DE4116116A1 - Fluoreszenzlichtmessgeraet fuer bindungsassaysysteme - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Fluoreszenzlichtmeßgerät zur Analyse von Fluoreszenz- Bindungsassaysystemen, die auf dem abstandsabhängigen Energietransfer (Förster­ transfer) zwischen einem Liganden/Rezeptorpaar basieren, das mindestens eine Fluoreszenzmarkierung aufweist.

Bindungsassaysysteme der genannten Art besitzen insbesondere auf den Gebieten der biochemischen Forschung und der medizinischen Diagnostik erhebliche Bedeu­ tung. Sie sind im wesentlichen gekennzeichnet durch ein Rezeptormolekül, das eine spezifische Bindungsstelle für den Liganden aufweist. Anschaulich wird dieses Paar durch das "Schlüssel-Schloß-Prinzip" beschrieben. Wichtige Paare dieser Art sind beispielsweise Antigene und ihre entsprechenden Antikörper. Ein weiteres Beispiel sind Lektine, die eine Affinität zu verschiedenen, teilweise hochspezifischen Zuckerstrukturen besitzen, wie sie beispielsweise bei Blutgruppen-Determinanten auftreten. Diese spezifische Kopplung wird für die verschiedensten Tests und Untersuchungsmethoden verwendet.

Zur quantitativen Analyse des Bindungsvorganges ist es bekannt, den Rezeptor oder den Liganden oder beide mit einer fluoreszierenden Verbindung zu markieren. Dazu wird beispielsweise dem Rezeptor ein Fluoreszenzfarbstoff F1 (Donor) und dem Liganden ein zweiter Fluoreszenzfarbstoff F2 (Akzeptor) zugeordnet. Die Zuordnung läßt sich durch eine chemische Bindung, beispielsweise durch eine kovalente Bindung realisieren. Erfüllen Akzeptor und Donor bestimmte Bedin­ gungen bezüglich ihrer elektronischen Anregungsniveaus, so kommt es zu einer abstandsabhängigen Übertragung der Anregungsenergie zwischen den beiden.

Dieser Vorgang ist in der Fotochemie als Förstertransfer bekannt. Dieser Effekt beruht darauf, daß von dem Donor-Fluoreszenzfarbstoff F1 dann und nur dann ein Teil der absorbierten Energie auf den Akzeptor-Fluoreszenzfarbstoff F2 übertragen wird, wenn zum einen der Emissionswellenlängenbereich von F1 mit dem Absorp­ tionswellenlängenbereich von F2 überlappt und zweitens, der Abstand zwischen den beiden Fluoreszenzfarbstoff-Molekülen so gering ist, daß der Energieübertrag stattfinden kann. Dies ist im allgemeinen nur der Fall, wenn der Abstand geringer als 10 nm ist (Försterradius).

Weitere Einzelheiten zu Bindungsassaysystemen, die auf dem Förstertransfer basie­ ren, sind beispielsweise EP-1 50 905-A2 sowie den beim Deutschen Patentamt anhängigen Anmeldungen mit dem Aktenzeichen P 39 38 598.1 bzw. P 40 13 713.9 zu entnehmen.

Zur Analyse eines Bindungsassaysystems, das auf dem Förstertransfer basiert, ist in vielen Fällen die Beobachtung zweier, von der Anregungswellenlänge verschiedener Fluoreszenzlichtwellenlängen erforderlich.

Fluoreszenzspektrometer sind seit langem bekannt. Sie bestehen beispielsweise aus einer Anregungslichtquelle, je einem Doppelmonochromator für das Anregungslicht und das Fluoreszenzlicht und einer empfindlichen Elektronik zum Nachweis der Fluoreszenz, z. B. durch Photonenzählen. Solche Geräte sind für die Anwendung in kleinen biochemischen Labors oder Arztpraxen in den Abmessungen zu groß, bei der Handhabung zu kompliziert und zu teuer.

Kleinere Fluoreszenzlichtmeßgeräte, die zur Analyse von fluoreszenzmarkierten Immunoassaysystemen verwendet werden, sind beispielsweise aus EP-00 71 991-A2, aus EP-01 03 426-A2 sowie aus Analytical Chemistry 83, 55, 878-881 bekannt. Diese Geräte sind zur Analyse von Bindungsassaysystemen, die auf dem Förstertransfer basieren, nicht geeignet, da sie nicht die Untersuchung zweier, von der Anregungswellenlänge verschiedener Fluoreszenzwellenlängen zulassen.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein kompaktes, preiswertes und einfach zu bedienendes Fluoreszenzlichtmeßgerät zu entwickeln, das sich trotz einfacher Bauweise für die Analyse verschiedener nach dem Förstertransfer arbeitender Bindungsassaysysteme eignet.

