadaan varautunut anioninen fenolaatti-ioni, joka kykenee vuorovaikutukseen albumiini-ja TBPA-molekyylien varausten kanssa. Kun joko 2,A-dinitrofenolia tai natriumsalisylaattia tai kumpaakin on mukana ylimäärin, leimattujen T3- ja TA-analogien sitoutuminen albumiiniin ja TBPAran on käytännöllisesti katsoen estynyt. Tämä menetelmä, jossa sopivilla 2,A-dinitrofenoli ja/tai natriumsalisylaatti-konsentraatioilla salvataan albumiini ja TBPA, on tehokas keino poistaa albumiinin aiheuttamat virheelliset analyysitulokset vapaan kilpirauhashormonin immunouutto-analogimenetel-missä.

Esillä olevaa keksintöä voidaan soveltaa moniin erilaisiin muihin kemiallisiin inhibiittorireagensseihin, so. reagensseihin, jotka kykenevät salpaamaan ligandianalogi-merkkiaineen ja kiertävien endogee-nisten sitovien proteiinien ei-toivotun reaktion. Esimerkkejä on orgaaniset substituoidut monoaryyliyhdisteet. Tällaisten yhdisteiden substituentteihin sisältyvät nitro, karboksyyli, karboksyylisuolat ja vastaavat. Erityisen hyödyllisiä ovat monoaryyliyhdisteet, joissa on fenolinen hydroksyyliryhmä. Muita sopivia ryhmiä ovat värit, kuten sulfobromiftaleiini, oranssinpunainen, bromikresyylisininen ja vastaavat. Myös korkeammat (yli noin 5 hiiliatomia) rasvahapot, kuten öljyhappo ovat hyödyllisiä. Alan ammattimiehille ovat ilmeisiä myös muutkin yhdisteet. Esimerkiksi monilla aminohapoilla on suuri affiniteetti albumiinille ja ne ovat siten hyödyllisiä tätä keksintöä toteutettaessa, esimerkiksi tryptofaani. Muita sopivia ryhmiä ovat T3-, TA- tai testosteroni-analogit, jotka syrjäyttävät leimatun analogin endogeenisistä proteiineista sitoutumatta vasta-aineeseen tai muuhun spesifiseen ligandisideaineeseen.

Tätä menetelmää voidaan käyttää minkä tahansa vapaan, normaalisti ihmisen kehonesteessä olevan ligandin konsentraation havaitsemiseen.

il 9 92878

Vapaa ligandi voi olla esimerkiksi tyroksiini, tri-jodityroksiini, testosteroni, kortisoli, progesteroni, östradioli, yleisesti hormonit ja steroidit, myös lääkkeet ja lääkemetabolian tuotteet, vitamiinit, Kuten B12, toksiinit ja vastaavat.

Yleisesti sanoen spesifinen ligandi-sideaine on aine, joka kytkeytyy tai sitoutuu vapaaseen ligandiin ja se voi olla spesifinen vasta-ainevapaalle ligandille tai muulle sitovalle aineelle. Yleisesti sanoen spesifiset ligandi-sideaineet, jotka sopivat erilaisille vapaille ligandeille, ovat tunnettuja eikä niitä tarvitse enempää kuvata.

Ligandianalogi-merkkiaine on leimattu jollain tavoin niin, että se voidaan havaita tai huomata. Radioaktiiviset leimat ovat yleisesti tunnettuja ja käyttökelpoisia, kuten myös muut alalla aikaisemmin käytetyt leimauskeinot, mukaanlukien entsyymit, fluoroforit, kromoforit ja kemiluminenssiryhmät osana ligandianalogi-merkkiainemolekyyliä.

Vapaat kilpirauhashormonit

Vasta-aineet sekä L-tyroksiinille että 3,5,31 - trijodityroniinille valmistettiin kaniineissa yleisesti vakiintuneilla, tavanomaisilla tekniikoilla käyttämällä immunogeeneinä naudanseerumialbumiini-T4 ja -T3.

Dijodityroniinin (T2) ja T3:n analogit valmistettiin sukkinyloimalla α-aminoryhmä alaniinisivuketjussa niin, että muodostuu vastaavasti N-L-trijodityroniini-sukkinimidiä ja N-L-trijodityroniinia, jotka sen jälkeen jodattiin tavanomaisin jodausmenetelmin niin, että 125 saatiin vastaavasti N- I-L-trijodityroniini-sukkinimidi ja N- 125 I-L-tyroksii-ni-sukkinimidi. Sen jälkeen merkkiaineet seostettiin 0,01M HEPES (N-2-hydroksietyylipiperatsiini-N1-2-etaanisulfonihappo)-puskuriin, pH 7,4 ja lisättiin 0,01 % natriumatsidia, 0,1 7. hiiliabsorboitua ihmisseerumialbumiinia (CAHSA), joka ei sisältänyt lainkaan näennäistä T3 tai T4, ja salpausaineita, kuten on kuvattu 10 92878 jäljempänä spesifissä esimerkeissä. Ihmisseerumiin, jossa ei ollut lainkaan näennäistä T3 ja/tai TA, lisättiin eri määrät T3 tai TA, kalibroitiin suoran tasapainodialyysin avulla, ja jokaiselle määrälle annettiin arvot.

T3- ja TA-vasta-aineet immobiiisoitiin polypropyleeniputkien (12x75mm) sisäseinämiin K. Catt'in, et ai, kuvaamalla tavalla (Solid phase radiommuoassay in antibody-coated tubes, Science 158:1570, 1967).

