NO168002B

NO168002B - Fremgangsmaate for maaling av frie ligander i biologiske fluider.

Info

Publication number: NO168002B
Application number: NO862278A
Authority: NO
Inventors: A Said El Shami
Original assignee: Diagnostic Products Corp
Priority date: 1985-10-04
Filing date: 1986-06-06
Publication date: 1991-09-23
Also published as: IL79283A; ATE130435T1; EP0661540B1; DE3650437T2; CA1299984C; AU602864B2; FI863186A; DK219686A; ES555425A0; NO862278D0; FI863186A0; JPH07311200A; DE3650691D1; EP0218309A3; DE3650437D1; DE3650691T2; ATE169410T1; EP0661540A1; IE60715B1; DK169365B1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for måling av frie ligander i biologiske fluider.

Nærmere bestemt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for måling av frie ligander i biologiske fluider i nærvær av en bundet ligand og.endogent bindende proteiner uten å forstyrre likevekten mellom den fri ligand og den proteinbundne ligand.

I flere ti-år var likevektsdialyseteknikker den eneste tilgjengelige metode for å måle frie hormoner i serum og var inntil nylig de eneste metoder som ble ansett pålitelige. Likevektsdialysemetoder i denne kontekst lider under diverse mangler inkludert dårlig nøyaktighet, omstendighet, og så videre, men fremfor alt var de oppnådde resultater sterkt avhengig av renheten til de benyttede tracere.

Ellis og Ekins, R. ("Acta Endocr." (KbH. ) Suppl. 177:106, 1973) beskrev en direkte metode for bestemmelse av frie hormoner i artikkelen "Direct Measurement By Radioimmunoassay of the Free Thyroid Hormone Concentration in Serium". Dette representerte en vesentlig forbedring i forhold til likevektsdialysemetoder, fordi den tillot direkte måling ved radioimmunoanalyse, RIA, av nivået for frie ligander i serumdialysater, noe som således omgikk problemet med tracer-renhet. Denne metode anses nu som referansemetoden for fri-hormonmålinger. Den er imidlertid fremdeles tidkrevende og operatoravhengig og er utilgjengelig for de fleste små laboratorier.

Den indirekte måling for bedømmelse av fri-hormonkonsentra-sjoner som ble innført kort derefter inkluderer testosteron: steroidhormonbindingsglobul in (SHBG)-forholdet, tyroksin(T4):tyroidbindingsglobulin(TBG)-forholdet, den frie T4-indeks (basert på produktet av triJodtyronin (T3)-opptaket og T4) samt den frie androgenindeks.

R. Ekins ("Free Thyroid Hormones; Proceedings of the Inter-national Symposium" i Venice, desember 1978, Amsterdam: "Excerpta Medica", 1979 72-92) innførte konseptet med "direct dynamic methods" hvori et anti-fri ligand-antistoff benyttes i direkte kontakt med det biologiske fluid under dialyse. Dette utgjør basis for såkalte "immunoekstra-herings"-metoder.

En slik metode beskrives i US-PS 4.046.870 der en to-rørs immunoanalysemetode måler forholdet for overføring av T4 fra bindingsproteiner til T4-spesifikt antistoff. Denne metode lider av flere analytiske og kliniske mangler som i virkeligheten gjør det til kun en annen fri-T4-indeksanalyse.

En annen metode, innført av "Clinical Assays" (Cambridge, MA 02139), var en virkelig immunoekstraheringsmetode. Den benyttet en enkeltrørs, totrinns, sekvensiell (tilbake-titrerings) teknikk. I denne metode inkuberes en serumprøve med immobilisert antistoff; efter et vasketrinn blir ikke opptatte seter på det immobiliserte antistoff "tilbake-titrert" ved bruk av merket ligand. Ved denne tilnærmelse kommer serumet aldri i kontakt med den merkede ligand. Selv om den teoretisk er god, lider den av dårlig sensitivitet og nøyaktighet og begge reaksjoner krever nøyaktig tidsavstem-ning.

En enkelttrinns immunoekstraheringsmetode for bestemmelse av friligandkonsentrasjoner i biologiske prøver var det åpenbare neste trinn ved utvikling av friligandanalysesystemer. Disse metoder stoler på kjemisk istedenfor fysikalsk separering av merket ligand fra endogene bindere. For å oppnå dette kan man nærme seg problemet på flere måter slik det er angitt nedenfor.

