FI92884C - Menetelmä ligandien vapaan fraktion mittaamiseksi biologisissa nesteissä - Google Patents

Description

x 92884

Menetelmä ligandien vapaan fraktion mittaamiseksi biologisissa nesteissä Tämä keksintö koskee orgaanisten aineiden tai li-5 gandien vapaan fraktion spesifisiä sitomismäärityksiä biologisissa nesteissä, joissa orgaaniset aineet tai ligandit ovat myös sitoutuneet nesteissä esiintyvään proteiiniin (tai muihin sitoja-aineisiin) muodostaen tasapainon vapaan fraktion kanssa. Tämä keksintö koskee erityisesti kompeti-10 tiivisia ligandin sitomismäärityksiä: tarkemmin sanoen se koskee immunologisia määrityksiä, joita käytetään proteiiniin sitoutumattomien aineiden, kuten hormonin, biokemiallisen lähetin, steroidin, lääkeaineen, lääkeaineen metabo-liitin, polypeptidin tai proteiinin, vitamiinin, tuumori-15 antigeenin, alkaloidin, mono-, di- tai polysakkaridin pitoisuutta määritettäessä biologisessa nesteessä, kuten plasmassa tai seerumissa, tämän aineen proteiinin sitoutuneiden muotojen läsnäollessa.

Useita fysiologisesti aktiivisia ligandeja esiintyy 20 sekä vapaana että proteiiniin sitoutuneena biologisissa nesteissä, kuten veressä. Sitoutunut muoto toimii oletettavasti ligandin kantajana, joka ryhmä voidaan massavai-kutuksen perusteella dissosioida muodostamaan vapaa ligan-di, jos tämä on kulutettu loppuun fysiologisissa proses-'25 seissa. Tavallisesti kosien tämänkaltaisia ligandeja ja varsinkin tässä kuvattua keksintöä, vain pieni osa ligan-dia esiintyy vapaassa muodossa. Koska nykyisin käsitetään vapaan ligandin pitoisuuden säätelevän näihin aineisiin kytkeytyneitä fysiologisia tapahtumia, pikemminkin kuin 30 kokonaisligandipitoisuuden (joka käsittää sitoutuneen pää-fraktion ja vähäisemmän vapaan fraktion), voi diagnosti-sesti olla arvokkaampaa mitata vapaa fraktio fysiologisen aktiivisuuden indikaattorina.

Tämän toimintamallin spesifistä esimerkkiä edusta-35 vat kilpirauhashormonit ja niihin liittyneet sitojapro- 92884 2 teiinit määritettäessä kilpirauhasaktiviteettia ja kilpirauhassairauden kliinistä tilaa. Tyroksiinista on noin 99,9 % verenkierrossa olevasta kokonaishormonimäärästä proteiiniin sitoutuneessa tilassa ja sen rinnalla esiinty-5 västä trijodityroniinista noin 99,7 % on vastaavasti proteiiniin sitoutunut. Veren seerumissa tai plasmassa esiintyy luonnollisena kolme proteiinia, jotka sitovat tyroksiinia ja trijodityroniinia, edustaen käytännöllisesti katsoen kaikkia proteiiniin sitoutuneita hormoneja: ne 10 ovat tyroksiinia sitova globuliini (TBG), tyroksiinia sitova prealbumiini (transtyretiini, TBPA) ja albumiini (A).

On kuitenkin todettava, että kilpirauhasen toimintahäiriön vaikeusaste korreloi paremmin vapaan kilpirauhashormonin pitoisuuteen kuin sen kokonaispitoisuuteen tai proteiiniin 15 sitoutuneen osan pitoisuuteen. Tämän lisäksi raskaudentila tai estrogeenihoito saattavat aiheuttaa muutoksia jonkun tai kaikkien kilpirauhashormonien sitojaproteiinien pitoisuuteen kuitenkaan samanaikaisesti vaikuttamatta vapaan hormonin pitoisuuteen. Tämä on seurausta siitä, että koko 20 kilpirauhashormonipitoisuus (joka on etupäässä proteiiniin sitoutunut) muuttuu vastaavasti kilpirauhashormonin sitojaproteiinin muuttuessa pyrkien massavaikutuslain perusteella säilyttämään vapaan kilpirauhashormonipitoisuuden vakiona.

25 Toisena esimerkkinä yleisen toimintamallin merkit tävyydestä annetaan steroidihormoni, testosteroni, joka osallistuu miehen seksuaalisen ja reproduktiivisen aktiviteetin säätelyyn. Testosteroni esiintyy veriplasmassa ja -seerumissa sekä vapaana (noin 2 % koko määrästä) että 30 sitoutuneena (noin 98 %) luonnollisesti esiintyviin plasman proteiineihin, sukupuolihormonin sitojaglobuliiniin (SHBG) ja albumiiniin (A). Nykyisen käsityksen mukaan sitoutumattoman (vapaan) testosteronin pitoisuus säätelee terveiden yksilöiden aivolisäke-sukurauhasyhteyttä. Näin 35 ollen on pidetty suositeltavana mitata syljen "vapaa tes- 92884 3 tosteroni", koska katsotaan sylkirauhasen erittävän vain määräosan veren vapaasta testosteronifrakfiosta ja täten antavan tarkemman arvion potilaan kliinisestä tilasta. Lisäksi sylki ei sisällä merkittäviä SHBG-määriä, josta 5 johtuen suoraa testosteronin mittaamista voi pitää varsin tarkkana veren sitoutumattoman hormonifraktion arviona. Samaa perustelua voi soveltaa sukurauhas-aivolisäkeyhtey-den muiden steroidihormonien, kuten estradiolin ja progesteronin, merkittävyyteen säätelijänä, joista hormoneista 10 suuri osa (yli 90 %) on proteiiniin, veriplasman tai -seerumin SHBGrhen ja albumiiniin sitoutunut. Samoin kortiso-lista, joka on lisämunuais-aivolisäkeriippuvuutta säätelevä steroidihormoni, yli 90 % hormonista on sitoutuneena veriseerumin tai -plasman pääasialliseen kortisolia sito-15 vaan proteiiniin, transkortiiniin, ja albumiiniin. Myöskin katsotaan vapaan kortisolin fraktion (noin 8 %) olevan paljon merkittävämpi fysiologinen säätelijä kuin kokonais-kortisolin (sitoutunut + vapaa) pitoisuus. Taaskin on suositeltu syljen kortisolin mittaamista veren vapaan (sitou-20 tumattoman) kortisolifraktion arvioimiseksi, koska trans-kortiinia ei erity sylkeen, ja syljen kortisolimäärä näin ollen on suorassa suhteessa plasman vapaaseen kortisoliin.

Klassiset tutkittavan aineen vapaan fraktion pitoisuuden mittausmenetelmät proteiiniin sitoutuneen aineen : 25 läsnäollessa edellyttävät tasapainodialyysiä tai ultra- filtraatiota. Näitä menetelmiä, jotka kumpikin antavat riittävän tarkat arviot useimpien aineiden vapaan fraktion pitoisuudesta useimmissa olosuhteissa, käytetään kalibrointi- ja tutkimustarkoituksessa, mutta rutiinikäyttöön 30 ne yleensä ovat liian hitaat tai menetelmäteknisesti hankalat edellyttäen asiantuntijakäsittelyä. Tästä johtuen on pyritty kehittämään teknisesti yksinkertaisempia menetelmiä, jotta kliinisesti merkittävien yhdisteiden vapaat fraktiot voitaisiin määrittää rutiinimittauksin kliinisen . 92884 kemian tai sairaalan laboratoriossa, joissa on suuret nay-temäärät analysoitavana.

Plasman tai seerumin vapaiden kilpirauhashormonien määrittämiseksi on kehitetty useita tekniikaltaan yksin-5 kertaisia ja tarkoituksenmukaisia mittausmenetelmiä, ja ne ovat monissa laboratorioissa päivittäiskäytössä. Suorissa ligandin määrityksissä, etenkin seerumin vapaan tyroksiinin ja vapaan trijodityroniinin määrityksissä, mitataan itse vapaa ligandi, kun taas toisissa menetelmissä ligan-10 din mittaaminen tapahtuu laskennallisesti, kuten vapaan tyroksiinin indeksin laskeminen. Itse asiassa kaikki vapaan ligandin määritykset perustuvat siihen, että seerumissa tai plasmassa tasapainotilassa merkityksettömän pienen ligandiosuuden (joka merkitsee endogeenistä proteii-15 niin sitoutunutta ja vapaata ligandia) poistaminen mittausta varten spesifisen ligandin sitojan, kuten esimerkiksi vasta-aineen, avulla ei merkittävästi muuta sen vapaan ligandin pitoisuutta, joka alkujaan oli seerumissa tai plasmassa ennen spesifisen ligandinsitojan lisäämistä. 20 Tyroksiinia tai trijodityroniinia pitäisi spesifisellä ligandin sitojalla poistaa reaktiosta vähemmän kuin 5 % koko läsnäolevasta ligandista (proteiiniin sitoutuneena tai vapaana). Jos yli 5 % kokonaisligandista on poistettu spesifisen ligandin sitojan avulla, voidaan vapaan ligan-' 25 din mittauksessa soveltaa joko interpolointia annos-res- ponssikäyriltä tai laskennallisesti korjata muuttunut vapaan ligandin pitoisuus pitoisuuteen ennen spesifisen ligandin sitojan lisäämistä seerumiin tai plasmaan. Joka tapauksessa kaikki menetelmät pyrkivät saattamaan ligandia 30 sitovien proteiinien (ja siten proteiiniin sitoutuneen ligandin pitoisuuksien) vaihtelujen aiheuttaman häiriön vähäiseksi määritettäessä vapaata ligandia. Tähän mennessä kehitetyt menetelmät poikkeavat toisistaan tavassa, jolla tämä tavoite on saavutettu.

92884 5

Clinical Assays'n ensiksi kehittämässä kaupallisessa menetelmässä (GB 2 030 290) seerumin tai plasman endo-geenisiä tyroksiinin sitojaproteiineja estetään häiritsemästä tyroksiinin vapaan fraktion määritystä siten, että 5 seerumia tai plasmaa aluksi inkuboidaan putkessa, jonka sisäpinta on päällystetty immobilisoidulla, spesifisellä ligandin sitojalla (vasta-aine, joka on tuotettu spesifisesti tyroksiinille). Olosuhteet on säädetty siten, että immobilisoitu, spesifinen ligandin sitoja putken seinämäs-10 sä sitoo systeemistä hyvin pienen tyroksiinimäärän (selvästi vähemmän kuin 5 %) . Täten varmistetaan se, että seerumin vapaan ja proteiiniin sidotun ligandin tasapainotilassa tyroksiinin poistuminen on niin vähäistä, ettei sillä ole merkittävää vaikutusta alkuperäiseen endogeeniseen 15 tasapainotilaan ja sen kautta alkuperäisen vapaan ligandin pitoisuuteen. Sopivan inkubaation jälkeen, kun uusi tasapainotila on muodostunut vapaan ligandin, endogeenisen sitojaproteiiniin sitoutuneen ligandin ja spesifisen ligandin sitojan kesken, seerumi tai plasma erotetaan kaatamal-20 la tai imemällä pois, jonka jälkeen putkessa suoritetaan uusi inkubaatio lisäten määrätty määrä puskuria, jossa on radioaktiivisesti leimattua tyroksiinia, jolloin radioak-tiivisesti leimattu tyroksiini valtaa ne spesifisen ligandin sitojan sitomispaikat, joita tyroksiini jo ensimmäi-25 sessä inkubaatiossa ei ole vallannut. Kun ensimmäisessä inkubaatiossa spesifisen ligandin sitojan sitomispaikkojen fraktioiva valtaaminen on suhteessa endogeenisen vapaan ligandin (tyroksiinin) pitoisuuteen, on radioaktiivisesti leimatun tyroksiinin valtaamien, jäljellä olevien vapaiden 30 paikkojen määrä kääntäen verrannollinen alkuperäisen vapaan ligandin pitoisuuteen. Menetelmällä on se etu, että samoja tunnettuja reagensseja, joita käytetään plasman tai seerumin kokonaistyroksiinipitoisuuden määrityksessä, voidaan tässä käyttää vapaan ligandin (tyroksiinin) pitoisuu-35 den määrityksessä. Menetelmän haittana on kuitenkin, että 6 92884 määrityksessä tarvitaan kaksi inkubaatiota ja se voi olla häiriöaltis siten, että toisessa inkubaatiossa tapahtuu liukumista, jolloin ensimmäisen inkubaation sitoutunut leimaamaton ligandi jossain määrin korvautuu toisen in-5 kubaation leimatulla ligandilla ja täten vaikuttaa tuloksiin.