Vapaan TA:n määrittämiseksi pipetoidaan 50 ^ul kaiibrointiainetta nai potilasnäytettä pipetoidaan anti-T^-vasta-aineella päällystettyihin putkiin ja tämän jälkeen 1,0 ml leimattua TA-analogia. Sen jälkeen putkia inkuboitiin 60 minuuttia 37°C:ssa. Tämän inkuboinnin jälkeen putket dekantoidaan ja lasketaan sidottu radioaktiivisuus. Tulokset lasketaan kalibrointikäyrästä ja ilmoitetaan ng/dl.

Vapaan T3:n määrittämiseksi pipetoidaan 100 |jl kalibrointiainetta tai potilasnäytettä anti-T3-vasta-aineella päällystettyihin putkiin ja sen jälkeen 1,0 ml leimattua T3-analogi-merkkiainetta. Putkia inkuboidaan 3 tuntia 37°C:ssa, sen jälkeen dekantoidaan ja lasketaan radioaktiivisuus. Tulokset lasketaan kuten vapaalle TA:lie ja ilmoitetaan pg/ml.

Vapaata kilpirauhashormonia koskevat esimerkit

Esimerkki 1: Vasta-aineet vapaan T3:n ja vapaan TA:n määrityssystee-meille valittiin sen perusteella, että vapaa hormoni on fysiologisessa tasapainossa siirtoproteiiniensa kanssa. Tämä tasapaino tulisi ylläpitää, kun systeemiin lisätään hormonia vastaan suunnattu vasta-aine. Oleellista on valita vasta-aine, joka on sopiva affiniteettivakioltaan ja spesifisyydeltään vapaan analyytin suhteen. Tällaisten vasta-aineiden reaktiokinetiikan tulisi myös olla hidas.

Vapaalle tyroksiinille (TA) valittiin vasta-aine, jonka työtiitteri tai -laimennus oli 1:250.000 (2,0 ng IgG/putki). Jotta voitaisiin

II

11 92878 tarkistaa, mikä vaikutus on merkkiainene sitoutumisella vasta-aineeseen albumiinin ja albumiinia salpaavien aineiden läsnäollessa ja ilman niitä, valmistettiin vasta-aineella päällystetyt putket käyttämällä tiittereitä 1:250.000 (2,0 ng IgG/putki) ja 1:25.000 (20,0 ng IgG/putki). Maksimaaliset sitoutumiset määritettiin noudattamalla edellä kuvattua protokollaa vapaalle T4:lle. Tulokset on koottu seuraavaan taulukkoon 1.

Taulukko 1, vapaa TA B/T, %

Ab Titer 1:25.000 1:250.000

Merkkiaine A 60,8% 63,3% ei CAHSA:ta: ei nollakalibraattoria (systeemissä ei albumiinia)

Merkkiaine B 18,1% 2,6% ei CAHSA:ta : 1,0 mg albumiiniputki nollakalibraattorista (50 pl)

Merkkiaine C 15,0 % 1,4% 1 mg CAHSA-putki: ei nollakalib raattoria

Merkkiaine D 9,4% 0,7% 1 mg CAHSA-putki + 50 pl nolla kalibraattoria

Merkkiaine E 39,1% 23,2% 1 mg CAHSA-putki + 50 ui nollaka libraattoria + 0,5 mg/ml Na-salisylaattia

Merkkiaine F 53,5% 49,2% 1 mg CAHSA-putki + 50 ui nollaka libraattoria + 5,0 mg/ml Nasal isylaatt ia

Merkkiaine G 51,2% 39,5% 1 mg CAHSA-putki + 50 jul nollaka libraattoria + 1 mg Na-salisylaat- : ttia + 1 mg/ml 2,4-dinitrofenolia

Merkkiaine H 58,2% 38,6% 1 mg CAHSA-putki + 50 Jil nollakalib raattoria + 25 mg/ml Na-salisylaat-tia + 0,15 mg/ml 2,4-dinitrofenolia

Kun albumiinia tai mitään muuta proteiinia ei ole mukana, analogi 1^5 I-T4-merkkiaine sitoutuu vasta-aineeseen kummassakin vasta-aine-tiitterissä yhtä paljon. Kun mukana on albumiini-2 mg albumiini/putki, yhdessä sekä merkkiaineesta että nollakalibraattorista - analogi-merkkiaine ei sitoudu suuremman tiitterin vasta-aineeseen, mutta sen sijaan sitoutuu alemman tiitterin vasta-aineeseen vain 9,4- ,2 92878 prosenttisesti (merkkiaine D). Kun mukana on vain 1 mg albumiini/putki, merkkiaineiden B ja C sitoutuminen suuremman tiitterin vasta-aineeseen on mitätön - vastaavasti 2,6 ja 1,4% - kun taas sitoutuminen pienemmän tiitterin vasta-aineeseen on merkittävä - vastaavasti 18,1 % ja 15,0%.

Maiden kokeiden tuloksista voidaan vetää seuraavat johtopäätökset: 1. Konsentraatiossa 1-2 mg/putki sitoutuu albumiini oleellisesti merkkiaineanalogiin, kun mukana on 2,0 ng IgG vasta-aine/putki.

2. 2,0 ng IgG vasta-aine/putki omaa alhaisemman affiniteetin kuin albumiini analogimerkkiaineelle.