Den kjente teknikk beskriver at ved kjemisk å endre struk-turen for en gitt ligand, blir bindingen til endogene bindere redusert eller opphevet. Dette er rikelig demonstrert for steroide hormoner. (Se diskusjonen av fritt testosteron nedenfor.) Når det gjelder tyroidhormoner har J.E. Ross og D.F. Tapley ("Effeet of various analogues on the binding of labeled thyroxine to thyroxine-binding globulin and prealbumin", "Endocrinology" 79:493, 1966) vist at bindingen av TBG, tyroidbindingsglobulin, til T4 inhiberes hvis en heller voluminøs substituering skjer i 3'-posisjonen i T4-molekylet. I tillegg har R.F. Schall et al., ("An enzyme-labeled immunoassay for the measurement of unsaturated thyroid hormone binding capacity in serum and plasma", "Clin. Chem.", 25:1078 (sammendrag) 1979), og G. Kleinhammer et al., ("Enzyme immunoassay for determination of thyroxine binding index", "Clin. Chem.", 24:1033, 1978) uavhengig vist at TBG ikke binder til konjugater dannet ved merking av T4 med pepperrotperoksydase. Dette faktum utgjør basis for den enkelttrinnsimmunoekstraheringsmetode som er beskrevet i US-PS 4.410.633 for måling av fri tyroksin og fri 3 ,5 ,3'-trijodtyronin hvori pepperrotperoksydase kjemisk festes til T4 og T3 og senere radiomerkes.

I tillegg beskriver den kjente teknikk også at T3 og T4 krever den følgende molekylstruktur for maksimal binding til endogene bindingsproteiner, nemlig TBG, tyroidbindingspre-albumin (TBPA), albumin,

S.M. Snyder et al. ("Binding of thyroid hormones and their analogues to thyroxine-globulin in human serum", "J. Biol. Chem.", 251:6489, 1976);

K. Sterling et al. ("Equilibrium dialysis studies of the binding of thyroxine by human serum albumin", "J. Clin. Invest.", 41:1021, 1962): 1. L-alanln-sidekjedekonfigurasjonen; 2. Nærværet av 4'-hydroksylgruppe (primært for TBPA- og albuminbinding); og 3. Nærværet av to (halogen) substituenter i de indre og ytre ringer (posisjonene 3,5,3' og 5').

Flere hundre T3- og T4-analoger er syntetisert og studert med henblikk på evnen til å binde til tyroidhormonbindings-proteiner.

US-PS 4.366.143 samt det europeiske motstykket, EP-PS

00 26 103, beskriver generelt bruken av slike analoger som tracere i en enkel immunoekstranering ved bruk av samtidig istedenfor sekvensiell titrering av antistoff for måling av frie hormoner. (For hensiktsmessighetens skyld vil disse patenter nedenfor kollektivt kalles "Amersham"-patentet.)

En intakt alaninsidekjede er nødvendig for optimal binding av T4 og T3 til TBG: aminogruppen på alaninsidekjeden er den vesentlige bestanddel. Analoger beskrevet i Amersham-patentet er T3- og T4-molekyler modifisert i alaninsidekjeden. Selv om disse analoger teoretisk ikke binder TBG i noen vesentlig grad, binder de utvilsomt albumin og TBPA signifikant fordi 4'-hydroksylgruppen på T3- og T4-molekylet forblir intakt. Det er vel fastslått at bindingen av albumin og TBPA til tyroniner er kvantitative, spesielt under fysiologiske betingelser: K. Sterling ("Molecular structure of thyroxine in relation to its binding by human serum albumin", "J. Clin. Invest.", 43:1721, 1964) og Pages et al. ("Binding of thyroxine and thyroxine analogs to human serum prealbumin", "Biochem.", 12:2773, 1973).

Mangelen i Amersham-patentet med henblikk på å erkjenne viktigheten av albumin- og TBPA-binding til tyroniner gjør patentets lære utilstrekkelig for virkelig måling av fri T3 og fri T4 i biologiske fluider. I virkeligheten gir de kommersielt tilgjengelige reagenser basert på patentet villedende og unøyaktige frihormonresultater. Dette gjelder spesielt under alvorlige patologiske tilstander som karakteriseres ved signifikante endringer i nivået av sirkulerende albumin.

Senere litteratur har vist at albuminkonsentrasjonen korrelerer direkte med fri-T4-konsentrasjoner dannet ved Amersham-analysesystemet. I tillegg er det godt dokumentert at Amershams metode konsistent gir falskt reduserte fri-T4-resultater i tredje trimestergraviditeter og hos pasienter som lider under alvorlig ikke-tyroid sykdom, mens den gir falsk forhøyede T4-nivåer når det gjelder familiær dys-albuminemisk hypertyroksinemi, en tilstand der T4 abnormt bindes til sirkulerende albumin.

Under gravlditex sirkulerer albumin ved lavere enn normale nivåer, spesielt under det tredje trimester. Fordi Amershams merkede analog T4-tracer binder albumin og TBPA i vesentlig grad (mer enn 99%), skulle man forvente at Amershams analysesystem gir lavere enn normale fri-T4-resultater under det tredje trimester: mere analog tracer er tilgjengelig for å binde T4-antistoff, noe som resulterer i høyere binding og lavere tilsynelatende dose.

Ikke-forestrede frie fettsyrer er i stand til å fortrenge merket analog fra albumin, i tillegg sirkulerer disse ved høyere enn normale konsentrasjoner under graviditet. Dette kan forklare de lavere enn forventede fri-T4-verdier man finner under graviditet målt ved Amershams metode, tilsynelatende frie T4-nivåer ville være signifikant lavere enn forventet hvis albuminbindingen til den merkede analog er vesentlig.

