JP3530914B2 - 親和結合毛細管電気泳動による微量分析物の定量 - Google Patents

親和結合毛細管電気泳動による微量分析物の定量

Info

Publication number
JP3530914B2
JP3530914B2 JP51708594A JP51708594A JP3530914B2 JP 3530914 B2 JP3530914 B2 JP 3530914B2 JP 51708594 A JP51708594 A JP 51708594A JP 51708594 A JP51708594 A JP 51708594A JP 3530914 B2 JP3530914 B2 JP 3530914B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
analyte
fragment
fab
labeled
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP51708594A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH08506182A (ja
Inventor
カルガー，バリー，エル．
シムラ，キヨヒト
Original Assignee
ノースイースタン ユニバーシティ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ノースイースタン ユニバーシティ filed Critical ノースイースタン ユニバーシティ
Publication of JPH08506182A publication Critical patent/JPH08506182A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3530914B2 publication Critical patent/JP3530914B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44795—Isoelectric focusing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
    • G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
    • G01N27/44726—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means using specific dyes, markers or binding molecules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G01N33/561—Immunoelectrophoresis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/6857—Antibody fragments

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、サンプル中の微量分析物の定量的検出方法
に関する。より具体的には、本発明は、微量分析物の標
識複合体の形成および毛細管電気泳動によるその分析に
関する。
政府の権利 本発明をもたらした研究の一部分は合衆国政府の基金
で行われ、したがって、合衆国政府は本発明に関して一
定の権利を有する。
発明の背景 サンプル中の微量物質（＜10-8−10-9M）の定量分析
には鋭敏で特異的な検出方法が要求される。そうでなけ
れば、サンプル中の微量物質の同定は、より高濃度で見
出される物質によって覆い隠される。微量物質の直接測
定は、分析物の低い濃度のために少量のサンプルではし
ばしば困難である。この問題は、対象となる物質が、容
易に測定することができる物理的または科学的特性（例
えばUV吸収性）をもたない場合にその度合いを増す。分
析物への放射性同位元素標識の導入は鋭敏な検出方法を
提供するが、大量の放射性廃棄物の廃棄は費用が嵩む。
標的微量物質に対する抗体を用いる免疫化学的検出
は、サンプル中の微量複合物を同定する最も特異的な方
法の１つを提供する。免疫ブロット法およびELISA法で
は、添加基質の検出可能な着色または蛍光生成物への変
換を触媒する酵素に結合させた抗体が利用される。しか
しながら、交差反応および非特異的結合によって正確さ
は減少し、さらにこれらの方法は多くの工程、高価な化
学薬品および長い保温時間を必要とする。
マニアン（Manian）らの米国特許第5137609号は、蛍
光的に標識した結合物質と特異的移動時間の測定を用い
た、量が豊富な標的分析物のための電気泳動利用検出系
を開示する。マニアンらは、遊離している結合物質が測
定場所に到達する時間を記録することによって装置に目
盛りを付け、続いてこの時間を用いて、複合体で予想さ
れる窓を設定する。さらに、蛍光標識からの記録信号の
データを調べ、遊離している結合物質と結合済みの複合
体との間の関係を確立する。
ニールセンら（Nielsenら、J.Chrom.539:177−185（1
991）は、形成された抗原／抗体複合物の溶液流通式毛
細管ゾーン電気泳動による分離を開示する。抗原、抗体
または複合物のUV吸收を直接測定することによって、該
複合体を検出、同定する。
発明の要旨 本発明は、サンプル中の微量の分析物（＜10-8−10-9
M）を定量的に検出するための分析方法に関する。この
方法は、分析物と標識複合体を形成することができる生
物学的特異性を有する作用物質を用い、さらに迅速で高
い解析力を有する毛細管電気泳動分離術を用いて、標識
前駆物質と作用物質／分析物複合体を濃縮、分離するこ
