NO163586B - Immunologiske jodtyroninanalyser hvor hms brukes som tbp-blokkerende middel. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører immunologiske analyser for bestemmelsen av jodtyroniner i biologiske væsker, slik som serum eller plasma. Nærmere bestemt, vedrører foreliggende oppfinnelse immunologiske analysefremgangsmåter med konkurrerende binding og reagenssystem, for å bestemme jodtyroniner i ikke-ekstraherte prøver av serum eller plasma gjennom nvendelsen av blokkerende eller dissosierte midler for bindingen av jodtyroniner ved hjelp av tyroksin-bindende proteiner (TBP) som er tilstede i slike prøver.

De viktigste jodtyroninene av klinisk interesse er 3,5,3',5'-tetrajodtyronin (tyroksin, T-4), 3,5, 3 '-trijodtyronin (T-3, eller ganske enkelt "trijodtyronin"), 3,3',5'-trijodtyronin ("revers-T3") og 3,3 *-dijodtyronin. Den kvantitative bestemmelsen av konsentrasjonen av de forskjellige jodtyroninene, særlig hormonene T-4 og T-3 i blodet, er av betydning ved diagnosen av sykdommer i skjoldbruskkjertelen.

I blodet er nesten alle jodtyroninene som er i omløp, kompleksbundet med forskjellige bærerproteiner inkludet albumin, tyroksinbindende prealbumin og tyroksinbindende globulin (TBG), slike bærerproteiner refereres her til ved et fellesnavn som tyroksinbindende protein (TBP). For å måle konsentrasjonen av den totale mengde av et jodtyronin i en blodprøve, slik som serum eller plasma, må de TBP-bundne formene dissosieres i en analytisk betydelig grad og den resulterende totale mengde fri jodtyronin bestemmes. Dissosieringen av jodtyroniner fra TBP, særlig TBG, ble opprinnelig utført ved hjelp av en ekstraksjonsfremgangsmåte (U.S. patentskrift nr. 3 414 383). Under den nåværende teknikkens stand kan jodtyroniner bestemmes ved hjelp av immunologisk analyse i ikke ekstraherte prøver gjennom bruken av forbindelser som empirisk er funnet å blokkere og forårsake dissosiering av TBP-binding. I gjengse immunologiske jodtyroninanalyser med konkurrerende binding, blandes en prøve med reagenser inkludert et antistoff til jodtyroninet som skal bestemmes, en merket form (f.eks. radioaktivt merket) av et slikt jodtyronin og et eller flere TBP-blokkerende midler. Jodtyroninet som i prøven er kompieksbundet til TBP, dissosieres fra dette og konkurrerer med merket jodtyronin om binding til antistoffet. Forholdet mellom merket jodtyronin som blir antistoffbundet sammenlignet med det som forblir ubundet til antistoffet, er avhengig av den totale konsentrasjonen av jodtyroninet i prøven og er målbart på en lang rekke måter avhengig av den bestemte immunologiske analyseteknikken som anvendes.

Forskjellige forbindelser er funnet å være nyttige TBP-blokkerende midler inkludert tetraklortyronin [Mitsuma et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 33:365 (1971)], difenyl-hydatoin [Lieblich an Utiger, J. Clin. Invest. 50:60a

(1971)], salicylate [Larson, Metab. 20:976 (1971)], de forskjellige stoffene beskrevet av Hollander (U.S. patentskrift nr. 3 928 553) og Chopra (U.S. patentskrift nr.3 911 096),særlig 8-nailin-l-naftalensulfonsyre (ANS) og hvis substituerte fenyleddiksyrer, særlig fenklofenak og diklo-fenak (søkerens U.S. pat.nr. 4 468 469 inngitt 3. september 1982). Strukturen og de generelle egenskapene til de kjente TBP-blokkerende midler varierer i svært stor grad. Egenskapene som er kritisk for anvendbarheten som et TBP-blokkerende middel i immunologiske analyser, dvs. evnen til i tilstrekkelig grad å dissosiere jodtyroniner fra TBP ved konsentra-sjonsnivåer som ikke er tilstrekkelig for å forårska inhibering av bindingsreaksjonen fra antistoffet, anses vanligvis som uforutsigbare ut fra rent strukturelle sammenligninger, selv om det er stilt opp noen teorier vedrørende TBG-blokkering [Brown and Metheany, J. Pharm. Sei. 63:1214 (1974)].