Denne situasjon er også godt dokumentert når det gjelder heparinterapi, der en signifikant forhøyelse av ikke-forestrede frie fettsyrer er til stede. Nivåene av fri T4 og fri T3, målt ved Amershams metode på heparinbehandlede pasienter, viser lavere enn normale nivåer.

Det samme problem oppstår for ikke-tyroide sykdom, der verdiene for fri T3 og T4 oppnådd ved Amersham-metoden er vist å være signifikant lavere enn for en eutyroidpopulasjon, sammenlignet med en direkte likevektsdialysemetode.

Prosedyren i Amershams patent er funnet noe mangelfull av arbeidere på dette området, slik den gir seg utslag i observering av falske og feilaktige målinger av nivåene for fri ligand. Det er nu oppdaget at problemet stammer fra bindingen av ligandanalogtraceren til visse endogene proteiner, for eksempel albumin, i biologiske fluider. Det er videre funnet at dette problem kan overvinnes ved bruk av spesifikke kjemiske inhibitorreagenser. Denne oppdagelse representerer et vesentlig fremskritt i denne teknikk.

I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte av den innledningsvis nevnte art og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at den omfatter følgende trinn:

a) å inkubere en prøve av biologisk fluid med

(i) en ligandanalogtracer som, på grunn av sin kjemiske struktur, ikke binder til noen av de endogene bindende proteiner, (ii) en spesifikk ligandbinder med en affinitetskonstant på opptil 5 x 10^ l/mol, og (ili) minst en spesifikk kjemisk inhibitorreagens som inhiberer binding av ligandanalogtraceren til andre endogene bindingsprotein idet den spesifikke kjemiske inhibitorreagens er til stede i en konsentrasjon tilstrekkelig til å fortrenge ligand analog-traceren fra minst et nevnte andre endogene bindingsprotein uten å fortrenge den native ligand fra de endogene bindingsproteiner; b) separering av ligandanalogtraceren bundet til den spesifikke binder fra ikke-bundet tracer; og c) å bestemme konsentrasjonen av fri ligand i det biologiske fluid.

Ved hjelp av oppfinnelsens fremgangsmåte stilles det til disposisjon en ny og forbedret metode for å måle frie ligander i biologiske fluider.

Denne nye og forbedrede metode gir spesielt en riktigere måling av de frie ligander.

Andre gjenstander og fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå av den følgende beskrivelse.

Foreliggende oppfinnelse henger sammen med de mangler som følger med metoden i Amershams patent og korrigerer effektivt inkonsistensene i frityroid-resultåtene som oppnås ved Amershams analogmetode.

Foreliggende oppfinnelse benytter merkede analoger for T3 og T4 som er modifisert i alaninsidekjeden. Spesifikt er a-aminogruppen modifisert for å forhindre bindingen til TBG. I mellomtiden er skritt tatt for å forhindre slike merkede analoger fra binding til albumin og TBPA. Dette oppnås ved omhyggelig valg av et eksogent kjemisk middel eller slike midler som alene eller i kombinasjon er i stand til å binde til ikke-opptatte bindingsseter på albumin- og TBPA-molekylene for derved å mette disse bindingsproteiner og effektivt å eliminere deres kapasitet til å binde tyronin-analoger og til andre endogene stoffer som ikke-forestrede frie fettsyrer. Disse eksogene kjemikalier bør ikke binde til TBG og deres konsentrasjon bør være slik at de ikke fortrenger noe bundet hormon fra albumin eller TBPA.

Assosiasjonskonstanten for albumin og T4 er ca. 500.000.

(Dette anslag er basert på den antagelse at antallet bindingsseter på albuminmolekylet som er tilgjengelig for tyroksin er lik 1, og at den tilsynelatende assosiasjonskonstant i liter pr. mol, det vil si likevektskonstanten i retning av kompleksdannelse, er 5 x 10<5>.). Likeledes er assosiasjonskonstanten for albumin og T3 ca. 24.600. Det er

vel fastslått at albumin har en høyere affinitet for fri T3 og T4 og deres analoger enn for anioniske farvestoffer, men en meget høyere affinitet for frie fettsyrer enn T3 og T4 og deres analoger.

Albumin har en relativt lav assosiasjonskonstant for enkle aromatiske forbindelser; de høyeste assosiasjonskonstanter er 11.000 for 2,4-dinitrofenol og 2.800 for salicylat.

For å opprettholde strenge likevektsbetingelser in vitro under immunoekstraheringsreaksjonen må man opprettholde strenge fysiologiske betingelser; dette medfører bruken av pH = 7,4. Ved denne pH-verdi har tyronin-molekylene tre ladede grupper: det anioniske karboksylation, den kationiske a-aminogruppe og det anioniske fenolation. (Det sistnevnte er 82% ionisert.) Nærværet av albumin eller TBPA under disse fysiologiske betingelser gir et høyere ladet albumin med et relativt stort antall kationiske aminogrupper. Disse kationiske aminogrupper på albuminmolekylet binder det anioniske fenolation på tyroninmolekylene. En slik gjensidig påvirkning er hovedgrunnen til at albumin binder til den merkede analog både i Amersham-patentmetoden og Corning-patentmetoden.