Toinen suora vapaan ligandin määritysmenetelmä on kuvattu EP-julkaisussa 0 026 103 (Amersham International Plc). Tässä tekniikassa seerumin tai plasman endogeeniset 10 ligandin sitojat neutraloidaan käyttäen ligandin kemiallisesti modifioitua johdosta (ligandin ''analogia”) , jolla on kyky sekä säilyttää reaktiivisuutensa että sitoutua erittäin reaktiiviseen ligandin sitojaan (kilpaillen vapaan ligandin kanssa) samalla kun sillä on selvästi heikentynyt 15 kyky sitoa seerumin tai plasman endogeenisia proteiinili-gandisitojia. Täten, pikemminkin kuin fysikaalisesti sulkemalla pois seerumin tai plasman endogeenisten ligandin sitojaproteiinien vaikutus ligandin sitomiseen ja erotus-tekniikkaa käyttäen, menetelmä perustuu differentiaaliseen 20 kemialliseen spesifisyyteen torjuakseen niiden vaikutuk sen. Tämän menetelmän etuna on, että se teknisesti on edellistä menetelmää mukavampi siten, että määrityksessä tarvitaan vain yksi inkubaatio ja perustekniikka on tyypillinen ligandianalytiikassa tunnetuille tavallisille, 25 yksivaiheisille, kompetitiivisille ligandi-”immunoassay"- menetelmille. Ligandianalogin affiniteetin spesifistä ligandin sitojaa kohtaan ei tarvitse olla yhtä suuri kuin mitattavan vapaan ligandin affiniteetti: niinpä Wilkins, Midgley & Glies (1982) ovat osoittaneet korrelaation spe-30 sifisen ligandin sitojan affiniteettivakion ligandianalo-gia kohtaan ja vapaan ligandin optimoidussa määrityksessä tarvittavien spesifisen ligandin sitojan ja ligandianalogin määrien kesken. Olkootpa näiden parametrien tarkat arvot mitkä tahansa, on spesifisellä ligandin sitojalla 35 oltava ehdottomasti korkea ligandin sitomispyrkimys ja on 7 92884 erittäin tärkeätä minimoida mahdollisimman hyvin ligandi-analogin residuaalinen sitoutuminen seerumin tai plasman endogeenisiin ligandin sitojiin. Muutoin vapaan ligandin mittaamiseen tällä tekniikalla vaikuttavat minkä tahansa 5 sitojan pitoisuuden muutokset, johon analogi sitoutuu sopimattoman voimakkaasti, ja olematta tällaisten endogee-nisten sitojien pitoisuudesta täysin riippumaton määritys onkin jossakin määrin siihen korreloitu. Tämänhetkiset vapaan tyroksiinin ja vapan trijodityroniinin määritykset 10 tätä tekniikkaa käyttäen ovat onnistuneet välttämään riippuvuuden endogeenisen TBG:n ja TBPA:n pitoisuuksien vaihteluista, mutta on osoittautunut vaikeammaksi riittävästi alentaa tyroksiinianalogin affiniteettia albumiinin sidos-paikkoihin, jotta estettäisiin seerumin albumiinin pitoi-15 suuden heikkokin korrelaatio vapaan tyroksiinin määritys-arvoihin. Lisäksi häiritsevät tyroksiinispesifiset autovasta-aineet, joita joissakin seerumeissa harvoin esiintyy suurina pitoisuuksina ja erittäin aktiivisina, koska nämä vasta-aineet saattavat voimakkaasti eristää tyroksiiniana-20 login ja poistaa sen määrityksestä. Viimein menetelmä edellyttää spesifisesti suunniteltujen merkkianalogien synteesiä jokaisen vapaan analysoitavan aineen mittaamiseen ja näin tuottaa uuden kemiallisen haasteen sellaisten merkkiaineiden kehittämisessä, joilla on vastaavan ana-25 lysoitavan aineen luonne, kuten reaktiivisuus ainespesifi-sen ligandin sitojan kanssa, ja olennaista on, ettei se reagoi seerumin tai plasman endogeenisten sitojaproteiinien kanssa.

EPÄ 89 806 kuvaa kompetitiivisen määritysmenetel-30 män, joka yleisesti ottaen on edellisen kaltainen paitsi, että spesifinen sitoja on leimattu ja analysoitavan aineen johdos on immonibilisoitu.

Tällaisten määritysten reagenssivalmistuksen yksinkertaistamiseksi on kuvattu julkaisussa Ekins (W0 35 83/03306) esitetty tekniikka. Tässä menetelmässä spesifi- β 92884 nen ligandin sitoja (vasta-aine) on leimattu merkkiaineeksi. Vasta-aine voidaan leimata määrityksen merkkiaineeksi 125-1:11a tai konjugoimalla aktiivisen entsyymin kanssa fluoresoivaksi molekyyliksi tai kemiluminesenssimolekyy-5 liksi. Määritysreaktiossa seerumin tai plasman vapaa analysoitava aine kilpailee immobilisoidun tai muuten eristettävän, leimaamattoman, differentiaalisesti sitovan li-gandianalogin kanssa sitoutumisesta leimatun, spesifisen ligandin sitojan kanssa. Tekniikka on olennaisesti julkai-10 sussa EP 0 026 esitetyn suoran immunologisen tekniikan im-munometrinen vastine, paitsi että edellisessä analogi on leimattu, kun taas julkaisussa W0 83/03306 vasta-aine on leimattu. Molemmissa tekniikoissa on tarpeen, että analogi (leimattu tai leimaamaton) sitoutuu suhteellisen heikosti 15 seerumin tai plasman endogeenisiin ligandin sitojaproteii-neihin. Julkaisussa WO 83/03306 pidetään tarpeellisena puhdistaa ligandispesifiset polyklonaaliset vasta-aineet ennen 125-I-atomeilla leimaamista. Lisäksi tekijän patenttihakemusten ja muiden kirjoitusten mukaan on (vapaan ty-20 roksiinin määrityksessä) tarpeen käyttää vasta-aineita, joilla on selvästi määritelty sopivan korkea reaktiivisuus (assosiaatiovakio noin 1011 1/mol) . Tähän vaatimukseen on päädytty, koska määrityksen katsottiin perustuvan todelliseen tasapainotilaan ligandin vapaan muodon, seerumin tai ’ 25 plasman endogeeniseen ligandin sitojaan sitoutuneen ligan din ja leimattuun vasta-aineeseen sitoutuneen ligandin kesken (kilpaillen differentiaalisesti sitovan ligandian-alogin kanssa). Massavaikutuslaki, joka esittää vasta-aineeseen sitoutuneen ligadin distribuutiota tyroksiinin 30 tasapainotilassa, saa seuraavan muodon: [FT4].Kab.Pab/(1 + Kab[FT4]) jossa FT4 = vapaan ligandin (tyroksiinin) pitoisuus

Kab = vasta-aineen assosiaatiovakio tyroksiinin suhteen 35 Pab = vasta-aineen pitoisuus.

9 92884

Olettamukset, että käytännöllisesti vapaan ligandin määrityksissä esiintyisi todellinen tasapainotila, täydellisesti selittäen niiden toiminnan, asettavat näihin määrityksiin soveltuvien vasta-aineiden sitoja-affiniteetille 5 jyrkkiä rajoituksia. Koska vapaan tyroksiinin pitoisuus on noin 10'" mol/1, eutyreoottisen kliinisen alueen keskiosassa yllä esitetty termi tulee eniten vaihtelemaan FT4:n muuttuessa nollasta hypertyreoottisiin arvoihin 5 x lO'11 mol/1, jos Kab:n arvo on lähellä arvoa 10u 1/mol. Siten 10 termi Kab [FT4] tulee olemaan lähellä arvoa 10u 1/mol. Siten termi Kab [FT4] tulee olemaan lähellä yksikköä määrityksen keskialueella, ja sen vaihtelu nollasta 5:een tai sen yli hypotyreoottisissa seerumeissa tuottaa mille tahansa määritykselle optimaalisen, vaan ei käyttökelvotto-15 man herkän annos-responssikuvaajakäyrän. Päinvastaisessa tapauksessa, jos Kab:n arvo on paljon suurempi kuin 10" 1/mol (eli suurempi kuin 1012 1/mol) , termin Kab[FT4] suuruus tulisi olemaan paljon yksikköä suurempi kaikille ajateltavissa oleville [FT4]:n arvoille, ja siten yllä olevan 20 yhtälön nimittäjän yksikköterir llä olisi mitättömän pieni arvo koko annos-responssikuvaajakäyrän alueella, jolloin käyrä olisi liian herkkä. Samoin, jos Kab:n arvo olisi paljon alle 10" 1/mol (eli yhtä suuri tai pienempi kuin 1010 1/mol) yllä mainitun termin Kab [FT4] arvo nimittäjäs-25 sä olisi pieni verrattuna yksikköön kaikilla hyväksyttävillä [FT4]:n arvoilla, ja tuloksena olisi epätarkka an-nos-responssikuvaajakäyrä. Näistä vaatimuksista seuraa edelleen, että jos differentiaalisesti sitovan ligandiana-login Kab-arvo on samaa suuruusluokkaa kuin itse vapaan 30 ligandin, niin Pab:n (leimatun spesifisen ligandin sito-jän) pitoisuuden ja differentiaalisesti sitovan ligandi-analogin pitoisuuden täytyy molempien olla lähellä arvoa 10'" mol/L, koska muutoin differentiaalisesti sitovan li-gandianalogin suuremmat pitoisuudet muodostaisivat liian 35 voimakkaan läsnäolevan vapaan ligandin kilpailijan, ja 92884 10 tuloksena olisi epäherkkä annos-responssikuvaajakäyrä. Käytännössä tästä johtuu, että vasta-aine on leimattava siten, että sillä on korkea merkkiaineen aktiivisuus. Koska vapaata tyroksiinia määritettäessä on vaikeata saada 5 näin korkean reaktiivisuuden omaavia vasta-aineita muista kuin polyklonaalisista lähteistä, on suoritettava tällainen puhdistusvaihe, jotta saataisiin tyroksiinispesifiset vasta-aineet leimatuksi riittävän korkeaan aktiivisuuteen, riittävän suuri määrä riittävän puhdasta ainetta käyttö-10 kelpoisen määrityksen aikaansaamiseksi. Lisäksi voi olla vaikeata leimata vasta-aine vaadittuun korkeaan spesifi-syyteen vahingoittamatta sen vapaan ligandin tai differen-tiaalisesti sitovan ligandianalogin sitomisaffiniteettia. Hormoneille, kuten kortisolille, jotka sitoutuvat kaikkein 15 reaktiivisimpiin seerumin sitojaproteiineihin heikommin kuin tyroksiini sitoutuu TBG:hen, ovat vasta-aineen affi-niteettivaatimukset vapaan ligandin määrittämiseksi vähemmän ankarat ja affiniteetit suuruusluokaltaan 108 1/mol saattavat olla riittävät käyttökelpoiseen määritykseen, 20 jolla on hyvä herkkyys.

Jos kuvattuun menetelmään lisätään tämän olennaisen vaiheen hyödynnettävyys, saadaan teknisesti se etu, että voidaan käyttää yksinkertaisempaa synteesin kulkua tuotettaessa merkkiaineita lukuisiin vapaan ligandin määrityk-25 siin, koska vasta-aine voidaan leimata vastaavalla kemiallisella tekniikalla kaikissa tapauksissa. Lisäksi voi myöskin olla etuna differentiaalisesti sitovien ligandi-analogien synteesin vaivattomuus, joka voidaan suorittaa kemiallisesti konjugoimalla kukin analyysiaine samalla 30 tekniikalla yhteiseen matriisiin, kun endogeenisten seerumin sitojaproteiinien sidospaikat sitovat ligandiaineen tehden sen kaikissa tapauksissa reagoimattomaksi. Julkaisussa W0 83/03306 kuvatussa määrityksessä analysoitava näyte, ligandin vasta-aine ja leimaamaton differentiaali-35 sesti sitova ligandianalogi yhdistetään, seos inkuboidaan

II

92884 11 ja täten annetaan näytteen vapaan ligandin ja differenti-aalisesti sitovan ligandianalogin kilpailla ligandin vasta-aineen sitojapaikoista. Differentiaalisesti sitovaan ligandianalogiin sitoutuneen spesifisen ligandin sitojan 5 (vasta-aineen) määrä on kääntäen verrannollinen näytteen vapaan ligandin määrään.

Käytännössä, jos on kysymyksessä erilaisen affiniteetin omaavien ligandi-spesifisten vasta-aineiden poly-klonaalinen seos, on todennäköistä, että affiniteettipyl-10 västekniikalla heikommin sitoutuvat fraktiot puhdistetaan antiseerumista helpommin kuin voimakkaammin sitoutuneet vasta-ainefraktiot (joita juuri tarvitaan yllä esitetyn keksinnön onnistuneeseen suoritukseen). Lisäksi differen-tiaalisesti sitovan ligandianalogin rakenne on harkittava 15 huolellisesti, koska on olemassa mahdollisuus, että endo-geenisten seerumin ligandinsitojaproteiinien jäännössito-misaktiviteettia saattaa esiintyä differentiaalisesti sitovan ligandianalogin yhteydessä. Jos differentiaalisesti sitovaa ligandianalogia käytetään siinä, missä endogeenis-20 ten seerumin sitojaproteiinien affiniteetti on pieni verrattuna vasta-aineen affiniteettiin differentiaalisesti sitovan ligandianalogin ligandijäännöstä kohtaan, tällaiset potentiaaliset häiriöt voitaneen hyvin alentaa merkityksettömälle tasolle. Tässä tapauksessa on huomattava, 25 että on lisäetu, jos sekä endogeenisillä seerumin sitojaproteiineilla että vasta-aineilla on huomattavasti heikennetty affiniteetti differentiaalisesti sitovan ligandianalogin ligandijäännöstä kohtaan verrattuna vasta-aineen affiniteettiin sitä vapaata ligandia kohtaan, jota on yri-30 tetty mitata. Tämä on monin tavoin systeemille eduksi.