Det er nå funnet at 2-hydroksy-4-metoksybenzofenon-5-sulfonsyre (HMS) og salter derav er særlig fordelaktige TBP-blokkerende midler for bruk i immunologiske jodtyroninanalyser.

Ifølge foreliggende oppfinnelse' er det tilvelebragt en Immunologisk analysefremgangsmåte av den type som fremgår fra innledningen til krav 1, og er kjennetegnet ved de trekk som fremgår fra karakteristikken i kravene 1-3.

Videre er det ifølge oppfinnelsen tilvelebragt et reagenssystem av den typen som fremgår fra innledningen til krav 4 og er kjennetegnet ved at det innbefatter 2-hydroksy-4-metok-sybenzofenon-5-sulfonsyre, eller et salt derav, som et blokkerende middel for binding av jodtyroninet til tyroksin-bindende protein i den biologiske væsken.

Blokkeringsmiddelforbindelsen innlemmes i den immunologiske analysereaksjonsblandingen i en konsentrasjon som er tilstrekkelig til å oppheve og blokkere bindingen a en analytisk betydningsfull prosentdel av et TBP-koinpleksbundet jodtyronin, fortrinnsvis mer enn 50$ og vanligvis mer enn 70#, mens konsentrasjonen er utilstrekkelig til i betydelig grad å forstyrre bindingen av jodtyronin til antistoffet. Mens de nøyaktige, ønskelige konsentrasjoner av blokkeringsmidlet i en bestemt immunologisk jodtyroninanalyse vil variere med jodtyroninet som skal analyseres, og med den immunologiske analyseteknikken som følges, såvel som andre faktorer, brukes forbindelsen vanligvis i konsentrasjoner i reaksjonsblandingen mellom 0,1 millimolar (mM) . og 10 mM, fortrinnsvis mer enn 0,25 mM, og vanligvis mindre enn 5,0 mM. Det HMS-blokkerende midlet tilsettes til analysereaksjonsblandingen som syren eller en analytisk akseptabel saltform derav, f.eks. natrium-, kalium-, litium- og ammoniumsaltene.

HMS gir bestemt fordeler som et TBP-blokkerende middel i immunologiske analyser. Forbindelsen er funnet å være et spsielt sterkt blokkeringsmiddel. Dissosiering av mer enn 50* av TBP-bundet jodtyronin i løpet av noen få minutter er mulig ved å bruke konsentrasjoner i reaksjonsblandingen som er så lave som 1 mM, og idet konsentrrasjoner på bare 4 mM gir over 90* dissosiering. HMS er sterkt vannoppløslig og er funnet å væreeffektiv over et ganske bredt pH-område, noe som gir allsidighet i utformingen av prøvesett.

Detil vil HMS ikke gi noen vesentlig inhiberende virkning på den katalytiske aktiviteten til mange enzymer ved konsentrasjoner hvor den er et effektivt TBP-blokkerende middel. Med uvensetlig inhiberende virkning på enzymatisk aktivitet er det ment at katlysehastigheten ikke nedsettes mer enn 70*, vanligvis mindre enn 50*, og fortrinnsvis mindre enn 30*. Denne forbindelse er således videre fordelaktig som et TBP-blokkernde middel i homogene immunologiske analyser hvor markøren som anvendes er en deltaker i en enzymatisk reaksjon, f.eks. et enzymsubstrat, en enzyminhibitor, en prostetisk gruppe i et enzym, et koenzym eller enzymet selv, eller en del derav. Tidligere kjente TBP-blokkerende midler, særlig det mest populære midlet, ANS, kan forårsake betydelig inhibering av enzymreaksjoner som igjen resulterer i redusert analyseutførelse.