Foreliggende oppfinnelse gjør bruk av det faktum at 24-dinitrofenol, DNP, og natriumsalicylat med deres relativt høye assosiasjonskonstanter til albumin og TBPA også vil ioniseres og lades under disse fysiologiske pH-betingelser, og derved å gi et ladet anionisk fenolation i stand til gjensidig reaksjon med ladningene på albumin- og TBPA-molekylene. Når enten 2,4-dinitrofenol eller natriumsalicylat eller begge deler er til stede i overskudd, blir bindingen av merket T3- og T4-analoger til albumin og TBPA i det vesentlige eliminert. Denne metode for blokkering av albumin og TBPA ved egnede konsentrasjoner av 2,4-dinitrofenol og/eller natriumsalicylat, er et effektivt middel for å eliminere de feilaktige analyseresultater som forårsakes av albumin i frityroidhormonimmunoekstraheringsanaloge metoder.

Foreliggende oppfinnelse kan anvendes på et antall andre kjemiske inhibitorreagenser, det vil si reagenser som er i stand til å blokkere uønskede reaksjoner av ligandanalogtraceren til sirkulerende endogene bindingsproteiner. De substituerte monoarylorganiske forbindelser er eksempler. Substituentene på slike forbindelser omfatter nitro, karboksyl, karboksylsalter og lignende. Monoarylforbindelsene har en fenolisk hydroksylgruppe som er spesielt brukbar. Andre egnede kategorier er farvestoffer som sulfobromftalein, oransjerødt, bromkresyl-blått og lignende. De høyere (over ca. 5 karbonatomer) fettsyrer som oljesyre er også brukbare. Ytterligere andre forbindelser vil være åpenbare for fagmannen. For eksempel har mange aminosyrer en høy affinitet til albumin og er således brukbare ved oppfinnelsens gjennomføring, for eksempel tryptofan. En annen egnet kategori er T3-, T4- eller testosteronanaloger som fortrenger merket analog fra endogene proteiner uten å binde til antistoffet eller annen spesifikk ligandbinder.

Oppfinnelsen kan benyttes for å detektere konsentrasjonen av en hvilken som helst av de frie ligander man vanligvis finner i humane kroppsfluider. For eksempel kan den frie ligand være tyroksin, tri-jodtyroksin, testosteron, kortisol, progesteron, østradiol, hormoner og steroider generelt, videre medikamenter og produkter av medikamentmetabolisme, vitaminer som B12, toksiner og lignende.

Generelt er en spesifikk ligandbinder en som kobler eller binder til den frie ligand og som kan være et spesifikt antistoff for den frie ligand eller et annet bindende middel. Generelt er de spesifikke ligandbindere som kan benyttes for de forskjellige frie ligander kjente og behøver ikke beskrives nærmere.

Ligandanalogtraceren merkes på en eller annen måte for å kunne detekteres eller observeres. Radiomerking er velkjent og anvendelig, dette gjelder også andre merkingsmetoder som tidligere er benyttet i i denne teknikk inkludert enzymer, fluorforer, kromoforer og kjemiluminescente grupper integrale med ligandanalogtracermolekylet.

Antistoffer til både L-tyjroksin og 3,5,3'-trijodtyronin ble fremstilt i kaniner ved velkjente konvensjonelle teknikker ved bruk av bovinserumalbumin-T4 og -T3 som immunogener.

Analoger av dijodtyronin (T2) og T3 ble fremstilt ved succinylering av oc-aminogruppen på analinsidekjeden for å oppnå N-L-dijodtyroninsuccinimid henholdsvis N-L-trijodtyronin, som så ble jodert ved konvensjonelle joderings-prosedyrer for å oppnå N-^^I-L-trijodtyroninsuccinimid og N-125i-L-tyroksinsuccinimid. Tracerne ble så tildannet i 0.01M HEPES (N-2-hydroksyetylpiperazin-N'-2-etansulfonsyre)-buffer, pH 7,4 og 0, 01% hatriumazid. 0, 2% trekull-absorbert humanserumalbumin, CABSA, fri for enhver tilsynelatende T3 og T4, og blokkeringsmidler ble benyttet som beskrevet i de spesifikke eksempler nedenfor. Forskjellige mengder av T3 og T4 ble tilsatt til humanserum fritt for tilsynelatende T3 og/eller T4, kalibrert uttrykt ved direkte likevektsdialyse og gitt verdier for hvert nivå.

T3- og T4-antistoffer ble immobilisert på de indre vegger av polypropylen 12 x 75 imm-rør ved passiv adsorpsjon som beskrevet av

K. Catt et al. ("Solid phase radioimmunoassay in antibody-coated tubes", "Science", il58:1570, 1967).

For analysen av fri T4 ble 50 pl kalibrator eller pasient-prøve pipettert til anti-T4-antistoffbelagte rør fulgt av 1,0 ml av den merkede T4-d;ialog. Rørene inkuberes så i 60 minutter ved 37° C. Ef tier denne inkubering blir rørene dekantert og den bundne radioaktivitet tellet. Resultatene beregnes fra kalibreringskurven og uttrykkes i ng/dl.

