JPS60194364A - 遊離アナライト分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物学的流体中で、蛋白質（または流体中に
存在する他の結合種）に結合した形および結合しない即
ち遊離の形の両者で存在し、遊離した形および結合した
形が相互に平衡しているアナライトまたは有機物質の遊
離部分の分析に関する。

血液の如き生物学的流体中に遊離の形および蛋白質結合
した形で共に見出される生理学的活性物質について、そ
れは、これらの物質と関連した生理学的反応を制御でき
、従って遊離（または非結合）および蛋白質結合物質の
両者を含有する全物質の濃度におけるよりも著しく臨床
的でありうる遊離の形の濃度にあると普通考えられてい
る。

ヨーロッパ４’Ｆ許第２６１０３号にはこの種の分析法
が記載されている。この方法はアナライ）　（ａｎａｌ
ｙｔｅ　）およびそのラベル付き誘導体をアナライトに
対する特定バインダーとの反応を競争させることを含む
。次いで特定バインダーに結合するようになったアナラ
イトのラベル付き誘導体の量を測定し、この測定値を生
物学的流体中の遊離アナライトの濃度を測定するために
使用する。使用するラベル付き誘導体および特定バイン
ダーの量は、上記平衡に実質的な影響を与えるのに不充
分な量である。またアナライトのラベル付き誘導体は、
生物学的流体中の天然バインダーと実質的に非反応性で
あるように選択する。

ヨーロッパ特許第８９８０６号には幾分類似した方法が
記載されているが、しかしながらこの場合、ラベル付け
されるのがアナライト誘導体でなく特定バインダーであ
る。アナライトおよびその誘導体はラベル付き特定バイ
ンダーと結合を競争する。ラベル付き特定バインダーに
結合したアナライト誘導体の量を測定し、その測定を遊
離アナライト濃度を測定するために使用する。前記のと
同様、アナライト誘導体およびラベル付き特定バインダ
ーの量は、遊離−結合アナライト平衡を実質的に乱すの
に不充分な量であ、！ｌ）、アナライト誘導体は生物学
的流体中の天然バインダーと実質的に非反応性であるよ
うに選択する。

本発明は上記二つのヨーロッパ特許明細書に記載された
種類の分析法に関する。これらの分析の開発は、若干厳
密な要件に合致するアナライト誘導体を見出すことが困
難なことによって遅くな゛つていた。これらには： （ａ１ヨーロッパ特許第２６１０３号の分析において使
用するため、アナライト誘導体をラベル付けしなければ
ならない。ヨーロッパ特許第８９８０６号の分析に使用
するためには、アナライト誘導体は、ラベル付き特定バ
インダーとの反応後、液体分析媒体から一般に容易善こ
分離できなければならない。

（ｂ）アナライト誘導体は特定バインダーとの反応に対
しアナライトと競争しなければならない。

（ｃ）アナライト誘導体は、生物学的流体中のアナライ
トに対する天然バインダーと実質的に非反応性、好まし
くは完全に非反応性でなければならない。

ことが要件としである。

特定バインダーに対しては強力に結合するが、生物学的
流体中のアナライトに対する天然バインダーとは完全に
非反応性であるアナライト誘導体を見出すことは困難で
ある。このことはアナライトに対する幾つかの異なる天
然バインダーを生物学的流体が含有するとき特にそうで
ある。これらの天然バインダーの一つに主として結合す
るアナライト誘導体を使用するならば、そのときには、
名目上は遊離アナライト濃度の測定であるが、事実とし
て、生物学的流体中のその天然バインダーの濃度との相
関関係を示す分析結果が得られる。

本発明は、遊離−結合アナライト平衡に不当に影響を与
えることなく、天然バインダーに対するアナライト誘導
体の結合の程度を低下させるため示差（ｄｉｆｆｅｒｅ
ｎｔｉａｌ　）ブロック剤を使用する考えに基いている
。

全アナライトに対する分析においてブロック剤を用いる
ことは良く知られている。ブロック剤は、天然バインダ
ーとの反応に°対してアナライトと競争させるため、そ
してこれらのバインダーに本来結合していたアナライト
の画分を有効に置換するため加える。ここでアナライト
は好適な抗体と結合するために完全に利用でき、従って
従来法によって容易に分析できる。このため、ブロック
剤は天然バインダーに対しできる限シ高い高親和力を有
すること、および抗体と結合するため全アナライトを利
用できるようにするに充分な濃度で使用することが必要
である。

