JPH0616046B2 - 遊離リガンドアッセイ方法およびキット - Google Patents
遊離リガンドアッセイ方法およびキットInfo
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- JPH0616046B2 JPH0616046B2 JP58500981A JP50098183A JPH0616046B2 JP H0616046 B2 JPH0616046 B2 JP H0616046B2 JP 58500981 A JP58500981 A JP 58500981A JP 50098183 A JP50098183 A JP 50098183A JP H0616046 B2 JPH0616046 B2 JP H0616046B2
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明の背景 本発明は、当該リガンドが内因性受容体へ結合した形で
も存在するテストサンプル中の遊離リガンドの直接的特
異結合アッセイに関する。本発明は特に、ＴＢＧおよび
アルブミンのようなチロキシン結合タンパクを含んでい
るテストサンプル中の遊離チロキシンのイムノアッセイ
に関する。
も存在するテストサンプル中の遊離リガンドの直接的特
異結合アッセイに関する。本発明は特に、ＴＢＧおよび
アルブミンのようなチロキシン結合タンパクを含んでい
るテストサンプル中の遊離チロキシンのイムノアッセイ
に関する。
この目的で遊離リガンドとは、当該リガンドのための内
因性受容体を含んでいるテストサンプル中に非結合状態
で存在する、通常低分子量であるが必ずしもそうでない
物質と定義される。そのような受容体の生物学的役割は
明確に確立されていないが、それらは遊離リガンドが生
物学的プロセスにおいて消費されるにつれて質物作用に
よって解離し得るリガンドの貯蔵庫として作用するらし
い。典型的には、リガンドの小パーセントを除いてすべ
てはその受容体との結合状態で存在する。
因性受容体を含んでいるテストサンプル中に非結合状態
で存在する、通常低分子量であるが必ずしもそうでない
物質と定義される。そのような受容体の生物学的役割は
明確に確立されていないが、それらは遊離リガンドが生
物学的プロセスにおいて消費されるにつれて質物作用に
よって解離し得るリガンドの貯蔵庫として作用するらし
い。典型的には、リガンドの小パーセントを除いてすべ
てはその受容体との結合状態で存在する。
そのような受容体は典型的にはタンパクである。受容体
は自家抗体、トランスコルチンおよびＴＢＧの場合のよ
うな特異的でもあり得るし、または例えばアルブミンの
ように比較的非特異的でもあり得る。内因性なる術語
は、患者から得られたまゝのテストサンプルが、関心あ
るリガンドのいくらかの割合を結合する受容体を含んで
いることが予想されもしくは可能性あることを意味す
る。
は自家抗体、トランスコルチンおよびＴＢＧの場合のよ
うな特異的でもあり得るし、または例えばアルブミンの
ように比較的非特異的でもあり得る。内因性なる術語
は、患者から得られたまゝのテストサンプルが、関心あ
るリガンドのいくらかの割合を結合する受容体を含んで
いることが予想されもしくは可能性あることを意味す
る。
機敏な臨床医は、彼等の患者の状態を一層正確に評価し
ようとして、遊離リガンドアッセイへ益々転じつつあ
る。この努力は遊離リガンドのいわゆる直接イムノアッ
セイ、特に遊離チロキシンイムノアッセイの市場への出
現によって容易になった。直接リガンドアッセイは、遊
離チロキシンインデックスにおけるような計算によって
その後に遊離リガンド濃度へ相関させる他の測定法では
なく、遊離リガンド自体を測定することによって特徴付
けられる。
ようとして、遊離リガンドアッセイへ益々転じつつあ
る。この努力は遊離リガンドのいわゆる直接イムノアッ
セイ、特に遊離チロキシンイムノアッセイの市場への出
現によって容易になった。直接リガンドアッセイは、遊
離チロキシンインデックスにおけるような計算によって
その後に遊離リガンド濃度へ相関させる他の測定法では
なく、遊離リガンド自体を測定することによって特徴付
けられる。
現在直接遊離リガンドアッセイのために二つの手法が存
在する。平衡透析のほかに、スピーディでそして日常的
な臨床検査用に特に良く適しない手法である。両手法に
おいて、遊離リガンドはテストキットに含まれる受容体
に結合され、そして次に結合したリガンドの量が測定さ
れる。これら方法は、テストサンプル中に存在する内因
性受容体がアッセイを妨害することを防止する仕方に違
いがある。英国特許出願第２，０３０，２９０号の方法
においては、内因性受容体は、テストサンプルから遊離
リガンドの吸収後にテストサンプル残渣をテスト受容体
結合リガンドから物理的に分離することにより、すなわ
ち、テストサンプルをリガンドに対する不溶性化した抗
体とインキュベートし、テストサンプル残渣を傾斜し、
洗浄し、トレーサー標識リガンドを加え、そして該抗体
に結合したトレーサーの量（これはテスト受容体へ結合
したリガンドの量に反比例する）を測定することによっ
て除去される。この方法は簡単な既存の試薬を使用する
ので商業的に有利である。総チロキシンテストに時々使
用されている放射標識チロキシンは、前記直接チロキシ
ンアッセイに使用するためにも満足である。しかしなが
ら、各リガンドは当該リガンドの類縁体を必要とし、そ
してすべてのリガンドアッセイに共通の標識した免疫試
薬を使用できなかった。特開昭５６−５１６６５号に対
応する欧州特許出願第００２６１０３号に記載の直接遊
離リガンドアッセイは、内因性受容体による可能性ある
妨害を中性化するための他の系を使用する。受容体を系
から洗浄することにより、標識したリガンド類縁体との
相互反応から内因性受容体を排除するのではなく、リガ
ンド類縁体は内因性受容体との結合から化学的に排除さ
れる。これはリガンド類縁体として、内因性受容体と実
質的に結合しないがしかしテスト受容体と比較的よく結
合するリガンド誘導体を使用することによって達成され
る。この誘導体は、以後便宜上選択結合リガンドと呼ば
れるであろう。この遊離リガンドのアッセイは、中間洗
浄ステップを必要としない利点を有する。しかしなが
ら、それはアッセイすべき特定の結合リガンド毎に注意
深くデザインされた別々のトレーサーの特別な合成を必
要とする。
在する。平衡透析のほかに、スピーディでそして日常的
な臨床検査用に特に良く適しない手法である。両手法に
おいて、遊離リガンドはテストキットに含まれる受容体
に結合され、そして次に結合したリガンドの量が測定さ
れる。これら方法は、テストサンプル中に存在する内因
性受容体がアッセイを妨害することを防止する仕方に違
いがある。英国特許出願第２，０３０，２９０号の方法
においては、内因性受容体は、テストサンプルから遊離
リガンドの吸収後にテストサンプル残渣をテスト受容体
結合リガンドから物理的に分離することにより、すなわ
ち、テストサンプルをリガンドに対する不溶性化した抗
体とインキュベートし、テストサンプル残渣を傾斜し、
洗浄し、トレーサー標識リガンドを加え、そして該抗体
に結合したトレーサーの量（これはテスト受容体へ結合
したリガンドの量に反比例する）を測定することによっ
て除去される。この方法は簡単な既存の試薬を使用する
ので商業的に有利である。総チロキシンテストに時々使
用されている放射標識チロキシンは、前記直接チロキシ
ンアッセイに使用するためにも満足である。しかしなが
ら、各リガンドは当該リガンドの類縁体を必要とし、そ
してすべてのリガンドアッセイに共通の標識した免疫試
薬を使用できなかった。特開昭５６−５１６６５号に対
応する欧州特許出願第００２６１０３号に記載の直接遊
離リガンドアッセイは、内因性受容体による可能性ある
妨害を中性化するための他の系を使用する。受容体を系
から洗浄することにより、標識したリガンド類縁体との
相互反応から内因性受容体を排除するのではなく、リガ
ンド類縁体は内因性受容体との結合から化学的に排除さ
れる。これはリガンド類縁体として、内因性受容体と実
質的に結合しないがしかしテスト受容体と比較的よく結
合するリガンド誘導体を使用することによって達成され
る。この誘導体は、以後便宜上選択結合リガンドと呼ば
れるであろう。この遊離リガンドのアッセイは、中間洗
浄ステップを必要としない利点を有する。しかしなが
ら、それはアッセイすべき特定の結合リガンド毎に注意
深くデザインされた別々のトレーサーの特別な合成を必
要とする。
将来は種々のリガンドがこのような直接法によってアッ
セイされると信じられるので、どのような可能なアッセ
イについても共通な試薬を使用することが商業的に望ま
れるであろう。加えて、もし可能ならそのようなアッセ
イにおいて標識した抗体を使用することが有利であり、
その利益は製造の容易さ、安定性および改良されたアッ
セイ性能を含む。
セイされると信じられるので、どのような可能なアッセ
イについても共通な試薬を使用することが商業的に望ま
れるであろう。加えて、もし可能ならそのようなアッセ