For fri-T3-analyse blir 100 pl kalibrator eller pasientprøve pipettert inn i anti-T3-antistoffbelagte rør fulgt av 1,0 ml merket T3-analog tracer. Rørene inkuberes i 3 timer ved 37'C, dekanteres så og telles radioaktivt. Resultatene beregnes som for fri T4 og uttrykkes i pg/ml.

Frltvroldhormoneksempler

Eksempel 1

Valget av antistoffer for fri-T3- og fri-T4-analysesystemer ble bestemt ved det faktum at det frie hormon er i fysio-logisk likevekt med sine transportproteiner. Denne likevekt bør opprettholdes når et antistoff rettet mot hormonet tilsettes til systemet. Det er vesentlig å velge et antistoff som er egnet uttrykt ved affinitetskonstanten og spesifisi-teten for den frie analytt. Slike antistoffer bør også ha langsom reaksjonskinetikk.

For fri tyroksin (T4) ble det valgt et antistoff med en arbeidstiter eller fortynning på 1:250.000 (2,0 ng IgG/rør). For å undersøke virkningen av tracerbindingen til antistoffet i nærvær eller fravær av albumin eller albuminblokkerende stoffer, ble antistoffbelagte rør fremstilt ved bruk av titere på 1:250.000 (2,0 ng IgG/rør) og 1:25.000 (20,0 ng IgG/rør). Maksimale bindinger ble bestemt ved å følge fri-T4-protokollen som beskrevet ovenfor. Resultatene er oppsummert i tabell 1.