* Ensinnäkin, huomattavasti enemmän differentiaalisesti sitovaa ligandianalogia voidaan käyttää verrattuna leimatun vasta-aineen määrään ja saadaan enemmän joustavuutta suunniteltaessa järjestelmää, joka pystyy käsittelemään useita 35 erilaisia seerumeita, joilla on laajasti vaihtelevat li- 12 92884 gandin sitojaproteiinien pitoisuudet ja affiniteetit li-gandin suhteen. Toiseksi tämä lisääntynyt joustavuus saattaisi parantaa määrityksen yleisiä ominaisuuksia, kuten tarkkuutta ja annos-responssiherkkyyttä. Kolmanneksi voi-5 daan minimoida kaikki menetelmän "liukumisongelmat", joita voi ilmetä vasta-aineeseen sidotun ligandin hitaasta korvautumisesta differentiaalisesti sitovalla ligandianalo-gilla, jos analogi sitoutuu paljon vähemmän voimakkaasti vasta-aineeseen kuin ligandiin. Esimerkkitapaus on immuno-10 metrinen vapaan ligandin määritys, jossa käytetään diffe-rentiaalisesti sitovana ligandianalogina ligandijäännöstä, joka vain heikosti sitoutuu endogeeniseen ligandin sitojaproteiiniin, jolloin määritys, jossa käytettäisiin riittävää määrää differentiaalisesti sitovaa ligandianalogia si-15 tomaan ligandia vastaan muodostuneet reaktiiviset autovasta-aineet, huolimatta joissakin potilasseerumeissa esiintyvästä ligandista (tai oikeastaan ligandin ristireaktio-aineesta) kuitenkaan vaikuttamatta määrityksen vasta-aineen sitoutumiseen. Tapauksessa, jossa differentiaalisesti 20 sitovan ligandianalogin ligandijäännös on senlaatuinen, että se sitoutuu yhtä voimakkaasti tai voimakkaammin kuin ligandi endogeenisiin ligandin sitojaproteiineihin, paljon vähemmän differentiaalisesti sitovaa ligandianalogia voitaisiin käyttää, koska muuten käytännöllisesti katsoen 25 kaikki vasta-aine sitoutuisi analogin vapaan ligandin kustannuksella. Niinpä jos läsnä on ylimääräisiä reaktiivisia ligandin autovasta-aineita, ne saattaisivat voimakkaasti häiritä vasta-aineen sitoutumista. Käytettäessä differentiaalisesti sitovia ligandianalogeja, joilla on suhteelli-30 sen alhainen ligandianalogijäännöksen affiniteetti endogeenisiin ligandin sitojaproteiineihin ja vasta-aineeseen, minimoidaan endogeenisten ligandin sitojaproteiinien vapaan ligandin määritykselle aiheuttama häiriön mahdollisuus, olipa se yleinen tai harvinainen. Jos kuitenkin ai-35 noastaan vasta-aineen differentiaalisesti sitovan ligan- « 92884 13 dianalogin affiniteetti olisi alentunut, säilyisi potentiaalinen endogeenisten ligandin sitojaproteiinien häiriö. Lisäksi heikosti sitovan ligandianalogin käyttö differen-tiaalisesti sitovassa analogikompleksissa minimoi endo-5 geeniseen sitojaproteiiniin sitoutuneen ligandin syrjäyttämisen mahdollisuuden siinäkin tapauksessa, että näillä proteiineilla olisi kyky vaikuttaa itse differentiaalises-ti sitovaan analogikompleksiin. Tämäkin puolestaan minimoi mahdollisuutta muuttaa mitatun vapaan ligandin pitoisuutta 10 häiritsemällä sidotun ja vapaan ligandin välistä tasapainotilaa.

Esillä olevassa keksinnössä yllä esitetyt differen-tiaalisesti sitovan ligandianalogin suunnitteluun liittyvät seikat on yhdistetty monoklonaalisen vasta-aineen 15 käyttöön, jolla on riittävän korkea affiniteetti ligandia kohtaan, jotta voitaisiin määrittää seerumin tai plasman vapaan ligandin pitoisuus. Sopivan ligandiaffiniteetin omaavan monoklonaalisen vasta-aineen käyttö vähentää suuresti julkaisussa WO 83/03306 kuvattuja vaikeuksia puhdis-20 taa polyklonaalilähteistä vasta-aineita, joilla on korkea ligandin affiniteetti, ja yhtälailla vähentää vaikeutta tuottaa tarpeeksi vasta-ainetta, joka on leimattu riittävän korkealla spesifisellä aktiivisuudella. Lisäksi mono-klonaalinen vasta-ainevalmiste käsittää paljon yhtenäisem-25 män molekyylikoosteen huomioon ottaen niiden ligandiaffi-niteetin kuin puhdistettu polyklonaalivalmiste, jossa erittäin todennäköisesti esiintyy sopimattoman matalan affiniteetin omaavia lajeja. Siten heikon differentiaalises-ti sitovan ligandianalogin käyttö reseptorina vasta-aine-30 fraktiolle, jota ligandi itse ei ole sitonut, korostaa vasta-aineen reaktiivisuutta ligandia kohtaan erotettaessa ligandiin sitoutuneita ja sitoutumattomia fraktioita.

Keksintö koskee menetelmää ligandin vapaan osan määrittämiseksi biologisessa, nestemäisessä näytteessä, 35 joka sisältää osan ligandista yhteen tai useampaan luon- - 92884 14 nolliseen sitojaan sitoutuneena, käyttäen signaalireagens-sia, joka on ligandin vasta-aine, sekä differentiaalisesti sitovaa ligandianalogia, joka kilpailee ligandin kanssa vasta-aineen sitomispaikoista, joka menetelmä käsittää 5 näytteen inkuboinnin analogin ja vasta-aineen kanssa ja analogiin sitoutuneen vasta-ainemäärän toteamisen, ja jolle menetelmälle on luonteenomaista, että vasta-aine on ligandin monoklonaalinen vasta-aine ja että analogi on siten valittu, että sillä on alhaisempi vasta-aineen sitomisaf-10 finiteetti kuin ligandilla.

Differentiaalisesti sitovan ligandianalogin joko ei lainkaan tulisi sitoutua biologisen nesteen luonnollisiin sitojiin tai muuten sitoutua ligandia paljon heikommin. Tämä on vakioedellytys vapaan ligandin määrityksessä ja 15 siitä syystä analogia kutsutaan "differentiaaliseksi" li- gandianalogiksi. Ligandianalogi voi olla ligandia muistuttava molekyyli, mutta ei välttämättä. Esimerkiksi se voi olla anti-idiotyyppinen vasta-aine, kuten on kuvattu EP-patentissa 106 615 (Amersham International plc). Olennai-20 nen edellytys ligandianalogille on sen sitoutuminen vasta-aineessa samaan tai viereiseen sitomispaikkaan kuin ligan-di, ja siitä syystä se kilpailee ligandin kanssa vasta-aineeseen sitoutumisesta.

Niin biologisen nesteen luonnollisten sitojien kuin 25 vasta-aineen sitomisaffiniteetin edelleen alentamiseksi analogi voidaan kovalenttisesti liittää suureen molekyyliin, jolloin saadaan differentiaalisesti sitova ligandi-analogikompleksi. Tämä suuri molekyyli voi olla vesiliukoinen tai se voi olla kiinteä matriisi. On edullista 30 saattaa analogi liukenemattomaksi ennen inkubointivaihetta esimerkiksi liittämällä se kovalenttisesti selluloosa- tai polystyreenipartikkeleihin. On mahdollista suorittaa inku-bointi analogin kanssa liuoksessa, mutta jos analogi jälkeen päin poistetaan liuoksesta, on se tehtävä irrottamat-35 ta siihen sitoutunutta vasta-ainetta.

. 92884 15

Monoklonaalinen vasta-aine voidaan leimata millä tahansa määrityksissä käytetyillä tavanomaisilla leimoilla, esimerkiksi luminesenssi-, fluoresenssi- ja entsyymi-leimasysteemeillä sekä varsinkin radioaktiivisilla lei-5 moilla, kuten 125-1:11a. Vaihtoehtoisesti ligandin monoklonaalinen vasta-aine voi olla leimaamaton, jolloin käytetään leimattua toista vasta-ainetta. Tämä voi mahdollistaa yleisen leimareagenssin käytön.

Differentiaalisesti sitovan ligandianalogin affini-10 teetti monoklonaaliseen vasta-aineeseen on edullisesti 0,01 - 10 % vapaan ligandin sitoja-affiniteetista monoklonaaliseen vasta-aineeseen. Tämä keksintö mahdollistaa affiniteetiltaan varsin matalan analogin varsin korkeiden pitoisuuksien käytön siten, että tehollinen analogipitoi-15 suus verrattuna vasta-aineen pitoisuuteen inkubaatioseok-sessa on edullisesti 10 - 105. Kuten kaikissa tällaisissa määrityksissä, on reaktionkulku optimoitava ottaen huomioon eri reagenssien affiniteetit ja pitoisuudet. On edullista, että suhde a):b) on välillä 0,1 - 10, missä a) on 20 (vasta-aineen affiniteettivakio analogin suhteen kertaa analogin tehollinen pitoisuus) ja b) on (vasta-aineen af-finiteettivakio ligandin suhteen kertaa vasta-aineeseen sitoutuneen ligandin pitoisuus inkubaation päättyessä).

On myös edullista, että analogin vasta-aineen sito-25 mispaikkojen pitoisuus ja vapaan ligandin pitoisuus ovat molemmat suurin piirtein samat inkubaatiovaiheen alussa ja lopussa. Esimerkiksi kumman tahansa pitoisuuden muutoksen inkubaation aikana tulisi olla vähemmän kuin 5 %.

Viitataan liitettyihin piirroksiin, joissa: 30 Kuvio 1 on vapaan T4:n määrityksen tyypillinen an- nos-responssikuvaajakäyrä (menetelmä kuvattu jäljempänä).

Kuvio 2 esittää leimatun vasta-aineen T3-selluloo-san kiinteään faasiin sitoutumisen tasapainotilaan hakeutumisen kinetiikkaa käyttäen seerumeita, joilla on tunne-35 tut, vaihtelevat tyroksiinipitoisuudet.

16 92884

Kuvio 3 esittää graafisesti tämän keksinnön mukaisen vapaan tyroksiinin määritysmenetelmän korrelaatiota kaupallisesti saatavaan vapaan T4:n määritykseen.

Sopivien differentiaalisesti sitovien ligandianalo-5 gien tuottaminen, joilla on vasta-aineen sitomisaffini-teettia mutta jotka ovat olennaisesti inaktiivisia seerumin tai plasman endogeenisten ligandin sitojaproteiinien suhteen, on alalla kuvattu yksityiskohtaisesti. Vakiintuneen immunologisen määritystekniikan esimerkkejä on 10 myöskin annettu julkaisussa EP 0 026 103 ja siinä esitetyissä viitteissä. Vastaavassa immunometrisessä vapaan ligandin määrityksessä käytettävää ligandia voidaan saman tarkoituksen saavuttamiseksi muunnella monin tavoin. Ligandin varausta tai steeristä profiilia voidaan muunnella, 15 jolloin voidaan vaikuttaa ligandin affiniteettiin seerumin tai plasman endogeenisia sitojareseptoreita kohtaan, tai voidaan myös käyttää ligandeja tai ligandianalogeja, joiden tiedetään olevan luonteeltaan heikosti ristireaktiivi-sia vasta-aineen sitomisen suhteen ja jotka sitoutuvat 20 heikommin endogeenisiin sitojareseptoreihin kuin määrityksessä mitattava vapaa ligandi. Näitä ligandeja tai ligandianalogeja voidaan edelleen estää reagoimasta endogeenisten sitojaproteiinien kanssa kiinnittämällä ne suureen molekyyliin, kuten esimerkiksi proteiiniin tai synteetti-25 seen tai luonnolliseen polymeeriin. Täten ligandianalogin jo heikentynyttä sitoutumista endogeenisiin sitojareseptoreihin (verrattuna mitattavaan vapaaseen ligandiin) edelleen heikennetään "raskaan" rakenteen aiheuttamalla stee-risellä esteellä tai varauksen häiriöllä. Lisäksi on otet-30 tava huomioon, että ligandianalogit tulisi liittää suuriin molekyyleihin siten, että niiden jäännökset ovat steeri-sesti esillä vasta-aineen sitomiseksi mutta eivät niin esillä, että endogeenisten sitojareseptorien varaamattomat sitomispaikat sitoutuisivat niihin. Tässä suhteessa on 35 edullista käyttää heikkoa ligandianalogia differentiaali- • 92884 17 sesti sitovan ligandianalogikompleksin osana, koska voidaan käyttää suurempia määriä ja siten voidaan sallia en-dogeenisten sitojareseptorien vähäisempi sitominen, koska ne eivät havaittavassa määrässä vähennä differentiaalises-5 ti sitovan ligandianalogikompleksin sitomispaikkoja, joihin vasta-aine voi sitoutua. Niin kauan kuin tämä endogee-nisten ligandisitojien vähäinen vetovoima differentiaali-sesti sitovaan ligandianalogikompleksiin ei vaikuta vapaan ligandin ja endogeenisiin ligandin sitojareseptoreihin si-10 toutuneen ligandin väliseen tasapainoon, on tällä vaikutuksella vähän merkitystä määritystuloksiin. Näin tapahtuu todennäköisesti, jos ligandianalogin jäännös on heikko sitoja, mutta häiriötä on hyvinkin odotettavissa, jos dif-ferentiaalisesti sitovan ligandianalogikompleksin ligan-15 dianalogijäännös sitoo voimakkaasti. Tyroksiinin tapauksessa voimakkaasti sitova tyroksiiniligandi differentiaa-lisesti sitovassa ligandianalogikompleksissa saattaisi aiheuttaa häiriötä endogeenisten proteiinin sitojareseptori-en välityksellä, kun sen sijaan sen homologi trijodityro-20 niini, joka on heikompi sitoja, ei todennäköisesti häiritsisi .