HMS og dens salter finner derfor ny anvendelse som TBP-blokkerende midler i immunologiske analyser generelt, og er spesielt fordelaktig når den anvendes i homogene immunologiske analyser, særlig de hvor markøren som anvendes er en deltaker i en enzymkatalysert reaksjon. Foreliggende oppfinnelse gir også et reagenssystem forutførelse av de nye immunologiske analysene, særlig i form av prøvesett og prøveinnretninger som vanligvis brukes i kliniske laborato-rier.

HMS med formelen:

er funnet å være sårlig fordelaktig som et TBP-blokkerende middel for bruk i immunologiske jodtyroninanalyser. Analoge forbindelser som har de fordelaktige, TBP-blokkerende egenskapene ifølge foreliggende oppfinnelse, vil bli ansett som ekvivalenter forsåvidt angår foreliggende sammenheng. F.eks. kan den usubstituerte fenylringen uten begrensninger sustitueres passende slik som med en eller flere substituen-ter valgt fra alkyl, vanligvis laverealkyl ( C1- 4), f.eks. metyl, etyl og propyl; alkoksy, vanligvis laverealkoksy, f.eks. metoksy og etoksy; hydroksyl; halogen; syregrupper slik som karboksylsyre- og sulfonsyregrupper og deres alkylhomologer, og lignende. Substituentene på fenylringen med svovelsyregruppen kan også flyttes til andre posisjoner på ringen eller fjernes, og ringen kan dertil substitueres ved passende grupper slik som f.eks. de som er nevnt ovenfor.

Foreliggende oppfinnelse har anvendbarhet på immunologiske jodtyroninanalyser generelt. For de foreliggende formål er en immunologisk analyse ment å bety en hvilken som helst analyse basert på ensidig påvirkning mellom antigen og antistoff, og antistoff er ment å skulle bety alle vanlige eller monoklonale antistoff (f.eks. IgG, IgM, IgA, etc-typene) eller en virksom del derav (f.eks. Fab, F(ab')-, etc.-fragmentene av IgG). Den vanligste immunologiske analysetypen som foreliggende oppfinnelse med fordel kan anvendes ved, er immunologisk analyse for å bestemme et jodtyronin, blandes en prøve av en kroppsvæske, vanligvis serum eller plasma, med et antistoff til jodtyroninet som skal analyseres, en merket form av jodtyroninet og et blokkerende middel for TBP-bindin. Forholdet mellom merket jodtyronin som bindes til antistoffet i konkurranse med eventuelt jodtyronin i prøven sammenlignet med det som forblir ubundet, står i forhold til konsentrasjonen av jodtyroninet i prøven.

Det kan brukes både homogene og heterogene irrmunolgiske analyseteknikker, de førstnevnte er imidlertid særlig foretrukket. Ved heterogene immunologiske analyser frasepareres den antistoffbundne formen fysisk fra det merkede jodtyroninet, slik som det er kjent innen teknikken, fra den ubundne formel, og markøren måles i den ene eller andre av de atskilte fasene. Det er kjent forskjellige markører for bruk ved heterogenet immunologisk analyser, inkludert radioaktive isotoper (f.eks U.S. patentskrift nr.

4 111 656 og 3 911 096), fluorescensfrembringende midler (f.eks U.S. patentskrift nr. 4 201 763, 4 171 311, 4 133 639 og 3 992 631), enzymer (f.eks U.S. patentskrift nr.3 654 090) osv. Ved radio-immunologiske analyser for jodtyroniner er det særlig fordel-

aktig å bruke radioaktivt jod som markør, idet dette erstatter et av de naturlig forekommende jodatomene i jodtyroninet.