1 fravær av albumin eller ethvert annet protein er bindingen av analog <*25>I-T4-traceren til antistoffet ved begge antistofftitre av samme størrelsesorden. I nærvær av albumin-2 mg albumin/rør, oppnådd samtidig av tracer og null-kalibrator, binder analog-traceren ikke til det høyere titerantistoff, mens det binder til det lavere titerantistoff med kun 9, 4% tracer D. I nærvær av kun 1 mg albumin/rør, er ;bindingen av tracerne B '■ og C til høy-titerantistoffet neglisjerbar, henholdsvis 2,6 og 1,456, mens bindingen til lavere titerantistoffet er signifikant, nemlig 18,1 henholdsvis 15,056. ;De følgende konklusjoner kan trekkes fra resultatene av disse forsøk: 1. Albumin i konsentrasjoner på 1-2 mg/rør binder i det vesentlige til traceranalogen i nærvær av 2,0 ng IgG ;antistoff/rør. , ;2. 2,0 ng IgG antistof f/rør har en lavere affinitet enn albumin for traceranalogen. 3. I nærvær av albuminblokkerende midler gjenopprettes bindingen av merket T4-analog til antistoffet. ;Det samme forsøk ble også gjennomført for frie T3-analyser. De tabulerte resultater understøtter tilsvarende konklusjoner (tabell 2). ;Konsentrasjonen av antistoff som benyttes i en frihormon-analyse er kritisk og må Justeres omhyggelig for ikke å fortrenge bundet analytt fra endogene proteiner. Lærene ifølge Amershams og Cornings patenter beskriver ikke konsentrasjonen av de benyttede antistoffer for å måle fri T3 og fri T4. Basert på de ovenfor angitte forsøk, kan man imidlertid anta at både Amersham og Corning må ha benyttet vesentlig høyere antistoffkonsentrasjoner for å oppnå rimelig binding mellom antistoff og analogtracer, fordi ingen av patentene benyttet blokkeringsmidler. ;Eksempel 2 ;De virkende antistoffkonsentrasjoner som ble påvist på basis av eksempel 1 ovenfor er 5,5 henholdsvis 2,0 ng IgG/rør av T3-antistoff henholdsvis T4-antistoff. For å bestemme det egnede albuminblokkeringsmiddel eller slike midler for bruk i fri-T3- og fri-T4-analysesystemer, ble følgende forbindelser tilsatt til analogtracerne i de spesifiserte konsentrasjoner. ;(Hver tracer inneholdt også 1 mg/ml trekull-absorbert humanserumalbumin.) Maksimalbinding ble bestemt for hver tracer. Null-kalibrator ble også tilsatt til hvert sett av maksimale bindingsrør. ;Det skal påpekes at rammen for oppfinnelsen ikke er begrenset til eksemplene som er anvendt i tabellene 3 til 11. Disse vises her for å vise at, ved de valgte antistoffkonsentrasjoner, bindingen av analogtracerne vil øke med økende mengde albuminblokkeringsmidler som tilsettes, inntil den når et nivå. Dette viser også at bindingen av T3- og T4-merket analog elimineres ved bruken av en egnet konsentrasjon av spesifikke albuminblokkeringsmidler. ;Eksempel 3 ;Det følgende forsøk ble gjennomført for å vise at albumin ikke har noen virkning på fri-T3- og fri-T4-analysesystemer. ;Ti prøver, fem fra vanlige individer og fem fra kvinner i tredje graviditetstrimester, ble delt i fire like mengder. Til tre av disse ble det satt lyofilisert trekull-absorbert humanserumalbumin i konsentrasjoner på 10, 20 og 50 mg/ml. De fire prøver ble så behandlet i duplikat som beskrevet ovenfor i fri-T3- og fri-T4-analyser ved bruk av fire forskjellige tracere. Den midlere verdi for hver albuminkonsentrasjon, N = 5, ble så plottet for hver tracer, fig. 1 til 16. For fri T3 og fri T4 var tracerne som følger: ;Det fremgår av disse forsøk at resultatene som oppnås ved tracer IV både for fri T3 og fri T4 er upåvirket av tilsetning av albumin opptil 5,0 g/dl for en omtrentlig total albuminkonsentrasjon på 8,0 g/dl. ;Eksempel 4 ;For å bestemme hvorvidt tyroidbindingsglobulin, TBG, vil binde de merkede fri T3- og fri T4-analogtracere, ble følgende forsøk gjennomført ved bruk av tracer IV fra eksempel 3. TBG-harpiks strippet for all tilsynelatende T4 og T3 ble tilsatt til den respektive null-kalibrator for hver fri T4- og fri T3-analyse i de konsentrasjoner som er angitt nedenfor. Observert prosentandel bundne (B/BQ) verdier er vist i tabellen. ;Eksempel 4a ;Dette forsøk er ment for å undersøke virkningen av tilsetning av albumin til null-kalibratoren ved bruk av tracer IV fra eksempel 3. Humanserumalbumin ble trekull-absorbert for å fjerne all tilsynelatende T3 og T4 og ble tilsatt til den respektive null-kalibrator for hver frie T3 og T4 i de antydede konsentrasjoner.<1> Igjen ble prosentandel bundet mengde undersøkt. ;Det fremgår av eksempel 4 og 4a at hverken albumin eller TBG binder analogtracere under de spesifiserte betingelser. ;Eksempel 5 ;Ved høye konsentrasjoner er sulfobromftalein, et farvestoff i stand til å binde til albumin, i stand til å fortrenge T3 og T4 fra albuminmolekylet. Sulfobromftalein i lave konsentrasjoner er effektivt til å blokkere T3- og T4-analogtracere fra binding til albumin. Jodert T4-analog ble behandlet som beskrevet ovenfor og delt i fem like mengder. Til hver slik ble følgende reagenser tilsatt. ;Hver tracer ble benyttet i en separat analyse for måling av fri T4 i 20 prøver under identiske forsøksbetingelser. ;Med tracer 1 som referanse og ved å sammenligne de andre med dem, ble følgende resultater oppnådd. ;Resultatene ved bruk av tracer 3 med 0, 05% sulfobromftalein korrelerer signifikant med de man fikk ved å benytte tracer 1. Resultater oppnådd ved bruk av tracer 3 er imidlertid ca. 20% lavere enn de som ble oppnådd ved bruk av tracer 1. Selv om tracer 4 korrelerer godt med tracer 1, gir den vesentlig høyere frie T4-verdier, antagelig på grunn av frigjøringen av albuminbundet T4 ved den høye konsentrasjon på 0, 1% sulfobromftalein. ;Oljesyre tilsatt til tracer 5 er i stand til å fortrenge analogtraceren fra albumin. Imidlertid viser pasientdata oppnådd med denne tracer dårlig korrelerering med data oppnådd med tracer 1, gitt oljesyre ved denne konsentrasjon. Høyere konsentrasjoner av oljesyre i tracerkonsentrasJoner over 1,0 mmol/1 fortrenger bundet ikke-merket T4 fra albuminet. ;Eksempel 6 ;For å undersøke virkningene av ikke-forestrede frie fettsyrer på fri T4- og fri T3-analysesystemer ble pasientprøver delt i deler, lyofilisert og så rekonstituert med forskjellige konsentrasjoner oljesyre i destillert vann. De rekonstituerte prøver ble analysert med henblikk på fri T3 og fri T4 i henhold til den ovenfor gitte protokoll ved bruk av de samme fire tracere som beskrevet i eksempel 3. Resultatene, oppsummert i tabell 18, viser klart at tracer 1 for fri T4 er vesentlig bundet til albumin, og at tilsetningen av oljesyre fortrenger traceren fra albumin og gir falske lave fri T4 resultater. Tracerne 2 og 3 bindes også til albumin men i langt mindre grad. Tracer 4 er imidlertid i det vesentlige ikke påvirket av albumin slik som vist i eksempel 3; videre har oljesyre ingen signifikant virkning på fri-T4-verdier. ;Resultatene for fri T3 tilsvarer de for fri T4 idet at de viser at tracer 4 i det vesentlige er upåvirket av ikke-forestrede frie fettsyrer, noe som igjen bekrefter resultatene som ble oppnådd i eksempel 3. ;Eksempel 7 ;For å vise at resultatene som ble oppnådd ved fri T4-analysen som beskrevet ovenfor er upåvirket av graviditet og ved ikke tyroid-sykdom, ble 185 eutyroidprøver analysert ved bruk av tracer IV som beskrevet i eksempel 3 ovenfor og sammenlignet med 25 første trimester- og 49 tredje trimester-graviditets-prøver samt 14 prøver fra ikke-tyroid-sykdomspasienter. Resultatene er oppsummert i tabell 19 og fig. 17-20 og viser at det ikke er noen statistiske eller kliniske signifikante forskjeller i fri-T4-verdiene under graviditet eller ikke-tyroid sykdom, sammenlignet med en eutyroid populasjon. ;Dette bekrefter igjen det faktum at når man benytter egnede albuminblokkerende reagenser forblir fri-T4-analysen uendret ved in vivo-endringer i albuminkonsentrasjonene. ;Fri testosteron ;Det er beskrevet i den kjente teknikk at steroidmolekyler binder til sine naturlige bindingsseter via A- og/eller fi-ringen i molekylet. Se til dette M. Forest et al. samt der gitte referanser ("Free and bound steroids in plasma: methodology and physiopathologlcal implications, In: Physiological Peptides and New Trends in Radioimmunology", CA. Bizollon, utg. , Amsterdam: Elsevier/North-Holland "Biochemical Press", 1981, 249-266). Kjemisk endring av A-og/eller B-ringen vil inhibere de fleste steroider inkludert testosteron, progesteron, østradiol, kortisol, og så videre, fra å binde til endogene bindere. Testosteron ble valgt som representative deltager i denne familie. En testosteron-analog, 6-hydroksytestosteron-19-karboksymetyleter-histamin, ble syntetisert og radiomerket med Jod 125 ved konvensjonelle teknikker. Denne analogtracer ble derefter blandet i 0,01M hepes-buffer med pH 7,4, inneholdende 1 mg/ml trekull-absorbert humanserumalbumin og 0,0156 natriumazid. Blokkeringsmidler ble tilsatt som beskrevet i eksemplene nedenfor. ;Antistoffer til testosteron ble oppnådd i kaniner ved bruk av testosteron-19-karboksymetyleter-bovinserumalbumin som immunogen og immobilisert på de indre vegger av polypropylen 12 x 75 mm rør som beskrevet ovenfor for fri T4 og fri T3. Fri testosteron-kalibratorer, fremstilt ved tilsetning av forskjellige mengder testosteron til humanserum, fritt for ethvert tilsynelatende testosteron, ble kalibrert ved direkte likevektsdialyse og gitt fri testosteronverdier i pg/ml. For analyse av fritt testosteron ble 50 pl kalibrator eller pasientprøve pipettert inn i antitestosteron-antistoffbelagte rør, fulgt av tilsetning av 1,0 ml Jodert 6-hydroksy-testosteron-19-karboksymetyleter-histaminanalog. Rørene inkuberes i 4 timer ved 37<*>C, dekanteres så og telles radioaktivt. Resultatene beregnes ved interpolering fra kalibreringskurven.