とによって実施される。
本発明の１つの特徴として、この方法は、生物学的特
異的作用物質として、検出可能なレポーター基で反応性
スルフヒドリル基部位で標識された免疫グロブリンのFa
b'フラグメントを提供し；該分析物を含む可能性がある
サンプルと該標識Fab'フラグメントとを合わせ；さら
に、毛細管電気泳動法を用いて、生じた標識物質／分析
物複合体を一切の未反応標識物質から分離し；標識され
た分析物／作用物質複合体を検出することを含む。好ま
しい実施例では、Fab'フラグメントは単一のスルフヒド
リル基において標識され、Fab'フラグメントを標識する
当該レポーター基は、レーザー誘発蛍光の検出で使用す
るために蛍光染料であり、さらに該混合物の成分はまた
電場で濃縮される。
本発明の別個の特徴として、反応性スルフヒドリルを
有する免疫グロブリンのFab'フラグメントは、レポータ
ー基による標識のために蛋白分解酵素ペプシンで免疫グ
ロブリン分子を切断して１個のＦ（ab'）２フラグメン
ト（ヒンジ領域プラス２個のジスルフィド結合ユニット
とFc部分の小ペプチドとから成る）を得ることによって
製造される。続いてジスルフィド結合Ｆ（ab'）２を還
元して２個のFab'フラグメントが得られる。好ましく
は、鎖内ジスルフィド結合は酸化によって形成され、各
々が１個の反応性スルフヒドリル基をもつそれぞれのFa
b'フラグメントが得られる。
標識Fab'フラグメントは、反応性スルフヒドリル基を
もつ免疫グロブリンFab'フラグメントを提供し；該Fab'
フラグメントの反応性スルフヒドリル基と反応する１個
の部位を有する検出可能なレポーター基を提供し、；さ
らに、該Fab'フラグメントと該検出可能なレポーター基
とを混合し、それによってFab'フラグメントの反応性ス
ルフヒドリル基を該検出可能なレポーター基の反応性部
位と反応させ、標識Fab'フラグメントを生成することに
よって調製できる。
図１のように、サンプル中の分析物と蛍光標識抗体フ
ラグメント、または通常の生物学的特異的作用物質は、
反応して複合体または”反応対”を形成するが、これは
単独の標識物質とは物理的、化学的に異なる性状を有す
る。当該複合体のこれらの性状によって、未反応標識物
質からの分離が可能になる。
好ましくは、本発明の分離方法は、濃縮と分離の工程
の両方を含む。最も好ましくは、当該分離工程は、濃縮
工程と組み合わせて実施され、等電点集合法（isoelect
ric focusing technique）を用いて標識された生物学的
特異的作用物質から分析物／作用物質複合体を濃縮、分
離させる。また別には、濃縮工程は例えば微小毛細管で
のイソタコフォレーシス（isotachophoresis）によって
実施され、その後毛細管ゾーン電気泳動を用いて分離が
実施される。電気泳動による分離は、例えばゲルマトリ
ックスのような支持媒体中で実施でき、泳動緩衝液は付
加的な物質を含むことができる。
他の特徴として、本発明は、本明細書および請求の範
囲に記載したように他の生物学的特異的作用物質を幅広
く含み、ここではそのような物質によって形成される反
応対は、レセプター／リガンド、結合蛋白／リガンド、
１本鎖もしくは２本鎖オリゴヌクレオチド、蛋白／オリ
ゴヌクレオチド、レクチン／炭水化物および酵素／イン
ヒビターを含むと定義されるが、但しこれらに限定され
るものではない。本発明の方法において有用な他のレポ
ーター基には、UVもしくは可視クロモフォア、放射性標
識、酵素性レポーター基、リガンド、レセプター、スピ
ン標識および電気化学的もしくは化学発光標識が含まれ
る。これらの基は、複合体形成といずれかの適切な手段
による分離の後検出できる。
一般には、遊離作用物質または分析物から生物学的特
異的作用物質／分析物複合体を分離するために、本発明
の方法は毛細管電気泳動を利用するので、どちらの反応
性前駆物質をレポーター基で標識してもよく、生じた複
合体を特異的かつ鋭敏に検出することができる。このよ
うな応用では、単クローン性抗体は、その均一性ゆえに
結合親和性と電気泳動の移動度の両方で多クローン性抗
体よりも適切である。完全な分子の代わりに単クローン
性抗体のフラグメントを用いることによって、抗原との
凝集が避けられる。生物学的特異的作用物質が反応対の
標識部分である場合は、分析されるサンプルと標識作用
物質とを混合し、適切な時間保温して、作用物質／分析
物複合体を形成させる。生じた複合体が遊離の生物学的
特異的作用物質の電気泳動移動度と異なる場合は、２種
の標識存在物質は毛細管電気泳動によって分離され、標
識複合体の量を特異的に検出できる。この系では、生物
学的特異的標識作用物質は、迅速に反応対を形成させ、
定量するべき分析物の量に対して直線的反応を得るため
に比較的高濃度で用いることができる。この系は、複合
体形成に際して生物学的特異的標識作用物質の移動度を
効果的に変化させることができる巨大分子分析物につい
て適切である。
分析物が標識された前駆体種である場合には、分析さ
れるサンプルを標識分析物および標識されていない生物
学的特異的作用物質と混合する。保温後、毛細管電気泳
動によって標識分析物から標識複合体を分離し、蛍光に
よって定量する。サンプル中の分析物は、該作用物質と
の結合において標識分析物と競合するので、該複合体と
遊離標識分析物の間の蛍光シグナル分布は、したがって
サンプル中の分析物の量の関数であるはずである。この
系は、免疫複合体の形成時に生物学的特異的作用物質に
対して移動度の十分な変化を引き起こすことができない
低分子量の分析物に対して適切である。標識分析物の移
動度は、該分析物を複合体から分離させるために十分な
移動の違いを標識分析物がもつことができるように、イ
オン性構成成分によって制御できる。
本発明は、迅速性、使いやすさ、感度の良さ、標的分