3. Kun mukana on albumiinin salpausaineita, leimatun T4-analogin sitotuminen vasta-aineeseen palautuu.

Samat kokeet suoritettiin myös vapaan T3:n määrityksille. Taulukon tulokset tukevat samanlaisia johtopäätöksiä (taulukko 2).

li ,3 92878

Taulukko 2, vapaa T3 B/T, %

Ab Titer 1:9.000 1:90.000

Merkkiaine A 70,6% 46,3% ei CAHSA:ta: ei nollakalibraattoria (systeemissä ei albumiinia)

Merkkiaine B 6,0% 1,0% ei CAHSA:ta: mukana nollakalibraattori (100 ui)

Merkkiaine C 6,3% 1,2% 1,0 mg/ml CAHSA/putki: ei nollakalib raattoria

Merkkiaine D 5,4% 0,9% 1,0 mg/ml CAHSA/putki + 100 ui nollakalibraattoria

Merkkiaine E 42,9% 22,5% 1,0 mg/ml CAHSA/putki + 100 ui nollakalibraattoria + 10 mg/ml Na-salisylaattia

Merkkiaine F 59,2% 35,0% 1,0 mg/ml CAHSA/putki + 100 ui nollakalibraattoria + 5 mg/ml Na-salisylaattia

Merkkiaine G 46,0% 23,1% 1,0 mg/ml CAHSA/putki + 100 ui nollakalibraattoria + 1,0 mg/ml 2.4- dinitrofenolia

Merkkiaine H 57,7% 28,5% 1,0 mg/ml CAHSA/putki + 100 ui nollakalibraattoria + 25 mg/ml Na-salisylaattia + 0,15 mg/ml 2.4- dinitrofenolia

Vapaan hormonin määrityksessä käytetyn vasta-aineen konsentraatio on siten kriittinen, ja se on huolellisesti säädettävä niin, että ei syrjäytetä sitoutunutta analyyttiä endogeenisistä proteiineista.

: Amersham- ja Corning-patenteista ei käy selville vapaan T3:n ja vapaan T4:n mittaamiseen käytettyjä vasta-aineiden konsentraatioita. Kokeiden, jotka on edellä esitetty yhteenvetona, perusteella voidaan kuitenkin olettaa, että sekä Amersham-patentissa että Corning-patentissa on täytynyt käyttää oleellisesti korkeampia vasta-ainekonsentraatioita, jotta saataisiin aikaan kohtuullinen sitoutuminen vasta-aineen ja analogimerkkiaineen välillä, koska kummassakaan patentissa ei ole käytetty salpausaineita.

Esimerkki 2: Edellä olevan esimerkin 1 perusteella saadut vasta-aineen käyttökonsentraatiot ovat vastaavasti 5,5 ja 2,0 ng/lgG/putki 14 92878 T3-vasta-ainetta ja T4-vasta-ainetta. Jotta voitaisiin määrittää sopiva albumiinin salpausaine (tai aineet), joita käytetään vapaan T3:n ja vapaan T4:n määritysjärjestelmissä, lisättiin seuraavat yhdisteet annetuissa konsentraatioissa analogimerkkiaineisiin. (Jokainen merkkiaine sisälsi myös 1 mg/ml hiiliabsorboitua ihmisseerumialbumiinia.) Jokaiselle merkkiaineelle määritettiin maksimaalinen sitoutuminen. Jokaiseen putkiryhmään, jossa sitoutuminen oli maksimaalinen, lisättiin myös nollakalibraattoria.

Korostettakoon, että tämän keksinnön alue ei rajoitu taulukoissa 3-11 käytettyihin esimerkkeihin. Niitä on tässä käytetty osoittamaan, että valituissa vasta-aineen konsentraatioissa analogimerkkiaineiden sitoutuminen kasvaa albumiinin salpausreagenssien kasvavien lisäys-määrien kanssa, kunnes saavutetaan tasanne. Tämä osoittaa myös, että T3-ja TA-leimatun analogin sitoutuminen estyy käyttämällä sopiva konsentraatio spesifisiä albumiinin salpausaineita.

Taulukko 3, vapaa T3 2,4-dinitrofenoli B/T, % 10 ^tg/ml 1,0% 50 1,4% 100 2,6% 150 A,3% 200 5,3% 400 10,0% 800 16,3% 1000 17,2% 3000 28,2% 3500 27,5% 4000 27,3% 11 92878

Taulukko 4, vapaa T3 Öljyhappo B/T, % 0,0125% mmol 1,2% 0,025 1,3% 0,05 1,3% 0,125 1,7% 0,25 3,5% 0,375 12,5% 0,50 17,6% 0,75 16,0% 1,0 15,5%

Taulukko 5, vapaa T3 Natrium- salisylaatti B/T, % 0,25 mg/ml 8,8% 0,50 14,0% 1.0 21,3% 2.0 26,7% 5.0 35,8% 10.0 36,7% 20.0 33,3% 25.0 30,4% 30.0 · 27,8% 16 92878

Taulukko 6, vapaa T3

Natr ium- salisylaatti 2,4-dinitrofenoli B/T, % 1.0 mg/ml 1,0 mg/ml 20,3% 5.0 1,0 29,8% 5.0 8,0 31,6% 5.0 4,0 34,2% 5.0 0,15 33,2% 10.0 0,15 35,0% 25.0 0,15 26,8%

Taulukko 7, vapaa T4 2,4-dinitrofenoli B/T, % 10 pg/ml 2,4% 50 4,5% 100 8,0% 150 11,0% 200 13,3% 400 22,9% 800 31,8% 1000 34,1% 1500 41,4% 2000 45,2% 2500 43,5% n 17 92878

