JPH11153602A - 全タンパク質検出法 - Google Patents
全タンパク質検出法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 水性試験流体中の全タンパク質を測定する
ための検定に対する改善された方法及び試験具の提供。 【解決手段】 モリブデートもしくはタングステートと
染料との錯体を用いて試験流体中の全タンパク質を検出
する際に、約１．０〜３．０のpHで作用可能にするpKa
を有し、５０mg/dLを超えるタンパク質の存在下でのみ
検出可能な応答を提供するような、タンパク質に対する
親和力を有する置換フェノールスルホンフタレイン染料
を用いること。
ための検定に対する改善された方法及び試験具の提供。 【解決手段】 モリブデートもしくはタングステートと
染料との錯体を用いて試験流体中の全タンパク質を検出
する際に、約１．０〜３．０のpHで作用可能にするpKa
を有し、５０mg/dLを超えるタンパク質の存在下でのみ
検出可能な応答を提供するような、タンパク質に対する
親和力を有する置換フェノールスルホンフタレイン染料
を用いること。
Description
【０００１】
【従来の技術】尿タンパクを検出する方法は、他の尿タ
ンパクよりもアルブミンに対して高感度であることが多
い。しかし、特にベンス・ジョーンズタンパク尿症の場
合、アルブミン以外のタンパク質を検出することが重要
である。決定レベル及び臨床医によって講じられること
を推奨される措置が患者の尿中で検出されるタンパク質
の濃度に依存して異なるため、タンパク質の検出は、広
い範囲のタンパク質濃度をカバーできるべきである。た
とえば、５０mg/dLを超える持続性のタンパク尿症は腎
疾患の強い証拠を表し、３００mg/dLを超えるタンパク
質レベルはネフローゼ症候群の診断と合致する。８００
mg/dLを超える尿中タンパク質濃度は、多量のタンパク
質の損失を示唆し、腎生検及び／又はステロイド治療を
確証させる。したがって、尿中のタンパク質の試験は、
広い範囲のタンパク質値にわたって有効でなければなら
ないことは明らかである。
ンパクよりもアルブミンに対して高感度であることが多
い。しかし、特にベンス・ジョーンズタンパク尿症の場
合、アルブミン以外のタンパク質を検出することが重要
である。決定レベル及び臨床医によって講じられること
を推奨される措置が患者の尿中で検出されるタンパク質
の濃度に依存して異なるため、タンパク質の検出は、広
い範囲のタンパク質濃度をカバーできるべきである。た
とえば、５０mg/dLを超える持続性のタンパク尿症は腎
疾患の強い証拠を表し、３００mg/dLを超えるタンパク
質レベルはネフローゼ症候群の診断と合致する。８００
mg/dLを超える尿中タンパク質濃度は、多量のタンパク
質の損失を示唆し、腎生検及び／又はステロイド治療を
確証させる。したがって、尿中のタンパク質の試験は、
広い範囲のタンパク質値にわたって有効でなければなら
ないことは明らかである。
【０００２】水性流体中のタンパク質を測定するための
種々の方法が文献に報告されている。これらの方法は、
ケルダール法、ビウレット法、Lowery法、色素組み合わ
せ法、ＵＶ法及び蛍光測定法を含む。一般に、タンパク
質は種々の物質、特に染料、たとえばブロモフェノール
ブルー、クマシーブリリアントブルー及びエオシンなら
びに金属イオン、たとえば銀（Ｉ）、銅（II）、亜鉛
（II）及び鉛（II）と反応する。典型的には、染料と金
属イオンとの反応に対するタンパク質の付加が、染料金
属イオン溶液にスペクトル変化をもたらす。藤田らは、
Bunseki Kogaku Vol. 32, pp. E379-E386で、ピロガロ