Ved homogene- immunologisk analyser, som er særlig foretrukket

ved foreliggende oppfinnelse, gir den antistoffbundne formen av det merkede jodtyroninet uttrykk for en egenskap som er forskjellig fra egenskapen til den ubundne formel, og separasjons-trinnet som kreves ved heterogenanalyser kan således unngås.

Innen teknikken er det kjent en lang rekke homogene , immunologiske analyseteknikker. Særlig foretrukket er de hvor markøren som er kjemisk konjugert med jodtyroninet, er et enzym, eller en del av et enzym, f.eks en prostetisk gruppe, eller er en deltaker i en enzymkatalysert reaksjon, f.eks et substrat, et koenzym, en inhibitor, en aktivator eller lignende. Bruken av HMS kan være noe begrenset i immunologisk analyser hvor en lysutstråling, f.eks fluorescens eller kjemiluminescens, er signalet og måles i nærvær av blokkeringsmidlet. HMS er funnet å absorbere ved bølgelengder over 36 0 nanometer (nm) og kan derfor eventuellt stanse strålinger i dette området.

Foreliggende oppfinnelse er særlig anvendbar ved homogenet immunologiske analyser med konkurrende binding hvor markøren er en deltaker i en enzymkatalysert reaksjon. Slike immunologiske analyser omfatter enzymsubstrat-merkede teknikker (Se U.S. patentsøknad nr. 894 836, inngitt 10. april 1978 og tilsvarende G.B. patentskrift nr. 1 552 607) teknikker med prostetisk gruppe som markør (se U.S. patentskrift nr. 4 238 565 som beskriver et spesiellt foretrukket system hvor markøren er flavinadenindi-nukleotid (FAD) og som måles ved tilsetning av apo (glukoseoksidase), koenzymmerkede teknikker (se U.S. pat.nr. 4,629,688), teknikker med enzymmodulator som markør (se U.S. patentskrift nr. 4 134 793 og 4 273 866) og enzymmerkede teknikker (se U.S. patentskrift nr. 3 817 837 og 4 043 872). Andre homogene', immunologiske analyseteknikker med konkurrerende binding kan følges uten at man avviker fra det foreliggende oppfinneriske utkast. Ytterligere detaljer er gitt i U.S.pat.nr. 4,468,469,

inngitt 3. september 1982.

Den biologiske væsken som skal testes kan være en hvilken som helst hvor jodtyroninet eller jodtyroninene av interesse kan være uønsket forbundet til bindende proteiner. Vanligvis er biologisk fluid en blodprøve slik som serum eller plasma.

Reagenssystemet ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter alle

de vesentlige kjemiske elementene som kreves for å utføre en ønsket immunologisk jodtyroninanalysefremgangsmåte omfattet av den foreliggende oppfinnelsen. Reagensenhetene frembys i en kommersiell pakkningsform, som en sammensetning eller blanding der hvor forenligheten mellom reagensene tillater det, i en prøve-innretningsutforming, eller som et prøvesett, dvs. en pakket kom-binasjon av en eller flere beholdere som inneholder de nødvendige reagensene. Inkludert i reagenssystemet er de reagensene som passer for det ønskede bindingsreaksjonssystemet, og har en forbindelse, f.eks. HMS, som et TBP-

blokkerende middel. Slike reagenser for bindingsreaksjon omfatter vanligvis, i tillegg til det foreliggende blokkeringsmiddel, et merket jodtyroninkonjugat, antistoff til jodtyroninet som analyseres, og eventuellt andre TBP blokkerende midler som måtte være ønsket. Selfølgelig kan reagenssystemet omfatte andre materialer som er kjent innen teknikken og som kan være ønskelige utfra et kommersielt eller brukersynspunkt, slik som buffere, fortynnings-midler, standardoppløsninger osv. Særlig foretrukket er et prøve-

sett for den homogene immunologiske analysen ved konkurrerende binding ifølge foreliggende oppfinnelse som omfatter (a) et antistoff til jodtyroninet som skal bestemmes, (b) et merket jodtyroninkonjugat som har en påvisbar egenskap som endres når det bindes til antistoffet, og (c) en forbindelse