Taulukko 8, vapaa TA

Öljyhappo B/T, % 0,00625 mmol 1,7% 0,0125 1,7% 0,025 1,9% 0,0625 2,3% 0,0125 3,5% 0,1875 6,8% 0,25 IA,3% 0,375 30,5% 0,30 32,7% 0,75 32,9%

1.00 31,0% I

Taulukko 9 vapaa TA Natrium- salisylaatti B/T, % 0,05 mg/ml 5,3% 0,075 7,2% 0,10 8,3% 0,15 11,7% 0,25 13,6% 0,30 22,0% : 1,0 28,3% 2.0 37,3% 5.0 A6,0% 10.0 A5,A% 20.0 A5,0% 25.0 AO,0% 30.0 AO,0% ie 92878

Taulukko 10, vapaa TA

Natrium- salisylaatti 2, A-dinitrofenoli B/T, % 1.0 mg/ml 1,0 mg/ml A4,l% 5.0 1,0 A9,8% 5.0 0,8 A8,1% 5.0 0, A A8,2% 5.0 0,15 46, A% 10.0 0,15 48,8% 25.0 0,45 42,6

Esimerkki 3: Seuraava koe suunniteltiin osoittamaan, että albumiinilla ei ole mitään vaikutusta vapaan T3:n ja vapaan T4:n määrityssystee-meihin.

Kymmenen näytettä - 5 normaaleilta henkilöiltä ja 5 raskauden kolmannella kolmanneksella olevilta naisilta - jaettiin kukin neljään osaan. Kolmeen näistä osista lisättiin lyofilisoitua hiiliabsorboitua ihmis-seerumialbumiinia 10, 20 ja 50 mg/ml konsentraatioissa. Nämä neljä osaa käsiteltiin sen jälkeen kaksinkertaisina edellä kuvatulla tavalla vapaan T3:n ja vapaan T4:n määritysmenetelmissä käyttämällä neljää erilaista merkkiainetta. Kullekin merkkiaineelle piirrettiin sen jälkeen keskiarvo kullekin albumiinikonsentratiolle (N = 5) (kuviot 1 - 16). VApaalle T3:lle ja vapaalle TA:lie ovat merkkiaineet seuraavat;

Taulukko 11- Vapaan T4:n merkkiaineet

Merkkiaine I sisältää 0,5 mg/ml natriumsalisylaattia

Merkkiaine II sisältää 1 mg/ml natriumsalisylaattia ja 1 mg/ml 2,A-dinitrofenolia

Merkkiaine III sisältää 5 mg/ml natriumsalisylaattia

Merkkiaine IV sisältää 25 mg/ml natriumsalisylaattia ja 0,15 mg/ml 2,4-dinitrofenolia il 19 92878

Taulukko 12. Vapaan T3:n merkkiaineet

Merkkiaine I sisältää 1 mg/ml natriumsalisylaattia (Merkkiaine II sisältää 1 mg/ml natriumsalisylaattia ja 1 mg/ml 2,A-dinitrofenolia

Merkkiaine III sisältää 5 mg/ml natriumsalisylaattia Merkkiaine IV sisältää 25 mg/ml natriumsalisylaattia ja 0,15 mg/ml 2,A-dinitrofenolia Näiden kokeiden tuloksista on ilmeistä, että albumiinilisäys aina 5,0 g/dl asti ei vaikuta merkkiaineella IV saatuihin tuloksiin sekä vapaalle T3:lle että vapaalle TA:lie, kun albumiinin arvioitu kokonais-konsentraatio on 8,0 g/dl.

Esimerkki A: Jotta voitaisiin määrittää, sitooko TBG (thyroid binding globulin) leimatut vapaan T3:n ja vapaan TA:n analogimerkkiaineet, suoritettiin seuraava koe käyttämällä merkkiainetta IV esimerkistä 3. TBG-hartsia, josta oli poistettu kaikki näennäinen TA ja T3, lisättiin jäljempänä annetuissa konsentraatioissa vastaavaan nollakalibraatto-riin sekä vapaan TA:n että vapaan T3:n määrityksissä. Seuraavassa taulukossa on annettu saadut prosentuaaliset sitoutumisarvot (B/Bq).

Taulukko 13.

B/Bo, % FTA FT3 nollakalib. 100% 100% + 10 mg/ml 95% 99% + 20 mg/ml 96% 99% + 50 mg/ml 9A% 95%

Esimerkki Aa: Tämä koe suunniteltiin tarkistamaan albumiinilisäyksen vaikutus nollakalibraattoriin käyttämällä merkkiainetta IV esimerkistä 3. Ihmisseerumialbumiini absorboitiin hiileen mahdollisen näennäisen T3:n ja TA:n poistamiseksi ja lisättiin annetuissa konsentraatioissa vastaavaan nollakalibraattoriin sekä vapaalle T3:lle että vapaalle 20 9 2 S 7 8 TA:lie. Prosentuaaliset sitoutumisarvot tarkistettiin jälleen.

Taulukko IA.

B/Bo, % _FTA_FT3_ nollakalib. 100% 100% + 10 mg/ml 97% 97% + 20 mg/ml 98% 100% + 50 mg/ml 95% 95%

Esimerkeisetä A ja Aa on ilmeistä, että ei albumiini eikä TBG sido analogimerkkiaineita annetuissa olosuhteissa.