かかるアナライトの例として甲状腺ホルモを考慮できる
。チロキシン（Ｔ４）は、体流体中で、天然蛋白質バイ
ンダーに結合した形で９９．９７チ存在し、遊離の形で
は０．０３　％しか存在しない。結合した画分の、７０
％はチロキシン結合クロア’　ＩＪン（ＴＢＧ　）に、
２０チはチロキシン結合プレアルブミン（ＴＢＰＡ　）
に、１０％がアルブミンに結合している。全Ｔ４分析に
しばしば使用されるブロック剤は８−アニリノー−ナフ
タレンスルホン酸およびチオマーサレートである。

トリョードチロニン（Ｔ３）は、体流体中に、天然蛋白
質結合剤に結合した形で９９．７　％が存在し、遊離の
形で０゜３チが存在する。結合した画分の中、６０％は
ＴＢＧに結合し、１５チがＴＢＰＡに結合し、２５チが
Ａｌｂ（アルブミン）に結合している。全Ｔ３および全
Ｔ４の両者分析のだめのブロック剤としてサリチル酸ナ
トリウムが使用されている。

従来の全アナライト分析に使用されるこれらのブロック
剤と異なり、本発明で使用する示差ブロック剤は始めか
ら天然バインダーに結合したアナライトのできる限シ少
しの置換をすることを目的としている。

本発明は、アナライトおよびそのだめの特定バインダー
からなる特定結合性対の一つであるアナライトの遊離部
分の濃度を測定する方法を提供し、アナライトの上記遊
離部分はアナライトに対する１種以上の天然バインダー
に結合したアナライトの部分も含有する生物学的流体中
に存在し、アナライトの結合部分および遊離部分は相互
に平衡している。この方法は （ａ）生物学的流体の試料と、上記平衡に実質的な影響
を与えるのには不充分な量のアナライトに対する特定バ
インダー、およびアナライト自体の親和力よシも天然バ
インダーに対する低い親和力を有するアナライトの誘導
体との混合物を形成し、 （′ｂ）アナライト誘導体の遊離部分を特定バインダー
と結合させるため競争させる時間混合物を保持し、特定
バインダーに結合するようになったまたは結合しないよ
うになったアナライト誘導体の量を測定し、この測定を
生物学的流体中の遊離アナライトの濃度の測定に使用す
る方法において、 混合物中に、溶液の形で示差ブロック剤を含有させ、こ
の示差ブロック剤が生物学的流体中の少なくとも１種の
天然バインダーに対し親和力を有し、天然バインダーに
対するアナライト誘導体の結合が、天然バインダーに対
するアナライトの結合を実質的に低下させることなく実
質的に低下させるような濃度で使用するのである。

天然バインダーに対するアナライトの親和力はアナライ
ト誘導体のそれよシも大であることが必須の要件である
。この前提の下で、天然バインダー上の結合位置で競争
する任意のブロック剤が、結合されたアナライトの割合
よシも結合したアナライト誘導体の大なる割合を置換す
る、即ち示差ブロック剤として作用する。天然バインダ
ーに対するアナライトの親和力とアナライト誘導体の親
和力の間の差が犬となればなる程、示差ブロッキングを
達成することは容易になる。親和力の差が充分に大であ
るならば、示差ブロック剤は必要なくなるであろう。天
然バインダーに対しゼロもしくは無視しうる親和力を有
する好適なアナライト誘導体を見出すことの困難さは本
発明による示差ブロック剤の使用の必要を生ぜしめる。

示差ブロック剤は天然バインダーと結合するための一定
の親和力を有していなければならない。また天然バイン
ダーに結合するだめのアナライト誘導体と競争しなけれ
ばならない。実際にはこれは、示差ブロック剤およびア
ナライト誘導体が、天然バインダー上の同じ位置または
少なくとも近くの位置に結合しなければならないことを
一般に意味する。