som et TBP-blokkerende middel. Den bestemte markøren som brukes vil avhenge av teknikken som følges, slik som beskrevet ovenfor. Også foretrukket er en prøveinnretning som omfatter en blanding av reagenser som inkluderer et jodtyroninantistoff, et merket jodtyroninkonjugat som har en påvisbar egenskap som endres når det bindes til antistoffet, og en forbindelse som et TBP-blokkernde middel, og en

fast bærerdel som er inkorporert med reagensblandingen. Noen av de forskjellige formene av slike prøveinnretninger er beskrevet i U.S. pat. nr. 4,668,619, inngitt 30. oktober, 1980,

og som er publisert som E.P. patentskrift nr. 51 213.

Foreliggende oppfinnelse skal nå illustreres, av de følgende eks empler.

Eksempel 1.

Dissosiering av tyroksin fra humanserumproteiner ved hjelp av

HMS.

125

Tyroksin merket med radioaktivt jod ( I-tyroksin) ble ekvi-librert med 3,5 milliliter (mL) normalt humant serum i 48 timer ved 4°C. Alikvoter av dette serumet (50 mikroliter (uL)) ble tilsatt til 450 yL 0,1 molar (M) natriumfosfatase, pH 6,0, som inneholdt forskjellige konsentrasjoner av HMS, slik at man fikk sluttkonsentrasjonene som er gjengitt i tabell 1. Etter 5 eller 30 minutter med inkubering ved værelsestemperatur, ble en 500

yL alikot tiført en "Sephadex"-kolonne fra et Seralute ® terok-sinanalysesett som var blitt ekvilibrert med 0,1 M natriumfosfat, pH 6,0. Den totale radioaktiviteten som ble tilført kolonnene, ble målt og ikke dissosiert materiale ble vasket gjennom kolonnen. Radioaktiviteten i kolonnene ble målt for å bestemme den prosent-vise tyroksin som var dissosiert fra serumproteinene.

Eksempel 2.

Virkning av pH på dissosieringen av jodtyronin fra serumpro-teiner ved hjelp av HMS.

Det ble utført analyser i doble sett med 3 ml polystyren prøve-rør. Det ble fremstilt en oppløsning (betegnet "MIX") som inneholdt 27 ml 0,1 M natriumfosfat, ved den fastsatte pH, 73 mL 21% polyetylenklykol, 1,0 mM HMS og 10 mikrogram (yg) (40 yL) 1-125-tyroksin for hver 100 mL. Analyseoppløsninger fremstilles ved tilsettning av 50 yL av en serumprøve, 0,1 mL anti (tyroksin) antiserum-fortynnet i 0,1 M natriumfosfat (ved den gitte pH) og 1,0 mL av MIX-oppløsningen. Det utføres analyser for maksi-male binding av merket og ikke spesifikk binding. Resultatene var som følger:

Dataene indikerer at pH ikke har noen vesentlig virkning på dissosieringseffektiviteten i området 6,0 til 7,5.

Eksempel 3.

Virkning av HMS på aktiveringen av Apo (glukoseoksidase) med

et FAD-merket tyroksinkonjugat.

Aktiveringen av apoglukoseoksidase ble etablert med forskjellige konsentrasjoner av HMS og utført ved 37°c. Anal.yseoppløsninger som inneholdt 50 mM natriumfosfat, pH 6,5, 200 mM glukose, 2,0 mM natriumdiklorhydroksibenzensulfonat (DHSA), 25 yg/mL perok-sidase, forskjellig konsentrasjoner HMS og 2,5 nM sluttkonsen-trasjon av et FAD-tyroksinkonjugat (se U.S. patentskrift nr.

4 213 893), ble igangsatt ved å tilsette apo (glukoseoksidase), 4 aminoantipyrin og anti (sur glukoseoksidase) ved sluttkonsen-trasjoner på henholdsvis 125 nM, 400 yM, og 8 yL/mL. Absor-bansen ved 520 nm ble målt etter en 5 minutter lang inkubering. Dataene er gjengitt i tabell 3 som en prosentdel av absor-bansen målt når ikke noe HMS er tilstede.