Esimerkki 5: Suurissa konsentraatioissa sulfobromiftaleiini-väri, joka kykenee sitoutumaan albumiiniin - voi syrjäyttää T3:n ja TA:n albumiinimolekyylistä. Alhaisissa konsentraatioissa sulfobromiftaleiini ei pysty salpaamaan T3- ja TA-analogimerkkiaineita sitoutumasta albumiiniin. Jodattu TA-analogi seostettiin edellä kuvatulla tavalla ja jaettiin viiteen osaan. Jokaiseen osaan lisättiin seuraavat reagenssit.

Taulukko 15.

Merkkiaine 1 25 mg/ml natriumsalisylaatti + 0,15 mg/ml 2,4-dinitro- fenoli (w/v)

Merkkiaine 2 0,25 mg/ml sulfobromiftaleiini

Merkkiaine 3 0,5 mg/ml sulfobromiftaleniini

Merkkiaine A 1,0 rag/ml sulfobromiftaleiini Merkkiaine 5 1,0 mmol/1 öljyhappo

Jokaista merkkiainetta käytettiin erillisessä määrityksessä mittaamaan vapaa TA 20 näytteessä identtisissä koelosuhteissa.

Seuraavat tulokset saatiin, kun merkkiainetta 1 pidettiin referenssinä ja verrattiin sitä muihin.

tf 21 92878

Taulukko 16 ----

Merkki- Merkki- Merkki- Merkki- Merkki-_aine 1 aine 2 aine 3 aine 4 aine 5_ CMP yhteensä 56,145 59,182 58,591 55,886 60,080 % NSB 0,5% 0,6% 0,6% 0,7% 0,5% % MB 38,6% 18,7% 28,6% 27,5% 80% rho -0,9976 -0,9964 -0,9973 -0,9975 -0,9986

Kalibrointialue (B B ) 65,3-8,8% 63,4-7,4% 65,1-9,6% 66,6-10,1% 62,8-8,6% 0. 1 - 9,0 ng/dl Häirintäaine ng/dl 20% 2,0 1,3 2,1 2,4 1,3 30% 0,3 0,2 0,3 0,3 0,2 80%_0,04 0,04_0,03 0.02_Q,Q4

Keskiarvo, 20 näytettä ng/dl 1,3 0,6 1,2 1,7 0,7

Korrelaatiokerroin (lineaarisuusindeksi)

Taulukko 17. Regeressiot

Merkkiaine 2 = 0,42 Merkkiaine 1+1,17 r = - 0,4914

Merkkiaine 3 = 0,81 Merkkiaine 1+0,14 r = 0,945

Merkkiaine 4 = 1,52 Merkkiaine 1-0,36 r = 0,956

Merkkiaine 5 = 0,11 Merkkiaine 1 + 0,51 r = 0,268 Käytettäessä merkkiainetta 3 ja 0,05% sulfobromiftaleiinia korrreloivat tulokset merkittävästi tuloksiin, jotka saatiin käyttämällä merkkiainetta 1. Käyttämällä merkkiainetta 3 saadut tulokset ovat kuitenkin noin 20% alhaisempia kuin merkkiainetta 1 käyttämällä saadut tulokset. Vaikkakin merkkiaine 4 korreloi hyvin merkkiaineen 1 kanssa, se antaa merkitsevästi suuremmat vapaat T4-arvot, luultavasti johtuen siitä, että korkea sulfobromiftaleiinikonsentraatio (0,1%) vapauttaa albumiiniin sitoutunutta T4.

Merkkiaineeseen 5 lisätty öljyhappo kykenee syrjäyttämään analogimerkki- 22 92878 aineen albumiinista. Tällä merkkiaineella saadut potilastiedot kuitenkin korreloivat huonosti merkkiaineella 1 saatujen arvojen kanssa käytettäessä öljyhappoa tässä konsentraatiossa. Suuremmat öljyhappokonsentraatiot merkkiaineessa - konsentraatio yli 1,0 mmol/1 - syrjäyttävät sitoutuneen leimaamattoman T4: n albumiinista.

Esimerkki 6: Jotta voitaisiin tutkia esteröitymättömien vapaiden rasva-happojen vaikutukset vapaan T4:n ja vapaan T3:n määrityssysteemiin, jaettiin potilasnäytteet osiin, lyofilisoitiin ja sen jälkeen rekonsti-tuoitiin eri konsentraatioilla öljyhappoa tislatussa vedessä. Rekonsti-tuoiduista näytteistä määritettiin vapaa T3 ja vapaa T4 edellä annetun protokollan mukaisesti käyttämällä neljää samaa esimerkissä 3 kuvattua merkkiainetta. Taulukkoon 18 kootut tulokset osoittavat selvästi, että vapaan T4:n merkkiaine 1 on oleellisesti sitoutunut albumiiniin, ja että öljyhapon lisääminen syrjäyttää merkkiaineen albumiinista, jolloin saadaan valheellisen alhaisia vapaan T4:n määriä. Merkkiaineet 2 ja 3 ovat myös sitoutuneet albumiiniin, vaikkakin paljon pienemmässä määrin. Albumiini ei kuitenkaan oleellisesti vaikuta merkkiaineeseen 4, kuten on osoitettu esimerkissä 3; lisäksi öljyhapolla ei ole mitään merkittävää vaikutusta vapaan T4:n arvoihin.