Vapaan tyroksiiniligandin määrityksessä liukenematonta differentiaalisesti sitovaa ligandianalogikompleksia muodostettaessa sopivia materiaaleja ovat polystyreenila-25 teksipartikkelit (jotka joskus, mutta ei välttämättä, sisältävät ferromagneettisen ytimen, joka mahdollistaa differentiaalisesta sitovan ligandianalogikompleksin erottamisen magneettisella erottamistekniikalla), joihin differentiaalisesta sitova ligandianalogi voidaan sitoa joko 30 kovalenttisesti tai fysikaalisesti adsorboimalla, tai alhaisen tiheyden omaava selluloosa (joka joskus, mutta ei välttämättä, sisältää ferromagneettisen ytimen, joka mahdollistaa differentiaalisesti sitovan ligandianalogikompleksin erottamisen magneettisella erotustekniikalla) , joka 35 kovalenttisesti on liitetty L-trijodityroniiniin (tai muu- 92884 18 hun ligandianalogiin) aktivoimalla selluloosa käyttäen bu-taani-1,4-diolidiglysidyylieetteriä. Differentiaalisesti sitovalla ligandianalogilla päällystetyt polystyreeni- tai selluloosapartikkelit, jotka eivät sisällä ferromagneet-5 tista ydintä, voidaan erottaa määritysmenetelmässä sentri-fugoimalla. Vaihtoehtoisesti menetelmässä trijodityroniini tai muu sopiva tyroksiininsukuinen ligandianalogi, jolla on halutut ominaisuudet, voidaan kovalenttisesti liittää proteiineihin amidisidoksin käyttäen kemiallista vakiintu-10 nutta tekniikkaa, edullisesti mutta ei välttämättä trijo-dityroniinin tai ligandianalogin aminoryhmän välityksellä. Proteiini-ligandianalogi voidaan saattaa liukenemattomaan tilaan absorboimalla se muoviputkien sisäpintaan tai ris-tisidoksilla glutarialdehydin kanssa ennen mainittua ab-15 sorptiota tunnetun tekniikan mukaisesti. Muut menetelmät, kutenantiligandivasta-aine-polyetyleeniglykolisaostukset, ovat myös hyvin tunnettuja reagoineen aineen erotusmenetelmiä inkubaation jälkeen.

Monoklonaalinen antiligandivasta-aine puhdistetaan 20 sopivasti hybridoomavalmisteesta alan ammattimiesten ylei sesti tuntemilla menetelmillä. Vasta-ainetta voidaan tuottaa spesifisesti sille ligandille, joka lopullisessa määrityksessä halutaan mitata vapaana ligandina, tai sitä voidaan tuottaa sopivaksi katsotuille ligandianalogeille 25 sillä edellytyksellä, että lopullinen vasta-ainevalmiste sisältää joka tapauksessa lajeja, jotka reagoivat ahnaasti ligandin kanssa. Lisäksi vasta-ainetta, jota on tuotettu sille eläinseerumille, josta monoklonaalinen vasta-aine oli lähtöisin, voitaisiin käyttää toisena vasta-aineena 30 leimaamiseen (universaalina vasta-aineleimaajareagenssi- na). Ensimmäinen (monoklonaalinen) tai toinen (universaalinen) vasta-aine voidaan leimata radioaktiivisella atomilla, kuten 125-1:llä, entsyymillä, kemiluminesenssi- tai fluoresenssimolekyyleiliä.

92884 19 Käytettävän antiligandivasta-aineen määrän tulisi noudattaa rajoittavia kriteerejä, jotka on asetettu toimiville vapaan ligandin määrityksille (kuten edellä esitetty) , ja sen määrän tulisi myöskin olla pienempi kuin immo-5 bilisoidun tai liukenemattomaksi saatetun differentiaalisesta sitovan ligandianalogin määrän. Sopivien annos-res-ponssikuvaajakäyrien tuottaminen näiden kriteerien rajoissa tapahtuu kokeellisesti tapaan kuuluvan rutiinin mukaisesti. Käyttäen seerumeita, joilla on tarkoin tunnettu 10 vapaan ligandin pitoisuus, voidaan tuottaa sopivan herkkyyden omaava annos-responssikuvaajakäyrä kliinisesti kiinnostavilla alueilla.

Trijodityroniini-selluloosapartikkeleiden (diffe-rentiaalisesti sitovan ligandianalogikompleksin) synteesin 15 kemia

Alhaisen tiheyden omaavien selluloosapartikkelei-den, joilla on ferromagnettinen ydin (kuten edellä kuvattu) annetaan reagoida butaani-1,4-diolidiglysidyylieette-rin kanssa seuraavasti: 20 v; f OH OH o • j j_o _0_ 1 0 ® \ :·!’ J/j7^j j/pH ^ + CH2-CH-CH2-0-(CH2) 4-0-CH2-CH-CH2 OH OH n Butaani-1,4-diolidiglysi- 2 5 ,, , dyylieetteri ; ; Selluloosa

Diglysidyylieetterinmolekyylin molemmissa päissä sijaitsevat epoksiryhroät reagoivat vaivatta nukleofiilis-30 ten ryhmien (kuten -OH, NH2-ryhmät) kanssa seuraavasti: • ♦ ♦ • ♦ « · ♦ » · • · • · « « • « • · · • · « • · «· » 92884 20 η \r°", r° Ί _|/ + n CH2-CH-CH2-0- (CH2) 4-R ------------> OH Jn ^ v __0— akti- \ voitu f/1 OH · . °Λ sellu- 0—CH2-CH-CH2-0-(CH2)4-0-CH2-CH-CH2 loosa _ — 10 Koska mitkä tahansa selluloosan -OH ryhmät voivat reagoida, on mahdollista, että aktivoidulla kompleksilla on paljon isomeerejä. Lisäksi on mahdollista, että kutakin reagoivaa selluloosan -OH ryhmää kohti lisätyn diglysidyy-lieetterin kaksi stereoisomeeriä ovat mahdolliset: 15 (A) (B> . -Kr

.·.· L 0-CH2-CH-CH2-0- (CH2) 4-R H0-CH2-0-CH-CH2-0-(CH2)4-R

*·'; -1' n _ n t · • *. Vaihtoehto (A) on todennäköisesti steerisesti edul- linen.

25 Aktivoitu selluloosa saa nyt reagoida trijodityro- *. niinin kanssa, jolloin syntyy kaksi mahdollista isomeeriä: (A) s- Ljf.

-f ί I / \ 0-CH2-CH-CH2-0-(CH2)4-0-CH2-CH-CH2 I n // 35 trijodityroniini-selluloosakompleksi • · · 92884 21 tai <B) Γ ΐΓ° /""^^5}"' l4 OH \—(

0-CH2-CH-CH2-0-(CH2)4-0-CH2-CH

— CH2-0H _Jn 10 Taaskin vaihtoehto isomeeri (A) on todennäköisesti steerisesti edullinen.

Kolmannessa vaiheessa jäljellä olevat selluloosa-johdannaisen reaktiiviset ryhmät poistetaan reaktiossa etanoliamiinin kanssa: 15 —o- _A OH 0 I / \ f -i )-CH2-CH-CH2-0- (CH2) 4-0-CH2-CH-CH2 1· n |l<K2-CK2-CH2-OHj 20 n •s aktivoitu selluloosa etanoliamiini • · « « —- _\ f—°- / _

:\· N

•' ' _l/1 OH OH

25 _ 0-CH2-CH-CH2-0-(CH2)4-0-CH2-CH-CH2-HH-CH2-CH2-0H

*... —1 n • « r · • « Tämä on tarpeen, jotta vältyttäisiin selluloosapar-tikkeleiden ristisilloittumiselta siten, että jäljelle 30 jääneet epoksiryhmät reagoisivat toisten selluloosamole-kyylien -OH-ryhmien kanssa, mikä muuten aikaansaisi aggre- • · ♦ gaattien muodostumista.

.1,’·1 Differentiaalisesti sitovan ligandianalogipäällys- • · teisten selluloosapartikkeleiden valmistaminen • · «« · • » « « · » 22 92884 20 millilitran (ml) ferromagneettisella ytimellä varustettujen alhaisen tiheyden selluloosapartikkeli-vesi-suspension (Scipac Ltd., Kent; U.K.), (partikkeleissa nimellisesti ferrioksidia, 25 % w/w, partikkelikoko alueella 5 2 - 10) ja pitoisuus 50 g/1 annettiin laskeutua, minkä jälkeen vesi imettiin pois ja jäännös sentrifugoitiin. Saatu erotettujen partikkeleiden "nappi" suspendoitiin uudelleen 20 ml:aan vettä, annettiin laskeutua ja sentrifugoitiin. Toimenpide suoritettiin kolmesti. Toiset kolme 10 kertaa partikkelit pestiin siten, että ne suspendoitiin joka kerta 20 ml:aan 0,1 M natriumhydroksidiliuosta. Viimeinen suspensio 20 ml:ssa natriumhydroksidiliuosta aktivoitiin sitten lisäämällä 0,53 ml butaani-1,4-dioliglysi-dyylieetteriä, ja seosta inkuboitiin 100 minuutin ajan 15 37 °C:ssa. Aktivoitujen selluloosapartikkeleiden suspen siolle suoritettiin sen jälkeen kolme sentrifugointia ja uudelleen suspendointia 20 ml:aan 0,05 M natriumkarbonaat-ti/bikarbonaattipuskuria, pH 9,6. Sitten lisättiin 13,3 mg L-trijodityroniinin natriumsuolaa (käyttäen dimetyyliform-20 amidiliuosta). Seos inkuboitiin 37 °C:ssa 3 tunnin ajan.

Partikkelisuspension annettiin laskeutua, yläosa imettiin pois ja jäännös sentrifugoitiin ja pestiin kolmesti 20 ml:11a 0,05 M natriumkarbonaatti/bikarbonaattipuskuria, pH 9,6. Seuraavaksi lisättiin 0,06 ml etanoliamiinia 20 ml:n * 25 partikkelisuspensioon .sitomaan reagoimattomat ryhmät.

Seosta inkuboitiin huoneenlämmössä yli yön. Partikkelisus-pensio sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen karbo-naatti/bikarbonaatinpuskuriin kolmesti, kolmesti 0,1 M natriumhydroksidiliuokseen ja kolmesti 0,1 M suolahappoon. 30 Partikkelit suspendoitiin viimein 20 ml:aan puskuria, joka oli 0,067 M natrium- ja kaliumfosfaattia, pH 6,7 (laimen-ninpuskuri). Tätä käytettiin määrityksissä rutiinimaisesti 1/100 laimennuksena.