析物の高い解析性、および分離された分析物の同定に付
加的工程が不要であるという利点を提供する。固有の構
造を有する標的分子はそうでないものと区別することが
できる。さらに、各アッセーに必要な少量のサンプルが
ごく少量の高価な試薬の使用を必要とし、エラーが発生
した場合、またはサンプルが沈澱した場合には、毛細管
カラムを迅速に洗浄し再使用することができる。
図面の簡単な説明 本発明の他の特徴および利点は、以下の好ましい実施
例の説明と下記に添付した図面とによって明らかとなろ
う： 図１は、本発明の方法の工程を表した図である； 図２は、マウスIgG1単クローン性抗体の標識Fab'フラ
グメントの調製を表した図である； 図３は、テトラメチルローダミンで標識したIgG1Fab'
フラグメントの想定される構造の１つを示す； 図4aは、テトラメチルローダミン標識Fab'と10ng/ml
のＮ−メチオニルヒト成長ホルモンとで得られた複合体
の電気泳動図を示す； 図4bは、テトラメチルローダミン標識Fab'と1ng/mlの
Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンとで得られた複合体の
電気泳動図を示す； 図５は、テトラメチルローダミン標識Fab'で調べた、
３種類のヒト成長ホルモン変種を含む人工的混合物の電
気泳動図を示す； 図6aは、10倍希釈のヒト血清中で検出した、テトラメ
チルローダミン標識Fab'と50ng/mlのＮ−メチオニルヒ
ト成長ホルモンとで得られた複合体の電気泳動図を示
す； 図6bは、Ｎ−メチオニル成長ホルモンを含まない10倍
希釈のヒト血清によるブランク電気泳動図を示す； 図７は、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンの定量的検
出のための標準曲線のログ−ログ図表を示す； 図８は、結合作用物質／標的分析物の複合体形成の時
間経過を示す。
好ましい実施例の説明 毛細管電気泳動（CE）は、混合物中の化合物を分析す
る鋭敏で迅速で正確な方法として最近認知され、微量分
析の実施のためにCE技術の応用が特に重要となった。毛
細管電気泳動は、ごく少量のサンプルを必要とし、分析
は約20分で完了する。毛細管電気泳動の高い解析力は、
毛細管電気泳動を抗原−抗体複合体を含む複合体混合物
の分析のための理想的な選択肢とさせた。
一般的抗体または免疫グロブリン分子は、該分子上の
種々の部位に位置する種々の活性を有する。特異的な抗
原結合活性は、重鎖の可変領域（VH）に付随し、軽鎖の
可変領域（VL）ドメインはFabフラグメントに位置し、
一方、エフェクター機能（例えば補体結合および細胞膜
レセプター相互反応）は、通常Fcフラグメントに付随し
ている。免疫アッセーに免疫グロブリンのフラグメント
を用いることは、他のドメインからの干渉を受けずに免
疫グロブリンの１部分の活性を利用することを可能にす
る。
免疫グロブリン分子は、各々が別個の活性をもつフラ
グメントに選択的に切断することができる。パパイン
は、免疫グロブリン分子を２つのFabフラグメントと鎖
間のジスルフィド結合を含む１つのFcフラグメントに切
断する。図２に示すように、対照的に、ペプシンによる
切断は、１つのＦ（ab'）２フラグメントとFc部分の小
さなペプチドを生じる。生じたＦ（ab'）２フラグメン
トは、２つのジスルフィド結合で結合したFabユニット
メントとヒンジ領域から成る。ジスルフィド結合Ｆ（a
b'）２フラグメントは還元され、２つのFab'フラグメン
トを生じる。鎖内ジスルフィドの形成後、各々が１つの
遊離チオール基をもつFab'フラグメントが生じる。
ペプシン調製Fab'ユニットの１つの反応性チオール基
は、外部のレポーター基または標識（例えばフルオロフ
ォア、クロモフォアまたは結合リガンド）を結合させる
ための有用な部位を提供する。Fab'の１つの反応性チオ
ールは、ただ１つのレポーター基が各フラグメントに結
合し、標識は特異的であることを保証する。
蛍光レポーター基が本発明に用いられる場合は、実施
が成功するように一定の性状が本発明については要求さ
れる。理想的には、結合フルオロフォアは、分析時に測
定可能なシグナルを発生させるために強力な吸収と強い
蛍光を有する必要がある。さらに、フルオロフォアは、
検出方法実施時に著しい光退色性をもつべきではなく、
さらに、分離方法として等電点集合を用いる場合には、
実施pH領域ではpH非感受性でなければならない。pHに感
受性のフルオロフォアは、pH勾配の中を移動している間
にその量子効率（量子収量）が変化するので、等電点集
合法では有用性が低い。したがって、本発明の好ましい
方法で極めて重要なことは、蛍光標識の適切な選択であ
る。好ましい蛍光標識基はテトラメチル−ローダミンヨ
ードアセトアミドまたはシアニン染料である。
さらに、Fab'フラグメントへのレポーター基の結合
は、活性部位または該分析物との結合反応に関与する他
の領域から離れている必要がある。自己消光を最小限に
するために、各Fab'フラグメントにただ１つの蛍光レポ
ーター基を結合させることが好ましい。
続いて、適切の標識された過剰量のFab'フラグメント
を対象となる抗原を含むサンプルと混合する。大量の標
識抗体フラグメントは、結合反応平行を複合体形成の方
へと移動させ、したがって大半の抗原がタイプ分けされ
る。続いて、形成された複合体を電気泳動術によって濃
縮し、未反応Fab'から分離する。電気泳動的濃縮および
分離工程は、抗原−抗体フラグメント複合体の固有の物
理的および化学的特性を利用する。濃縮工程は、遊離抗
原および未反応標識フラグメントからの標識複合体のよ
り完全な分離、並びに非常に少量の複合体のより強化さ
れた検出を可能にする。好ましくは、濃縮と分離工程は
等電点集合によって同時に実施される。