イにおいて標識した抗体を使用することが有利であり、
その利益は製造の容易さ、安定性および改良されたアッ
セイ性能を含む。
従って本発明の目的は、遊離リガンドの直接アッセイに
おいて試薬調製を容易にすることである。
おいて試薬調製を容易にすることである。
本発明は、リガンドが一種またはそれ以上の内因性受容
体と結合した形でも共存するテストサンプル中の遊離リ
ガンドの量を測定する方法であって、 （ｉ）テストサンプルと、（ii）直接または間接に標識
されかつ前期リガンドと結合する外因性リガンド受容体
と、（iii）不溶化された、または分析操作の一部とし
て不溶化でき、かつ前記外因性リガンド受容体とは結合
するがしかし前記内因性受容体のいずれとも結合しない
標識しないリガンド類縁体（選択結合リガンド類縁体）
を混合するステップと、 遊離リガンドと前記選択結合リガンド類縁体とが前記外
因性リガンド受容体に対して競合することを許容するよ
うに混合物をインキュベートするステップと、 前記選択結合リガンド類縁体を前記混合物の残りの成分
から分離するステップと、 前記遊離リガンドと結合した、または選択結合リガンド
類縁体と結合した前記外因性リガンド受容体の量を測定
するステップと、そして 測定した結合した外因性リガンド受容体の量をテストサ
ンプル中に存在する遊離リガンドの量と相関させるステ
ップを含むことを特徴とする遊離リガンドの測定方法を
提供する。
体と結合した形でも共存するテストサンプル中の遊離リ
ガンドの量を測定する方法であって、 （ｉ）テストサンプルと、（ii）直接または間接に標識
されかつ前期リガンドと結合する外因性リガンド受容体
と、（iii）不溶化された、または分析操作の一部とし
て不溶化でき、かつ前記外因性リガンド受容体とは結合
するがしかし前記内因性受容体のいずれとも結合しない
標識しないリガンド類縁体（選択結合リガンド類縁体）
を混合するステップと、 遊離リガンドと前記選択結合リガンド類縁体とが前記外
因性リガンド受容体に対して競合することを許容するよ
うに混合物をインキュベートするステップと、 前記選択結合リガンド類縁体を前記混合物の残りの成分
から分離するステップと、 前記遊離リガンドと結合した、または選択結合リガンド
類縁体と結合した前記外因性リガンド受容体の量を測定
するステップと、そして 測定した結合した外因性リガンド受容体の量をテストサ
ンプル中に存在する遊離リガンドの量と相関させるステ
ップを含むことを特徴とする遊離リガンドの測定方法を
提供する。
本発明はまた、リガンドが一種またはそれ以上の内因性
受容体と結合した形でも共存するテストサンプル中の遊
離リガンドの量を測定するためのキットであって、 （ａ）直接または間接に標識されかつ前記リガンドと結
合する外因性リガンド受容体を既知濃度で含む試薬と、 （ｂ）不溶化された、または分析操作の一部として不溶
化でき、かつ前記外因性リガンド受容体とは結合するが
しかし前記内因性受容体のいずれとも結合しな標識しな
いリガンド類縁体（選択結合リガンド類縁体）と、そし
て （ｃ）前記リガンドの標準液 との組合せを含むことを特徴とする遊離リガンド測定用
キットを提供する。
受容体と結合した形でも共存するテストサンプル中の遊
離リガンドの量を測定するためのキットであって、 （ａ）直接または間接に標識されかつ前記リガンドと結
合する外因性リガンド受容体を既知濃度で含む試薬と、 （ｂ）不溶化された、または分析操作の一部として不溶
化でき、かつ前記外因性リガンド受容体とは結合するが
しかし前記内因性受容体のいずれとも結合しな標識しな
いリガンド類縁体（選択結合リガンド類縁体）と、そし
て （ｃ）前記リガンドの標準液 との組合せを含むことを特徴とする遊離リガンド測定用
キットを提供する。
本発明は従って、前記欧州特許出願で必要とする標識し
たリガンド類縁体を必要としない。その代わり、テスト
受容体が直接または間接に標識される。後で説明するよ
うに、今や多目的または万能トレーサー、すなわちすべ
ての遊離リガンドアッセイに共通用途を持つトレーサー
を目論むことが可能である。
たリガンド類縁体を必要としない。その代わり、テスト
受容体が直接または間接に標識される。後で説明するよ
うに、今や多目的または万能トレーサー、すなわちすべ
ての遊離リガンドアッセイに共通用途を持つトレーサー
を目論むことが可能である。
本発明のアッセイ方法は二種の主要試薬、すなわち第１
に、不溶化された、または分析操作の一部として不溶化
できる選択結合リガンド類縁体と、第２に、標識したリ
ガンド抗体か、または標識した抗一（リガンド抗体）と
結合した未標識リガンド抗体を使用する。
に、不溶化された、または分析操作の一部として不溶化
できる選択結合リガンド類縁体と、第２に、標識したリ
ガンド抗体か、または標識した抗一（リガンド抗体）と
結合した未標識リガンド抗体を使用する。
選択結合リガンド類縁体は、内因性受容体を相対的に排
除しつつ抗リガンド抗体または他の抗リガンド受容体を
結合し得る、リガンドの残部であって、実質上水不溶性
物質と共有結合した、またはもっと好都合には、(a)不
溶性物質へ物理的に吸着された、または(b)実質上水不
溶性物質を形成するようにさらに反応せしめられた、実
質上水溶性成分と共有結合した該リガンド残部よりな
る。
除しつつ抗リガンド抗体または他の抗リガンド受容体を
結合し得る、リガンドの残部であって、実質上水不溶性
物質と共有結合した、またはもっと好都合には、(a)不
溶性物質へ物理的に吸着された、または(b)実質上水不
溶性物質を形成するようにさらに反応せしめられた、実
質上水溶性成分と共有結合した該リガンド残部よりな
る。
このアッセイは、テストサンプルと、リガンド抗体と、
そして標識してない選択結合リガンド類縁体とを混合
し、遊離リガンドと未標識選択結合類縁体とが該リガン
ト抗体に対し競合することを許容するようにインキュベ
ートし、該リガンドと、または該リガンド類縁体と結合
したリガンド抗体の量を定量し、そして結合したリガン
ド抗体の量をテストサンプル中に存在する遊離リガンド
の量に相関させることによって実施される。
そして標識してない選択結合リガンド類縁体とを混合
し、遊離リガンドと未標識選択結合類縁体とが該リガン
ト抗体に対し競合することを許容するようにインキュベ
ートし、該リガンドと、または該リガンド類縁体と結合
したリガンド抗体の量を定量し、そして結合したリガン
ド抗体の量をテストサンプル中に存在する遊離リガンド
の量に相関させることによって実施される。
本発明の詳細な説明 こゝで使用する選択結合リガンド類縁体を製造するため
の出発物質は、抗体のような企図するテストリガンド受
容体を結合するが、しかし内因性リガンド受容体を比較
的結合しない、この分野で既知のリガンド類縁体であ
る。適当な出発物質の実例は前述の欧州特許出願および
それに引用されている参考文献に開示されている。
の出発物質は、抗体のような企図するテストリガンド受
容体を結合するが、しかし内因性リガンド受容体を比較
的結合しない、この分野で既知のリガンド類縁体であ
る。適当な出発物質の実例は前述の欧州特許出願および
それに引用されている参考文献に開示されている。
適当な出発物質を製造する鍵は、リガンド上のどの部位
が予期される内因性受容体と結合するために比較的に必
要であるかを決定することと、そしてそれらの部位を変
性剤への結合基として使用することである。この決定
は、リガンドの各種の位置においてリガンドの電荷、極
性または立体的アウトラインを変性し、そして例えばリ
ガンドの活性炭吸着により好ましくはリガンドを分離し
た受容体への変性したリガンドの吸収の程度を測定する
ことによって通常達成される。吸収程度の決定は当業者
の伎倆範囲内であろう。例えば、14Ｃまたは３Ｈのよう
な放射性原子を含有するリガンドは各種の位置で一般に
前記のように変性し得る。受容体とリガンドとの混合物
をインキュベートし、その後未結合リガンドを除去する
ために透析する。もし透析物中に放射能が全くもしくは
少ししか発見されなければ、その時変性したリガンドは
適当な出発物質の良い候補である。
が予期される内因性受容体と結合するために比較的に必
要であるかを決定することと、そしてそれらの部位を変
性剤への結合基として使用することである。この決定
は、リガンドの各種の位置においてリガンドの電荷、極
性または立体的アウトラインを変性し、そして例えばリ
ガンドの活性炭吸着により好ましくはリガンドを分離し
た受容体への変性したリガンドの吸収の程度を測定する
ことによって通常達成される。吸収程度の決定は当業者
の伎倆範囲内であろう。例えば、14Ｃまたは３Ｈのよう
な放射性原子を含有するリガンドは各種の位置で一般に
前記のように変性し得る。受容体とリガンドとの混合物
をインキュベートし、その後未結合リガンドを除去する
ために透析する。もし透析物中に放射能が全くもしくは
少ししか発見されなければ、その時変性したリガンドは
適当な出発物質の良い候補である。
リガンドはその内因性受容体との結合に影響することが
予期できる任意の数の方法で変性することができる。そ
のような結合はリガンドの電荷および立体像の関数であ