Tyroksiinispesifisen monoklonaalisen vasta-aineen 35 lähde ja ominaisuudet • *

II

92884 23

Hiiren hybridoomasta valmistettu tyroksiinispesi-fisten monoklonaalisten vasta-aineiden tuote hankittiin Immunosearch Inc., Toms River, New Jersey, USA, tuottajalta. Tuottaja toimitti tämän kloonin (nro 02-911-112) immu-5 noglobuliinifraktiona (alaluokka IgG2B) 0,015 M kaliumfos-faattipuskurissa (pH 7,2), jossa oli 0,85 % (w/v) natrium-kloridia ja 0,1 % (w/v) natriumatsidia. Immunoglobuliinin puhdistaminen suoritettiin pylväskromatografisesti käyttäen dietyyli (aminoetyyli) selluloosaa (DEAE) toimittajan il-10 moituksen mukaisesti. Vasta-aineen affiniteettivakiot tyroksiinin, trijodityroniinin ja trifjodityroniini-sellu-loosakompleksin (katso edellä) suhteen mitattiin klassisen Scatchardin menetelmän avulla. Assosiaatiovakiot 37 °C:ssa olivat a) tyroksiinille 4,6 x 109 1/mol (toimittajan ilmoi-15 tus noin 1010 1/mol), b) trijodityroniinille 3,4 x 107 1/mol (merkiten noin l-%:ista vasta-aineen sitoutumisen risti-reaktiota tyroksiinin suhteen) ja c) trijodityroniini-sel-luloosakompleksille käytettäessä tyroksiinimäärityksen kiinteänä faasina 6,7 x 105 1/mol. Vertailuna suoritettiin 20 tavanomainen jodaustoimenpide yhdelle monoklonaaliselle vasta-aineelle, kuten edellä esitetty, paitsi että ei-ra-dioaktiivinen jodidi korvasi radioaktiivisen aineen. Puhdistettuna tällä jodatulla vasta-aineella saatiin seuraa-vat assosiaatiovakiot 37 °C:ssa a) tyroksiinille 4x4 x 109 '25 1/mol, b) trijodityroniinille 4,0 x 107 1/mol ja c) trijo-dityroniini-selluloosakompleksille käytettäessä määrityksen kiintäenä faasina 5,5 x 105 1/mol. Jodatun ja ei-joda-tun vasta-ainevalmisteen vasta-aineen affiniteetit olivat käytännöllisesti katsoen identtiset samalle aineelle, ja 30 kaikissa tapauksissa vasta-aineen affiniteetti tyroksii nille oli paljon korkeampi kuin sen ristireagoivalle analogille, trijodityroniinille. Selluloosapartikkeleiden liittäminen kompleksiksi trijodityroniiniin alensi lisää vasta-aineen affiniteettia kompleksin suhteen oletettavas-35 ti johtuen etupäässä lisääntyneestä eteerisestä esteestä 24 . 92884 ja "raskaan" molekyylin vaikutuksesta, kuten edellä on esitetty. Ilmeisen voimakkaasti alentuneeseen vasta-aineen affiniteettiin trijodityroniini-selluloosakompleksin suhteen saattoi lisäksi alentavasti vaikuttaa se, ettei vas-5 ta-aine "tavoittanut" kompleksiin sidottuja trijodity-roniinijäännöksiä. Kuitenkin vasta-aineen affiniteetti tyroksiinia kohtaan oli selvästi julkaisussa W 83/03306 ilmoitettua pienempi, mikä oli olennaista toimivalle vapaan tyroksiinin määritykselle. Monoklonaalista vasta-ai-10 nevalmistetta säilytettiin, kunnes sitä tarvittiin, samassa puskurissa, jossa se oli toimitettu (katso edellä), pitoisuus oli 1 g/1.

125-I-leimattujen antityroksiinivasta-aineiden valmistus 15 Kaikki seuraavassa esitetyt reaktiotoimenpiteet suoritettiin huoneenlämmössä (n. 20 °C) . Seuraavat rea- genssit sekoitettiin ensin keskenään: 45 mCi (1,67 GBq) [125-1]-natriumjodidia (Amersham International, koodi IMS 300, pitoisuusalue 350 - 600 mCi/ml (12,9 - 22,2 GBq/ml) 20 0,1 M natriumfosfaattipuskurissa, pH 6,0, joka sisälsi 0,3 M NaCl, 0,6 ml monoklonaalista antityroksiinivasta-aine-valmisteliuosta, joka oli väkevöity 5 mg/ml:ksi kylmäkui-vaamalla ja sen jälkeen suspendoimalla uudelleen 0,1 ml:-aan 0,1 M natriumfosfaattipuskuria, pH 7,5. Sitten lisät-25 tiin 0,02 ml kloramiini-T-liuosta, (joka sisälsi 10 mg/ml kloramiini-T:tä samassa fosfaattipuskurissa) ja liuosta sekoitettiin 5 sekuntia. Seosta inkuboitiin 55 sekuntia, kun 0,02 ml natriummetasulfiittiliuosta (20 mg/ml natrium-metasulfiittia samassa fosfaattipuskurissa) lisättiin py-30 säyttämään reaktio. Liuos vietiin korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) -pylvääseen [Superose 12 (HR 10/30), mitat 1 cm x 30 cm, (Pharmacia Ltd.)] ja eluoitiin puskurilla, joka sisälsi 0,1 M natriumfosfaattia ja 0,3 M natriumkloridia, pH 6,0, eluointinopeudella 1 ml/min. Ulos 35 tuleva leimattu vasta-ainepiikki todettiin ultraviolet-

II

25 9 2 8 8 4 tiabsorbanssidetektorilla 280 nm:n aallonpituudella, ja leimatun vasta-aineen vastaavaa radioaktiivista profiilia seurattiin. [125-1]-leimattu antityroksiinivasta-aineval-miste kerättiin 2-3 ml:ssa nestettä, joka eluoitui pyl-5 väästä noin 20 minuutin kuluttua. Leimatun vasta-aineval-misteen spesifinen aktiivisuus oli 2,4 x 106 mCi/mmol (88,8 TBq/mmol) proteiinia. Tämän mukaan valmisteessa oli yksi 125-I-radioatomi yhtä vasta-ainemolekyyliä kohti. Täten kutakin määritysputkea kohti tuli [125-1]-radioaktiivi-10 suutta noin 0,05 mikrocurieta (18,5 hBq) [1,1 x 105 dpm] .

Seerumin/plasman vapaan tyroksiinin immunometrisen määrityksen kuvaus 50 μΐ seeruminäytettä sekoitettiin 0,5 ml:aan kiinteän faasin trijodityroniini-(T3)-konjugoidun selluloosa-15 kompleksisuspensiota (pitoisuus 0,5 g/1, kts. luku, jossa selvitetään miten työliuoksen pitoisuus valmistetaan), joka sisälsi 253 pmol kompleksi-T3:a. Sitten lisättiin 0,5 ml [125-1]-leimattua antityroksiinivasta-aineliuosta (joka sisälsi 3 ng [20 fmol] vasta-ainetta). Kompleksi-T3:n mo-20 laarinen suhde [125-1]-leimattuun vasta-aineeseen oli noin 12600/1. Liuosta sekoitettiin vortexilla ja inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuuttia. Seerumin vapaa tyroksiini kilpaili T3-selluloosakompleksin kanssa [125-1]-leimatun antityrok-siinivasta-aineen sitomispaikoista, ja kompleksiin sitou-25 tunut [ 125-1]-fraktion pulssimäärä oli kääntäen verrannollinen seerumin vapaan tyroksiinin pitoisuuteen. Magneti-soitu T3-selluloosakompleksi, johon oli liitetty [125-1]-antityroksiinivasta-aine, saostettiin nyt sijoittamalla reaktioseosputket telineeseen, jossa on magneettipohja 30 (Amersham International Plc) niin, että liukenematon T3-selluloosakompleksi painui putken pohjaan muodostaen kiinteän "napin". Kymmenen minuutin seisotus magneettisessa erotustelineessä riitti selluloosakompleksin täydelliseen erottamiseen liuoksesta. Putket käännettiin ylösalaisin 35 (edelleen telineessä) nesteen poistamiseksi ja putkia va- « 92884 26 lutettiin ylösalaisin 5 minuutin ajan, minkä jälkeen putket sisälsivät ainoastaan magneettisiin T3-selluloosapar-tikkeleihin liittynyttä leimattua vasta-ainetta. Putkien aktiivisuus laskettiin tavalliseen tapaan 60 sekunnin ajan 5 käyttäen standardia radioisotooppidetektoria [125-1]-emissiolle. Tuntemattomien seerumien vapaan tyroksiinin pitoisuudet interpoloitiin annos-responssikuvaajakäyrältä, joka oli laadittu käyttäen tunnettuja vapaan tyroksiinipitoisuuden näytteitä koko odotettavissa olevalta mittausalu-10 eelta. Kuvio 1 esittää tyypillistä kuvaajakäyrää.

Määritykset, joissa käytettiin muita monoklonaali-sia antityroksiinivasta-aineita, joiden tyroksiinin asso-siaatiovakiot olivat noin 108 1/mol, olivat epäkäytännöllisiä johtuen liian alhaisesta, alle 5 %:n B(0):sta, käytet-15 täessä T3-selluloosaa, mikä osoittaa, etteivät heikosti reaktiokykyiset vasta-aineet sopineet tämän keksinnön mukaisten määritysten kehittämiseen. T4-selluloosa antoi kuitenkin käyttökelpoisen käyrän, koska vasta-aineen af-finiteettivakio oli lähempänä 108 1/mol (eli sallittujen 20 arvojen rajoissa). Jotta voitaisiin määrittää vasta-aineen assosiaatiovakiot vasta-aineiden sitoutuessa ligandianalo-giselluloosan kiinteän faasin kompleksiin, tulee vakioiden kohtuudella olla rajojen 105 - 108 1/mol välissä, jolloin saadaan vapaan tyroksiinin määrityksen edellyttämä annos-25 responssi. Tämä kattaa alarajan, jonka alapuolella kestävä vasta-aineen ja ligandianalogiselluloosan kiinteän faasin välinen sitoutuminen saattaa olla saavuttamattomissa, ja ylärajan, jonka yläpuolella vasta-aineen assosiaatiovakio kompleksin suhteen lähestyy tyroksiinin assosiaatiovakiota 30 ja täten asettaa rajan ligandianalogiselluloosakompleksin sallitulle määrälle (katso aikaisempi selvitys).

Vasta-aineen assosiaatiovakion (Kab) ja T3-kiinteä-faasikompleksin pitoisuuden (C) tulo oli 5,5 x 105 x 2,53 x 1010 eli 1,39 x 10-4. Vastaavasti sama tulo vapaalle ty-35 Toksiinille oli 4,6 x 109 x 1,5 x 10'14 eli 6,9 x 10'5 (jos „ 92884 27 oletetaan, että 0,05 ml:ssa eutyreoottista seerumia, joka sisältää 10'7 mol/1 tyroksiinia, noin 0,3 % läsnäolevasta hormonista on vasta-aineen eristämä). Se, että kilpailevan T3-selluloosakompleksin ja eristetyn tyroksiinin Kab x C 5 tulon arvot ovat hyvin lähellä toisiaan, osoittaa, että vasta-aineen tehollinen reaktiivisuus kummankin osapuolen suhteen on lähes yhtäläinen ja ennustaa käyttökelpoista annos-responssikäyrää.

Kuvio 2 esittää T3-selluloosa -kiinteään faasiin 10 sitoutuneen leimatun vasta-aineen tasapainotilan kinetiikkaa. Käyrä on laadittu käyttäen seerumeita, joilla on erilainen vapaan tyroksiinin pitoisuus. Määritys oli käytännöllisesti katsoen saavuttanut täyden tasapainotilan 30 minuutissa 37 °C:ssa. Jodileimatun vasta-aineen affini-15 teettivakio tyroksiinin suhteen määrityksessä oli < 5 x 109 1/mol. Patenttihakemuksessa W0 83/03306 esitetyn sekä sen tekijän lisäkirjoitusten mukaan verrattuna tässä hakemuksessa esitetyssä keksinnössä käsiteltyihin asioihin, sellaisten antityroksiinivasta-aineiden käyttö, joiden affi-20 niteettivakiot ovat selvästi alle seerumin vapaan tyroksiinin pitoisuuden (tyypillisesti noin 1,3 x I0n mol/1) käänteisarvo, tulisi antamaan erittäin epäherkkiä ja käyttökelvottomia annos-responssikäyriä.

Vapaan tyroksiinin määrityksessä yhtälön, joka ku-25 vaa tyroksiinin sitoutumista vasta-aineeseen (katso edellä) tutkiminen vahvistaa tätä ennustetta, jos otaksutaan määrityksen tapahtuvan puhtaasti massavaikutuksen lain periaatteen mukaisesti. Vapaan tyroksiinin sitoutumista vasta-aineeseen kuvaavan yhtälön [FT4].Kab.Pab/1 + Kab-30 [FT4] nimittäjässä Kab:n arvo paljon alle 10" 1/mol antaa kaikilla fysiologisesti reaalisilla FT4-arvoilla Kab[FT4]-:lle yksikköä paljon pienemmän arvon ja merkitsee siten, ettei käyttökelpoista annos-responssia saataisi, jos Kab « 5 x 1010 1/mol.