等電点集合は、電場が与えられたとき、pH勾配を持つ
媒体中の同じ領域に与えられた等電点（pI）をもつ全て
の分子が移動する平衡過程である。好ましい実施例で
は、大半の抗原分子を標識フラグメントと反応させるた
めに、過剰の標識Fab'を抗原と反応させる。未反応標識
Fab'フラグメントは、反応複合体とは異なるpIを有し、
この２種の分子種は、pH勾配において異なる点へと移動
するであろう。
別の工程では、濃縮と分離は、フォーレットら（Fore
tら、J.Chromatogr.608:3−12（1992）、この文献は参
照により本明細書に含まれる）が記載したように毛細管
ゾーン電気泳動と組み合わせてイソタコフォレーシスに
よって連続的に実施できる。１例にしたがえば、オンカ
ラム一過性イソタコフォレーシス移動によって、比較的
大量のサンプルをその後のCZEのために市販の器具に注
入することが可能である。また別に、連結カラム系は、
CZE泳動条件の選択において大きい自由度と、より大量
のサンプル注入の可能性を与える。
本発明の方法を用いて同定できる抗原には、ホルモ
ン、ペプチド、酵素、オリゴヌクレオチド、リガンド、
レセプター、炭水化物、脂質およびハプテンが含まれ
る。問題の抗原の存在を分析することができるサンプル
の種類には、血清、血漿、植物抽出物、細胞抽出物、細
胞培養液、醗酵混合物、またはいずれかの複雑なサンプ
ルが含まれる。
以下の実施例は、本発明の利点を詳述し、当業者が同
じものを実施する場合に役立てるために提示する。これ
らの実施例は、如何なる意味においても本開示の範囲を
制限するものではない。
実施例Ｉ 好ましい実施例では、マウス単クローン性IgG1免疫グ
ロブリン（ピアース（Pierce）；ロックフォード、イリ
ノイ）をペプシンで切断し、得られたＦ（ab'）２フラ
グメントを分離し、還元剤（例えばジチオスレイトー
ル、ジチオエリスリトールまたはβ−メルカプトエチル
アミン）で処理して３つの連結ジスルフィド結合を還元
し、Fab'フラグメントを生成する。システイン残基間の
鎖内ジスルフィド結合は、Fab'分子につき唯１つの反応
性チオール基を提供するために酸化によって形成する必
要がある。各Fab'フラグメントの遊離スルフヒドリル基
は、テトラメチルローダミンヨードアセトアミド（モリ
キュラープローブ社；ユージーン、オレゴン）またはシ
アニン（ポリメチン鎖で連結された２つの４分化異種芳
香族塩基から成る蛍光染料（Ernst.ら、Cytometry10:3
−10（1989）（この文献は参照により本明細書に含まれ
る））で標識される。このフラグメントを、例えばイモ
ビリン（Imobiline）ゲル電気泳動（等電点集合）（フ
ァルマシア）で使用前に精製する。標識Fab'フラグメン
トの推定される構造を図３に示すが、そこでは、鎖内ジ
スルフィド結合は、イソロイシンによってのみ分断され
た２つのシステイン残基間で形成され、一方、残りのシ
ステイン残基はその遊離スルフヒドリルを介して蛍光染
料と反応させる。
Ｎ−メチオニル組換え体ヒト成長ホルモンのサンプル
（ジェネンテック）を続いて過剰量の標識Fab'フラグメ
ントおよび担体アンホライトと混合し、さらにこの混合
物をシリカ被覆融合毛細管カラムに導入する。標識Fab'
フラグメントを過剰に供給し、それによって、抗原との
反応をかなり短持間に完了させる。過剰の標識Fab'フラ
グメントの量は、複合体の予想される最大量の２から10
倍以上となってはならない。サンプルは場合によって夾
雑物の混入の可能性を除去するために希釈またはろ過処
理を行ってもよい。
抗原と標識抗体フラグメント間で形成される複合体は
等電点集合法によって分離されるが、この場合、分析物
は、毛細管内に維持されているpH勾配内の位置にその等
電点に基づいて移動する。シリカ毛細管はポリアクリル
アミドで被覆され、その直径は５から200μｍ、好まし
くは25から100μｍの範囲である。サンプルを担体アン
ホライトとともに混合し、適切な時間電気的に集合させ
る。集合の後、分離した複合体を陽極液交換法（Hjerte
nら、米国特許第4725343号）によって移動させ、レーザ
ー誘発蛍光によって検出する。蛍光分析における励起源
としてレーザーを用いることによって、多くの化合物の
検出限界が著しく改善された（例えばピコモルの範囲ま
たはそれ以下である：ヘムリア（Hemmila）、免疫アッ
セーにおける蛍光の利用（Applications of Fluorescen
ce in Immunoassays）；（Chemical Analysis、117
巻）、J.D.Winefordner著;Wiley−Interscience刊、ニ
ューヨーク（1991）、この文献は参照により本明細書に
含まれる）。また別に、分離された複合体と残存する抗
体フラグメントは、オンライン画像化システム、例えば
レーザー誘発蛍光を用いてその場で検出することができ
る。
図4aおよび4bは、２種の異なる濃度（10ng/mlと1ng/m
l）でＮ−メチオニルヒト成長ホルモンで得られた電気
泳動図を示している。成長ホルモン溶液（４μｌ）、標
識Fab'フラグメント溶液（４μｌ）および６％ファーマ
ライト（Pharmalyte）３−10（４μｌ）を混合し、毛細
管（内径75μｍ、長さ20cm、ポリアクリルアミド被覆）
に充填した。集合は、陽極液として20mMのリン酸、陰極
液として20mMのNaOHを用いて8kV、５分で実施した。毛
細管の１部分（陽極から8cm−18cm）を氷冷水で冷却し
た。集合バンドを陽極液を20mMのNaOHに変えることによ
って陽極に移動させた。蛍光（580nm）をレーザー励起
（488nm、2mW）で陽極端から5cmで検出した。図4aによ
れば、10ng/mlのサンプルの電気泳動図は、比較的低い
感度で２つの主要なピークを示している。より酸性領域