るので、これら像特性の変性は該リガンドのその内因性
受容体に対する親和性をしばしば変えるであろう。この
変性は該親和性を増加または減少させることもあるし、
またはそれを大部分変えないこともある。このため多く
の場合親和力の変化を前記またはこの分野で既知の他の
方法で実際にテストすることが望ましい。
予期できる任意の数の方法で変性することができる。そ
のような結合はリガンドの電荷および立体像の関数であ
るので、これら像特性の変性は該リガンドのその内因性
受容体に対する親和性をしばしば変えるであろう。この
変性は該親和性を増加または減少させることもあるし、
またはそれを大部分変えないこともある。このため多く
の場合親和力の変化を前記またはこの分野で既知の他の
方法で実際にテストすることが望ましい。
適当な例示的リガンド変性は、前に引用した欧州特許出
願に記載されている。例として、リガンドはタンパクま
たは合成ポリマーのような大分子へ置換されることがで
きる。このかさ高の置換は内因性受容体のリガンド類縁
体への結合を立体的に（そして多分電荷効果によって）
妨害する。
願に記載されている。例として、リガンドはタンパクま
たは合成ポリマーのような大分子へ置換されることがで
きる。このかさ高の置換は内因性受容体のリガンド類縁
体への結合を立体的に（そして多分電荷効果によって）
妨害する。
その代わりに、内因性受容体を結合しない光学異性体を
使用してもよい。
使用してもよい。
その他の代替法は、内因性受容体との結合に関与する基
の電荷または極性を編成することである。例えば、カル
ボキシル基はエステルまたはアミドを生成するように反
応させることができ、アミノ基はアミド化することがで
き、そして帯電した部位はメチル化することができる。
の電荷または極性を編成することである。例えば、カル
ボキシル基はエステルまたはアミドを生成するように反
応させることができ、アミノ基はアミド化することがで
き、そして帯電した部位はメチル化することができる。
上記変性の一つまたは二以上のどれもが一度に実施する
ことができるが、しかし一般に一時に一つだけの変性を
することが好ましい。
ことができるが、しかし一般に一時に一つだけの変性を
することが好ましい。
チロキシンの場合、適当な出発物質はＤ−チロキシン
か、またはチロキシンカルボキシルもしくはアミノ基と
のアミド結合によりタンパクと共有結合したチロキシン
である。
か、またはチロキシンカルボキシルもしくはアミノ基と
のアミド結合によりタンパクと共有結合したチロキシン
である。
本発明で使用する選択結合リガンド類縁体を製造するた
めの出発物質は前述した欧州特許出願およびそれに引用
されている参考文献に開示されていることを述べた。し
かしながら本発明ではそのような出発物質をそのまま使
用するのではなく、あらかじめ不溶化するかまたは分析
操作の一部として不溶化しなければならない。このよう
なリガンド類縁体を不溶化することにより、サンプル中
の内因性受容体が該リガンド類縁体と結合しないことを
確実にすることが可能になる。このようなリガンド類縁
体の高い選択結合能力は前述の欧州特許出願の方法では
達成不可能であった。
めの出発物質は前述した欧州特許出願およびそれに引用
されている参考文献に開示されていることを述べた。し
かしながら本発明ではそのような出発物質をそのまま使
用するのではなく、あらかじめ不溶化するかまたは分析
操作の一部として不溶化しなければならない。このよう
なリガンド類縁体を不溶化することにより、サンプル中
の内因性受容体が該リガンド類縁体と結合しないことを
確実にすることが可能になる。このようなリガンド類縁
体の高い選択結合能力は前述の欧州特許出願の方法では
達成不可能であった。
一旦適当な非結合性変性リガンドが発見されたならば、
サンプルリガンドと企図したリガンド類縁体の両方を結
合し得るテスト受容体を得なければならない。
サンプルリガンドと企図したリガンド類縁体の両方を結
合し得るテスト受容体を得なければならない。
タンパクを不溶化する技術は広く普及しており、そして
イムノアッセイ技術においては普通の使用であるため、
水溶性タンパク置換リガンドを水不溶性選択結合リガン
ド類縁体を製造するための出発物質として使用するのに
好ましい。リガンド類縁体のタンパク成分は、アッセイ
の操作の間標識したリガンド受容体とのインキュベーシ
ョンの前または後で不溶性化することができるが、リガ
ンド置換タンパクをアッセイ実施前に不溶性化すること
が好ましい。これは、好ましくはそれを公知方法に従っ
てポリオレフィン試験管内壁へ吸着させるだけを含む、
種々の方法によって達成することができる。タンパクは
その代わりにグルタルアルデヒドのような試薬で架橋
し、そして試験管壁へ吸着させることができる。
イムノアッセイ技術においては普通の使用であるため、
水溶性タンパク置換リガンドを水不溶性選択結合リガン
ド類縁体を製造するための出発物質として使用するのに
好ましい。リガンド類縁体のタンパク成分は、アッセイ
の操作の間標識したリガンド受容体とのインキュベーシ
ョンの前または後で不溶性化することができるが、リガ
ンド置換タンパクをアッセイ実施前に不溶性化すること
が好ましい。これは、好ましくはそれを公知方法に従っ
てポリオレフィン試験管内壁へ吸着させるだけを含む、
種々の方法によって達成することができる。タンパクは
その代わりにグルタルアルデヒドのような試薬で架橋
し、そして試験管壁へ吸着させることができる。
リガンド置換タンパクは、アッセイ操作後ポリエチレン
グリコールの存在下抗タンパクによる免疫沈澱によって
不溶性化することができる。
グリコールの存在下抗タンパクによる免疫沈澱によって
不溶性化することができる。
その代わりに、リガンドは内因性受容体との結合に重要
であることがあらかじめ判明している基を通じ、不溶性
基質へ直接共有結合させることができる。適当な手法は
アフィニティークロマトグラフィー技術から良く知られ
ている。
であることがあらかじめ判明している基を通じ、不溶性
基質へ直接共有結合させることができる。適当な手法は
アフィニティークロマトグラフィー技術から良く知られ
ている。
タンパク置換リガンドは、それらは当該テストにおいて
受容体として作用する抗体をつくるための免疫原として
も使用できるので好ましい。タンパク置換リガンドは、
治療および診断技術における抗血清製造の慣用操作に使
用するための免疫原として一般に良く知られている。そ
れらの合成および使用は通常の当業者の伎倆範囲内であ
る。しかしながら、内因性受容体と容体と少ししかもし
くは全く結合しないタンパク置換リガンドのみが本発明
において使用価値があることが明らかでなければならな
い。
受容体として作用する抗体をつくるための免疫原として
も使用できるので好ましい。タンパク置換リガンドは、
治療および診断技術における抗血清製造の慣用操作に使
用するための免疫原として一般に良く知られている。そ
れらの合成および使用は通常の当業者の伎倆範囲内であ
る。しかしながら、内因性受容体と容体と少ししかもし
くは全く結合しないタンパク置換リガンドのみが本発明
において使用価値があることが明らかでなければならな
い。
リガンドはタンパクへ結合すること以外の方法で変性す
ることができる。そのような場合、テスト受容体（抗
体）は、前に引用した欧州特許出願中に示された態様
で、すなわち選択結合リガンド類縁体と少なくとも構造
的に周族である免疫原に対する抗血清を産生させること
によって製造することができる。
ることができる。そのような場合、テスト受容体（抗
体）は、前に引用した欧州特許出願中に示された態様
で、すなわち選択結合リガンド類縁体と少なくとも構造
的に周族である免疫原に対する抗血清を産生させること
によって製造することができる。
抗リガンド抗対は好ましくは採取した血清から精製され
る。これは慣用であり、そして免疫グロブリンを分離す
るためエタノールもしくはポリエチレングリコールによ
る沈澱と、続いて不溶性選択結合リガンド類縁体上のア
フィにティクロマトグラフィーのような手法を一般に伴
うであろう。その代わりに、該抗体を生産するクローン
の細胞からハイブリドーマを製造することができる。該
抗体は１０11リットル／モルのオーダーの平衡定数を持
っていなければならない。
る。これは慣用であり、そして免疫グロブリンを分離す
るためエタノールもしくはポリエチレングリコールによ
る沈澱と、続いて不溶性選択結合リガンド類縁体上のア
フィにティクロマトグラフィーのような手法を一般に伴
うであろう。その代わりに、該抗体を生産するクローン
の細胞からハイブリドーマを製造することができる。該
抗体は１０11リットル／モルのオーダーの平衡定数を持
っていなければならない。
次に精製した抗体は、酵素、螢光基、化学発光基、また
は放射性原子のような検出できる基で標識することがで
きる。しかしながら、抗リガンド抗体を生成させた動物
種の血清に対する第２の抗血清もしくは抗体を標識する
ことが好ましい。この標識した第２の抗血清は、それを
任意の遊離リガンドアッセイに使用できる点で万能トレ