28 92884

Keksinnön toteuttaminen vakuuttavammin lähtee siitä edellytyksestä, että koko reaktion ajan, jossa leimattu vasta-aine reagoi kilpailevien kiinteän faasin T3-sellu-loosakompleksin ja seerumin vapaan tyroksiinin kanssa (jo-5 ta jatkuvasti vapautuu seerumin tyroksiinin sitojaproteiinista sitä mukaa kun vasta-aine sitä kuluttaa), eivät kummankaan kilpailevan osapuolen teholliset pitoisuudet olennaisesti muutu niiden sitoutuessa leimattuun vasta-aineeseen. Sen johdosta, että leimattu vasta-aine kuluttaa hä-10 viävän pienen tyroksiinifraktion, ei seerumin vapaiden tasapainojen säätely käytännöllisesti katsoen muuta vapaan tyroksiinin pitoisuutta, ja heikosti sitoutuvan T3-sellu-loosakompleksin erittäin suuri ylimäärä leimattuun vasta-ainepitoisuuteen nähden varmistaa, että vasta-aineen va-15 päiden sitomispaikkojen pitoisuus säilyy käytännöllisesti katsoen vakiona reaktion kestäessä. Täten on siis olemassa vapaan tyroksiinin vakiopitoisuuden ja vapaan T3-selluloo-san kesken vasta-aineen sitomispaikoista vallalla yksinkertainen kilpailu, joka perustuu pelkästään niiden suh-20 teellisiin affiniteetteihin ja pitoisuuksiin. Siten leimatun vasta-aineen assosiaationopeuksia joko vapaaseen tyroksiiniin tai T3-selluloosan vapaisiin sitomispaikkoihin kuvaa kaava K(a)[fAn](fPab], jossa K(a) on joko vasta-aineen assosiaatiovakio analysoitavan aineen suhteen tai 25 differentiaalisesti sitovan ligandianalogin suhteen ja {fAn] on joko vapaan analysoitavan aineen pitoisuus tai differentiaalisesti sitovan ligandianalogin vapaiden sitomispaikkojen pitoisuus. [fPab] edustaa vasta-aineen täyttämättömien sitomispaikkojen pitoisuutta.

30 Määrityksen toimintatavan selittämistä vastaan klassisen massavaikutuksen mukaan puhuu lisäksi se havainto, että aikaisemmin muodostuneen T3-selluloosa-[125-1]-vasta-ainekompleksin "takaisinkorvaamista" vapaalla tyrok-siinlla tapahtuu mitättömässä määrin. Ensin suoritettiin 35 vakiomääritys joukolle seerumeita, joilla oli erilaiset 29 92884 vapaan tyroksiinin pitoisuudet, ja T3-selluloosapartikke-leihin sitoutunut [125-1]-leimattu vasta-aine erotettiin edellä kuvatulla tavalla magneettisesti. Partikkelit sus-pendoitiin sitten uudelleen 1 ml:aan merkkiainepuskuria, 5 joskaan vasta-ainetta ei lisätty enää, ja inkuboitiin uuden seerumilisäyksen kanssa 240 minuuttia tavallisissa määritysolosuhteissa. T3-selluloosa-[125-1]-vasta-aine- kompleksi erotettiin "napiksi" magneettista erotusta käyttäen .

10 Taulukon 1 mukaan ensimmäisessä inkuboinnissa T3- selluloosaan sidotun vasta-aineen reaktionopeus "takaisin" oli erittäin alhainen, joten muodostui huomattavia määriä liukoiseen, vapaaseen tyroksiiniin sidottua vasta-ainetta toisessa, 8 kertaa suositusta pidemmässä inkubaatiossa. 15 Jos ensimmäinen inkubaatio olisi edistynyt lähestymällä tasapainotilaa yhtä nopean eteenpäin ja taaksepäin tapahtuvan reaktion välityksellä, olisi toisessa inkubaatiossa ollut odotettavissa merkittävä ja nopea vasta-aineen syrjäyttäminen T3-selluloosasta. Tämän mukaan määritystä voi 20 kuvata paremmin "kvasi"-tasapainon kuin "tosi"-tasapainon nimellä.

Nämä koehavainnot siis osoittavat määrityksen perustuvan yksinkertaiseen, nopeasti edistyvään kompetitii-viseen reaktioon reagoivan vapaan tyroksiinin ja magneti-25 soidun T3-selluloosa-kiinteäfaasikompleksin sitomispaikko- jen olennaisesti muuttumattomien pitoisuuksien kesken, kunnes [125-1]-vasta-aineen sitomispaikkojen kyllästys efektiivisesti on saavutettu. Tyroksiinin tai T3-selluloo-san dissosioitumisnopeus vasta-aineesta on niin hidas, 30 että tämän reaktion vaikutus reaktiokinetiikkaan määrityk sen 30 minuutin inkubaation kuluessa on mitätön.

30 9 2 8 8 4

Taulukko 1 "Tasapainotettu" tyroksiinin määritys, jossa ei tapahdu nopeata reaktiota takaisin % 125-1 vasta-aineesta sitoutuneena mag-5 netisoituun T3-selluloosan kiinteään faasiin

Seeruminäyte Seerumi toisen FT4:n inkubaation jälkeen uuden seeruminäytteen kanssa, aika ilmoi tettumi nuutteina (pmol/1) 10 15 90 240

Kontrollit (Amerlex) -MFT4 RIA Kit)_____ H (hypo) 4,7 33,0 31,5 29,8 15 I (eu) 11,3 18,2 15,9 15,2 K (hyper) 78,8 4,0 3,4 2,5 P 21 (raskaus) 8,7 22,6 19,3 18,9 RIA 3__41,8 6,3 5,1 4,7

Potilasnäytteet 2 0 (eutyreoottiset)_ 1 10,2 19,5 17,2 16,6 2 11,0 18,4 16,5 15,1 3 17,1 13,3 11,2 10,5 : 4 16,3 13,7 11,5 11,0 25 _5 nolla TBG 14,0__14,9 13,8 12,4

Kokeet, joissa tässä keksinnössä kuvatun T3-selluloosan sijasta käytettiin tyroksiiniselluloosakompleksia, antoi-30 vat samanlaisia tuloksia pidennetyssä inkubaatiossa tapahtuvasta kiinteään faasiin sitoutuneen, [125-1]-leimatun vasta-aineen hitaasta vähenemisprosentista.

Määrityksessä eristetyn seerumin tyroksiinin prosenttiosuus li .

31 92884 Käyttökelpoisen tyroksiinin määritysmenetelmän tulee noudattaa sitä keskeistä kriteeriä, että käsillä olevasta seerumin tyroksiinista (sidottu + vapaa) niin pieni prosenttiosuus eristetään systeemistä, ettei sidotun ja 5 vapaan suhdetta määräävän tasapainon säätely merkittävästi muuta vapaan tyroksiinin pitoisuutta. Tämä reaktiosta eristäminen ei siis saisi koskea enempää kuin noin 5 % annetun seerumin kokonaistyroksiinista. Siispä tutkittiin viidellä seerumilla annetun kriteerin pitävyys kokonaisuu-10 dessaan; a) hypotyreoottinen, b) normaali TBG eutyreootti-nen, c) hypertyreoottinen, d) kolmannen trimesterin raskaus- (korkea TBG), ja e) eutyreoottinen nolla TBG-see-rumi.

Kokeessa tasapainotettiin 0,5 ml seerumia 10 mikro-15 litralla [125-1]-leimattua tyroksiinia (korkea spesifinen aktiivisuus, Amersham International Plc, koodi IM 141) 30 minuutin ajan. 50 mikrolitran eriin lisättiin 0,5 ml T3-selluloosa-kiinteäfaasisuspensiota määrityksessä käytettynä pitoisuutena. Yhteen seoksen erään lisättiin 0,5 ml 20 [125-1]-leimatussa vasta-aineliuoksessa käytettyä puskuria ("sokea koe"). Toiseen erään lisättiin leimaamatonta anti-tyroksiinivasta-ainetta tässä puskurissa vasta-aineen pitoisuuden ollessa 25 kertaa niin suuri kuin kokeessa käytetty. Kaikkia putkia inkuboitiin sekoittamisen jälkeen 30 25 minuuttia 37 °C:ssa. Sen jälkeen lisättiin 50 % (w/v) po-lyetyleeniglykoliliuosta (PEG 6000), putkien sisältö sekoitettiin vortexilla ja sentrifugoitiin 1500 x g 20 minuuttia. Polyetyleeniglykoli saosti vasta-aineimmunoglobu-liinit vieden mukanaan kaiken sitomispaikkoihin sitoutu-30 neen [125-1]-tyroksiinin. Liuoksen supernatantti dekantoi-tiin pois, saostumat suspendoitiin uudelleen 0,5 ml:aan vettä ja saostettiin uudelleen polyetyleeniglykolilla. Dekantoinnin jälkeen saostuman radioaktiivisuutta mitattiin 1 minuutin ajan. "Sokea'^korjausten jälkeen lasket-35 tiin vasta-aineeseen sitoutuneen [125-1]-tyroksiinin pro- 92884 32 senttiosuus, ja tulos korjattiin normaalista määritystavasta poikkeavaa 25-kertaista vasta-ainepitoisuutta vastaavaksi. Tulokset esitetään taulukossa 2.

5 Taulukko 2

Vasta-aineeseen sitoutuneen seerumin tyroksiinin prosenttiosuus vapaan tyroksiinin määrityksessä

Seerumin tyyppi % vasta-aineeseen sitou- 10 tunutta [125-J]-tyroksiinia

Hypotyreoottinen 0,21

Eutyreoottinen, normaali TBG 0,20

Hypotyreoottinen 0,19 15 3. trimesterin raskaus 0,08

Eutyreoottinen - nolla TBG 0,75

Kaikissa tapauksissa käytetyissä määritysolosuh-teissa vasta-aineen eristämä seerumin kokonaistyroksiinin 20 prosenttiosuus vastasi kriteerejä, joita oli noudatettava hyväksyttävässä vapaa tyroksiinin määrityksessä.

Laimennuksen ominaispiirteet vapaan tyroksiinin määrityksessä

On osoitettu, että jopa täydellisimmässä nolla-TBG-: 25 tapauksessa, jossa TBG:n puutos johtaa suhteellisen alhai seen kokonaistyroksiinipitoisuuteen ja mahdollistaa normaalin vapaan tyroksiinin tason (ja edelleen liian suuren tyroksiinin sekvesteröintimahdollisuuden vasta-aineeseen ollakseen oikea), [125-1]-leimatun vasta-aineen tyroksii-30 nin sitomisprosentti on vielä sallittujen rajojen sisällä. Silloin, edellyttäen, ettei [125-1]-leimatulla vasta-aineella ja/tai kiinteän faasin T3-selluloosakompleksilla ole merkittävää vuorovaikutusta minkään endogeenisen tyroksiinin sitojaproteiinin (TBG, TBPA, tai albumiini) 35 kanssa, ei seerumin laimennussarjän tulisi johtaa merkit-

II

92884 33 taviin muutoksiin vapaan tyroksiinin mitattavissa pitoisuuksissa, kunnes tullaan 5 % kokonaistyroksiinia sisältäviin kokeisiin. Siis aina tähän laimennukseen asti seerumin sidotun ja vapaan tyroksiinin tasapaino sietää tällai-5 set sekvensteröintitasot ja pystyy nopeasti mukautumaan ylläpitämään käytännöllisesti katsoen pysyvän vapaan tyroksiinin pitoisuuden. Tämä olisi vähemmän totta hyperty-reoottisissa seerumeissa, koska niillä on suurempi taipumus menettää sidottua tyroksiinia vapaaseen faasiin ja 10 siten muuttaa endogeenisissä seerumin sitojaproteiineissa (etenkin TBG) sidottu/vapaa-sitomispaikkojen suhdetta ja edelleen vapaan tyroksiinin tasoja. Tutkittaessa seerumin edelleen laimentamisen vaikutusta edellä kuvatun vapaan tyroksiinin määrityksen suoritukseen käytettiin useita 15 hypotyreoottisia, eutyreoottisia, hypertyreoottisia ja kolmannen raskaustrimesterin seeruminäytteitä. Näytteiden vapaan tyroksiinin pitoisuus mitattiin joko laimentamatto-mana tai 1:2 tai 1:4 laimennuksista käyttäen 0,01 M HEPES puskuria, pH 7,4. Tulokset esitetään taulukossa 3.

92884 34

Taulukko 3

Immunometrisen vapaan tyroksiinimäärityksen häiriöttömyys seeruminäytteitä laimennettaessa (määrityksen laimennus-kertoimen 1/21 lisäksi) 5

Seerumin tyyppi Seerumin lisälaimennuskerroin laimentamaton 1/2 1/4

Vapaan tyroksiinin pitoisuus _(pmol/L)_

Hypotyreoottinen 1 10,2 13,6 9,9

Hypotyreoottinen 2 8,9 8,6 8,7 10 Eutyreoottinen 1 10,0 13,0 10,0

Eutyreoottinen 2 15,6 15,3 13,6

Eutyreoottinen 3 19,0 20,0 15,7

Eutyreoottinen 4 22,0 22,0 16,3

Raskausseerumi 1 13,3 14,3 14,3 15 Raskausseerumi 2 12,8 11,4 11,2

Nolla-TBG euty- 17,7 - 10,6 (lai- reoottinen mennus)

Hypertyreoottinen 1 71,7 46,0 28,5

Hypertyreoottinen 2 75,7 55,8 35,4 20

Odotettavasti hypotyreoottisissa, eutyreoottisissä ja raskauden aikaisissa seerumeissa saatiin hyvä vastaa-25 vuus laimennuksissa: saatiin lähes vakioarvot laimennettaessa näytettä aikaisemmin esitetyistä syistä johtuen. Vastaavasti laimennus häiritsi nolla-TBG-eutyreoottisia näytteitä johtuen siitä, että laimentamattomassa seerumissa vasta-aineen eristämän tyroksiinin prosenttiosuus oli 30 huomattavasti korkeampi kuin muissa seerumeissa siten kaventaen aluetta, jolla laimennuksen ei odoteta vaikuttavan. Määritys osoittaa siten vapaan tyroksiinin klassisen kokeen suorituksen päteväksi, koskapa eutyreoottisissa tai 92884 35 hypotyreoottisissa seerumeissa laimennuskerroin neljä alensi mitattua vapaan tyroksiinin arvoa vain noin 10 -20 %.

