ES2211290B1 - Detector universal y cuantitativo de moleculas organicas por fluorescencia. - Google Patents
Detector universal y cuantitativo de moleculas organicas por fluorescencia.Info
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Abstract
Detector universal y cuantitativo de moléculas orgánicas por fluorescencia. No todas las moléculas orgánicas son fluorescentes, ni se pueden convertir en fluorescentes usando un único procedimiento. Esta invención permite la detección cuantitativa por fluorescencia o cualquier molécula orgánica, sea o no fluorescente, y de sus mezclas. Este carácter universal de la detección confiere a la invención su principal novedad. El procedimiento está caracterizado por la medida de la variación de la intensidad de la fluorescencia que provoca la interacción ión- dipolo inducido al adicionar la molécula orgánica que se quiera detectar a cualquier catión orgánico, fluorescente y con carga igual o superior a la unidad, y, posteriormente, irradiar el conjunto con luz en el rango ultravioleta o visible. Este procedimiento puede ser llevado a cabo en disolución, en dispositivos tipo sensor, preferentemente de fibra óptica, e incorporado a sistemas cromatográficos, electroforéticos y electrocromatográficos.
Description
Detector universal y cuantitativo de moléculas
orgánicas por fluorescencia.
El sector en el que se encuadra la invención es
el de la Tecnología Química. Esta invención tiene interés para
todos los campos en que se detectan y cuantifican moléculas
orgánicas (bioquímica, medioambiente, cromatografía, química
orgánica y analítica, etc...).
La fluorescencia es una de las técnicas más
sensibles de detección de moléculas, que se aplica en modo
espectroscópico, como detector cromatográfico, o en dispositivos de
tipo sensor.
No todas las moléculas orgánicas presentan
fluorescencia. Existen muchas que carecen de las características
estructurales precisas para ser detectables mediante tal propiedad.
Así, sólo son detectadas las que poseen fluorescencia intrínseca o
bien aquéllas moléculas que se pueden convertir en fluorescentes
mediante reacción o interacción química con otros compuestos
químicos (en adelante, derivatizantes). Éstas reacciones o
interacciones involucran derivatizantes que suelen ser eficaces
sólo para una molécula o un conjunto particular de moléculas
orgánicas. Así, pues, no se ha descrito hasta ahora ningún
procedimiento, derivatizante o sistema de detección general que
sirva para detectar por fluorescencia a todas las moléculas
orgánicas existentes.
Un ejemplo de derivatizante utilizado únicamente
desde hace tiempo como detector exclusivo de hidrocarburos
saturados es el cloruro de berberina, cuando una placa de silica
gel impregnada con una disolución de esta sal, y sobre la que se
depositaba el correspondiente hidrocarburo saturado, se irradiaba
con luz ultravioleta a 254 nm y con luz visible a 365 nm en un
sistema de cromatografía en capa fina (Mamlok, L. Technical Note:
Berberine Hydrochloride for Detection (as a Detector) in
Thin-Layer Chromatography. J. Chromatogr.
Sci. 1981, 19, 53.). También se utilizó el cloruro de
berberina para detectar a simple vista (usando luz natural) los
hidrocarburos saturados eluídos a través de una columna abierta
rellenada con silica gel (Brockmann, H.; Volpers, F. Zur Kenntnis
der chromatographischen Adsorption, II. Mitteil: Ein neues
Verfahren zur Trennung farbloser Stoffe. Ber. 1947, 80,
77). En ambos casos, la detección era visual, es decir, la
fluorescencia emitida no era recogida mediante ningún
dispositivo.
Utilizando el mismo procedimiento en
cromatografía en capa fina aunque recogiendo la fluorescencia
emitida mediante el uso de filtros en un densitómetro, Marsh y
Hiekane también detectaron hidrocarburos saturados en un bitumen en
1991 (Marsh, C. M.; Hiekane, C. J. Quantitative Analysis of Bitumen
by Conventional High Performance Thin Layer Chromatography. J.
Planar Chromatogr.-Mod TLC 1991, 4,
293-298).