Tulokset vapaalle T3:lle ovat samanlaiset kuin vapaalle T4:lle siinä suhteessa, että niiden mukaan esteroitymättömät vapaat rasvahapot eivät oleellisesti vaikuta merkkiaineeseen 4, mikä jälleen vahvistaa esimerkissä 3 saatuja tuloksia.

tl 23 92878

Taulukko 18. Öljyhapon vaikutus -- - — ,— " 1 - |

Vapaa T4-merkkiaine Vapaa T3-merkkiaine

I II IIII IV I I II IV I

Ilman 1,1 1,0 1,7 1,4 5,9 5,6 4,5 5,3 + 2,5 mmol/1 0,4 0,9 1,1 1,3 2,4 3,2 3,7 5,3 +5,0 0,30,9 1,1 1,3 2,7 2,9 4,2 5,3 + 7,5 0,3 0,8 1,1 1,3 3,2 2,8 4,2 5,5 +10,0 0,4 0,7 1,2 1,2 3,6 3,0 4,4 5,1 n = 3n = 3 n = 4 n = 4n = 3n = 3 n = 4 n = 4

Esimerkki 7: Jotta voitaisiin osoittaa, että raskaus ja non-thyroidal-sairaus eivät vaikuta edellä kuvatulla vapaan T4:n määritysmenetelmällä saatuihin tuloksiin, tutkittiin 185 normaalin kilpirauhastoiminnan näytettä käyttämällä edellä esimerkissä 3 kuvattua merkkiainetta 4 ja verrattiin 25 ensimmäisen kolmanneksen ja 49. kolmannen kolmanneksen raskausnäytteeseen ja 14 näytteeseen potilailta, joilla oli non-thyroidal-tauti. Taulukkoon 19 ja kuviin 17-20 kootut tulokset osoittavat, että vapaan T4:n arvoissa ei ole mitään tilastollisesti tai kliinisesti merkittäviä eroja raskauden aikana tai non-thyroidal-sairaudessa verrattuna kilpirauhastoiminnaltaan normaaliin populatioon Tämä vahvistaa jälleen sen, että sopivia albumiinia salpaavia aineita käytettäessä in vivo muutokset albumiinikonsentraatioissa eivät muuta vapaan T4:n määritystä.

Taulukko 19. Vapaa T4

957. Keski- N

'_ arvo_

Norm, kilpirau- hastoiminta 0,8-2,0 1,3 185

Raskaus 1. kolmannes 0,9-2,2 1,5 25 3. kolmannes 0,7-2,1 1,5 49 NTI 0,8-1,9* 1,2 14 * Absoluuttinen alue 24 92878

Vapaa testosteroni

Alalla on hyvin osoitettu, että steroidimolekyylit sitoutuvat luonnollisiin sideaineisiinsa molekyylin A- ja/tai B-renkaan kautta. Kts. Forest, M., et ai ja sen viitteet (Free and bound streoids in plasma: methdology and physiopathological implications, In: Physiological Peptides and New Trends in Radioimmunology, C.A. Bizollon, toim., Amsterdam: Elsevier/North-Holland Biochemical Press, 1981, 249-266). A- ja/tai B-renkaan kemiallinen muuttaminen estää useimmat steroidit - mukaanlukien testosteronin, progesteronin, estradiolin, kortikosolin jne. - sitoutumasta endogeenisiin sideaineisiin. Tämän ryhmän tyypilliseksi jäseneksi valittiin testosteroni. Syntetisoidiin testosteronianalogi, 6-hydroksitestosteroni-19-karboksimetyylieetterihistamiini, ja se radioleimattiin tavanomaisilla tekniikoilla jodi 125:llä. Tämä analogimerkkiaine seostettiin sen jälkeen 0,01M HEPES-puskuriin, pH = 7,4, joka sisälsi 1 mg/ml hiiliabsorboitua ihmisseerumialbuiniinia ja 0,01% natriumatsidia. Salpausaineita lisättiin seuraavissa yksittäisissä esimerkeissä kuvatulla tavalla.

Vasta-aineet testosteronille kehitettiin kaniineissa käyttämällä immunogeeninä testosteroni-19-karboksimetyylieetteri-naudanseerumi-albumiinia ja immobilisoitiin polypropyleeniputkien (12x75 mm) sisäseinämiin samalla tavoin kuin edellä on kuvattu vapaan T4:n ja vapaan T3:n yhteydessä. Vapaan testosteronin kalibraattorit, jotka oli valmistettu lisäämällä testosteronia eri määriä ihmissee-rumiin, jossa ei ollut lainkaan näennäistä testosteronia, kalibroitiin suoraan tasapainodialyysin avulla ja niille annettiin vapaan testosteronin arvot pg/ml. Vapaan testosteronin määrittämistä varten pipetoi-daan 50 ui kalibraattoria tai potilasnäytettä antitestosteroni-vasta-aineella päällystettyihin putkiin, minkä jälkeen lisätään 1,0 ml jodattua 6-hydroksitestosteroni-19-karboksimetyylieetteri-histamiini-analogia. Putkia inkuboidaan 4 tuntia 37°C:ssa, minkä jälkeen dekantoidaan ja lasketaan radioaktiivisuus. Tulokset lasketaan kalibrointikäyrästä interpoloimalla.