ールレッドとモリブデン（VI）との反応に対するタンパ
ク質の付加が、ピロガロールレッド−モリブデン（VI）
錯体溶液のスペクトルとは異なるスペクトルを生じさせ
ることを報告している。特開昭６２−６１７０号公報
は、モリブデン酸塩と、モリブデン酸イオンとで錯体を
形成し、吸収バンドがタンパク質の存在下で移動する顔
料と、モリブデン酸イオンと結合するキレート化剤とを
含むタンパク質測定用の試験片を開示している。微量の
タンパク質のための同様な検定が、尿試料中に通常に存
在するシュウ酸、クエン酸、リン酸もしくはそれらの塩
と結合することができるモリブデン又は金属イオンと結
合することができるキレート化剤の使用を記載する特開
昭６１−１５５７５７号公報に開示されている。この検
定は、ピロガロールレッドとモリブデンとの錯体を使用
する色素結合法である。低いpHでは、染料−金属錯体は
赤である。より高いpHで脱プロトン化されると、青に変
色する。タンパク質は、正電荷を帯びたアミノ酸基が、
負電荷を帯びた脱プロトン化された染料−モリブデート
錯体を安定化する相互作用により、染料をより容易に
（より低いpHで）脱プロトン化させる。
種々の方法が文献に報告されている。これらの方法は、
ケルダール法、ビウレット法、Lowery法、色素組み合わ
せ法、ＵＶ法及び蛍光測定法を含む。一般に、タンパク
質は種々の物質、特に染料、たとえばブロモフェノール
ブルー、クマシーブリリアントブルー及びエオシンなら
びに金属イオン、たとえば銀（Ｉ）、銅（II）、亜鉛
（II）及び鉛（II）と反応する。典型的には、染料と金
属イオンとの反応に対するタンパク質の付加が、染料金
属イオン溶液にスペクトル変化をもたらす。藤田らは、
Bunseki Kogaku Vol. 32, pp. E379-E386で、ピロガロ
ールレッドとモリブデン（VI）との反応に対するタンパ
ク質の付加が、ピロガロールレッド−モリブデン（VI）
錯体溶液のスペクトルとは異なるスペクトルを生じさせ
ることを報告している。特開昭６２−６１７０号公報
は、モリブデン酸塩と、モリブデン酸イオンとで錯体を
形成し、吸収バンドがタンパク質の存在下で移動する顔
料と、モリブデン酸イオンと結合するキレート化剤とを
含むタンパク質測定用の試験片を開示している。微量の
タンパク質のための同様な検定が、尿試料中に通常に存
在するシュウ酸、クエン酸、リン酸もしくはそれらの塩
と結合することができるモリブデン又は金属イオンと結
合することができるキレート化剤の使用を記載する特開
昭６１−１５５７５７号公報に開示されている。この検
定は、ピロガロールレッドとモリブデンとの錯体を使用
する色素結合法である。低いpHでは、染料−金属錯体は
赤である。より高いpHで脱プロトン化されると、青に変
色する。タンパク質は、正電荷を帯びたアミノ酸基が、
負電荷を帯びた脱プロトン化された染料−モリブデート
錯体を安定化する相互作用により、染料をより容易に
（より低いpHで）脱プロトン化させる。
【０００３】より最近、タングステートがタンパク質及
び染料の存在下でモリブデートと同様な挙動を見せるこ
とが見いだされた。本発明の全タンパク質的検定に有用
なモリブデン酸塩及びタングステン酸塩は、ナトリウム
塩、カリウム塩、リチウム塩及びアンモニウム塩又はア
ルキル、ジアルキル、トリアルキルもしくはテトラアル
キルアンモニウムイオンとのタングステン酸塩／モリブ
デン酸塩又は同様なカチオンを有するリンタングステン
酸塩を含む。
び染料の存在下でモリブデートと同様な挙動を見せるこ
とが見いだされた。本発明の全タンパク質的検定に有用
なモリブデン酸塩及びタングステン酸塩は、ナトリウム
塩、カリウム塩、リチウム塩及びアンモニウム塩又はア
ルキル、ジアルキル、トリアルキルもしくはテトラアル