天然バインダーに対する示差ブロック剤の親和力は、そ
れが反応混合物中に含有される濃度に逆に変化する。低
親和力を廟する示差ブロック剤を選択したときには、混
合物中に高濃度を含有させる必要がある。従って示差ブ
ロック剤の親和力についての下限は液体分析媒体中での
その溶解度によって決定する。従って、高親和力を有す
る示差ブロック剤を選択したときには、低濃度を使用す
る必要がある。

全アナライト分析とは対照的に、遊離アナライト分析に
対する要件は、分析試料を形成する生物学的流体中に存
在する天然バインダーの異なる濃度のために生ずる。か
く有用であるためには、示差ブロック剤は、天然バイン
ダーの異なる濃度に対処できなければならない。この能
力は、天然バインダーに対する示差ブロック剤の親オロ
カと逆に変化し、低り度では高親和力剤を使用し、形成
された系は天然バインダーの大きく異なる濃度で有効で
ない。従って天然バインダー濃度のかなシの変動が期待
されるとき、天然バインダーに対する示差ブロック剤の
親和力が、天然バインダーに対するアナライトの親和力
より著しく犬でなく、望ましくは小であることが好まし
い。

一度天然バインダーに対する好適な親和力を有する示差
ブロック剤を選択したら、次の工程はどの位それを使用
するか決定することである。

これは一般に試行錯誤によって行なう。多く使用しすぎ
たときには、殆んど全てのアナライト誘導体に加えて、
大量のアナライトを天然バインダーから置換する、そし
て分析は遊離アナライトよシも全アナライトを測定する
傾向がある。

少なく使用しすぎたときには、天然バインダーから多く
ないアナライト誘導体が置換され、遊離アナライトの分
析測定は、天然バインダー濃度との少し望ましからぬ相
関関係を示すように継続する。

アナライトの種類について見ると、本発明方法は一般的
適用性がある。本発明方法が適用しうるアナライトの群
の例には、ホルモン、生化＃メツセンジャー、ステロイ
ド１．薬剤、薬剤代謝産物、ポリペプチド、蛋白質、ビ
タミン、抗腫瘍剤、トキシン、アルカロイド、およびモ
ノ−、ジー、およびポリサツカロイドがある。特定バイ
ンダー、アナライト誘導体、ラベル、および分析条件は
、前記ヨーロッパ特訂−第２６１０３号および第８９８
０６号に示された線に沿って全て選択できる。それぞれ
の場合において、それに示された基準を用いて好適な示
差ブロック剤を選択する。

これらのアナライトの多くは、生物学的流体中の天然結
合蛋白質の幾つかに結合する性質を有する。例えば甲状
腺ホルモンはＴＢＧおよびＴＢＰＡ　ｉｃ特異的に結合
し、アルブミンに対しては特異的に少なくかなり低い結
合をする。コルチゾルはコルチゾル結合グロブリンに特
異的に結合し、アルブミンに対しては特異的に少なく、
かなシ低い親和力を有する。同じことがグロゲステロン
およびテストテロンの如き他のステロイドにも当てはま
る。事実、多くの可能なアナライトが、約１０６〜１０
６の親和力定数でアルブミンに対しむしろ非特定結合性
を示す。アルブミンに対するアナライトの親和力はその
特定化された天然バインダーに対するよシも低いが、生
物学的流体中にアナライトの実質的割合がそれに結合し
うる程大量のアルブミンが存在する。

更に、アルブミンに有意な程結合しないアナライト誘導
体を見出すことはしばしば特に困難なことである。従っ
て試料中にアルブミンが存在することは、遊離アナライ
トに対する一工程分析に大きな障害としばしばなる。従
って約１０４〜１０６の親和力定数でアルブミンに結合
する化合物は、各種のアナライトを測定するた本発明方
法において使用するのに潜在的に好適な示差ブロック剤
である。この種の親和力を有するアルダに結合する化合
物は文献に記載されており、５−スルホサリチル酸、サ
リチル酸、バルビトール、ゲンチシン酸、γ−レゾルシ
ル酸および２，４−ジニトロフェノール、およびそれら
の誘導体例えば塩およびエステルを含む。

これらの化合物は必ずしも個々のアナライトの分析に好
適であるとはかぎらない、例えばそれらはアナライト誘
導体の如く同じ結合位置で競争しない、しかしそれらは
かなり価値がある。