Endogeenisen seerumin tyroksiinin sitojaproteiinien 5 häiritsemättömyys vapaan tyroksiinin määrityksess

Seerumin tyroksiinin sitojaproteiineista TBG ja albumiini tuottavat eniten hankaluutta potentiaalisina vapaan tyroksiinin määrityksen häiriöinä. Näistä edellinen on suljettava pois potentiaalisena häiriönä, koska se on 10 seerumin pääasiallinen tyroksiinin sitojaproteiini, ja TBG:n vähäinen sitoutuminen T3-selluloosan kiinteään faasiin saattaa häiritä vapaan tyroksiinin määritystä (kilpaillen [125-1]-leimatun antityroksiinivasta-aineen kanssa TBGrsta) ja siten saattaa määrityksen riippuvaiseksi see-15 rumin TBG-pitoisuudesta. Vastaavasti on tutkittava sitä mahdollisuutta, että albumiini häiritsee vasta-aineen sitoutumista kiinteään faasiin, koska käytettäessä leimattuja analogeja vapaan tyroksiinin määrityksessä, on todettu vaikeaksi estää näiden analogien residuaalinen sitoutu-20 minen albumiiniin. Niinpä sellaisten reagenssien lisäämistä, jotka pystyvät täyttämään seerumin albumiinin sitomis-paikat, jotka muutoin voivat eristää osan ligandityroksii-nin leimatusta analogista, on esitetty parannettuihin vapaan tyroksiinin "analogi"-radioimmunomäärityksiin (RIA) 25 (EP-patenttihakemus 0 155 104) , ja niiden tarkoituksena on vähentää tulosten epätoivottua rippuvuutta seerumin albumiinin pitoisuudesta.

Mahdollisuus, että nämä ilmiöt voisivat vaikuttaa esillä olevaan keksintöön, tutkittiin seuraavasti. Puhdas-30 ta TBG:a, joka todettavissa määrin ei sisältänyt tyroksiinia, lisättiin eri pitoisuuksia Amerlex-M vapaan tyroksiinin radioimmunomääritykseen (Amersham International Plc:n Amerlex-M FT4 RIA kitti, koodi IM3050) ”nolla"-standardi-na. Kitin "nollaM-standardi oli muutoin normaalia seerumia 35 (TBG:n, TBPA:n ja albumiinin pitoisuuksien suhteen), mutta • 92884 36 ei sisältänyt tyroksiinia (se oli poistettu ioninvaihdolla) . Siten kaikkiin taulukon 4 TBG-pitoisuuksiin tulisi lisätä ylimääräinen 20 mg/1 standardin endogeenisen TBG-pitoisuuden huomioon ottamiseksi. Vastaavasti lisättiin 5 puhdasta, sidottua tyroksiinia sisältämätöntä humaanisee- rumin albumiinia toisiin "nolla"-standardieriin. Taulukossa 4 ilmoitettuihin pitoisuuksiin lisättiin pitoisuus 40 g/1 vastaamaan standardin endogeenista albumiinia.

Kokeet suoritettiin käyttäen normaalin määrityksen 10 T3-selluloosa-kiintofaasipitoisuuksia, [125-1]-leimattua vasta-ainetta sekä vastaavia tilavuuksia ja inkubaatio-olosuhteita. Taulukosta ilmenee, ettei endogeenisen TBG:n lisäyksellä aina 150 mg/1:aan saakka tai humaaniseerumin albumiinilisäyksellä 100 g/1:aan saakka ollut mitään vai-15 kutusta määrityksen B(o)-arvoon, kuten "nolla"-standardis- ta nähdään. Koska TBG:n tai albumiinin ylimmät lisätyt pitoisuudet ovat huomattavasti todettuja seerumin fysiologisia pitoisuuksia korkeammat, osoittaa koe, etteivät nämä proteiinit havaittavissa määrin häiritse määritystä.

Il 92884 37

Taulukko 4

Lisätyn TBG:n tai humaaniseerumin albumiinin vaikutus vapaan tyroksiinin määrityksen B(o) arvoon 5 ___

Lisätty TBG (MG/L) Lisätty albumii- Nollastandardin __nia (G/L)__B(0) arvo (%)_ 0 - 69,1 37,5 - 70,2 75 - 69,6 10 150 - 67,1 0 69,7 25 68,9 50 68,7 100 68,6 15 (+ 20 mg/L endo- (+ 40 mg/endo- geenista) geenistä) 20 Edellisen lisäksi seerumin vapaan tyroksiinin mää ritysten häiriytymättömyys huolimatta aina 4-kertaisista seerumilaimennuksista sekä epäsuorasti vahvisti edellä esitettyä käsitystä että myöskin osoitti, ettei TBPA mitenkään merkittävässä määrässä häiritse määritystä, vaikka 25 muuten laimennuksesta johtuvat ominaisuudet voisivat olla epäedulliset TBPA-pitoisuuksien aletessa seerumin progres-siivisessä laimentamisessa.

Potilasseerumeilla suoritettu vapaan tyroksiinin määrityskoesarja 30 Koesarjassa, joka käsitti eutyreoottisia (n=37), hypotyreoottisia (n=34) ja hypertyreoottisia (antityreoo-sihoito) (n=40) näytteitä, määritettiin seerumin vapaa tyroksiini keksinnössä esitetyn tekniikan mukaisesti, ja arvoja verrattiin jo kaupallisesti saatavilla olevan va-35 paan tyroksiinin analogimääritysmenetelmällä saatuihin 92884 38 arvoihin (Amerlux-M FT4 RIA kit, Amersham International Plc.), tulokset kuviossa 3. Molempien menetelmien kesken oli erittäin merkittävä (p < 0,001) korrelaatio (r=0,965), ja eri potilasryhmät erottuivat vastaavasti hyvin. Korre-5 laatiokuvaajan kaltevuus oli 1,052. Tämä osoittaa uudelleen menetelmän ekvivalenttisuuden olemassa olevien, hyväksyttyjen seerumin vapaan tyroksiinin määritysmenetelmien kanssa. Hypotyreoottisen, eutyreoottisen ja 27 hyperty-reoottisen seerumin vapan tyroksiinin arvot (joiden arvot 10 vertailuna käytetyssä "analogia-menetelmässä ovat normaalialueen yläpuolella) esitetään taulukossa 5.

Taulukko 5 15 Immunometrinen FT 4 Analogi FT 4

Seerumiryhmä N (PMOL/L) (PMOL/L) ___(PMOL/L)__(PMOL/L)

Hypotyreoot- 34 0,7-13,4 1,1-14,8 tinen 20 Eutyreootti- 37 8,3-27,3 9,6-23,8 nen

Hypertyreoot- 27 23,1 - 109,3 26,5 - 108 tinen : Normaalialue 8,8-26 9 - 25* 25 ‘kuten se on annettu vapaan tyroksiinin analogimenetelmän tuotekirj allisuudessa.

Määritysmenetelmässä ei myöskään esiintynyt mitään 30 riippuvuutta albumiinin tai TBG:n pitoisuuksista, niin kuin voisi ennustaa [125-1]-leimatun vasta-aineen sitoutumisen vaikutuksen puutteesta T3-selluloosa -kiinteään faasiin (kts. taulukko 4) . Taulukossa 6 esitetään tuloksia, jotka on saatu eutyreoottisilla seerumeilla, joissa on 35 alhaiset (tai puuttuvat) tai korkeat TBG-pitoisuudet ja

II

92884 39 joko seerumin albumiinin matalat pitoisuudet (analbumine-mia) tai seerumissa on sellaisen albumiinin molekyylimuo-don korkea pitoisuus, jolla on epätavallisen voimakas tyroksiinin sitomispaikka (familiaalinen dysalbumineminen 5 hypertyroksinemia syndrooma [FDH]). Päinvastoin kuin vapaan tyroksiinin ''analogi-menetelmässä, jossa tiedetään leimatun analogimerkkiaineen residuaalisesti sitoutuvan joko normaalialbumiinin tai sen FDH-syndroomassa tavattavaan muotoon ja siten häiritsevän tämän määritysmenetelmän 10 tuloksia FDH:n tai albuminemian yhteydessä), nämä häiriöt eivät vaikuta keksinnön immunometriseen määritykseen, vaan saadaan normaalit tulokset. Seerumit, joissa on kilpirau hashormonien kanssa aktiivisesti reagoivia autovasta-aineita (jotka häiritsevät analogimääritysmenetelmää endo-15 geenisten vasta-ainemolekyylien eristäessä merkkiaineita) , voidaan myös moitteettomasti mitata immunometrisellä menetelmällä. Taulukossa esitetään myös sellaisten potilaiden tuloksia, joilla on erilaisia kilpirauhasesta johtumatto-mia sairauksia, mutta jotka muuten lasketaan eutyreootti-20 siksi. Tulokset puolestaan tukevat sitä käsitystä, että määritys korjaa seerumin TBG:n vaihteluista johtuvan häiriön, kuten käyttökelpoisessa vapaan tyroksiinin määrityksessä tulisi olla laita, eikä siihen myöskään vaikuta albumiinin pitoisuuden tai sitomiskyvyn vaihtelu.

92884 40

Taulukko 6

Immunometrisen määrityksen suoritus potilasnäytteistä, joissa on endogeenisten tyroksiinin sitojaproteiinien epä-5 normaalit pitoisuudet tai affiniteetit

Seerumin tyyppi N Vapaan tyroksiinin määritys (pmol/L)

Immunometri- Analoginen määritys menetelmä __(kaupallinen)

Normaali 37 9-26 10 - 24

Eutyreoottinen 10 (normaaliarvot)

Matala (nolla) 2 16,4 - 15,5 16, 18

TBG

Korkea TBG (ei 9 17,1 +/-7,9 16,3 +/-6,4 raskaus) 15 3. trimesterin 25 11,8 +/-2,7 10,1 +/-2,7 raskaus FDH syndrooma 13 11,4 +/-2,3

Ei-kilpirauhas- 76 14,6 +/-4,5 14,6 +/-4,1 sairaus 20 Albuminemia Kil- 1 20,0 10,0 pirauhashormoni autovasta-aineita 2 8,7, 19,2__48,6, 137_ 25

Tulokset ovat samanlaiset kuin kaupallisesti saatavalla vapaan tyroksiinin "analogi"-radioimmunomäärityksel-lä TBG:n vaihdellessa (ei-raskeudentilan matala ja korkea TBG, kolmannen trimesterin raskaus) ja ei-kilpirauhaspe-30 räisten sairauksien yhteydessä (normaali TBG, mutta jonkun verran alentunut albumiinin pitoisuus). Immunometrinen määritysmenetelmä osoittautuu suorituskyvyltään paremmaksi tapauksissa, joissa albumiinin pitoisuus tai tyroksiinin-sitomisaffiniteetti vaihtelevat voimakkaasti (FDH syndroo- 92884 41 ma, analbuminemia) ja seerumissa on kilpirauhashormoneja sitovia autovasta-aineita. Tämä on sopusoinnussa sen käsityksen kanssa, että "analogi"-menetelmä on jossain määrin riippuvainen seerumin albumiinin pitoisuudesta tai affini-5 teetista, sen vaikuttaessa tuloksiin, milloin albumiini poikkeaa huomattavasti normaalista. Albumiinista riippumattomalla immunometrisellä menetelmällä ei ole tätä häiriötä .

Esimerkki 2 10 Vapaan testosteronin immunometrinen määritys

Differentiaalisesti sitovalla liaandianaloailla päällystettyjen aktivoitujen selluloosapartikkeleiden valmistus 20 ml aktivoitujen, alhaisen tiheyden selluloosa-15 partikkeleiden vesisuspensiota valmistettiin kuten edellä esimerkissä l on kuvattu. Etiokolan-17B-oli-3-karboksime-tyylioksiimi (5B-DHT-3CMO) valmistettiin standardimenetelmällä saattamalla 5B-DHT reagoimaan karboksimetyylioksii-min kanssa. Tuote puhdistettiin uuttamalla ja uudelleen 20 kiteyttämällä. 5B-DHT-3CMO liitettiin naudan seerumin albumiiniin (BSA) aktiiviesterimenetelmää käyttäen ja pudistettiin geelisuodatuskromatografisesti ennen kylmäkuivaus-ta. DHT:n liittyminen määritettiin mittaamalla kytkettyjen aminoryhmien määrä trinitrobentseenisulfonihapolla. Tässä 25 valmisteessa DHT:BSA -suhde oli 5:1. Valmistettiin 5B-DHT-3CM0 - BSA:n karbonaatti/bikarbonaattiliuos laimennuksena 125 mg/ml.