キルアンモニウムイオンとのタングステン酸塩／モリブ
デン酸塩又は同様なカチオンを有するリンタングステン
酸塩を含む。
【０００４】米国特許第５，３９９，４９８号明細書に
は、モリブデン酸塩又はタングステン酸塩と、タンパク
質の存在下において吸収バンドが移動する、モリブデン
酸イオン又はタングステン酸イオンとの錯体を形成する
染料とを使用する、タンパク質検定におけるバックグラ
ウンド反応性を減らすための化合物を含む特定のイオン
化性ホスフェートの使用が開示されている。しかし、こ
の引用例は、この方法がタンパク質濃度の全範囲で作用
できるということを実証していない。米国特許第５，３
７４，５６１号明細書は、ニトロソ置換ポリハロゲン化
フェノールスルホンフタレインを使用してアルブミンを
検出できるということを開示しているが、この染料クラ
スをピロガロール染料と併用できるということを実証し
ていない。米国特許第５，２７９，７９０号明細書に
は、ニトロ置換ポリハロゲン化フェノールスルホンフタ
レインをメロシアニン染料と併用してアルブミンを検出
することができる分析方法が開示されている。
は、モリブデン酸塩又はタングステン酸塩と、タンパク
質の存在下において吸収バンドが移動する、モリブデン
酸イオン又はタングステン酸イオンとの錯体を形成する
染料とを使用する、タンパク質検定におけるバックグラ
ウンド反応性を減らすための化合物を含む特定のイオン
化性ホスフェートの使用が開示されている。しかし、こ
の引用例は、この方法がタンパク質濃度の全範囲で作用
できるということを実証していない。米国特許第５，３
７４，５６１号明細書は、ニトロソ置換ポリハロゲン化
フェノールスルホンフタレインを使用してアルブミンを
検出できるということを開示しているが、この染料クラ
スをピロガロール染料と併用できるということを実証し
ていない。米国特許第５，２７９，７９０号明細書に
は、ニトロ置換ポリハロゲン化フェノールスルホンフタ
レインをメロシアニン染料と併用してアルブミンを検出
することができる分析方法が開示されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】モリブデート又はタン
グステートとピロガロールレッドとの相互作用に基づ
く、広い範囲のタンパク質濃度で作用するタンパク質検
定を提供することが望ましく、それが本発明の目的であ
る。
グステートとピロガロールレッドとの相互作用に基づ
く、広い範囲のタンパク質濃度で作用するタンパク質検
定を提供することが望ましく、それが本発明の目的であ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、水性試験流体
中の全タンパク質を測定するための検定に対する改善で
あって、試験流体を、モリブデートもしくはタングステ
ート及び低いpH、すなわち約１．０〜３．０のpHでモリ
ブデートもしくはタングステートとで錯体を形成するピ
ロガロールレッドと合わせることを含む検定に関する。
この検定では、錯体の吸収バンドがタンパク質の存在下
で移動して、反射率計で検出することができる応答を提
供する。本発明は、この検定に対する改善であって、約
１．０〜３．０のpHで作用することを可能にするpKaを
有し、水性試料中５０mg/dLを超えるタンパク質の存在
下でのみ検出可能な応答を提供するような、タンパク質
に対する親和力を有する置換スルホンフタレイン染料を
検定に導入することを含む改善を含む。
中の全タンパク質を測定するための検定に対する改善で
あって、試験流体を、モリブデートもしくはタングステ
ート及び低いpH、すなわち約１．０〜３．０のpHでモリ
ブデートもしくはタングステートとで錯体を形成するピ