遊離チロキシン（Ｔ４）の分析は現在市場で入手できる
。本発明はかかる分析に関連して特に価値を有する。以
後は血清または、血漿中の遊離Ｔ４を測定するための市
場で入手できるアマ−レックス（Ａｍｅｒｌｅｘ　：ア
メルシャム・インターナショナル・ｐｌｃの商標）放射
線免疫分析キットに関して示す。

このキットにおいては、分析試料中の遊離Ｔ４は固定杭
体との反応のため１２３エラペル付きＴ４同族体（アナ
ライト誘導体）と競争する。このキットにおいて、ラベ
ル付きトレーサーとして使用するＴ４同族体は、Ｔ４自
体と比較して、ＴＢＧ。

ＴＢＰＡおよびＡ１１）の甲状腺ホルモン結合位置に対
しかなシ減少した親和力を有する。分析において使用す
る同族体はこれらの蛋白質に対するＴ４の親和力の約３
チでＴＢＧおよびＴＢＰＡと結合し、Ｔ４の親和力の約
２０〜３０チでアルブミンに結合する。Ｔ４同族体とＴ
４自体の結合の親和力における大きな差は、血清結合蛋
白質から同族体およびＴ４の示差置換を可能にし、これ
によって好適な濃度および好適な性質を有するブロック
剤がよシ弱く結合した同族体を置換でき、一方でより強
く結合したＴ４には殆んど影響を与えない。

血清Ｔ４結合蛋白質の既知濃度および結合位置に対する
Ｔ４およびＴ４同族体の親和力に基づいた計算は、Ｔ４
同族体のアルブミン結合性が、ＴＢＧまたはＴＢＰＡへ
の等個結合よシも、測定した血清遊離Ｔ４濃度の歪みに
おいて重要な要因であることを示す。この予言との一致
において、ＴＢＧ。

ＴＢＰＡおよびアルブミンの血清濃度を広く変えた甲状
腺機能正常な被検者の群において、ＴＢＧまたはＴＢＰ
Ａ濃度と遊離Ｔ４定量値の相関関係はないことを示した
。しかしながら、遊離Ｔ４定量値とアルブミン濃度の間
の小さいが認めうる相関関係は、臨床的には重大でない
が識別できる。従って遊離Ｔ４分析において血清アルブ
ミンへのＴ４同族体の残存結合の効果を著しく小さくす
ることはブロック剤を見出すことは最も重大なことであ
る。この方法で、血清アルブミン濃度に対する遊離Ｔ４
濃度の小さい相関関係は更に低減される。Ｔ４はアルブ
ミンに弱く結合しているだけるのみならず、更に尚弱く
結合しだＴ４同族体の　ｉよυ大なる画分も置換するこ
とがある。しかしながらＴ４のアルブミン結合が、血清
または血漿中の結合Ｔ４および遊離７４間の質量作用平
衡における少量成分だけであるので、他のより強力な結
合蛋白質（ＴＢＧ　ｉ　７’ｃはＴＢＰＡ　）上のＴ４
の小さい置換は遊離Ｔ４における著しい変化なしに許容
できる。Ｔ４結合についてのかかる小さい効果は更に遊
離Ｔ４の放射線免疫分析に使用する標準および対照につ
いて生ずる比較効果によって補正できる。

遊１１１Ｔ４に対する示差ブロック剤として、５−スル
ホサリチル酸（ＳＳＡ　）　（および誘導体例えばその
塩およびエステル）が好適な選択である。

従来この物質の用途は、沈澱可能な蛋白質の評価におい
て尿からの蛋白質（アルブミンを含む）の酸性沈澱剤と
してもっばら用いられていた。

本発明者等の知る限シにおいて、血清結合蛋白質にＴ４
またはＴ３を結合させることに対するブロック剤として
のその使用の報告はない。事実、スルホン酸基によって
与えられるＳＥＡ分子の増大した極性は、アルブミンの
非常に疎水性のＴ４結合位置およびＴＢＧまたはＴＢＰ
Ａ　Ｔ４結合位置で競争結合させるためサリチル酸自身
よシもそれを小さいアビジチーにする。従ってＳＳＡは
溶解度および親和力に関して見たとき、血清蛋白質結合
位置に結合するＴ４ｐ］族体の示差ブロック剤としての
その用途においてかなシの汎用性を有する。