Fri testosteroneksempler

Eksempel 1

For å undersøke virkningen av blokkeringsmidler på fri testosteronresultater ble 20 prøver analysert på fritt testosteron ved bruk av Jodert analog, behandlet som beskrevet ovenfor, både med og uten sulfobromftalein, SBP, og med forskjellige mengder natriumsalicylat, 2,4-dinitrofenol, DNP, og 8-anilin-l-naftalensulfonsyre, ANS. Middelverdi for hver tracer i pg/ml er oppsummert i tabell 20.

Regresjonsligninger mellom tilsvarende tracere er gitt nedenfor:

Fra eksemplene ovenfor finner man at fraværet av sulfobromftalein vil øke de tilsynelatende fri testosteron-nivåer med 14#, fordi sulfobromftalein inhiberer bindingen av analogtraceren til albumin uten å fortrenge testosteron bundet til albumin. Man finner også, og dette er det vesentlige, at salicylat, 2,4-dinitrofenol og ANS fortrenger testosteron fra albumin og/eller SHBG, noe som øker tilsynelatende fritt testosteron målt ved denne metode.

Eksempel 2

For å undersøke effektiviteten av analogtraceren i fri testosteron-analysen ble Jodert 6-hydroksytestosteron-19-karboksymetyleter-hlstamin (analogtracer) sammenlignet med Jodert testosteron-19-karbbksymetyleter-histamin (regulær tracer) i analyser på fritt testosteron i pasientprøver.

Tracerne ble behandlet som beskrevet ovenfor med 10 pg/ml sulfobromftalein. For å opprettholde ekvivalenssensitiviteten ble det gjort justeringer for hver tracer i mengde antistoff som ble immobil isert på den indre vegg av propylenrørene.

20 pasientprøver ble analysert ved å følge den allerede beskrevne fri testosteronprotokoll ved bruk av de to tracere som nevnt ovenfor. De midlere fri testosteronverdier i pg/ml og regresjonsligningen er beskrevet nedenfor.

Resultatene indikerer klart at den analoge 6-hydroksy-testosteron-19-histamin-<125>I-tracer ikke binder til endogene bindere, mens traceren testosteron-19-histamin-<l25>I gjør det, noe som således gir ca. 5056 høyere fri testosteronverdier sammenlignet med analogtraceren under identiske forsøks-betingelser.