ーサー試薬である。そのような試薬は、抗体と、不溶性
受容体と既に結合している小分子リガンドとは有効に結
合できないので、英国特許出願第２，０３０，２９０号
の方法には使用できなかったであろう。同じ理由によ
り、そのような試薬は、開示されているリガンド類縁体
の大部分が小分子であるので、欧州特許出願第００２６
１０３号の方法において普遍的に使用できなかった。開
示されたタンパク置換リガンドに関してさえも、置換の
部位はリガンドに応じて変わり、そのため一種の抗血清
を普遍的に使用できなかった。
は放射性原子のような検出できる基で標識することがで
きる。しかしながら、抗リガンド抗体を生成させた動物
種の血清に対する第２の抗血清もしくは抗体を標識する
ことが好ましい。この標識した第２の抗血清は、それを
任意の遊離リガンドアッセイに使用できる点で万能トレ
ーサー試薬である。そのような試薬は、抗体と、不溶性
受容体と既に結合している小分子リガンドとは有効に結
合できないので、英国特許出願第２，０３０，２９０号
の方法には使用できなかったであろう。同じ理由によ
り、そのような試薬は、開示されているリガンド類縁体
の大部分が小分子であるので、欧州特許出願第００２６
１０３号の方法において普遍的に使用できなかった。開
示されたタンパク置換リガンドに関してさえも、置換の
部位はリガンドに応じて変わり、そのため一種の抗血清
を普遍的に使用できなかった。
アッセイに使用される抗リガンド抗体の量は、定量すべ
きサンプル中に予期される遊離リガンドと、不溶性選択
結合リガンド類縁体としてのリガンドの見掛け濃度との
合計よりも少なくなければならない。これは、もっとも
満足な用量反応曲線が得られるまで、抗リガンド抗体の
種々の希釈液を使用して既知遊離リガンド濃度の広範囲
を有するテストサンプルのパネルをアッセイすることに
より、最善に決定される。
きサンプル中に予期される遊離リガンドと、不溶性選択
結合リガンド類縁体としてのリガンドの見掛け濃度との
合計よりも少なくなければならない。これは、もっとも
満足な用量反応曲線が得られるまで、抗リガンド抗体の
種々の希釈液を使用して既知遊離リガンド濃度の広範囲
を有するテストサンプルのパネルをアッセイすることに
より、最善に決定される。
選択結合リガンド類縁体の量、標識した受容体の能力お
よび親和力、インキュベーションの温度および時間、そ
れにこの方法の他のパラメーターはケース毎にこの技術
で慣用のルーチンな実験によって決定すべきである。簡
単にいえば、これはテストサンプル中に予期される遊離
リガンド濃度範囲にわたって適当な用量反応曲線が得ら
れるまで、パラメーターを調節することを伴う。
よび親和力、インキュベーションの温度および時間、そ
れにこの方法の他のパラメーターはケース毎にこの技術
で慣用のルーチンな実験によって決定すべきである。簡
単にいえば、これはテストサンプル中に予期される遊離
リガンド濃度範囲にわたって適当な用量反応曲線が得ら
れるまで、パラメーターを調節することを伴う。
ケース毎にアッセイを最適化するのに要する仕事量は、
以下の式に従っていくつかのパラメータの事前推計を実
施することによって減らすことができる。
以下の式に従っていくつかのパラメータの事前推計を実
施することによって減らすことができる。
式中〔ｆＨ〕＝平衡（平衡透析によって決定できるよう
な）時の遊離リガンド濃度 〔Ｒ＊）＝標識受容体の濃度 ＫＲ＝受容体結合部位の平衡定数 ｂ＝不溶性選択結合リガンド類縁体と結合した標識抗体
の割合（分数） 用量反応曲線はこの式から決定できるが、しかしこれは
抗体結合部位の単一オーダーと、そして遊離リガンドと
そして不溶性リガンドに対し標識受容体の同じ結合力を
仮定している。特に後者は大部分の場合あり得ようもな
く、そのため上の式は時間と実験を節約するガイドと考
えるべきである。諸パラメーターは実験的努力によって
最適アッセイ成績のために最適化されなければならない
であろう。
な）時の遊離リガンド濃度 〔Ｒ＊）＝標識受容体の濃度 ＫＲ＝受容体結合部位の平衡定数 ｂ＝不溶性選択結合リガンド類縁体と結合した標識抗体
の割合（分数） 用量反応曲線はこの式から決定できるが、しかしこれは
抗体結合部位の単一オーダーと、そして遊離リガンドと
そして不溶性リガンドに対し標識受容体の同じ結合力を
仮定している。特に後者は大部分の場合あり得ようもな
く、そのため上の式は時間と実験を節約するガイドと考
えるべきである。諸パラメーターは実験的努力によって
最適アッセイ成績のために最適化されなければならない
であろう。
実施例１ この実施例は代表的な遊離リガンドアッセイを記載す
る。定量される遊離リガンドはＬ−チロキシンである。
る。定量される遊離リガンドはＬ−チロキシンである。
精製した標識抗チロキシン抗体の製造 それ自体公知の方法を使用して、Ｌ−チロキシンメチル
エステルをカルボジイミドによってウシ血清アルブミン
へ結合した。免疫グロブリン分画抗血清を以下の操作に
よってＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）セルロースへ
の結合からの除外により、該免疫グロブリン分画へ精製
した。抗血清１ｍを水３ｍで希釈し、湿った水洗し
たＤＥＡＥセルロース８ｇへ加えた。３７℃で１時間イ
ンキュベーション後、上清液をロ過によって除去し、１
０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８．０の５ｍづつによるＤＥ
ＡＥセルロースの４洗液の上清と合した。合併した上清
は圧力限外ロ過によって最終濃度８mg／ｍへ濃縮し
た。
エステルをカルボジイミドによってウシ血清アルブミン
へ結合した。免疫グロブリン分画抗血清を以下の操作に
よってＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）セルロースへ
の結合からの除外により、該免疫グロブリン分画へ精製
した。抗血清１ｍを水３ｍで希釈し、湿った水洗し
たＤＥＡＥセルロース８ｇへ加えた。３７℃で１時間イ
ンキュベーション後、上清液をロ過によって除去し、１
０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ８．０の５ｍづつによるＤＥ
ＡＥセルロースの４洗液の上清と合した。合併した上清
は圧力限外ロ過によって最終濃度８mg／ｍへ濃縮し
た。
精製用および精製抗体のヨード化用アフィニティーカラ
ムは以下のように調製した。洗浄し、パックしたアミノ
誘導体セファローズ（ＡＨ−セファロース４Ｂ；ファル
マシア、スウェーデン国ウプサラ）１０ｍを、あらか
じめチロキシン遊離酸５２mgを加えた５０％水性ジメチ
ルホルムアミド（５０％ＤＭＦ）１０ｍへ加えた。希
ＨＣｌを加えてｐＨを４．５へ調節した。これへ、あら
かじめ１−エチル−３−（３−ジエチルアミノ）プロピ
ルカルボジイミド５００mgを加えた水３ｍを５分間に
わたり滴下した。室温で２０時間振とう後、誘導体化セ
ファロースを５０％ＤＭＦおよび水の十分な量で洗い、
最後に２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４中に懸濁した。
ムは以下のように調製した。洗浄し、パックしたアミノ
誘導体セファローズ（ＡＨ−セファロース４Ｂ；ファル
マシア、スウェーデン国ウプサラ）１０ｍを、あらか
じめチロキシン遊離酸５２mgを加えた５０％水性ジメチ
ルホルムアミド（５０％ＤＭＦ）１０ｍへ加えた。希
ＨＣｌを加えてｐＨを４．５へ調節した。これへ、あら
かじめ１−エチル−３−（３−ジエチルアミノ）プロピ
ルカルボジイミド５００mgを加えた水３ｍを５分間に
わたり滴下した。室温で２０時間振とう後、誘導体化セ
ファロースを５０％ＤＭＦおよび水の十分な量で洗い、
最後に２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４中に懸濁した。
抗チロキシン抗体の精製およびヨード化は以下のように
実施した。パックしたチロキシン誘導体化セファロース
２ｍへ２５ｍＭリン酸緩衝化食塩水（ｐＨ７．４）４
ｍと、精製したウサギ免疫グロブリン含有抗チロキシ
ン２００μを加えた。混合物を室温で４８時間振とう
し、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４の１２ｍづつで
２回洗った。セファロース１ｍを後で使用するため残
した。２．０ｍの０．５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４
を湿ったゲルの他の１ｍへ加え、そして水酸化ナトリ
ウム１０μ中の125Ｉ（アマーシャム社、英国）１μC
iを加えた。次に新しいクロラミンＴ７ｍ／ｍ水溶
液４０ｍを加えた。室温で６０秒混合した後、新しい
メタ重亜硫酸ナトリウム水溶液８０μを加えた。ヨー
ド化したゲルをガラスカラムに充填したビオゲルＰ２
（ビオラッド社、カリフォルニア州リッチモンド）３ｍ
のトップへ加えた。別に取っておいたヨード化してい
ないゲル１ｍも同様にカラム中に入れた。両方のカラ
ムを同じ手法を使用して溶離した。カラムを２５ｍの