25 92878

Vapaata testosteronia koskevat esimerkit

Esimerkki 1: Salpausaineiden vaikutus vapaan testosteronin määritystu-loksiin tutkittiin määrittämällä 20 näytteestä vapaa testosteroni käyttämällä edellä kuvatulla tavalla selostettua jodattua analogia yhdessä sulfobromifta^eiinin (SBP) kanssa ja ilman sitä ja eri määrillä natriumsalisylaattia, 2,4-dinitrofenolia (DNP) ja 8-anilino-l-naftaleenisulfonihappoa (ANS). Kullekin merkkiaineelle on koottu seuraavassa keskiarvot pg/ml.

Taulukko 20.

Merkki- mg/ +5 +10 +0,15 +0,3 +1,0 +2,0 I

jaine putki salisy- salisy- DNP DNP ANS ANS

laatti laatti ilman SBP 7.9(A) 13.0(B) 14,3(0 10.5(D) 13.4(E) 18.9(F) 17.7(G) mukana SBP 7.1(A) 13.1(B) 14.4(C) 9.8(D) 13.5(E) 16.8(F) 15.0(G)

Vastaavien merkkiaineiden väliset regressioyhtälöt on annettu seuraavassa.

Taulukko 21.

-- A = 1,14 A - 0,21 r - 0,991 B = 1,00 B - 0,11 r = 0,997 C = 1,02 C - 0,31 r = 0,998 D = 1,11 D - 0,30 r = 0,996 E = 1,03 E - 0,52 r = 0,997 F = 1,13 F - 0,05 r = 0,996 G = 1,19 G - 0,26 r = 0,997 A = 2,76 F - 2,70 r = 0,966 A = 2,34 G - 1,58 r = 0,987 26 92878

Edellä olevasta esimerkistä havaitaan, että sulfobromiftaleiinin poissaolo nostaa IA %:lla näennäisen vapaan testosteronin määriä, koska sulfobromiftaleiini estää analogimerkkiaineen sitoutumisen albumiiniin syrjäyttämättä albumiiniin sitoutunutta testosteronia. Havaitaan myös - ja tämä on tärkeintä - että salisylaatti, 2,4-dinitrofenoli ja ANS syrjäyttävät testosteronin albumiinista ja/tai SHBG:stä, mikä nostaa tällä menetelmällä mitattua näennäistä vapaata testosteronia.

Esimerkki 2: Analogimerkkiaineen tehokkuus vapaan testosteronin määritysmenetelmässä tarkistettiin vertaamalla jodattua 6-hydroksitesto-steroni-19-karboksimetyylieetterihistamiinia (analogimerkkiaine) jodattuun testosteroni-19-karboksimetyylieetterihistamiiniin (normaali merkkiaine) vapaan testosteronin määrityksissä potilasnäytteissä.

Merkkiaineet seostettiin edellä kuvatulla tavalla 10 ug/ml sulfobromi-ftaleiinin kanssa. Yhtä suuren herkkyyden säilyttämiseksi säädettiin kunkin merkkiaineen vasta-ainemäärää, joka immobilisoitiin propyleeniputkien sisäseinämään.

20 potilasnäytettä tutkittiin noudattamalla jo kuvattua vapaan testosteronin protokollaan käyttämällä kahta edellä mainittua merkkiainetta. Seuraavassa taulukossa on annettu vapaan testosteronin keskiarvot pg/ml ja regressioyhtälö.

Taulukko 22.

Merkkiaine 6-hydroksitestosteroni-19- Testosteroni-19-histamiini I histamiini I

Keskiarvo 11,0 (A) 17,5 (B) (.n=20) A = 1,48 B + 1,24 r = 0,977

Tulokset osoittavat selvästi, että 6-hydroksi-testosteroni-19-125 histamiini- I merkkiaineanalogi ei sitoudu endogeenisiin sideai- 125 neisiin päinvastoin kuin testosteroni-19-histamiini- -merkkiaine,

II

27 92878 jolloin saadaan noin 50% suurempia vapaan testosteronin määriä kuin analogimerkkiaineella identtisissä koeolosuhteissa.

Esimerkki 3: Jotta voitaisiin tutkia SHBG-määrien (sex hormonebinding globulin) vaikutus vapaan testosteronin määritysjärjestelmään, hiiliabsorboituun ihmisseerumipooliin lisättiin 400 ug SHBG ml kohti. Tämä määrä on noin 10 kertaa normaali määrä. Kun SHBG-terästetty pooli tutkittiin vapaan testosteronin määritysmenetelmällä, sen prosentuaaliseksi sitoutumisarvoksi saatiin 99 % B/Bq.

Koska hiiliabsorptio poistaa testosteronin seerumipoolista, sen vapaan testosteronin (ja kokonaismäärän) konsentraatioiden tulisi olla nolla - so. prosentuaalisten sitoutumisarvojen tulisi olla noin 100 % B/Bq " sekä ennen terästämistä että sen jälkeen. Kuten toivottiinkin, tulokset osoittavat, että analogimerkkiaine, so.

125 6-hydroksitestosteroni-19-histamiini- I, ei sitoudu edes suuriin SHBG-määriin.

Esimerkki 4: Kohonneiden albumiinitasojen vaikutus vapaan testosteronin määritysmenetelmään tutkittiin rekonsituoimalla kolme lyofilisoitua näytettä vesiliuoksilla, jotka sisälsivät 0, 1,0, 2,0 ja 3,0 g/dl hiiliabsorboitua ihmisseerumialbumiinia. Kaikki näytteet määritettiin rinnakkain käyttämällä samaa merkkiainetta kuin esimerkissä 3 tulosten ollessa seuraavat.

: Taulukko 23.