EKsempel 4.

Bruken av HMS i det immunologiske apoenzymreaktiverings-analysesystemet (ARIS) for serumtyroksin.

En ARIS-fremgangsmåte (se U.S. patentskrift nr. 4 238 565) ble utført på følgende måte. Standardkurve for serumtyroksin ble

TM"

tilveiebrakt ved å bruke et Ames/Gilford "OPTIMATE instru-ment-system med en automatisert fremgangsmåte for tilsettning 1 rekkefølge. (Serum og antiserum ble tilsatt til reaksjons-beholderen etterfulgt av en 18 minutter lang forinkubering. FAD-konjugatet og apoenzymet ble tilsatt for å starte opp analysen. Etter en 5 minutter lang inkubering ved 37°C, ble ab-sorbansen ved 520 nm målt). Sluttkonsentrasjonenetil reagensene som ble brukt i analysen, var 50 mM natriumfosfat, pH 6,5, 2 mM diklorhydroksibenzensulfonat (DHSA), 25 yg/mL peroksidase* 200 mM glukose, 2 mM HMS, 50 yL/mL serumprøve, 4 yL anti (tyroksin) antiserum, 10 yL anti (glukoseoksidase) antiserum, 2,5 nM T^-FAD-konjugat, 50 nM apoglukoseoksidase og 320 nM 4 aminoantipyrin. Serumsstandardene ble fremstillt ved å tilsette tyroksin til T4-» T -fritt humanserum inntil den ønskede totale konsentrasjon. Resultatene var som følger:

Med HMS som det jodtyronindissosierende middel kan det iaktas eh korrelasjon mellom den målte absorbans ved 520 nm og kon-sentrasjonene av tyroksin i serum når man bruker det homogene, immunologiske apoenzymreaktiverings-analysesystemet.

Claims (4)

1. Immunologisk analysefremgangsmåte for å bestemme et jodtyronin så som tyroksin eller trijodtyronin i en biologisk væske, hvor prøven av nevnte biologiske væske blandes med et antistoff til jodtyroninet, et merket jodtyroninkonjugat omfattende en markør som tilveiebringer en påvisbar respons som er målbart forskjellig når nevnte konjugat er bundet til nevnte antistoff, sammenlignet med når det ikke er bundet, og et blokkerende middel for binding av jodtyroninet til det tyrosinbindende proteinet i nevnte prøve, karakterisert ved at det anvendes 2-hydroksy-4-metoksybenzofenon-5-sulfonsyre (HMS), eller et salt derav som et blokkerende middel for binding av jodtyroninet til tyroksinbindende protein i den biologiske væsken.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at 2-hydroksy-4-metoksybenzofenon-5-sulfonsyre eller saltet derav som anvendes er tilstede i analysereaksjonsblandingen ved en konsentrasjon som er større enn 0,1 mM.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at 2-hydroksy-4-metoksybenzofenon-5-sulfonsyre eller saltet derav som anvendes er tilstede 1 en analysereaksjons-blanding ved en konsentrasjon mellom 0,25 mM og 5,0 mM.

4. Reagenssystem for homogen immunologisk analysebestemming av et jodtyronin i et biologisk fluid, hvori en prøve av nevnte biologiske fluid omfattende (a) et antistoff til nevnte jodtyronin, (b) et merket jodtyroninkonjugat som omfatter en markør som gir en påvisbar respons som er målbart forskjellig når konjugatet bindes til antistoffet, sammenlignet med når det Ikke bindes, og (c) et blokkerende middel for tyroksin-bindende protein, karakterisert ved at det innbefatter 2-hydroksy-4-metoksybenzofenon-5-sulfonsyre, eller et salt derav, som et blokkerende middel for binding av Jodtyroninet til tyroksinbindende protein i den biologiske væsken.