１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４と、次に２０ｍの
０．１Ｍクエン酸ナトリウムで洗った。０．１Ｍクエン
酸二ナトリウム（５０ｍ）と０．１Ｍ塩酸（５０ｍ
）との比例混液よりなる濃度勾配液１００ｍを加え
た。分画は０．５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４中へ直接集
めた。ヨード化したゲルカラムに関しては、ｐＨ２．５
および１．５の間で溶離する分画がピーク放射能を含有
し、そしてプールした。放射標識しない抗体からの分画
の分析は平衡会合定数３．０×１０11Ｍ-1を有する高い
特異性抗体を示した。放射標識した抗体の比活性は２．
８５×１０７mCi／ｍモルであった。
実施した。パックしたチロキシン誘導体化セファロース
２ｍへ２５ｍＭリン酸緩衝化食塩水（ｐＨ７．４）４
ｍと、精製したウサギ免疫グロブリン含有抗チロキシ
ン２００μを加えた。混合物を室温で４８時間振とう
し、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４の１２ｍづつで
２回洗った。セファロース１ｍを後で使用するため残
した。２．０ｍの０．５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４
を湿ったゲルの他の１ｍへ加え、そして水酸化ナトリ
ウム１０μ中の125Ｉ（アマーシャム社、英国）１μC
iを加えた。次に新しいクロラミンＴ７ｍ／ｍ水溶
液４０ｍを加えた。室温で６０秒混合した後、新しい
メタ重亜硫酸ナトリウム水溶液８０μを加えた。ヨー
ド化したゲルをガラスカラムに充填したビオゲルＰ２
（ビオラッド社、カリフォルニア州リッチモンド）３ｍ
のトップへ加えた。別に取っておいたヨード化してい
ないゲル１ｍも同様にカラム中に入れた。両方のカラ
ムを同じ手法を使用して溶離した。カラムを２５ｍの
１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４と、次に２０ｍの
０．１Ｍクエン酸ナトリウムで洗った。０．１Ｍクエン
酸二ナトリウム（５０ｍ）と０．１Ｍ塩酸（５０ｍ
）との比例混液よりなる濃度勾配液１００ｍを加え
た。分画は０．５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４中へ直接集
めた。ヨード化したゲルカラムに関しては、ｐＨ２．５
および１．５の間で溶離する分画がピーク放射能を含有
し、そしてプールした。放射標識しない抗体からの分画
の分析は平衡会合定数３．０×１０11Ｍ-1を有する高い
特異性抗体を示した。放射標識した抗体の比活性は２．
８５×１０７mCi／ｍモルであった。
不溶性選択結合チロキシンリガンド類縁体の製造 Ｌ−チロキシン１．０ｇをジメチルスルホキシド２０ｍ
に溶解し、これへＮ−メチルモルホリン２当量を加え
た。ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ，ピアース
・ケミカル・カンパニー，ニュージャージー州）をこの
溶液へ加え、そして混合物を室温で３０分間混合した。
この溶液を水酸化ナトリウム溶液の添加によってｐＨを
１０．０へ調節した５０％ＤＭＦ４００ｍに溶かした
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２ｇの溶液へ加えた。こ
の混合物を室温で２時間かきまぜ、そしてｐＨを水酸化
ナトリウム溶液の滴下によって１０．０に保った。次に
溶液を５０％ＤＭＦ２に対し２回４℃で４８時間透析
し、次に０．１ｍＭ水酸化ナトリウム溶液６に対し４
℃で一夜、そして最後に水６で８時間間隔で５回４℃
で透析した。生成する透析物は凍結乾燥した。
に溶解し、これへＮ−メチルモルホリン２当量を加え
た。ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ，ピアース
・ケミカル・カンパニー，ニュージャージー州）をこの
溶液へ加え、そして混合物を室温で３０分間混合した。
この溶液を水酸化ナトリウム溶液の添加によってｐＨを
１０．０へ調節した５０％ＤＭＦ４００ｍに溶かした
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２ｇの溶液へ加えた。こ
の混合物を室温で２時間かきまぜ、そしてｐＨを水酸化
ナトリウム溶液の滴下によって１０．０に保った。次に
溶液を５０％ＤＭＦ２に対し２回４℃で４８時間透析
し、次に０．１ｍＭ水酸化ナトリウム溶液６に対し４
℃で一夜、そして最後に水６で８時間間隔で５回４℃
で透析した。生成する透析物は凍結乾燥した。
セファデックスＧ１００（ファルマシア、スウェー国ウ
プサラ）を２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４中に平衡化
し、ガラスカラム中に注ぎ、ＰＨＯＳ中の１％ＢＳＡ溶
液２００ｍで洗い、そして最後にそれ以上タンパクが
溶離しなくなるまでＰＨＯＳで洗った。Ｌ−チロキシン
−ＤＳＳ−ＢＳＡ複合体１０mgをＰＨＳＯ１ｍに溶か
し、ＰＨＯＳで溶離した。４つのタンパクピークが観察
された。溶離する最後のピークをプールし、そして凍結
乾燥によって濃縮した。この物質の一部のヨード化はク
ロラミンＴ法によって実施され、そして前もって甲状腺
ホルモンを除去するため活性炭で処理した血清中の血清
タンパクへ結合しないことが見出された。この物質は、
標準の第２抗体分離ラジオイムノアッセイ法によって示
されるように精製した抗チロキシン抗体から125Ｉ−チ
ロキシンを置換しない。
プサラ）を２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４中に平衡化
し、ガラスカラム中に注ぎ、ＰＨＯＳ中の１％ＢＳＡ溶
液２００ｍで洗い、そして最後にそれ以上タンパクが
溶離しなくなるまでＰＨＯＳで洗った。Ｌ−チロキシン
−ＤＳＳ−ＢＳＡ複合体１０mgをＰＨＳＯ１ｍに溶か
し、ＰＨＯＳで溶離した。４つのタンパクピークが観察
された。溶離する最後のピークをプールし、そして凍結
乾燥によって濃縮した。この物質の一部のヨード化はク
ロラミンＴ法によって実施され、そして前もって甲状腺
ホルモンを除去するため活性炭で処理した血清中の血清
タンパクへ結合しないことが見出された。この物質は、
標準の第２抗体分離ラジオイムノアッセイ法によって示
されるように精製した抗チロキシン抗体から125Ｉ−チ
ロキシンを置換しない。
固相抗原はＬ−チロキシン−ＤＳＳ−ＢＳＡ複合体から
以下のようにして製造された。セファロース４Ｂ（ファ
ルマシア、スウェーデン）をCuatrecasasの方法Cuatrec
asas,P.,J.BiO.Chem.,２４５，３０５９（１９７０））
によって臭化シアンで活性化した。活性化したセファロ
ース１ｍへ０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．５の１０ｍ
に溶かした凍結乾燥Ｌ−チロキシン−ＤＳＳ−ＢＳＡ
０．１mgを加えた。室温で１６時間反応後、セファロー
スへ結合したＬ−チロキシン−ＤＳＳ−ＢＳＡ複合体を
５０％ＤＭＦおよび水でよく洗い、そして最後に２５ｍ
Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４の１０ｍへ再懸濁した。
以下のようにして製造された。セファロース４Ｂ（ファ
ルマシア、スウェーデン）をCuatrecasasの方法Cuatrec
asas,P.,J.BiO.Chem.,２４５，３０５９（１９７０））
によって臭化シアンで活性化した。活性化したセファロ
ース１ｍへ０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．５の１０ｍ
に溶かした凍結乾燥Ｌ−チロキシン−ＤＳＳ−ＢＳＡ
０．１mgを加えた。室温で１６時間反応後、セファロー
スへ結合したＬ−チロキシン−ＤＳＳ−ＢＳＡ複合体を
５０％ＤＭＦおよび水でよく洗い、そして最後に２５ｍ
Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４の１０ｍへ再懸濁した。
セファロースへ結合した複合体の逓倍希釈は２５ｍＭリ
ン酸緩衝液ｐＨ７．５中の未反応セファロースの１０ｖ
／ｖ％懸濁液を用いて行われた。このアッセイ系は以下
の手法を用いて最適化された。セファロース／セファロ
ース複合体１００μ，活性炭処理ヒト血清５０μ，
および９００μの２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４中
の125Ｉ−抗チロキシン抗体150,000cpmを混合した。こ
の混合物を37℃で４時間振とうしながらインキュベート
した。インキュベーション後、セファロースを遠心によ
り沈降させ、上清を捨て、次に２５ｍＭリン酸緩衝液を
加えた。ボルテックス混合後、セファロースを再沈降さ
せ、上清を除去し、固相中の放射能を測定した。固相へ