にある15.2分のピークは複合体で、より塩基性領域（1
8.2分）は遊離標識フラグメントである。16.7分では、
感度は標識フラグメントの完全なピークの検出より10倍
低い。
図4bは、1ng/mlのＮ−メチオニルヒト成長ホルモンの
検出を示している。複合体は16.4分に出現し、標識Fab'
は19.4分に出現する。挿入図は複合体ピークの拡大を示
している。
実施例II 等電点が異なる抗原の変異体もまた本発明の方法によ
って分析できる。例えば、３種のヒト成長ホルモン種を
含む人工的な蛋白混合物を調製した。１つのＮ−メチオ
ニル成長ホルモンは、ヒト成長ホルモンのＮ末端にさら
に１つのメチオニン残基を有する。Ｎ−メチオニル成長
ホルモンのN149D変種は、アスパラギン酸によってアス
パラギン−149ただ１つが置換されている。N149D/N152D
と呼ばれるもう１つの変種は、アスパラギン149および1
52が２つ一緒にアスパラギン酸によって置換されてい
る。５μｌの蛋白混合物（Ｎ−メチオニル成長ホルモン
（31ng/ml）;N149D（59ng/ml）；およびN149D/N152D（1
13ng/ml））を抗ヒト成長ホルモン単クローン性抗体の
テトラメチルローダミン標識Fab'フラグメント５μｌ
（700ng/ml）と１％ポリアクリルアミド含有６％担体ア
ンホライト（ファルマライト３−10）溶液に加え、サン
プルを室温で５分保温した。ポリアクリルアミド被覆融
合シリカ毛細管（内径75μｍ、長さ15cm）にこの保温溶
液を充填した。等電点集合を3kVで１分、および6kVで４
分、陽極液としてリン酸、陰極液として20mMのNaOHを用
いて実施した。集合させた蛋白を、陽極液を0.1MNaCl含
有10mMリン酸に変えることによって6kVで陽極側に移動
させた。レーザー励起（488nm、2mW）で、蛍光（580n
m）を陽極端から5cmのところで検出した。これら密接に
関連する変異種の得られた分離は図５に示すが、ここで
は、ピーク１はＮ−メチオニル成長ホルモンで、ピーク
２はN149Dで、ピーク３はN149D/N152Dである。
実施例III 本発明の方法はまた、複雑な混合物中の特異的な分析
物を検出するために用いることができる。図6aおよび6b
に示したように、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンとヒ
ト血清の人工的混合物を、実施例IIで述べた実験と同じ
方法で分析した。図6aは、10倍希釈のヒト血清中のメチ
オニル成長ホルモン（50ng/ml）を示し、図6bは、メチ
オニル成長ホルモンを含まない10倍希釈ヒト血清のブラ
ンク泳動を示している。図6aでは、標識メチオニル−GH
のピークは血清のバックグラウンドに対して鮮明に検出
できる。シアニン染料の使用は、その最大吸收が500nm
より大きいので、さらに一層バックグラウンドを減少さ
せるであろう。したがって、レポーター基としてのそれ
らの検出は、血清成分の励起を誘発する可能性は低い。
使用 直接親和結合毛細管電気泳動検出の並外れた特徴は、
本発明の方法を、迅速な分析、高い感受性および使用の
容易さが特に重要な場面で特に適切なものにする。例え
ば、臨床検査室では、単位時間当たり多数のサンプルを
取り扱うことが可能で、さらに高度な訓練なしに技術者
が実施できる工程が必要とされている。同様に、商業用
の調製用工程を支援しさらにモニターするための工程進
行の分析は、薬物速度論のための測定において代謝研究
を支援するために分析が必要とされるように、定量的分
析のための効率的で有効な技術によって利益を受けるで
あろう。
本発明の方法において可能な定量能力と迅速性は図７
および図８に表されている。図７に示すように、Ｎ−メ
チオニルヒト成長ホルモンの定量的検出のためのログ−
ログ図表の標準曲線は、少なくとも1000倍の濃度範囲に
亙って直線的であり、サンプル濃度の決定は広範囲に許
容される。複合体形成の時間経過を表す図８は、親和結
合反応は、迅速な分離とともに５分以下で完了すること
を示し、このことは、本発明の方法は日常的に使用する
場合に十分使用に耐える範囲内にあることを示すもので
ある。
多数のサンプルを同時に扱う場合、蛍光結合毛細管電
気泳動（FACE）を用いる好ましい系は、直線的に配置さ
れ、多数のサンプルを同時に処理できる微小毛細管セッ
トから成るであろう。標識抗体フラグメント／標的分析
物複合体を等電点電気泳動によって未反応前駆体から分
離した後、毛細管をレーザー誘発蛍光で直接走査し、同
時に画像化できるであろう。サンプル評価は、リアルタ
イムで電気的に記録されるか、またはそれに続いて移動
させない集合状態でのデータ分析が記録されるであろ
う。分析完了後、毛細管内の緩衝液を吹き出し、僅かな
遅れだけで新たな泳動を開始させることができる。この
分析系は、自動化によって容易に連続工程化できる。
本発明を好ましい実施例と合わせて詳述したので、前
述の記載によって、当業者ならば、種々の変更、同等物
による置き換え、さらに前述の組成物および方法に対す
るその他の変更を実施することが可能であろう。したが
って、レターズパテントによって付与される保護は、添
付の請求の範囲に含まれる範囲およびその同等物によっ
てのみ限定されるであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭64−32170（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−45561（ＪＰ，Ａ) 国際公開91／019983（ＷＯ，Ａ１) ぶんせき 第８巻（1991）第599−606 頁 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 - 33/579 G01N 27/447