Die Aufgabe wurde durch ein Fluoreszenzlichtmeßgerät gelöst, das aus einem optischen Anregungskanal und zwei Fluoreszenzkanälen besteht, wobei der Anregungskanal eine Lichtquelle und optische Bauteile zur Erzeugung eines quasi-monochromatischen Anregungslichtes aufweist und die Fluoreszenzkanäle Strahlaufweitungs- und Fokussieroptiken sowie Interferenzfilter und Detektoren zur Intensitätsmessung von Fluoreszenzlicht jeweils einer Wellenlänge aufweisen.

Das neue Meßgerät erlaubt die Arbeit mit Licht dreier, voneinander unterschiedlich einstellbaren Wellenlängen. Die Lichtquelle ist vorzugsweise eine Gasentladungs­ lampe, die eine Quecksilber-, Wasserstoff- oder Edelgasfüllung aufweist. Optische Bauteile im Sinne der Erfindung sind Blenden, Linsen und Interferenzfilter. Die Wahl der einzelnen Wellenlängen geschieht bevorzugt durch Interferenzfilter. Das durch einen solchen Filterungsprozeß gewonnene Licht gilt als monochromatisch im Sinne der Erfindung, wenn seine Halbwertsbreite weniger als 15 nm, bevorzugt weniger als 1,5 nm, beträgt.

In einer bevorzugten Ausführungsform, die die Trennung der Lichtquelle vom Meß­ gerät erlaubt, wird das Anregungslicht durch eine Lichtleitfaser aus Glas oder Kunststoff von der Lichtquelle zum Monochromator des Anregungskanales gelenkt. Die Detektoren bestehen vorteilhaft aus Photomultipliern, da deren Empfindlichkeit größer ist als die von Photodioden. Photodioden, kommen ihrerseits in Fällen hoher Fluoreszenzlichtintensität zur Anwendung. Die Abbildungsoptiken in den Fluores­ zenzkanälen sind vorzugsweise so angeordnet, daß ihre optischen Achsen einen Winkel von 45 bis 90°, bezogen auf die optische Achse des Anregungskanales, einnehmen. In diesen Winkelbereichen ist das Verhältnis von Fluoreszenzlicht zu ohne Wellenlängenänderung gestreutem Licht am günstigsten.

Die Erfindung wird nachstehend anhand einer Zeichnung und zweier Ausführungs­ beispiele näher erläutert.

Fig. 1 zeigt den prinzipiellen Aufbau des Fluoreszenzlichtmeßgerätes mit einem Anregungskanal und zwei getrennten Fluoreszenzkanälen.

Fig. 2 zeigt den prinzipiellen Aufbau des Fluoreszenzlichtmeßgerätes mit einem Anregungskanal und zwei Fluoreszenzkanälen mit gemeinsamer Optik und einem gemeinsamen Detektor.

Das gesamte Fluoreszenzlichtmeßgerät besteht aus drei Baugruppen 1, 2 und 3, die durch flexible Leitungen 4, 5 verbunden sind. Baugruppe 1 besteht im wesentlichen aus einer xenongefüllten Gasentladungslampe 6, deren Licht mittels der Optik 7 in das Lichtleitkabel 4 eingekoppelt wird. In der Baugruppe 2 wird das aus dem Lichtleitkabel 4 austretende Licht mittels einer Linse 8 durch das Interferenzfilter 9 gelenkt, das die Anregungswellenlänge λ1 ausfiltert. Mittels der Linse 10 wird das Anregungslicht auf die Probe 11 gelenkt. Das von der Probe 11 ausgehende Licht wird durch die Linsen 12, 13 gesammelt und auf die Interferenzfilter 14, 15 gelenkt, die aus dem Licht jeweils eine Wellenlänge λ2, λ3 herausfiltern. Mittels der Linsen 16, 17 wird das Fluoreszenzlicht der jeweiligen Wellenlänge auf die Detektoren 18, 19 fokussiert. Die Meßsignale der Detektoren 18, 19 werden über die elektrischen Leitungen 5 der elektronischen Auswerteeinrichtung 3 zugeführt. Die Fluoreszenz­ kanäle 12, 14, 16, 18 bzw. 13, 15, 17, 19 sind drehbar auf Schwenkarmen montiert, so daß sie in einem beliebigen Winkel zur optischen Achse des Anregungskanales 8, 9, 10 bzw. deren Verlängerung durch die Probenhalterung 11 einstellbar sind. Bei Normalbetrieb wird für beide Fluoreszenzkanäle jeweils ein Winkel von 45° einge­ stellt. Insbesondere für Messungen an flüssigen Proben bzw. Durchflußküvetten läßt sich jedoch ebenfalls ein Winkel von 90° einstellen. Bei durchsichtiger Probe bzw. Probenhalterung 11 lassen sich die Fluoreszenzkanäle auch auf der dem Anregungs­ kanal gegenüberliegenden Seite der Probenebene anbringen. Der Raumbedarf der gesamten Baugruppe 2 beansprucht weniger als 2000 cm³.