この示差ブロック効果を行なうのに好適な濃度のＳＳＡ
を使用すると、遊離Ｔ４免疫分析におけるＴ４同族体の
アルブミン結合が差をもって示されることを証する下記
の七つの推論をすることができる。

（１）透析実験においてＥＩＳＡの逐次増大する濃度を
使用するとき、透析バッグ中で血清アルブミンがトレー
サー箪での１２６エラベル付きＴ４またはＴ４同族体と
平衡せしめられている場合、アルブミン結合を含まない
、従ってバッグの膜を通って透析されたトレーサーの百
分率における増大は、同族体がよシ弱く結合されており
従ってよシ容易に置換されるならば、Ｔ４に対するよシ
もＴ４同族体に対して大であるに違いない。

（２）正常のＴＢＧ　ＸＴＢＰＡおよびアルブミン濃度
を有するがトレーサー量のみの１２１＋エラペル付きＴ
４またはＴ４同族体を有する血清の試料を用いて同じ実
験を行なうと、同じＳＳＡ　８度で、同族体の置換はそ
の相対的に弱い結合のため著しく増大することがあるが
、Ｔ４の著しい置換は見られない。

（３）遊離Ｔ４に対する免疫分析にＳＳＡを加えること
はＢｏ（上口Ｔ４濃度で抗血清に結合した数の百分率）
を著しく上昇させるに違いない、何故ならばよシラベル
伺けされたＴ４同族体は血清蛋白質（Ｉ！Ｉｖ、にアル
ブミン）から置換され、従って抗血清によって結合され
るため利用されるようになるからである。

（４）血清への過剰のアルブミンの添加は、免疫分析で
得られる血清遊離Ｔ４に対する見掛の値について、ＳＳ
Ａの存在下においてはその不存在下におけるよりも効果
が小さい。これは過剰のアルブミンがよシ多くトレーサ
ーを封鎖し、それを免疫分析法から除去し、従って人工
的に結果を上昇させるためである。この封鎖に対向する
ことによってＳＳＡは加えたアルブミンの歪み効果を緩
オロする。

（５）透析アルブミン血症患者で測定された人工的に低
い血清遊離Ｔ４は、ＳＳＡまたはその協同作用物の使用
によって修正される。これは血清対照例においてアルブ
ミンによる同族体の封鎖のためであり、標準（アルブミ
ンの正常の濃度を有する）はＳＳＡによつで最少にされ
る、しかし勿論２．常の如く、透析アルブミン血症（ａ
ｎａｌｂｕｍｉｎｅ＋ｎｉｃ　）血清においては存在し
ないか強力に減少している。従って分析標準と比較して
、分析法は、より近似した匹敵する形で低（不存在）ア
ルブミンおよび正常アルブミン血清を、標準投与反応曲
線から内挿したときの透析アルブミン血症血清値に対す
る予測しうる結果で処理することにある。

（６）非エステル化脂肪酸（ＮＥＥｊＡ　）　（例えば
オレイン酸）は血清アルブミン上の位置で強力に結合す
る、そしてこうした状態で、第一に残存結合Ｔ４同族体
を置換し、第二にアルブミン結合位置からよυ強力に結
合したＴ４を置換する。

この効果のため、遊離Ｔ４放射線免疫分析におけるＮＥ
ＦＡによるアルプミ／結合Ｔ４同族体トレーサーの放出
は、第一に遊離Ｔ４定量において明らかな減少を生ぜし
める（　Ｎ］ＩＦＡの不存在下における元の値の３０〜
４０％まで）、そしてこれは次いで更にＮＩＦＡを添加
したとき、よシ強力に結合したＴ４の遊離相中への置換
の二次現象により再び上昇する。

ＳＳＡがアルプミ／結合位置を連続的にブロックし、有
効に結合することからラベル付きＴ４同族体を阻止する
ならば、そのときには置換のため、少々いトレーサーが
有効であるからＮＦｌｉＦＡの添加は遊＠Ｔ４放射線免
疫分析結果に非常に小さい抑制効果を有する。