Las bases de este fenómeno no fueron
sistemáticamente estudiadas hasta 1999 por Cebolla et al.
(Cebolla, V. L.; Membrado, L.; Domingo, M. P.; Henrion, P.; Garriga,
R.; González, P.; Cossio, F. P.; Arrieta, A.; Vela, J.
Quantitative Applications of Fluorescence and Ultraviolet Scanning
Densitometry for Compositional Analysis of Petroleum Products in
Thin-Layer Chromatography. J. Chromatogr.
Sci. 1999, 37, 219-226, y Cebolla, V.L.,
Matt, M., Gálvez, E.M., Membrado, L., Domingo, M.P., Vela, J.,
Beregovtsova, N., Sharypov, V., Kuznetsov, B.N., Marin, N., Weber,
J.V. Application of Thin-layer Chromatography with
Fluorescence Scanning Densitometry for Analysing Saturates in Heavy
Liquids Derived from Co-pyrolysis of Biomass and
Plastics. Chromatographia 2002, 55,
87-93), y Cossío et al. (Fernando P. Cossío, Ana
Arrieta, Vicente L. Cebolla, Luis Membrado, María P. Domingo,
Patrick Henrion, Jesús Vela. Enhancement of Fluorescence in
Thin-Layer Chromatography Induced by the
Interaction between n-Alkanes and an Organic
Cation. Anal. Chem. 2000, 72,
1759-1766, y Fernando P. Cossío, Ana Arrieta,
Vicente L. Cebolla, Luis Membrado, Jesús Vela, Rosa Garriga, and
María P. Domingo. Berberine Cation: A Fluorescent Chemosensor for
Alkanes and Other Low-Polarity Compounds. An
Explanation of This Phenomenon. Organic Letters 2000,
2, 2311-2313), quienes asimismo realizaron
contribuciones a su aplicación en cromatografía en capa fina para el
análisis de hidrocarburos saturados en productos de petróleo y
biomasa. Estos autores demostraron que la emisión fluorescente es
debida a una interacción ión-dipolo inducido entre
el catión berberina y el correspondiente hidrocarburo
saturado.
El descubrimiento que nos lleva a proponer esta
patente es que la emisión fluorescente caracterizada por
interacciones ión-dipolo inducido no permite
solamente la detección de hidrocarburos saturados u otras
moléculas puntuales sino que es un procedimiento general que
permite la detección de todas y cada una de las moléculas
orgánicas. Cualquiera de los cationes orgánicos existentes,
con tal que sean fluorescentes y con carga igual o superior a la
unidad se comportan como derivatizantes universales de moléculas
orgánicas, en virtud de las ecuaciones matemáticas que rigen este
tipo de fluorescencia (Fernando P. Cossío, Ana Arrieta, Vicente L.
Cebolla, Luis Membrado, Jesús Vela, Rosa Garriga, and Mana P.
Domingo. Berberine Cation: A Fluorescent Chemosensor for Alkanes and
Other Low-Polarity Compounds. An Explanation of
This Phenomenon. Organic Letters 2000, 2,
2311-2313). El catión berberina es un caso
particular de este fenómeno. El sistema de detección inventado
aquí se basa en este tipo de interacción. La parte fundamental del
descubrimiento consiste en la generalización del fenómeno a otros
cationes y otras técnicas de separación distintas de la
cromatografia en capa fina (TLC), sobre la que se ha estudiado
hasta el momento la detección de algunos compuestos particulares
con berberina, por lo que se excluye en consecuencia su aplicación
a la TLC en las reivindicaciones de esta invención, aunque tampoco
en el caso de la TLC se ha descrito como detector universal.
Esta invención es aplicable a una variedad de
dispositivos analíticos que tienen interés para la detección de
múltiples analitos.
No se ha descrito hasta ahora ningún
procedimiento que permita detectar por fluorescencia todas y cada
una de las moléculas orgánicas existentes en diversos sistemas
analíticos de interés. Nuestra invención permite la detección de
todas y cada una de las moléculas orgánicas (carácter universal)
de modo cuantitativo, lo cual presenta interés en su aplicación a
distintos campos de la Química por ser la fluorescencia un modo de
detección muy sensible. Asimismo, es posible incorporarla a los
diferentes tipos de sistemas comerciales con ligeras
modificaciones.