接合した放射能約60,000を得た。セファロース希釈液，
典型的に１：100,000を選択した。既に平衡透析法で測
定された遊離Ｔ４値を有するヒト血清サンプルを上のセ
ファロース組成物希釈液を使用して最適化されたアッセ
イ系においてアッセイした。本発明方法と平衡透析との
間に満足な相関関係が観察された。
ン酸緩衝液ｐＨ７．５中の未反応セファロースの１０ｖ
／ｖ％懸濁液を用いて行われた。このアッセイ系は以下
の手法を用いて最適化された。セファロース／セファロ
ース複合体１００μ，活性炭処理ヒト血清５０μ，
および９００μの２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４中
の125Ｉ−抗チロキシン抗体150,000cpmを混合した。こ
の混合物を37℃で４時間振とうしながらインキュベート
した。インキュベーション後、セファロースを遠心によ
り沈降させ、上清を捨て、次に２５ｍＭリン酸緩衝液を
加えた。ボルテックス混合後、セファロースを再沈降さ
せ、上清を除去し、固相中の放射能を測定した。固相へ
接合した放射能約60,000を得た。セファロース希釈液，
典型的に１：100,000を選択した。既に平衡透析法で測
定された遊離Ｔ４値を有するヒト血清サンプルを上のセ
ファロース組成物希釈液を使用して最適化されたアッセ
イ系においてアッセイした。本発明方法と平衡透析との
間に満足な相関関係が観察された。
実施例 ２ この実施例においては、不溶性選択結合リガンド類縁体
は、セファロース複合体の代わりに被覆されたプラスチ
ック試験管である。
は、セファロース複合体の代わりに被覆されたプラスチ
ック試験管である。
実施例１からの精製したＬ−チロキシン−ＤＳＳ−ＢＳ
Ａは北川および金丸の方法（北川、金丸，Enzyme Label
led Immunoassay of Hormones and Drugs,W.de Gruyte
r,New York,Berlin,1978,page 59）の変法によって正常
マウスイムノグロブリンへ結合された。実施例１からの
純Ｌ−チロキシン−ＤＳＳ−ＢＳＡ１mgを５ｍの５０
ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０へ溶かした。これへｍ−マ
レイミドベンゾイルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル（ＭＢＳ，ピアース・ケミカル・カンパニー）のテ
トラヒドロフラン中１０mg／ｍ溶液７５μを加え
た。室温で３０時間反応後、混合物をセファデックスＧ
１０カラムを通過させ、５０ｍＭリン酸緩衝液で溶離し
た。溶離する最初のタンパク分画を採取し、プールし、
そして真空脱気し、そして窒素で平衡化した。実施例１
のＤＥＡＥ法によって正常マウス血清から製造した正常
マウスイムノグロブリンＧ２．０mgを、ジチオスレイト
ール（ＤＴＴ，アルドリッチ・ケミカル・カンパニー）
０．５mgを含有する、脱気しそして窒素平衡化した２０
０ｍＭTRIS・HCl緩衝液ｐＨ８．６中の８Ｍ尿素２ｍ
に溶かした。この混合物を窒素中で室温で２時間かきま
ぜた。インキュベーション後、混合物をＤＴＴを除去す
るためセファデックスＧ１００カラムを通し、脱気しそ
して窒素で平衡化した２００ｍＭTRIS・HClで平衡化
し、溶離した。タンパク性のボイドボリューム分画をプ
ールした。ＭＢＳ活性化抗原溶液を尿素中８Ｍとし、そ
して次に還元したＩｇＧ溶液と混合し、室温で窒素中２
時間かきまぜた。得られる溶液を毎回６の２５ｍＭリ
ン酸緩衝液ｐＨ７．４で１２時間４回透析した。透析物
を限外ロ過により最終容積２．０ｍへ濃縮した。
Ａは北川および金丸の方法（北川、金丸，Enzyme Label
led Immunoassay of Hormones and Drugs,W.de Gruyte
r,New York,Berlin,1978,page 59）の変法によって正常
マウスイムノグロブリンへ結合された。実施例１からの
純Ｌ−チロキシン−ＤＳＳ−ＢＳＡ１mgを５ｍの５０
ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０へ溶かした。これへｍ−マ
レイミドベンゾイルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル（ＭＢＳ，ピアース・ケミカル・カンパニー）のテ
トラヒドロフラン中１０mg／ｍ溶液７５μを加え
た。室温で３０時間反応後、混合物をセファデックスＧ
１０カラムを通過させ、５０ｍＭリン酸緩衝液で溶離し
た。溶離する最初のタンパク分画を採取し、プールし、
そして真空脱気し、そして窒素で平衡化した。実施例１
のＤＥＡＥ法によって正常マウス血清から製造した正常
マウスイムノグロブリンＧ２．０mgを、ジチオスレイト
ール（ＤＴＴ，アルドリッチ・ケミカル・カンパニー）
０．５mgを含有する、脱気しそして窒素平衡化した２０
０ｍＭTRIS・HCl緩衝液ｐＨ８．６中の８Ｍ尿素２ｍ
に溶かした。この混合物を窒素中で室温で２時間かきま
ぜた。インキュベーション後、混合物をＤＴＴを除去す
るためセファデックスＧ１００カラムを通し、脱気しそ
して窒素で平衡化した２００ｍＭTRIS・HClで平衡化
し、溶離した。タンパク性のボイドボリューム分画をプ
ールした。ＭＢＳ活性化抗原溶液を尿素中８Ｍとし、そ
して次に還元したＩｇＧ溶液と混合し、室温で窒素中２
時間かきまぜた。得られる溶液を毎回６の２５ｍＭリ
ン酸緩衝液ｐＨ７．４で１２時間４回透析した。透析物
を限外ロ過により最終容積２．０ｍへ濃縮した。
この溶液１ｍをリン酸緩衝液で１０倍逓倍希釈し、希
釈液１ｍをポリプロピレン１２×７５mm試験管へ加え
た。１２時間静置後、試験管を吸引乾燥し、１４μｇ／
ｍ正常マウス抗体溶液１．０ｍをすべての試験管へ
加えた。２時間静置後、試験管を吸引し、リン酸緩衝液
で洗い、乾燥した。逓倍希釈したＬ−チロキシン−ＤＳ
Ｓ−ＢＳＡ複合体を含有する被覆試験管のめいめいへ、
活性炭処理ヒト血清５０μと、実施例１で製造した
125Ｉ標識抗チロキシンＩｇＧ（150,000cpm）とを加え
た。
釈液１ｍをポリプロピレン１２×７５mm試験管へ加え
た。１２時間静置後、試験管を吸引乾燥し、１４μｇ／
ｍ正常マウス抗体溶液１．０ｍをすべての試験管へ
加えた。２時間静置後、試験管を吸引し、リン酸緩衝液
で洗い、乾燥した。逓倍希釈したＬ−チロキシン−ＤＳ
Ｓ−ＢＳＡ複合体を含有する被覆試験管のめいめいへ、
活性炭処理ヒト血清５０μと、実施例１で製造した
125Ｉ標識抗チロキシンＩｇＧ（150,000cpm）とを加え
た。
３７℃で４時間インキュベーション後、溶液を吸引し、
試験管へ結合した放射能を測定した。125Ｉ抗チロキシ
ン抗体の150,000cpmの約４０％を被覆時結合した複合体
希釈液を選び、上の方法で十分な数の試験管をこの希釈
液で被覆した。これら試験管を使用し、上と同じ方法で
ヒト血清遊離チロキシン標準液と、次に125Ｉ抗チロキ
シンを添加することによって、標準曲線が得られた。
試験管へ結合した放射能を測定した。125Ｉ抗チロキシ
ン抗体の150,000cpmの約４０％を被覆時結合した複合体
希釈液を選び、上の方法で十分な数の試験管をこの希釈
液で被覆した。これら試験管を使用し、上と同じ方法で
ヒト血清遊離チロキシン標準液と、次に125Ｉ抗チロキ
シンを添加することによって、標準曲線が得られた。
実施例１と同じく、遊離チロキシン濃度増加とともに、
トレーサー結合の満足な抑制曲線が観察された。既知遊
離チロキシン濃度のヒトサンプルを測定するためこの標
準曲線の使用は、既知方法との良い相関関係を与えた。
トレーサー結合の満足な抑制曲線が観察された。既知遊
離チロキシン濃度のヒトサンプルを測定するためこの標
準曲線の使用は、既知方法との良い相関関係を与えた。
実施例３ この実施例は実施例２と似ているが、しかし万能な第２
の抗体、すなわち前の実施例で製造された抗チロキシン
抗体に特異的な種によって発生する放射能が供給され
る。
の抗体、すなわち前の実施例で製造された抗チロキシン
抗体に特異的な種によって発生する放射能が供給され
る。
この実施例のトレーサーは125Ｉ標識ヤギ抗ウサギＩｇ
Ｇ抗体である。これは以下の方法で製造された。実施例
１からの精製したウサギＩｇＧ１０μｇをCuatrecassas
（前出Cuarecassas,P.）の方法を使用して臭化シアン活
性化セファロース４Ｂ１ｇを加えた。反応生成物を１０
ｍの２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４へ懸濁した。標
準的方法によってヤギから引き出したヤギ抗ウサギＩｇ
Ｇ抗血清１００μを反応生成物懸濁液へ加えた。７２
時間インキュベート後、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗血清をヨ
ード化し、実施例１に記載した抗チロキシンと同じ方法
で精製した。
Ｇ抗体である。これは以下の方法で製造された。実施例
１からの精製したウサギＩｇＧ１０μｇをCuatrecassas