（７）　ＳＳＡまたはその協同作用物の主たる効果が血
清アルブミン結合位置へのラベル付きＴ４同族体の結合
をブロックすることにあるなら、そのとき標準および対
照におけるものとは非常に異なるＴＢＧ濃度を有するが
、正常のアルブミン濃度を有する血清はＳＳＡの存在に
よって著しく影響を受けることはない。アルブミンＴ４
結合位置を有するかかるバインダーの濃度が放射線免疫
分析におけるＳＥＡのそれよシ有効的に非常に少ないこ
とが常であるならば、血清試料中のサリチレー）または
フェニトイン（薬として）の存在はＥＩＳＡの効果を妨
害しない。これは免疫分析法において反応成分の合計１
．１−中の血清１００パのみが存在するときと似ている
。

下記実施例は本発明を示し、これらの推測を試験をする
ものである。

実施例　１ ５−スルホサリチル酸のストック溶液を、水でこの溶液
を力価１：８まで稀釈して５Ｘ１０　Ｍの最終濃度を与
えるように作った（そして水酸化ナトリウムでｐＨ７，
４に中和した）。高比放射能１１１ｉ１ラベル付きＴ４
同族体（Ｔ４とＥＤＴＡとの錯体）を０．２Ｍのホスフ
ェート、０．１ＭのＦｉＤＴＡ、および０．１　Ｍのナ
トリウムアジドを含有するバッファー（ｐＨ７，４）で
稀釈して各実験において合計約２５００００　ｃｐｍと
した。

ＳＳＡ溶液、１２ｓニ−Ｔ４同族体溶液およびバッファ
の種々の混合物をアマ−フレックス（登録商標＞７’）
−Ｔ４免疫分析キットの「ゼロ」標準（内因性Ｔ４を含
まぬ）の一定濃度に加えて最終容１１４−とした。これ
らの溶液を透析バッグ中に入れ、室温で一夜バッグと密
着させておいた４−のホスフェート、１ｅＤＴＡ、アジ
ドバッファーｐＨ７，４に対して透析した。表１にこの
実験のためキットのゼロ標準の代シにヒト血清アルブミ
ンを用いた以外は同様の実験を行なった、・透析バッグ
内のアルブミンの製置は４０ｒ／１であった。

上記した二つに相当する実験も、高比放射能で１２ｓエ
ラペル付きＴ４のトレーサー量について行なった。全て
の場合において、透析ノ（ラグの内側および外側から溶
液の一部を、平衡に到達した後計数のためとり、蛋白質
結合トレーサーおよび遊離（非結合）トレーサーの割合
を次の如く計算した。

計数７分（バッグ内）＝結合画分十ｉ遊離画分計数／分
（バッグ外）＝Ｔ遊離画分 これはバッグの内外の溶液容量が等しいからである。従
ってＴ４まだはＴ４同族体に結合した蛋白質の百分率は
次式によって与えられる。

Ｔ４同族体およびＴ４に対する結果を表２および表３に
示す。

表　２ 表　３ これらの表は、アルブミンおよびゼロ標準の両者に対し
、Ｔ４よシもＴ４同族体はＳＳＡによって蛋白質結合位
置から容易に置換されることを示している。事実ゼロ標
準によるＴ４４分は使用したＳＳＡ濃度の範囲にわたっ
て影響を受けないこと、一方同族体の若干は５Ｘ１０’
Ｍよシ大なるＢｓｈ濃Ｗで置換されることを示している
。同族ＳＳＡの濃度でアルブミンから置換されており、
一方２Ｘ１０”ＭまでＴ４置換は小さい（表２）。

これらの実験は、好適な濃度でＳＥＡがアルブミンおよ
び可能な他の血清景白質Ｔ４結合位置の両方からＴ４お
よびその同族体の示差ブロックを示すことを証明してい
る。ＳＳＡの濃度はＴ４置換が最小である場選択できる
。

実施例　２ Ｂｏ（ゼロＴ４濃度で抗血清に結合するＴ４同族体トレ
ーサーの百分率）に対する値について５ＩＩＩＡの磯度
増大の効果を表４に示す。

表　４ 推論黒３から予期された如（、ＳＳＡは、血清蛋白質に
よりＴ４同族体結合を示差ブロックすることによって、
抗血清への結合に対してよ、Ｑ）レーサーを有効ならし
め、従ってＢ、値を上昇させる。