Nuestra invención se basa en recoger
cuantitativamente la fluorescencia emitida cuando se irradia el
correspondiente compuesto orgánico que se quiere determinar, con luz
ultravioleta o visible, en una disolución de cualquier catión
orgánico fluorescente de carga igual o superior a la unidad. Así,
en las condiciones mencionadas, estos cationes se comportan como
detectores o sensores de cualquier compuesto orgánico. La principal
novedad de la invención es que todas las moléculas orgánicas son
detectadas en estas condiciones. Este tipo de fluorescencia se
caracteriza por una interacción ión-dipolo inducido
entre el correspondiente compuesto orgánico y el catión
utilizado.
Otra novedad de nuestra invención es que puede
ser llevada a cabo en diferentes sistemas comerciales, con ligeras
modificaciones, que se detallan en el apartado siguiente. Todos
estos sistemas ya incorporan dispositivos para realizar la
irradiación de la muestra con luz ultravioleta o visible.
La explotación industrial de esta invención puede
venir por el desarrollo comercial de estos sistemas de detección
para su aplicación a la detección de analitos de interés en los
campos de la química orgánica, cromatografia, bioquímica,
medioambiente.
Es posible detectar cualquier compuesto orgánico
mediante el aumento o la disminución de la intensidad de la
fluorescencia emitida a una longitud de onda, que se produce cuando
se irradia con luz en el rango ultravioleta o visible una
disolución conjunta del compuesto orgánico a detectar y cualquier
sal de cualquier catión orgánico que sea fluorescente y con carga
igual o superior a la unidad, respecto de la fluorescencia de la
misma disolución sin adición del compuesto orgánico.
La fluorescencia emitida está caracterizada por
una interacción ión-dipolo inducido. Como
consecuencia de dicha interacción, el catión polariza a la molécula
orgánica creando una cierta separación de cargas en ella y
produciendo una emisión fluorescente.
El aumento o disminución de fluorescencia ocurre,
en las condiciones mencionadas, para todos los compuestos
orgánicos y su valor absoluto depende de la masa del compuesto
orgánico añadido y de las condiciones de adición del catión
fluorescente, además de depender de las longitudes de onda de
excitación y emisión. El signo de la fluorescencia depende del
disolvente utilizado. La única restricción es que tanto el catión
como el compuesto orgánico a detectar sean solubles en dicho
disolvente.
Las longitudes de onda de excitación y de emisión
dependerán de cada catión particular y compuesto a detectar. De
entre los posibles cationes a utilizar, el catión berberina es un
caso particular. En este caso, la longitud de onda de excitación se
encuentra preferentemente entre 250 y 400 nm, y la de emisión,
preferentemente en el rango 350-550 nm. Los
valores de longitud de onda mencionados son orientativos. Los
valores óptimos suelen darse para el catión berberina alrededor de
365 nm en lo referente a excitación y 450-550 nm
en cuanto a emisión.
Esta invención permite la detección universal y
cuantitativa de cualquier compuesto orgánico, tanto puro como en
mezclas. En ella se reivindica el uso, en las condiciones
mencionadas, de cualquier catión orgánico fluorescente, en virtud de
las expresiones que rigen este tipo de fluorescencia.
Esta invención se puede llevar a cabo en
diferentes sistemas. En primer lugar, y tal como se ha descrito
anteriormente, puede ser aplicada a la detección directa de analitos
orgánicos en disolución, utilizando sistemas tales como equipos de
espectroscopia. En este caso, la detección puede ser llevada a
cabo en la misma cubeta en la que se realiza la medida
espectroscópica. También puede aplicarse en cualquier dispositivo
tipo sensor, por ejemplo, asociado a fibra óptica.