ロガロールレッドと合わせることを含む検定に関する。
この検定では、錯体の吸収バンドがタンパク質の存在下
で移動して、反射率計で検出することができる応答を提
供する。本発明は、この検定に対する改善であって、約
１．０〜３．０のpHで作用することを可能にするpKaを
有し、水性試料中５０mg/dLを超えるタンパク質の存在
下でのみ検出可能な応答を提供するような、タンパク質
に対する親和力を有する置換スルホンフタレイン染料を
検定に導入することを含む改善を含む。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明のタンパク質検定は、湿式
又は乾式のいずれで実施することもできる。もっとも好
都合には、緩衝剤、ピロガロールレッドならびに一次指
示薬としてのモリブデン酸塩もしくはタングステン酸塩
及び二次指示薬としてのフェノールスルホンフタレイン
染料を含浸させた吸収性試験片の形態で実施する。
又は乾式のいずれで実施することもできる。もっとも好
都合には、緩衝剤、ピロガロールレッドならびに一次指
示薬としてのモリブデン酸塩もしくはタングステン酸塩
及び二次指示薬としてのフェノールスルホンフタレイン
染料を含浸させた吸収性試験片の形態で実施する。
【０００８】本発明に特に有用であるフェノールスルホ
ンフタレイン指示薬は、次式の構造Ａ及びＢによって表
される。
ンフタレイン指示薬は、次式の構造Ａ及びＢによって表
される。
【０００９】
【化１】
【００１０】構造Ａは、プロトン性溶剤、たとえば水又
はアルコール中のフェノールスルホンフタレイン誘導体
の一般構造を表し、構造Ｂは、乾燥状態又は非プロトン
性溶剤、たとえばエーテル及びアセトニトリル中で優勢
である形態を表す。フェノールスルホンフタレイン誤差
指示薬は、タンパク質の存在下でプロトンが置換される
ようなpKa値を有するイオン化性プロトンを含むpH指示
薬である。フェノールスルホンフタレイン指示薬のpKa
値は、指示薬分子の数の半分が脱プロトン化されたＣ環
フェノール性ヒドロキシル基を含むところのpHである。
上記に表したフェノールスルホンフタレインタンパク質
誤差指示薬の場合、観測可能な変色を起こさせるため
に、二つの脱プロトン化イベントが起こる。最初の脱プ
ロトン化がＡ環上のアリールスルホン酸からプロトンを
除去して、以下に式Ｃとして示すイオンを発生させる。
はアルコール中のフェノールスルホンフタレイン誘導体
の一般構造を表し、構造Ｂは、乾燥状態又は非プロトン
性溶剤、たとえばエーテル及びアセトニトリル中で優勢
である形態を表す。フェノールスルホンフタレイン誤差
指示薬は、タンパク質の存在下でプロトンが置換される
ようなpKa値を有するイオン化性プロトンを含むpH指示
薬である。フェノールスルホンフタレイン指示薬のpKa
値は、指示薬分子の数の半分が脱プロトン化されたＣ環
フェノール性ヒドロキシル基を含むところのpHである。
上記に表したフェノールスルホンフタレインタンパク質
誤差指示薬の場合、観測可能な変色を起こさせるため
に、二つの脱プロトン化イベントが起こる。最初の脱プ
ロトン化がＡ環上のアリールスルホン酸からプロトンを
除去して、以下に式Ｃとして示すイオンを発生させる。
【００１１】
【化２】
【００１２】このプロトンのpKaは１未満であり、すべ
ての有用なpH値でこの基のイオン化をもたらす。このイ
オン化性基はまた、これらの化合物の水溶性の原因であ
る。第二の脱プロトン化は、Ｃ環フェノール性ヒドロキ
シルからプロトンを放出してジアニオンを生むことを含
む。このタイプのタンパク質誤差指示薬を用いると、第
二の脱プロトン化が、試験される試料におけるタンパク
質の存在を示す観測可能な変色を起こさせる。フェノー