実施例　３ 甲状腺機能正常プールの一部に、牛血清アルブミン（血
晶）を種々の濃度で加えた。加えたアルブミンの各濃度
に対して、添加アルブミンによって生ぜしめられたアマ
−レックスキットによる遊離Ｔ４測定の歪みについての
ＳＳＡの対向効果を試験するため、各種濃度のＳＳＡを
各一部に加えた。結果を表５に示す。

表　５ 推論惠４から期待される如＜、ｌｏ”Ｍ以上のＳＳＡの
添加は、約３０チまで過剰に加えたアルプミ／によって
トレーサーの封鎖の歪み効果を減少させる。これは予期
した如く、８ＳＡはアルブミンによるトレーサーの封鎖
を限定したことを示す。これは、ＳＳＡ　／添加アルブ
ミン比が低下したとき、ＳＳＡの有効ブロック力も漸進
的に減少することを思い出さなければならない。

更に７０９／ｎ以上（内因性４０ｆ／ｆｔ＋添加３０　
ｆ／１．　）のアルブミン濃度は多分非生理学的なもの
である。

実施例　４ 甲状腺機能減退の境界線（境界線ＴＢＨ値、臨床徴候、
および症候）の患者からの血清試料（アルブミン４９／
ｎ　）を８ＳＡの不存在下および添加８８Ａの存在下に
、標準アマ−レックス遊離Ｔ４分析で血清遊離Ｔ４につ
いて測定した。表６に結果を示す。

表　６ 推論Ａ５で予測した如く、透析アルブミン血症患者に対
する遊離Ｔ４定蓋は、境界線甲状腺機能減退状態および
血清中の全Ｔ４、ＴＢＧ　ＸＴＢＰＡおよびアルブミン
濃度の両者からの知識から予期された値に近＜　ＳＳＡ
添加によって上昇される。

キットの正常範囲の下限は８．５　ｐｍｏｌ　／　ｎで
ある。

ＳＥＡを用いないと、遊離Ｔ４値は明らかに甲状腺機能
減退である。しかし１０’Ｍ以上でのＳｓＡの存在下、
境界線の患者の典型的なものである。

実施例　５ 甲状腺機能正常血清のプールに種々なｌ！Ｉｆｆオレイ
／酸を加えた。このプールの一部にＳＳＡも逐次増大し
だ濃度で加えた。結果を表７に示す。

遊離ｒ４値は、ゼロオレイン酸濃度（１０（１）の各Ｓ
ＳＡ濃度に対する値の百分率として表わす。

推論黒６から期待された如く、ＳＳＡの添加は血清結合
結合蛋白質からＴ４同族体トレーサーの置換においてオ
レイン酸（ＮＫＦＡ　）の効果を緩和した。理由はこの
推論の下に説明した通りである。最良のＥＩＳＡ効果（
即ち５ｍＭ／４で最少オレイン酸効果）は約１０’ＳＳ
Ａで見出される。この点において１０−３以上の全ての
ＳＳＡレベルが著しい効果を有する。より高いＳＳＡ濃
度の僅かに悪い性能の理由は明らかでない。

実施例　６ ＳＳＡの存在下に、正常なアルブミン濃度を有するが、
異常に高いかまたは低いＴＢＧ濃度を有する血清につい
てアマーレックス遊離Ｔ４Ｒ工Ａキットで血清遊離Ｔ４
測定を行なった。最適濃度（前記各実施例での実験から
）１０”ＭのＳＳＡ濃匿製置　８ 推論雁７によって予測した如く、これらの血清中の遊離
Ｔ４値についてのＳＳＡの著しい効果はなかった。

実施例　７ Ｔ４結合蛋白質（例えばチロキシン結合グレアルプミン
）を置換することのできるものとして文献にＳＳＡと共
に記載された他の化合物も、ＦＴ４分析における示差ブ
ロック剤として作用するそれらの能力について試験した
。推定ブロッカ＊＋１／ＴＩ４［有］請２４＋￥１−μ
−ドアｔデ俤ハイ　壷田よ一麟一Φロック剤は、ＦＴ４
分析において漸次増大するＢ。