Claims (19)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】反応性スルフヒドリル基において検出可能
    なレポーター基で標識された免疫グロブリンFab'フラグ
    メントであって、当該標識Fab'フラグメントは、フラグ
    メント一つあたりただ一つ存在する反応性スルフヒドリ
    ル基において結合させることよりフラグメント一つあた
    り検出可能なレポーター基としての蛍光染料がただ一つ
    存在するものであり、当該分析物に結合し分析物−Fab'
    フラグメント複合体を形成できる当該標識Fab'フラグメ
    ントを提供し； 当該標識Fab'フラグメントを当該分析物を含む可能性が
    あるサンプルと混合して組み合わせ； 毛細管電気泳動によって当該混合物の成分を分離し；さ
    らに； 当該サンプル中の当該分析物の存在の表示として、当該
    分析物−Fab'複合体上の当該レポーター基としての蛍光
    染料を蛍光によって検出するという工程を含むサンプル
    中の微量分析物の定量的検出方法。
  2. 【請求項２】更に、電場で当該混合物の成分を濃縮する
    工程を含む、請求の範囲第１項の方法。
  3. 【請求項３】当該レポーター基が実施pH範囲内のpH変化
    に感受性をもたない、請求の範囲第１項の方法。
  4. 【請求項４】当該検出可能なレポーター基がシアニンま
    たはテトラメチル−ローダミンヨードアセトアミドであ
    る、請求の範囲第１項の方法。
  5. 【請求項５】当該検出工程がレーザー誘発蛍光による請
    求の範囲第１項の方法。
  6. 【請求項６】当該濃縮工程および当該分離工程が同時に
    実施される、請求の範囲第１項の方法。
  7. 【請求項７】当該濃縮工程がイソタコフォレーシスを含
    む請求の範囲第１項の方法。
  8. 【請求項８】当該分離工程が等電点集合を含む請求の範
    囲第１項の方法。
  9. 【請求項９】当該分析物がペプチドまたは蛋白である請
    求の範囲第１項の方法。
  10. 【請求項１０】当該分析物が誘導派生ペプチドまたは蛋
    白である、請求の範囲第１項の方法。
  11. 【請求項１１】当該分析物を含む可能性があるサンプル
    と、当該分析物に結合して分析物−免疫グロブリンFab'
    フラグメント復合体を形成することができる、当該フラ
    グメント一つあたりただ一つ存在する反応性スルフヒド
    リル基において結合させることにより当該フラグメント
    一つあたりただ一つ存在する検出可能なレポーター基と
    しての蛍光染料で標識された標識Fab'フラグメントをと
    もに混合し； 毛細管等電点集合によって当該混合物の成分を濃縮し分
    離し；さらに、 当該サンプル中の当該分析物の量の表示として、当該分
    析物−Fab'複合体上の当該レポーター基としての蛍光染
    料を定量的に蛍光によって検出するという工程を含むサ
    ンプル中の微量分析を定量的に検出する方法。
  12. 【請求項１２】当該検出可能なレポーター基が、実施の
    pH範囲内のpH変化に感受性をもたない、請求の範囲第11
    項の方法。
  13. 【請求項１３】当該分析物を含む可能性があるサンプル
    と、当該分析物と結合することができる生物学的特異的
    作用物質とをともに混合して、当該分析物−作用物質複
    合体上に当該複合体一つあたりただ一つ存在する検出可
    能なレポーター基としての蛍光染料を含む分析物−作用
    物質複合体を形成し； 毛細管電場で当該混合物の成分を濃縮し； 毛細管電気泳動によって当該混合物の成分を分離し；さ
    らに 当該サンプル中の当該分析物の量の表示として、当該分
    析物−作用物質複合体上のただ一つ存在する当該レポー
    ター基としての蛍光染料を定量的に蛍光によって検出す
    るという工程を含む、サンプル中の微量分析物を定量的
    に検出する方法。
  14. 【請求項１４】当該生物学的特異的作用物質が当該検出
    可能なレポーター基としての蛍光染料で標識され、当該
    レポーター基としての蛍光染料は当該生物学的特異的作
    用物質一つあたりだた一つ存在する、請求の範囲第13項
    の方法。
  15. 【請求項１５】当該混合工程において、当該検出可能な
    レポーター基としての蛍光染料を含む既知量の当該標識
    分析物を更に混合することを含む、請求の範囲第13項の
    方法。
  16. 【請求項１６】当該生物学的特異的作用物質が、抗体フ
    ラグメント、結合蛋白、およびリガンドから成る群から
    選ばれる、請求の範囲第13項の方法。
  17. 【請求項１７】当該濃縮工程と当該分離工程が同時に実
    施される、請求の範囲第13項の方法。
  18. 【請求項１８】当該濃縮工程がイソタコフォレーシスを
    含む請求の範囲第13項の方法。
  19. 【請求項１９】当該分離工程が等電点集合を含む、請求
    の範囲第13項の方法。
JP51708594A 1993-01-22 1994-01-12 親和結合毛細管電気泳動による微量分析物の定量 Expired - Lifetime JP3530914B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US006,922 1993-01-22
US08/006,922 US5348633A (en) 1993-01-22 1993-01-22 Method for quantitating trace amounts of an analyte in a sample by affinity capillary electrophoresis
PCT/US1994/000426 WO1994017409A1 (en) 1993-01-22 1994-01-12 Quantifying trace analytes by affinity capillary electrophoresis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH08506182A JPH08506182A (ja) 1996-07-02
JP3530914B2 true JP3530914B2 (ja) 2004-05-24