Asimismo, la invención puede llevarse a cabo,
mediando separación de los compuestos que eventualmente compongan
la muestra problema, en equipos de cromatografia líquida de alta
eficacia (HPLC), o en equipos de cromatografia supercrítica. También
en sistemas de cromatografía en capa fina, así como en sistemas de
electroforesis y electrocromatografía. Se detallan algunas
particularidades de la detección de compuestos orgánicos en dichos
sistemas.
La descripción de la invención para el caso de
sistemas electroforéticos o electrocromatográficos requiere la
impregnación de la capa de gel mediante una disolución del catión,
pudiéndose regular la concentración de la disolución del catión y el
tiempo de impregnación a voluntad del analista en función de las
necesidades de detección.
En el caso de la cromatografía HPLC, la muestra
se inyecta en un equipo convencional de cromatografía equipado con
columna o columnas de cualquier tipo de fase estacionaria y
detector de fluorescencia. En el caso de nuestra patente, se debe
utilizar una bomba adicional que impulse un caudal de una
disolución de cualquier sal de berberina. Este caudal se deberá
mezclar con el de fase móvil tras la salida de la columna y antes
de la entrada al detector de fluorescencia. La berberina puede ser
añadida en cualquier disolvente adecuado, en concentraciones
típicas entre 1 y 200
\hbox{ \mu g / mL}y a un flujo típico entre 0.1 y 10
\hbox{mL / min}. De este modo, los compuestos separados junto con la fase móvil interaccionan con la berberina y es posible detectarlos de forma cuantitativa por fluorescencia en las condiciones descritas anteriormente. El nivel de fluorescencia de línea base corresponde al de la fluorescencia original de la fase móvil. La cantidad de berberina añadida y el flujo utilizado condicionan la intensidad de la fluorescencia emitida y sus características (positiva o negativa).
La figura 1 presenta un esquema general de la
fluorescencia presentada en esta patente y que está caracterizada
por interacción ión-dipolo inducido. La irradiación,
con luz ultravioleta o visible de cualquier molécula orgánica
disuelta en una disolución de cualquier sal de cualquier catión
orgánico (que sea fluorescente) conduce a una interacción
ión-dipolo inducido en la que el catión polariza a
la molécula orgánica. Esta interacción produce una emisión
fluorescente.
La figura 2 pretende ilustrar la detección de
moléculas orgánicas de distinta naturaleza mediante el empleo del
catión berberina como sensor o detector, utilizando un equipo de
HPLC con detector de fluorescencia. A notar que las moléculas
reseñadas en la presente figura no poseen fluorescencia
intrínseca. La figura 2 representa la respuesta fluorescente de
diversos alcoholes (propanol, butanol, octanol, pentanol, decanol y
metanol) mediante fluorescencia caracterizada por interacción
ión-dipolo inducido, utilizando un sistema de HPLC
(cromatografía líquida de alta eficacia). Las condiciones utilizadas
eran las que se citan a continuación. Fase móvil: Diclorometano
con flujo de 0'3 ml/min. Concentración de berberina: 200
microgramos/ml en diclorometano (disuelta en 3 ml de metanol por
100 de la disolución total). Flujo de la disolución de berberina
0'8 ml/min. La respuesta de cada compuesto depende de las
condiciones anteriores. Longitud de onda de excitación: 350 nm.
Longitud de onda de detección: 520 nm.
La figura 3 corresponde a un ejemplo de detección
espectroscópica por fluorescencia de n-hexano en disolución
mediante el uso de sulfato de berberina y excitación con luz
ultravioleta a 350 nm. En el eje de ordenadas se representa la
intensidad de fluorescencia (en unidades arbitrarias); en el eje
de abscisas se representa la longitud de onda de la emisión
fluorescente. El espectro A es el de fluorescencia de la
disolución de sulfato de berberina en acetona. El espectro
B es el de fluorescencia de la disolución anterior a la que
se había añadido n-hexano.
El primer ejemplo se corresponde con la figura 2,
que representa la detección de diferentes alcoholes mediante
fluorescencia ión-dipolo inducido, utilizando un
sistema de HPLC (cromatografía líquida de alta eficacia).