0,5 ml tätä liuosta lisättiin sitten aktivoituun selluloosaan. Seosta inkuboitiin 37 °C:ssa kahden tunnin 30 ajan. Partikkelisuspensio sai laskeutua, yläosa imettiin pois ja sentrifugoitiin ja suoritettiin pesu kolmesti 10 ml:11a 0,05 M karbonaatti/bikarbonaattipuskuria, pH 9,6, jota seurasi pesu kolmesti 0,1 M NaOH:lla ja pesu kolmesti 0,1 M HCl:lla. Lopuksi partikkelit pestiin kolmesti 0,1 M 35 fosfaattipuskurilla, pH 7,0 ja suspendoitiin uudelleen 20 92884 42 ml:aan fosfaattipuskuria. Määritystä varten partikkelit laimennettiin samaan puskuriin suhteessa 1:10.

Testosteronispesif isen monoklonaalisen vasta-aineen lähde ja ominaisuudet 5 Testosteronispesifinen monoklonaalinen valmiste saatiin Interpharm Laboratories'sta Israelista. Vasta-aineet oli valmistettu kloonista, joka aikaansaatiin hybri-disoimalla N50/1 hiiren myeloomasoluja BSA-konjugoidulla testosteroni-3-karboksimetyylioksimilla immunisoitujen 10 Wistar-rottien pernasolujen kanssa. Tämä klooni (numero F2) edusti toimittajan ilmoituksen mukaan lyofilisoitua, erittäin puhdistettua immunoglobuliinifraktiota (alaluokka IgGl). Toimittaja ilmoitti vasta-aineen affiniteettiva-kioksi 1 x 1010 1/mol. Sen ristireaktioksi 5B-DHT:n kanssa 15 ilmoitettiin 15 %. Vasta-aineen affiniteettivakioksi liukenematonta 5B-DHT:tä kohtaan arvioitiin 1,5 x 107 1/mol.

125-1-leimattuja antitestosteronivasta-aineiden valmistus

Seuraavassa esitetyt reaktiot ja toimenpiteet suo-2 0 ritettiin huoneenlämmössä (n. 2 0 °C) . Seuraavat reagenssit sekoitettiin ensin yhteen: 1,0 mCi 125-I-natriumjodidia 0,1 M kaliumfosfaattipuskurissa, pH 6,0, jossa oli 0,3 M NaCl:a; 0,05 ml monoklonaalista antitestosteronivasta-ai-nevalmistetta, jonka pitoisuus oli 2 mg/ml tislattua vet-' 25 tä. Sitten lisättiin 0,04 ml kloramiini-T-liuosta (100 μg/ml kloramiini-T:tä kaliumfosfaattipuskurissa, pH 7,5), ja liuosta sekoitettiin viisi sekuntia. Seosta inkuboitiin kuusikymmentä sekuntia, kun reaktio keskeytettiin lisäämällä 0,04 ml natriummetasulfiittiliuosta (200 μg/ml nat-30 riummetasulfiittia samassa fosfaattipuskurissa). Seos gee-lisuodatettiin Sephadex S25:llä (PD-10 pylväs, Pharmacia Ltd.) ja eluoitiin 0,1 M kaliumfosfaattipuskurilla pH 7,5, johon oli lisätty 0,1 % BSA:ta. Ulos tuleva leimatun vasta-aineen piikki eluoitui pylvään partikkelien välisen ti-35 lan volyymissä (void volume). Leimatun vasta-aine-valmis- 92884 43 teen spesifinen aktiivisuus oli 1,5 x 106 mCi/mmol proteiinia.

Seerumin/plasman vapaan testosteronin immunometri-sen määrityksen kuvaus 5 50 μΐ seeruminäytettä sekoitettiin 0,2 ml:aan kiin teän faasin 5B-DHT-3CMO-BSA-konjugoitua selluloosakomplek-sisuspensiota. Lisättiin 0,2 ml leimattua antitestostero-nivasta-ainetta (joka sisälsi 5 ng, 33 fmol vasta-ainetta) 0,1 M kaliumfosfaattipuskurissa, pH 7,5, jossa oli 1 % 10 BSA:ta. Liuos sekoitettiin vortexilla ja inkuboitiin 37 °C:ssa tunnin ajan. Seerumin vapaa testosteroni kilpaili 5B-DHT-selluloosakompleksin kanssa leimatun vasta-aineen sitomisesta, ja kompleksiin sitoutunut 125-1 oli kääntäen verrannollinen seerumin vapaan testosteronin pitoisuuteen. 15 Magnetisoitu 5B-DHT-selluloosakompleksi siihen liitettyine vasta-aineineen seostettiin viemällä reaktioseosputket magneettipohjalla varustettuun telineeseen, jolloin liukenematon 5B-DHT-selluloosakompleksi vedettiin putken pohjaan ja muodosti kiinteän "napin". Kymmenen minuutin aika-20 jakso magneettisessa erotustelineessä riitti selluloosa- kompleksin täydelliseen erottamiseen liuoksesta. Putket käännettiin alassuin (edelleenkin telineessä) ja neste kaadettiin pois. "Napit" suspendoitiin uudelleen 1 ml:aan vettä ja putket asetettiin 10 min ajaksi magneettitelinee-25 seen ja käännettiin alassuin. Ne saivat valua 5 minuuttia alassuin, minkä jälkeen ainoastaan magneettiseen 5B-DHT-selluloosapartikkeleihin kiinnittynyttä leimattua vasta-ainetta sisältävien putkien aktiivisuus laskettiin kuudenkymmenen sekunnin ajan. Tuntemattomien seerumien vapaan 30 testosteronin pitoisuudet voitiin interpoloida annos-res-ponssikäyrältä, joka oli laadittu käyttäen tunnettuja vapaan testosteronin pitoisuuksia ja ulottui yli koko odotettavissa olevan määritysalueen. Seuraavassa tyypillisiä saatuja tuloksia.

• 44 92884

Vapaata testostero- Saostuman radio- % radioaktii-nia aktiivisuus, visuutta si- _(pg/ml)__cpm__toutunut_ 5 0 34,726 23,2 % 1 28,843 19,2 % 4,2 23,313 15,5 % 12,5 18,144 12,1 % 35 13,435 9,0% 10 100 8,885 5,9 % _250__6,264__4,2 %

Vasta-aineen affiniteettivakio analogin suhteen oli 1,5 x 15 107 1/mol; analogin tehollinen pitoisuus määritysputkessa oli 1,7 x 10‘8 mol; näiden kahden luvun tulo on 2,6 x 10'1 Vasta-aineen affiniteetti ligandin suhteen oli 1 x 1010 1/mol; vasta-aineeseen sitoutuneen ligandin pitoisuus in-kubaation päättyessä todettiin 4 x 10“ mooliksi; näiden 2 0 kahden luvun tulo on 4 x 10'1. Näiden kahden tulon suhde on 0,65. Tehollisen analogipitoisuuden suhde vasta-ainepitoisuuteen on noin 5 x 104.

Endogeenisen sukupuolihormonia sitovan globuliinin häiritsemättömyys vapaan testosteronin määrityksessä 25 Testosteronia verenkierrossa kuljettavat pääasial lisesti kaksi luonnollisesti esiintyvää proteiinia, SHBG (TsBG) ja albumiini. Naisilla noin 79 % testosteronista on sitoutunut SHBG:hen (TsBG). SHBG:n (TsBG:n) taso ja vastaavasti kokonaistestosteronin pitoisuudet kasvavat ras-30 kauden aikana. Kuitenkaan raskaana olevien naisten vapaan testosteronin pitoisuudet eivät merkittävästi poikkea yleensä naisten arvoista.

Tehtiin koesarja, jossa määritettiin ei-raskaana olevien naisten (n=38) ja kolmannen trimesterin raskauden 35 aikana naisten (n=25) seerumeista vapaa testosteroni edellä esitetyllä tekniikalla. Ei-raskausnäytteiden vapaan li 92884 45 testosteronin pitoisuuden keskiarvo (+/- SD) oli 15,6 ± 5,06 pg/ml, joka ei merkittävästi poikkea raskaana olevien arvosta (12,5 ± 2,9 pg/ml).

Esimerkki 3 5 Vapaan trijodityronin (T3) immunoradiometrinen mää ritys

Reagenssit

Monoklonaalinen anti-T3-vasta-aine valmistettiin itse käyttäen standarditekniikalla puhdistettua T3-BSA:ta, 10 joka sen jälkeen leimattiin 125-1:11a kuten esimerkissä 1 esitetty.

Ligandianalogi oli dijodityroniini (T2). Tämä liitettiin aktiiviseen selluloosaan esimerkissä 1 esitetyn tekniikan mukaisesti.

15 Leimatun vasta-aineen affiniteettivakio T3:n suh teen oli 5 x 109 1/mol; leimatun vasta-aineen affiniteetti-vakio T2:n suhteen oli 1 x 108 1/mol; leimatun vasta-aineen affiniteettivakio liukenemattoman T2:n suhteen arvioitiin 5 x 106 l/mol:ksi.

20 Määritysmenetelmä 50 μΐ seeruminäytettä sekoitettiin 0,5 ml:n kanssa T2-selluloosapartikkelisuspensiota, 2,5 x 10'9 mol/1, (eli 0,25 x 1010 moolia T2:a 1,25 x 10^ g:ssa selluloosaa kussakin määritysputkessa); ja 0,5 ml leimatun vasta-aineen 25 liuosta, jossa oli 5 x 10'5 moolia vasta-ainetta määritys-putkessa. Laimennuspurkit, inkubaatio-olosuhteet ja mag-neettipartikkeleiden erotus suoritettiin kuten esimerkissä 1 on esitetty. Seuraavassa tyypillisiä saatuja koetuloksia.

46 9 2 8 8 4

Vapaata T3 (pq/ml) % radioaktiivisuutta sitoutunut_ 0 39 5 2,5 37 5 32 10 30 20 22 40 16 10 Tässä määrityksessä tulo a) (leimatun vasta-aineen affiniteettivakio analogin suhteen kertaa analogin tehollinen pitoisuus) on 1,25 x 10'2; ja tulo b) (vasta-aineen affiniteettivakio ligandin suhteen kertaa inkubaation päättyessä vasta-aineeseen sitoutuneen ligandin pitoisuus) 15 on 3 x 10'2. Suhde a) :b) on silloin 0,4. Tehollisen analo-gipitoisuuden suhde vasta-ainepitoisuuteen on noin 5 x 104.

Claims (10)

92884

1. Menetelmä ligandin vapaan osan määrittämiseksi biologisessa nestenäytteessä, joka sisältää myös osan li-5 gandista sitoutuneena yhteen tai useampaan luonnolliseen sitojaan, käyttäen merkkireagenssia, joka on ligandin vasta-aine, ja differentiaalisesti sitovaa ligandianalogia, joka kilpailee ligandin kanssa vasta-aineen sitomispai-koista, jossa menetelmässä näytettä inkuboidaan analogin 10 ja vasta-aineen kanssa ja todetaan vasta-aineen määrä, joka sitoutuu analogiin, tunnettu siitä, että vasta-aine on ligandin monoklonaalinen vasta-aine ja että analogi on siten valittu, että sen affiniteetti vasta-aineen sitomiseksi on alempi kuin ligandin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että analogin sitomisaffiniteetti vasta-aineen suhteen on 0,01 % - 10 % vapaan ligandin affiniteetista vasta-aineen suhteen.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että differentiaalisesti sitova ligandianalogi on saatettu liukenemattomaksi ennen inku-baatiota.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että differentiaalisesti sitova 25 ligandianalogi on saatettu liukenemattomaksi siten, että se on kovalenttisesti sidottu selluloosa- tai polystyree-nipartikkeleihin.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine on lei- 30 mattu 125-1:11a.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suhde a):b) on välillä 0,1 ja 10, jolloin a) on (vasta-aineen affiniteettiva-kio analogin suhteen kertaa analogin tehollinen pitoisuus) 35 ja b) on (vasta-aineen affiniteettivakio ligandin suhteen 48 92ΰο4 kertaa vasta-aineeseen sitoutuneen ligandin pitoisuus in-kubaation päättyessä).

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että analogin tehollisen 5 pitoisuuden suhde vasta-aineen pitoisuuteen on 10 - 105.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että analogin vasta-aineen sitomispaikkojen pitoisuus ja vapaan ligandin pitoisuus ovat olennaisilta osiltaan samat inkubaation alussa ja 10 lopussa.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ligandi on kilpirauhashormoni, steroidi tai kortisoli.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että ligandi on tyroksiini ja dif- ferentiaalisesti sitova ligandianalogi on trijodityro-niini. t * 92884