（前出Cuarecassas,P.）の方法を使用して臭化シアン活
性化セファロース４Ｂ１ｇを加えた。反応生成物を１０
ｍの２５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４へ懸濁した。標
準的方法によってヤギから引き出したヤギ抗ウサギＩｇ
Ｇ抗血清１００μを反応生成物懸濁液へ加えた。７２
時間インキュベート後、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗血清をヨ
ード化し、実施例１に記載した抗チロキシンと同じ方法
で精製した。
このトレーサーを使用するアッセイは以下のように構成
した。最適Ｌ−チロキシン−ＤＳＳ−ＢＳＡ−ＩｇＧ希
釈液（実施例２）で被覆した被覆試験管へ、活性炭処理
したヒト血清５０μと、そして２５ｍＭリン酸緩衝液
中の、実施例１と同様に精製した非標識特異抗チロキシ
ン抗体の種々の希釈液９００μを加えた。試験管を３
２℃で４時間平衡化させた後、溶液を吸引によって除去
した。リン酸緩衝液中125Ｉヤギ抗ウサギＩｇＧ500,000
cpmを加えた。37℃で２時間インキュベーション後、液
体を吸引し、そして固相へ結合した放射能を測定した。
ヤギ抗ウサギＩｇＧ放射能の１０％結合を与えた非標識
特異抗チロキシン抗体希釈液を検索した。
した。最適Ｌ−チロキシン−ＤＳＳ−ＢＳＡ−ＩｇＧ希
釈液（実施例２）で被覆した被覆試験管へ、活性炭処理
したヒト血清５０μと、そして２５ｍＭリン酸緩衝液
中の、実施例１と同様に精製した非標識特異抗チロキシ
ン抗体の種々の希釈液９００μを加えた。試験管を３
２℃で４時間平衡化させた後、溶液を吸引によって除去
した。リン酸緩衝液中125Ｉヤギ抗ウサギＩｇＧ500,000
cpmを加えた。37℃で２時間インキュベーション後、液
体を吸引し、そして固相へ結合した放射能を測定した。
ヤギ抗ウサギＩｇＧ放射能の１０％結合を与えた非標識
特異抗チロキシン抗体希釈液を検索した。
活性炭処理ヒト血清を遊離チロキシン濃度既知の正常ヒ
ト血清標準液で置換することにより、遊離ホルモン濃度
が増加するにつれてヤギ125Ｉ抗ウサギＩｇＧの結合が
減少した標準曲線が得られた。患者のサンプルを測定す
るために使用した時、この方法は再び遊離チロキシン測
定のための証明された参照方法とよく相関した。
ト血清標準液で置換することにより、遊離ホルモン濃度
が増加するにつれてヤギ125Ｉ抗ウサギＩｇＧの結合が
減少した標準曲線が得られた。患者のサンプルを測定す
るために使用した時、この方法は再び遊離チロキシン測
定のための証明された参照方法とよく相関した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エキンズ・ロジヤ−・フイリツプ 英国ロンドンＷＩＮ８ＡＡモ−テイマ−ス トリ−ト・ミドルセツクス・ホスピタル・ メデイカル・スク−ル・インステイテユ− ト・オブ・ニユ−クリア・メデイシン（番 地なし) (56)参考文献 特開 昭56−51665（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−44622（ＪＰ，Ａ)
Claims (15)
- 【請求項１】リガンドが一種またはそれ以上の内因性受
容体と結合した形でも共存するテストサンプル中の遊離
リガンドの量を測定する方法であって、 （ｉ）テストサンプルと、（ii）直接または間接に標識
されかつ前期リガンドと結合する外因性リガンド受容体
と、（iii）不溶化された、または分析操作の一部とし
て不溶化でき、かつ前記外因性リガンド受容体とは結合
するがしかし前記内因性受容体のいずれとも結合しない
標識しないリガンド類縁体（選択結合リガンド類縁体）
を混合するステップと、 遊離リガンドと前記選択結合リガンド類縁体とが前記外
因性リガンド受容体に対して競合することを許容すうよ
うに混合物をインキュベートするステップと、 前記選択結合リガンド類縁体を前記混合物の残りの成分
から分離するステップと、 前記遊離リガンドと結合した、または選択結合リガンド
類縁体と結合した前記外因性リガンド受容体の量を測定
するステップと、そして 測定した結合した外因性リガンド受容体の量をテストサ
ンプル中に存在する遊離リガンドの量と相関させるステ
ップ を含むことを特徴とする遊離リガンドの測定方法。 - 【請求項２】前記選択結合リガンド類縁体自体が不溶性
である請求の範囲第１項の方法。 - 【請求項３】前記外因性リガンド受容体は抗体である請
求の範囲第２項の方法。 - 【請求項４】前記外因性リガンド受容体はテストサンプ
ルと混合され、そして遊離リガンドの実質量を結合する
のに十分な時間インキュベートされ、その後インキュベ
ートした混合物が不溶性選択結合リガンド類縁体と混合
される請求の範囲第３項の方法。 - 【請求項５】前記外因性リガンド受容体、テストサンプ
ルおよび選択結合リガンド類縁体は実質上同時に混合さ
れる請求の範囲第３項の方法。 - 【請求項６】前記外因性リガンド受容体はＳ．ａｕｒｅ
ｕｓからのタンパクＡである請求の範囲第２項の方法。 - 【請求項７】前記外因性リガンド受容体はトレーサーに
よる共有結合置換により標識されている請求の範囲第１
項の方法。 - 【請求項８】トレーサーはラジオアイソトープである請
求の範囲第７項の方法。 - 【請求項９】前記遊離リガンドは遊離チロキシンであ
り、前記直接または間接に標識されかつ前記リガンドと
結合する外因性リガンド受容体（ii）は抗チロキシン抗
体と、抗チロキシン抗体に対する標識した抗体であり、
前記不溶化された標識しないリガンド類縁体（iii）は
プラスチック容器の壁へ吸着されたタンパクへ共有結合
したチロキシン類縁体である請求の範囲第１項の方法。 - 【請求項１０】リガンドが一種またはそれ以上の内因性
受容体と結合した形でも共存するテストサンプル中の遊
離リガンドの量を測定するためのキットであって、 （ａ）直接または間接に標識されかつ前記リガンドと結
合する外因性リガンド受容体を既知濃度で含む試薬と、 （ｂ）不溶化された、または分析操作の一部として不溶
化でき、かつ前記外因性リガンド受容体とは結合するが
しかし前記内因性受容体のいずれとも結合しな標識しな
いリガンド類縁体（選択結合類縁体）と、そして （ｃ）前記リガンドの標準液 との組合せを含むことを特徴とする遊離リガンド測定用
キット。 - 【請求項１１】前記標識しないリガンド類縁体は、
（ｉ）水不溶性基質に、サンプル中に存在する内因性受
容体が実質上結合しないような態様で共有結合したリガ
ンドか、または（ii）水不溶性基質へ吸着させた水溶性
物質と、サンプル中に存在する内因性受容体が実質上結
合しないような態様で共有結合したリガンドよりなる請
求の範囲第１０項のキット。 - 【請求項１２】前記水溶性物質はタンパクである請求の
範囲第１１項のキット。 - 【請求項１３】前記リガンドはホルモンまたは薬物であ
る請求の範囲第１１項または第１２項のキット。 - 【請求項１４】前記リガンドはチロキシンである請求の
範囲第１３項のキット。 - 【請求項１５】前記水不溶性基質はポリオレフィン表面
である請求の範囲第１１項または第１２項のキット。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8208043 | 1982-03-19 | ||
| GB8208043REJP | 1982-03-19 | ||
| GB8208043 | 1982-03-19 | ||
| PCT/GB1983/000078 WO1983003306A1 (en) | 1982-03-19 | 1983-03-17 | Method and composition for free ligand assays |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5344249A Division JP2599096B2 (ja) | 1982-03-19 | 1993-12-17 | 遊離リガンドアッセイのための組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59500632A JPS59500632A (ja) | 1984-04-12 |
| JPH0616046B2 true JPH0616046B2 (ja) | 1994-03-02 |
Family
ID=10529117
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58500981A Expired - Lifetime JPH0616046B2 (ja) | 1982-03-19 | 1983-03-17 | 遊離リガンドアッセイ方法およびキット |