Se realizaron inyecciones sucesivas de 20
microlitros de propanol (2 inyecciones), butanol (2 inyecciones),
octanol (2 inyecciones), pentanol (2 inyecciones), decanol (2
inyecciones) y metanol (3 inyecciones). La fase móvil utilizada fue
diclorometano con un flujo de 0.3 mi/min. Se adicionó sulfato de
berberina a la salida de la columna en una concentración de 200
microgramos/ml tras haber sido disuelta en diclorometano/metanol
(3%de metanol en volumen) con un flujo de 0.8 ml/min. Ambos
caudales, el de fase móvil y el de berberina fueron mezclados a la
salida de la columna antes de su paso por el detector de
fluorescencia. La longitud de onda de excitación fue de 350 nm y la
de detección de 520 nm.
La respuesta de cada alcohol depende, como para
el resto de productos, de los flujos de fase móvil y berberina
empleados. Si bien en este caso apenas se detecta respuesta en el
caso del pentanol, otras condiciones permiten detectar también con
claridad dicho compuesto.
El segundo ejemplo se corresponde con la figura
3, que representa el aumento de fluorescencia producido por un
hidrocarburo (n-hexano). Dicho aumento de fluorescencia
permite detectar la presencia de este compuesto. Hay que hacer notar
que éste compuesto no es fluorescente como tampoco lo eran los
alcoholes del ejemplo anterior. El modo de proceder es el
siguiente: se toman 2 ml de una disolución de berberina en acetona
en una concentración de 125 microgramos por mililitro y se añaden
23 ml de acetona. Se realiza el espectro de fluorescencia con
longitud de onda 350 nm. Es el espectro denominado A en la figura.
Posteriormente, se toman 2 ml de la mencionada disolución de
berberina en acetona, se añaden 22 ml de acetona y 1 ml de
n-hexano. Se realiza el espectro de fluorescencia en las
mismas condiciones que en el caso anterior. Es el espectro
denominado B en la figura. Se observa, por comparación de ambos
espectros, que la adición de n-hexano ha producido un
incremento de la fluorescencia emitida en el rango
400-570 nm.
Claims (6)
1. Procedimiento para la detección universal y
cuantitativa de cualquier molécula orgánica y mezclas compuestas
de ellas caracterizado por la medida de la variación de la
intensidad de la fluorescencia que provoca la interacción
ión-dipolo inducido al adicionar la molécula
orgánica que se quiera detectar a cualquier catión orgánico,
fluorescente y con carga igual o superior a la unidad, y,
posteriormente, irradiar el conjunto con luz en el rango
ultravioleta o visible.
2. Procedimiento para la detección de cualquier
molécula orgánica y mezclas compuestas de ellas según
reivindicación 1, caracterizado por ser llevado a cabo en
disolución, mediante adición del compuesto orgánico que se quiera
detectar a una disolución de cualquier sal de cualquiera de los
cationes definidos en 1.
3. Procedimiento para la detección de cualquier
molécula orgánica y mezclas compuestas de ellas según
reivindicación 1, caracterizado por su incorporación a
cualquier tipo de sistema de cromatografía líquida de alta eficacia
(HPLC), por adición post-columna de una disolución
de cualquier sal de cualquiera de los cationes descritos en 1.
4. Procedimiento para la detección de cualquier
molécula orgánica y mezclas compuestas de ellas según
reivindicación 1, caracterizado por su incorporación a
cualquier tipo de sistema de cromatografía supercrítica, por
adición post-columna de una disolución de cualquier
sal de cualquiera de los cationes descritos en 1.
5. Procedimiento para la detección de cualquier
molécula orgánica y mezclas compuestas de ellas según
reivindicación 1, caracterizado por su incorporación a todo
tipo de sistema de electroforesis, mediante pre o post impregnación
con una disolución de cualquier sal de cualquiera de los cationes
descritos en 1.
6. Procedimiento para la detección de cualquier
molécula orgánica y mezclas compuestas de ellas según
reivindicación 1, caracterizado por su incorporación a todo
tipo de sistema de electrocromatografía, por adición
post-columna de una disolución de cualquier sal de
cualquiera de los cationes descritos en 1.
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