Family

ID=21723287

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP51708594A Expired - Lifetime JP3530914B2 (ja) 1993-01-22 1994-01-12 親和結合毛細管電気泳動による微量分析物の定量

Country Status (5)

Country Link
US (1) US5348633A (ja)
EP (1) EP0680608A1 (ja)
JP (1) JP3530914B2 (ja)
AU (1) AU6162594A (ja)
WO (1) WO1994017409A1 (ja)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5468359A (en) * 1988-11-14 1995-11-21 Anthony R. Torres Method of determining presence of an analyte by isoelectric focusing
US5571680A (en) * 1994-01-21 1996-11-05 Beckman Instruments, Inc. Homogeneous immunoassays and enzyme based assays of analytes using capillary electrophoresis
US5536382A (en) * 1994-05-23 1996-07-16 Advanced Molecular Systems, Inc. Capillary electrophoresis assay method useful for the determination of constituents of a clinical sample
US5431793A (en) * 1994-07-29 1995-07-11 Beckman Instruments, Inc. Quantitative analysis of glycosylated hemoglobin by immunocappillary electrophoresis
CA2197493A1 (en) * 1994-08-22 1996-02-29 James Eberwine A method of sequencing proteins by epitope ordering and protein restriction mapping
WO1996010170A1 (en) * 1994-09-29 1996-04-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Capillary-based separation methods for identifying bioactive analytes in a mixture
GB9421468D0 (en) * 1994-10-18 1994-12-07 Surface Active Ltd Biosensor
DE69605712T2 (de) * 1995-03-31 2000-04-27 Laboratory Of Molecular Biophotonics, Hamakita Anwendung von isoelektrischen Punkt Markern bei der isoelektrischen Fokussierung mit Fluoreszenzdetektierung
US5630924A (en) * 1995-04-20 1997-05-20 Perseptive Biosystems, Inc. Compositions, methods and apparatus for ultrafast electroseparation analysis
US5783397A (en) * 1995-12-11 1998-07-21 Northeastern University Screening natural samples for new therapeutic compounds using capillary electrophoresis
US5824478A (en) * 1996-04-30 1998-10-20 Vysis, Inc. Diagnostic methods and probes
US6299747B1 (en) 1997-12-17 2001-10-09 Cetek Corporation Capillary electrophoretic methods to detect new biologically active compounds in complex biological material
US7329388B2 (en) 1999-11-08 2008-02-12 Princeton Biochemicals, Inc. Electrophoresis apparatus having staggered passage configuration
US6406604B1 (en) * 1999-11-08 2002-06-18 Norberto A. Guzman Multi-dimensional electrophoresis apparatus
JP2003520961A (ja) * 2000-01-19 2003-07-08 エムティー テクノロジー，インコーポレイテッド 核酸を分離および検出するための方法および装置
WO2001059119A1 (fr) * 2000-02-10 2001-08-16 Laboratory Of Molecular Biophotonics Methode de production d'un anticorps fab' a homogeneisation isoelectrique, et anticorps fab' a homogeneisation isoelectrique marque par fluorescence
US7153701B1 (en) * 2000-02-17 2006-12-26 Hamamatsu Photonics K.K. Method for quantitatively detecting antigen
DE10127045C2 (de) * 2001-06-02 2003-10-30 November Ag Molekulare Medizin Verfahren zum Nachweis einer Substanz und Mikrotiterplatte
JPWO2002101389A1 (ja) * 2001-06-12 2005-04-07 和光純薬工業株式会社 ヒアルロン酸の測定方法
US7223538B2 (en) * 2001-12-14 2007-05-29 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Post-synthesis labeling of nucleic acids, assays using nucleic acids that are labeled post-synthetically, single nucleotide polymorphism detection, and associated compounds and microarrays
US20050211555A1 (en) * 2002-02-14 2005-09-29 Solus Biosystems, Inc. Method for multiple sample screening using IR spectroscopy
AU2003295805A1 (en) * 2002-11-22 2004-06-18 Solus Biosystems, Inc. High throughput screening with parallel vibrational spectroscopy
US20040260414A1 (en) * 2003-06-20 2004-12-23 Groton Biosystems, Llc Method and apparatus for operating an automated biomolecular preparation system
US7601545B2 (en) * 2003-06-20 2009-10-13 Groton Biosystems, Llc Automated macromolecule sample preparation system
EP1706735B1 (en) * 2003-11-07 2017-01-04 Princeton Biochemicals, Inc. Multi-dimensional electrophoresis apparatus
US8030092B2 (en) * 2003-11-07 2011-10-04 Princeton Biochemicals, Inc. Controlled electrophoresis method
US20050130319A1 (en) * 2003-12-15 2005-06-16 Xerox Corporation Molecular binding event detection using separation channels
KR100852348B1 (ko) * 2003-12-23 2008-08-14 와코 쥰야꾸 고교 가부시키가이샤 분석물 주입 시스템
US7407816B2 (en) * 2004-05-07 2008-08-05 Gentius, Inc Isoelectric particles and uses thereof
US7846676B2 (en) * 2004-07-19 2010-12-07 Cell Biosciences, Inc. Methods and devices for analyte detection
US20060292558A1 (en) * 2004-07-19 2006-12-28 Cell Biosciences Inc. Methods and apparatus for protein assay diagnostics
EP2916128B1 (en) * 2004-07-19 2019-04-03 ProteinSimple Method and device for analyte detection
US7935479B2 (en) * 2004-07-19 2011-05-03 Cell Biosciences, Inc. Methods and devices for analyte detection
US20060292649A1 (en) * 2004-07-19 2006-12-28 Cell Biosciences Inc. Methods and apparatus for reference lab diagnostics
EP1842045A4 (en) * 2005-01-18 2009-04-15 Solus Biosystems Inc SCREENING MULTIPLE SAMPLES BY IR SPECTROSCOPY
JP2008536128A (ja) * 2005-04-09 2008-09-04 セル バイオサイエンシズ，インコーポレイテッド 自動化微小体積アッセイシステム
US20060286378A1 (en) * 2005-05-23 2006-12-21 Shivkumar Chiruvolu Nanostructured composite particles and corresponding processes
DE602006011756D1 (de) * 2005-09-02 2010-03-04 Wako Pure Chem Ind Ltd Komplexformierungs- und -trennungsverfahren
JP4724816B2 (ja) * 2005-09-06 2011-07-13 シャープ株式会社 タンパク質の測定方法
WO2007035864A2 (en) * 2005-09-20 2007-03-29 Cell Biosciences, Inc. Electrophoresis standards, methods and kits
AU2008214063A1 (en) * 2007-02-07 2008-08-14 Lyzer Diagnostics, Inc. A rapid homogeneous immunoassay using electrophoresis
US20090023156A1 (en) * 2007-07-20 2009-01-22 Voss Karl O Methods and reagents for quantifying analytes
US10107782B2 (en) 2008-01-25 2018-10-23 ProteinSimple Method to perform limited two dimensional separation of proteins and other biologicals
US20110071051A1 (en) * 2008-05-27 2011-03-24 Koninklijke Philips Electronics N.V. Biochip for frationating and detecting analytes
GB201010405D0 (en) * 2010-06-21 2010-08-04 Binding Site Group The Ltd Assay
EP2839276B1 (en) 2012-04-19 2018-06-27 ProteinSimple Dual wavelength isoelectric focusing for determining drug load in antibody drug conjugates
US9766206B2 (en) 2013-09-27 2017-09-19 ProteinSimple Apparatus, systems, and methods for capillary electrophoresis