値を示さなければなら々い（表４参照）、表９は１０”
−”Ｍおよび１０−”Ｍの濃度で（１）サリチル酸ナト
リウム、（＋＋）ゲンチシン酸ナトリウム（２゜５−ジ
ヒドロキシ安息香酸塩）、曲）γ−レゾルシン酸ナトリ
ウム（２，６−ジヒドロキシ安息香酸塩）、Ｑｖ）サリ
チルアミド、および（ｖ）　２　、４−ジニトロフェノ
ールの添加に対する結果を示す。

表　９ 表から、γ−レゾルシン酸、サリチルアミド、２．４−
ジニトロフェノールの何れもが本実施例において示した
分析を用いた示差ブロック剤として価値のないことが明
らかである、しかしサリチル酸ナトリウムおよびゲンチ
シン酸ナトリウムの両者は血清蛋白質からラベル付き同
族体の成る程度の置換を示す。それらは５ＳＡ（表４）
よシこの特定の場合において有効性が劣る、しかし血清
蛋白質結合位置と弱い親和力の同族体を置換するに当っ
ては多分より有効であろう。

これらの実験は、特定免疫分析についての最良の効果の
ため個々の示差ブロック剤の適合性を決定するのに必要
な方法の本質的に経験的な性質を証明しているが、しか
しかかる示差ブロック剤の全範囲が血清蛋白質結合位置
に対する広く異なる親和力で、可能なことを示し、従っ
て何れの場合においてもアナライトおよびその同族体の
給体的および相対的結合親和力によって、アナライト分
析の広い範囲に対して好適であることを示している。

手続補正書 昭和６０年３り／ｇ日 １、事件の表示　昭芥。しＱ斗特↓竹婚ヤＪ３３乙ぷ２
う事件との関係　叶Ｉ′＋庄ＪＷｋん〜 住中井蓄許千ド ４、代理人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　アナライトおよびそのための特定結合剤からなる
   特定結合性対の一員であシ、アナライトの遊離部分がア
   ナライトに対する１種以上の天然バインダーに結合した
   アナライトの一部も含有する生物学的流体中に存在し、
   アナライトの結合部分および遊離部分が相互に平衡して
   いるアナライトの遊離部分の濃度を測定する方法であっ
   て、 （ａｌ生物学的流体の試料と、上記平衡に実質的な影響
   を与えるには不充分な量のアナライトに対する特定バイ
   ンダー、およびアナライト自体に対するよシも天然バイ
   ンダーに対し低い親和力を有するアナライトの誘導体と
   の混合物を形成し、 ＋ｂ＋アナライト誘導体の遊離部分を特定バインダーと
   結合させるため競争させる時間混合物をつたもしくは結
   合するようにならなかったアナライト誘導体の量を測定
   し、生物学的流体中の遊離アナライトの濃度を測定する
   だめの測定法を用いる ことによるアナライトの遊離部分の濃度を測定する方法
   において、 溶液の形で示差ブロック剤を混合物中に含有させ、示差
   ブロック剤が生物学的流体中の少なくも１棟の天然バイ
   ンダーに対する親和力を有し、天然バインダーに対する
   アナ２イト誘導体の結合が天然バインダーに対するアナ
   ライトの結合を実質的に低下させることのないような濃
   度で使用することを特徴とするアナライトの遊離部分の
   濃度測定法。 ２、　天然バインダーに対する示差ブロック剤の親和力
   が天然バインダーに対するアナライトの親和力よシ著し
   く大でない特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、　天然バインダーがアルブミンであり、示差ブロッ
   ク剖がアルブミンに対し約１０４〜１０６）親和力定数
   を有する特許請求の範囲第１項または第２項記載の方法
   。 ４、示差ブロック剤が、５−スルホサリチル酸、サリチ
   ル酸、パルビトール、ゲンチシン酸、γ−レゾルシル酸
   および２，４−ジニトロフェノール、およびそれらの誘
   導体から選択される特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、　アナライトが甲状腺ホルモンである特許請求の範
   囲第１項〜第３項の何れが一つに記載の方法。 ６、　アナライトがチロキシンである特許請求の範囲第
   ５項記載の方法。 ７、示差ブロック剤が５−スルホサリチル酸またはその
   誘導体である特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、示差ブロック剤を５Ｘ１０−５Ｍ〜５Ｘ１０”Ｍの
   濃度で使用する特許請求の範囲第７項記載の方法。