Näyte Terästämätön Terästetty albumiinilla (g/dl) 1,0 2,0 3,0 1 4,7 4,4 4,2 3,9 2 16,7 16,4 16,7 15,8 3 37,0 37,0 34,2 34,0

Keskiarvo 19,5 19,3 18,4 17,9

Talteensaanti - 99% 94% 92% 28 92878

Tulokset osoittavat, että edes suuretkaan albumiinitasojen nousut eivät aiheuta kliinisesti merkittävää vaikutusta. Huomattakoon, että näytteet, jotka on terästetty 3,0 g/dl albumiinilla, merkitsevät erittäin suurta albumiinimäärää, so. noin 7g/dl.

Esimerkki 5: Useita potilasnäytteitä analysoitiin vapaan testosteronin määritysmenetelmällä käyttämällä samaa merkkiainetta kuin esimerkissä 3 sekä ennen hiiliabsorptiota että sen jälkeen. Seuraavassa on annettu vapaan testosteronin konsentraatiot (pg/ml) ennen hiiliabsorptiota ja prosentuaaliset sitoutumisarvot (B/Bq, %) hiiliabsorption jälkeen.

Taulukko 24.

— Normaalit miehet Normaalit naiset 3. kolmannes

Ennen jälkeen Ennenn jälkeen Ennen jälkeen 21,24 96% 0,80 105% 4,75 99% 14,33 98% 2,32 104% 9,10 96% 19,91 99% 1,73 104% 3,58 96% 21,03 98% 3,47 104% 4,44 97% 15,01 95% 1,93 105% 3,86 96%

Kuten toivottiinkin, osoittavat tulokset, että hiiliabsorptio oleellisesti alentaa potilasnäytteiden näennäisen vapaan testosteronin määrän nollaan mitattuna analogimenetelmällä, so. prosentuaaliset sitoutumisarvot ovat noin 100% B/Bq. Koska hiiliabsorptio poistaa seeruminäytteestä testosteronin yhdessä muiden steroidien ja pienten molekyylien kanssa, mutta jättää jäljelle suuremmat molekyylit, kuten albumiinin, SHBG:n ja muut sitovat proteiinit, tämä koe osaltaan vahvistaa sen, että siirtoproteiinien määrät sellaisenaan eivät vaikuta vapaan testosteronin analogimenetelmään.

Esimerkki 6: Koska esteröitymättömillä vapailla rasvahapoilla (NEFA) on korkeampi assosiaatiovakio albumiinin suhteen kuin testosteronilla, NEFA-lisäyksen tulisi syrjäyttää vapaa testosteroni albumiinista. Tämä vahvistettiin kokeella, jossa öljyhappoa lisättiin eri määrät tl » 92878 kulloinkin kolmeen potilasnäytteeseen. Taulukossa 24 on annettu vaikutukset näennäisen vapaan testosteronin määriin.

Taulukko 25.

Lisätty öljyhappo Potilas 1 Potilas 2 Potilas 3 Keskiarvo 0 mmol/1 6,2 3,3 10,0 6,5 2.5 7,3 4,7 11,6 7,9 5,0 11,6 11,1 21,8 14,8 7.5 21,2 16,0 32,3 23,2 10,0 30,3 17,9 47,8 32,0

Claims (7)

92878

1. Menetelmä vapaan ligandin konsentraation mittaamiseksi biologisista nesteistä sitoutuneen ligandin ja endogeenisten sitovien proteiinien läsnäollessa vaikuttamatta vapaan ligandin ja proteiiniin sitoutuneen ligandin väliseen tasapainoon, tunnettu siitä, että menetelmässä (a) inkuboidaan biologisen nesteen näytettä yhdessä (i) ligandianalogi-merkkiaineen kanssa, joka kemiallisen rakenteensa vuoksi ei sitoudu joihinkin endogeenisiin sitoviin proteiineihin, mutta sitoutuu ainakin yhteen muuhun endogeeni-seen sideproteiiniin, (ii) spesifisen ligandisideaineen kanssa, jonka affiniteet-tivakio on korkeintaan noin 5 x 105 1/mol, ja (iii) ainakin yhden spesifisen kemiallisen inhibiittorirea-genssin kanssa, joka estää ligandianalogi-merkkiaineen sitoutumisen mainittuun aiankin yhteen muuhun endogeeniseen sitovaan proteiiniin, jota inhibiittorireagenssia on läsnä määrä, joka on riittävä syrjäyttämään ligandianalogi-merkkiaineen ainakin yhdestä muusta endogeenisesta sitovasta proteiinista syrjäyttämättä luonnonligandi mainitusta endogeenisesta side-proteiinista; (b) erotetaan spesifiseen sideaineeseen sitoutunut ligandianalogi -merkkiaine sitoutumattomasta merkkiaineesta; ja (c) määritetään vapaan ligandin konsentraatio mainitussa .. biologisessa nesteessä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritetään vapaan ligandin konsentraatio vertaamalla sitoutunutta jaetta näytteessä vapaan ligandin tietyn kalibraattoriryhmän sitoutuneeseen jakeeseen.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että kemiallinen inhibiittorireagenssi on 2,4-dinitrofenoli.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet - t u siitä, että kemiallinen inhibiittorireagenssi on natrium-salisylaatti. ti 92878

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kemiallinen inhibiittorireagenssi on sulfobromif-taleiini.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kemiallinen inhibiittorireagenssi on öljyhappo.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vapaa ligandi on testosteroni. 92878