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4725343A (en) * 1985-10-15 1988-02-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. High performance electrophoretic mobilization of isoelectrically focused protein zones
US4810638A (en) * 1986-07-24 1989-03-07 Miles Inc. Enzyme-labeled antibody reagent with polyalkyleneglycol linking group
US4911808A (en) * 1986-09-04 1990-03-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Mobilization of focused protein zones by ion introduction
JP2564540B2 (ja) * 1987-04-01 1996-12-18 株式会社日立製作所 免疫分析方法
JPS6432170A (en) * 1987-07-29 1989-02-02 Agency Ind Science Techn Production of novel fluorescent labeled antibody
DK160189A (da) * 1988-04-04 1989-10-05 Teijin Ltd Reagenssystem til immunologisk analyse af kompleks af human plasminogenaktivatorinhibitor og human vaevsplasminogenaktivator, analysesaet dertil samt monoklone antistoffer og hybridomer
US5149661A (en) * 1988-06-08 1992-09-22 Sarasep, Inc. Fluid analysis with particulate reagent suspension
US5006210A (en) * 1989-02-06 1991-04-09 Iowa State University Research Foundation, Inc. Means and method for capillary zone electrophoresis with laser-induced indirect fluorescence detection
US5108568A (en) * 1989-07-07 1992-04-28 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Controlled method of reducing electrophoretic mobility of macromolecules, particles or cells
US5128005A (en) * 1990-01-29 1992-07-07 Millipore Corporation Method for separating ionic species using capillary electrophoresis
US5156724A (en) * 1990-01-29 1992-10-20 Millipore Corporation Method for analyzing ionic species using capillary electrophoresis
FR2671407B1 (fr) * 1991-01-08 1994-08-05 Europhor Sa Procede d'analyse par electrophorese capillaire avec detection par fluorescence, et dispositifs de mise en óoeuvre.
US5120413A (en) * 1991-05-31 1992-06-09 Beckman Instruments, Inc. Analysis of samples utilzing capillary electrophoresis
US5221454A (en) * 1992-01-31 1993-06-22 Biometric Imaging Inc. Differential separation assay
US5137609A (en) * 1992-01-31 1992-08-11 Biometric Imaging Inc. Differential separation assay

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ぶんせき 第８巻（１９９１）第５９９−６０６頁

Also Published As

Publication number Publication date
WO1994017409A1 (en) 1994-08-04
EP0680608A1 (en) 1995-11-08
US5348633A (en) 1994-09-20
AU6162594A (en) 1994-08-15
JPH08506182A (ja) 1996-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3530914B2 (ja) 親和結合毛細管電気泳動による微量分析物の定量
JP3507853B2 (ja) 毛細管電気泳動を用いる被検体の均一免疫検定および酵素ベース検定
US7556932B2 (en) Particle based homogeneous assays using capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection
JP2556659B2 (ja) 電気泳動の間に標的物質を検知する方法及び装置
Bao Capillary electrophoretic immunoassays
Schmalzing et al. Capillary electrophoresis based immunoassays: a critical review
Chen et al. Characterization of proteins by capillary electrophoresis in fused‐silica columns: Review on serum protein analysis and application to immunoassays
US5431793A (en) Quantitative analysis of glycosylated hemoglobin by immunocappillary electrophoresis
US5221454A (en) Differential separation assay
WO1994017409B1 (en) Quantifying trace analytes by affinity capillary electrophoresis
JP2002303629A (ja) 免疫クロマトデバイス及びそれを用いた被検物質測定方法
Zhu et al. Post-column derivatization for fluorescence and chemiluminescence detection in capillary electrophoresis
US5863401A (en) Simultaneous analysis of analytes by immunoassay using capillary electophoresis with laser induced fluorescence
Tim et al. Ultratrace analysis of drugs in biological fluids using affinity probe capillary electrophoresis: analysis of dorzolamide with fluorescently labeled carbonic anhydrase
Chen Characterization of charge-modified and fluorescein-labeled antibody by capillary electrophoresis using laser-induced fluorescence Application to immunoassay of low level immunoglobulin A
JPS62100660A (ja) 高分子のイムノアツセイ法
Couderc et al. Drug analysis by capillary electrophoresis and laser‐induced fluorescence
Steinmann et al. Characterization of competitive binding, fluorescent drug immunoassays based on micellar electrokinetic capillary chromatography
CA2315051C (en) Capillary electrophoretic methods to detect new biologically active compounds in complex biological material
Wang et al. A novel in‐capillary assay for dynamically monitoring fast binding between antibody and peptides using CE
EP3296318A2 (en) Assay for detecting free light chains by capillary zone electrophoresis
EP0848251A2 (en) Homogeneous on-line assays using capillary electrophoresis
WO2000075663A1 (en) Method and kit for ligand assay
Kühn et al. I. SCOPE
Gygax et al. Proteinanalytics with Surface Plasmon Resonance Technique and Capillary Electrophoresis: FH–HES

Legal Events

Date Code Title Description
A911 Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20031218

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20040106

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20040204

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090312

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090312

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100312

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100312

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110312

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120312

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120312

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130312

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130312

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140312

Year of fee payment: 10

EXPY Cancellation because of completion of term