Eine kompaktere Bauweise wird durch die Identität der optischen Bauteile 12, 13, 16, 17 und der Detektoren 18, 19 der Fluoreszenzkanäle erreicht. Zur Realisierung der beiden Fluoreszenzkanäle werden die unterschiedlichen Interferenzfilter 15, 16 auf einer Vorrichtung 20 montiert, die einen schnellen Wechsel der Filter im gemeinsamen Kanal zuläßt. Die Vorrichtung 20 ist ein senkrecht zur optischen Achse beweglicher Schlitten, auf dem die beiden Filter 15, 16 montiert sind. Die Vorrichtung läßt sich auch realisieren, indem die beiden Filter auf einer durch die optische Achse rotierenden Scheibe montiert werden. Die Verwendung eines einzi­ gen Detektors besitzt zudem den Vorteil, daß während der Auswertung nur eine einzige Empfindlichkeitskurve zu berücksichtigen ist.

Zum Nachweis einer Reaktion wird die Probe 11 in die Apparatur 2 eingebracht. Die Probe enthält zwei Reaktionspartner, die mit je einem Fluoreszenzfarbstoff (F1, F2) markiert sind. Das Interferenzfilter 9 im Anregungskanal wird so ausgewählt, daß seine maximale Transmission (λ1) möglichst genau das Absorptionsmaximum des Donor-Fluoreszenzfarbstoffes F1 trifft. Die beiden Interferenzfilter der Fluor­ eszenzkanäle 15, 16 haben ihre höchste Transmission bei den Wellenlängen, bei denen der Donor-Farbstoff F1 und der Akzeptor-Farbstoff F2 am stärksten fluor­ eszieren. Es wird die Fluoreszenzintensität der Probe bei den beiden Fluoreszenz­ wellenlängen der Farbstoffe F1 und F2 (λ2, λ3) gemessen und der Quotient gebildet, der ein Maß dafür ist, wieviel von der absorbierten Energie auf den Farbstoff F2 übertragen wurde. Aus diesem Wert kann auf den Belegungsgrad bzw. die Menge des spezifisch gebundenen Reaktionspartners geschlossen werden.

Die mit Hilfe des neuen Gerätes gewonnenen Meßergebnisse stimmen gut mit den Messungen überein, die mit Hilfe der um ein vielfaches größeren herkömmlichen Fluoreszenzspektrometern gewonnen wurden. Zudem können Messungen mit dem neuen Fluoreszenzlichtmeßgerät etwa 10 mal schneller durchgeführt werden.

Claims (4)

1. Fluoreszenzlichtmeßgerät zur Analyse von Fluoreszenz-Bindungsassaysyste­ men, die auf dem abstandsabhängigen Energietransfer (Förstertransfer) zwischen einem Liganden/Rezeptorpaar basieren, das mindestens eine Fluo­ reszenzmarkierung aufweist, bestehend aus einem optischen Anregungskanal und zwei Fluoreszenzkanälen, wobei der Anregungskanal eine Lichtquelle (6) und optische Bauteile (8, 9, 10) zur Erzeugung eines quasi-monochroma­ tischen Anregungslichtes aufweist und die Fluoreszenzkanäle Sammellinsen (12, 13, 16, 17) sowie Interferenzfilter (14, 15) und Detektoren (18, 19) zur Intensitätsmessung von Fluoreszenzlicht jeweils einer Wellenlänge aufwei­ sen.

2. Fluoreszenzlichtmeßgerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Anregungskanal ebenfalls einen Interferenzfilter (9) und mindestens zwei Sammellinsen (8, 10) aufweist.

3. Fluoreszenzlichtmeßgerät nach den Ansprüchen 1 bis 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Anregungskanal über einen Lichtleiter (4) mit der Lichtquelle (6) verbunden ist.

4. Fluoreszenzlichtmeßgerät nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die beiden Fluoreszenzkanäle gemeinsame Sammellinsen (12, 16) und einen gemeinsamen Detektor (18) aufweisen.