Eksempel 3

For å undersøke virkningen av seks hormonbindende globulin, SHBG,-nivåer for fri testosteronanalysesystemet, ble en trekull-absorbert humanserum-mengde tilsatt 400 jjg SHBG/ml, et nivå som er omtrent ti ganger det normale. Den SHBG-tilsatte mengde viste ved analyse i henhold til fri testo-steronprosedyren, en prosentandel bundet verdi på 9956 B/BD.

Fordi trekull-absorpsjon fjerner testosteron fra serum-mengden, skulle denne ha fri (og total) testosteronkonsentra-sjoner på null, det vil si prosent bundet verdi på ca. 10056 B/Bc, både før og efter tilsetning. Resultatene viser som ønsket at analogtraceren 6-hydroksy-testosteron-19-histamin-<125>I, ikke binder til engang høye nivåer SHBG.

Eksempel 4

For å undersøke virkningen av forhøyede albumin-nivåer på fri testosteron-prosedyren ble tre lyofiliserte prøver rekonstituert med vandige oppløsninger inneholdende 0, 1,0, 2,0 og 3,0 g/dl trekull-absorbert humanserumalbumin. Alle prøver ble analysert i parallell ved bruk av den samme tracer som i eksempel 3, og med følgende resultater.

Resultatene viser at det ikke er noen klinisk signifikant effekt på grunn av ikke engang større økninger i albumin-nivået. Bemerk at prøven tilsatt 3,0 g/dl representerer et meget høyt albumin-nivå i størrelse 7 g/dl.

Eksempel 5

Flere pasientprøver ble analysert ved fri testosteronprose-dyren ved bruk av samme tra<i>cer som 1 eksempel 3 både før og efter trekull-absorpsjon. Angitt nedenfor er fri testosteron-konsentrasjonene 1 pg/ml før trekull-absorpsjon og prosent bundede (% B/BQ) verdier efter trekull-absorpsjon.

Resultatene viser som ønsket at trekull-absorpsjon i det vesentlige reduserer det tilsynelatende fri-testosteron-nivået for pasientprøver; målt ved analogprosedyren, til null, det vil si til prosent bundne verdier på ca. 10056 B/BQ. Fordi trekull-absorpsjon fjerner testosteronet sammen med andre steroider og små molekyler fra serumprøven, mens større molekyler slik som albumin, SHBG og andre bindingsproteiner blir tilbake, er dette forsøk med på å bekrefte at den analoge fri testosteronprosedyre ikke påvirkes av nivåer av transportproteinene som sådanne.

Eksempel 6

Fordi ikke-forestrede fri fettsyrer, NEFA, har en høyere assosiasjonskonstant mot, albumin enn testosteron, skulle tilsetningen av NEFA fortrenge fritt testosteron fra albumin. Dette ble bekreftet ved et forsøk der forskjellige mengder oljesyre ble tilsatt til hver av tre pasientprøver. Virkningene på de tilsynelatende fri-testosteron-nivåer er vist i tabell 25.

Claims

1. Fremgangsmåte for måling av frie ligander i biologiske fluider i nærvær av en bundet ligand og endogent bindende proteiner uten å forstyrre likevekten mellom den fri ligand og den proteinbundne ligand, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: a) å inkubere en prøve av biologisk fluid med (i) en ligandanalogtracer som, på grunn av sin kjemiske struktur, ikke binder til noen av de endogene bindende proteiner, (li) en spesifikk ligandbinder med en affinitetskonstant på opptil 5 x IO<5> l/mol, og (ili) minst en spesifikk kjemisk inhibitorreagens som inhiberer binding av ligandanalogtraceren til andre endogene bindingsprotein idet den spesifikke kjemiske inhibitorreagens er til stede i en konsentrasjon tilstrekkelig til å fortrenge ligand analog-traceren fra minst et nevnte andre endogene bindingsprotein uten å fortrenge den native ligand fra de endogene bindingsproteiner; b) separering av ligandanalogtraceren bundet til den spesifikke binder fra ikke-bundet tracer; og c) å bestemme konsentrasjonen av fri ligand i det biologiske fluid.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at konsentrasjonen av den frie ligand bestemmes ved sammenligning av den bundne fraksjon i prøven til den bundne fraksjon i et gitt sett av kjente friligand-kalibratorer.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som kjemisk inhibitormiddel benyttes 2,4-dinitrofenol i en mengde av 5 til 10 mmol/1.

4. Fremgangsmåte ifølge kravene 1, karakterisert ved at det som kjemisk inhibitormiddel benyttes natriumsalicylat i en konsentrasjon av 40 til 145 mmol/1.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som kjemisk inhibitor-reagens benyttes sulfobromftalein I en konsentrasjon av 0,8 x 10~<5>M til 1,6 x 10~5M.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som kjemisk inhibitor-reagens benyttes oleinsyre i en konsentrasjon av 0,4 til 0,8 mmol/1.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den frie ligand som bestemmes er testosteron.