| JP5344249A Expired - Lifetime JP2599096B2 (ja) | 1982-03-19 | 1993-12-17 | 遊離リガンドアッセイのための組成物 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5344249A Expired - Lifetime JP2599096B2 (ja) | 1982-03-19 | 1993-12-17 | 遊離リガンドアッセイのための組成物 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0103605B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0616046B2 (ja) |
| DE (1) | DE3382044D1 (ja) |
| WO (1) | WO1983003306A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| GB8317124D0 (en) * | 1983-06-23 | 1983-07-27 | Ekins R P | Free ligand assay |
| GB8404843D0 (en) * | 1984-02-24 | 1984-03-28 | Amersham Int Plc | Free analyte assay |
| EP0165669A1 (en) * | 1984-05-04 | 1985-12-27 | Corning Glass Works | Improved method of measuring free ligand |
| GB8514288D0 (en) * | 1985-06-06 | 1985-07-10 | Amersham Int Plc | Enzyme assay of body fluids |
| DE3624464A1 (de) * | 1986-07-19 | 1988-01-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis eines analyten sowie hierfuer geeignetes mittel |
| DE3727238A1 (de) * | 1987-08-14 | 1989-02-23 | Henning Berlin Gmbh | Immunologisches bestimmungsverfahren zur bestimmung von hapteneigenschaften aufweisenden freien substanzen |
| GB8800419D0 (en) * | 1988-01-08 | 1988-02-10 | Amersham Int Plc | Method for measuring free fraction of ligands in biological fluids |
| US5028535A (en) * | 1989-01-10 | 1991-07-02 | Biosite Diagnostics, Inc. | Threshold ligand-receptor assay |
| US5364796A (en) * | 1989-07-11 | 1994-11-15 | Pb Diagnostics Systems, Inc. | Diagnostic assay system |
| DE4214922C2 (de) * | 1992-05-06 | 1996-06-13 | Brahms Diagnostica Gmbh | Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Anteils der freien Form eines Schilddrüsenhormon-Liganden in einer biologischen Flüssigkeit und Kit zur Durchführung eines solchen Verfahrens |
| FR2706618B1 (fr) * | 1993-06-11 | 1995-09-01 | Bio Merieux | Dispositif pour le dosage d'haptènes et son utilisation. |
| DE19504198A1 (de) | 1995-02-09 | 1996-08-14 | Behringwerke Ag | Kompetitiver Immuntest unter Verwendung komplexierter Analytderivate |
| DE10028186A1 (de) * | 2000-06-09 | 2002-09-19 | November Ag Molekulare Medizin | Verfahren zur Bestimmung der Menge von an Ziel-Molekülen gebundenen Liganden |
| DE10125258A1 (de) | 2001-05-23 | 2003-01-09 | November Ag Molekulare Medizin | Verfahren zur Bestimmung des Bindeverhaltens von an Ziel-Molekülen spezifisch bindenden Liganden |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5344622A (en) * | 1976-09-30 | 1978-04-21 | Mochida Pharm Co Ltd | Immunologically measuring method |
| SE445680B (sv) * | 1978-06-20 | 1986-07-07 | Damon Biotech Inc | Immunoanalysforfarande och anordning for bestemning av obundna substanser |
| US4292296A (en) * | 1978-09-12 | 1981-09-29 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Diagnostic method |
| US4381291A (en) * | 1979-02-23 | 1983-04-26 | Ab Fortia | Measurement of free ligands |
| JPS5651665A (en) * | 1979-09-24 | 1981-05-09 | Radiochemical Centre Ltd | Method of analysing isolated part of matter in biological fluid |
| US4366143A (en) * | 1979-09-24 | 1982-12-28 | Amersham International Public Limited Company | Assay for the free portion of substances in biological fluids |
| US4410633A (en) * | 1980-09-25 | 1983-10-18 | Corning Glass Works | Method for the measurement of free thyroxine or 3,5,3'-triiodothyronine in a liquid sample |
-
1983
- 1983-03-17 WO PCT/GB1983/000078 patent/WO1983003306A1/en active IP Right Grant
- 1983-03-17 JP JP58500981A patent/JPH0616046B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1983-03-17 DE DE8383900947T patent/DE3382044D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1983-03-17 EP EP83900947A patent/EP0103605B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-12-17 JP JP5344249A patent/JP2599096B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| DE3382044D1 (de) | 1991-01-17 |
| EP0103605A1 (en) | 1984-03-28 |
| JPS59500632A (ja) | 1984-04-12 |
| WO1983003306A1 (en) | 1983-09-29 |
| JP2599096B2 (ja) | 1997-04-09 |
| EP0103605B1 (en) | 1990-12-05 |
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