ルスルホンフタレインタンパク質誤差指示薬は、観測者
が、試験流体と接触したときのpH変化の結果ではなくタ
ンパク質の存在の結果である色の変化に頼ることができ
るよう、一定pHの環境を提供するために通常は緩衝剤と
ともに吸収性マトリックス材料に適用される。第二の脱
プロトン化が約１．０〜３．０のpHで起こるような第二
のpKaを有するフェノールスルホンフタレインタンパク
質誤差指示薬だけが本発明に有用である。理由は、その
ような強酸性pHでこそ、ピロガリルレッド／モリブデー
トもしくはタングステートとタンパク質との反応が起こ
るからである。
ての有用なpH値でこの基のイオン化をもたらす。このイ
オン化性基はまた、これらの化合物の水溶性の原因であ
る。第二の脱プロトン化は、Ｃ環フェノール性ヒドロキ
シルからプロトンを放出してジアニオンを生むことを含
む。このタイプのタンパク質誤差指示薬を用いると、第
二の脱プロトン化が、試験される試料におけるタンパク
質の存在を示す観測可能な変色を起こさせる。フェノー
ルスルホンフタレインタンパク質誤差指示薬は、観測者
が、試験流体と接触したときのpH変化の結果ではなくタ
ンパク質の存在の結果である色の変化に頼ることができ
るよう、一定pHの環境を提供するために通常は緩衝剤と
ともに吸収性マトリックス材料に適用される。第二の脱
プロトン化が約１．０〜３．０のpHで起こるような第二
のpKaを有するフェノールスルホンフタレインタンパク
質誤差指示薬だけが本発明に有用である。理由は、その
ような強酸性pHでこそ、ピロガリルレッド／モリブデー
トもしくはタングステートとタンパク質との反応が起こ
るからである。
【００１３】多くのフェノールスルホンフタレインタン
パク質誤差指示薬が、それらの第二のpKaを適切な範囲
に有し、したがって、本発明で使用するのに適してい
る。有用なフェノールスルホンフタレインは、Ａ、Ｂ又
はＣ環を電子求引基及び電子供与基、たとえばアミノ、
芳香族基、アルキル、ヒドロキシル、カルボン酸基、ア
ルコキシ、アセチル、ハロゲン、ニトロ又はシアニン基
で置換されているものを含む。得られる染料が適当な範
囲のpKaを示す限り、具体的な置換基（複数でもよい）
及び染料分子上のそれらの位置は重要でない。非置換の
フェノールスルホンフタレインは、そのpKaが適当な範
囲にないため、適しているとはいえない。オクタ置換ス
ルホンフタレイン指示薬、すなわち３′、３″、５′、
５″、３、４、５及び６の位置で置換されているフェノ
ールスルホンフタレイン誘導体が、本発明で使用するの
に特に適していることが見いだされた。これらの指示薬
は、ハロゲン及びニトロ基で置換されていることが好ま
しく、以下の式で表すことができる。
パク質誤差指示薬が、それらの第二のpKaを適切な範囲
に有し、したがって、本発明で使用するのに適してい
る。有用なフェノールスルホンフタレインは、Ａ、Ｂ又
はＣ環を電子求引基及び電子供与基、たとえばアミノ、
芳香族基、アルキル、ヒドロキシル、カルボン酸基、ア
ルコキシ、アセチル、ハロゲン、ニトロ又はシアニン基
で置換されているものを含む。得られる染料が適当な範
囲のpKaを示す限り、具体的な置換基（複数でもよい）
及び染料分子上のそれらの位置は重要でない。非置換の
フェノールスルホンフタレインは、そのpKaが適当な範
囲にないため、適しているとはいえない。オクタ置換ス
ルホンフタレイン指示薬、すなわち３′、３″、５′、
５″、３、４、５及び６の位置で置換されているフェノ
ールスルホンフタレイン誘導体が、本発明で使用するの
に特に適していることが見いだされた。これらの指示薬
は、ハロゲン及びニトロ基で置換されていることが好ま
しく、以下の式で表すことができる。
【００１４】
【化３】
【００１５】式中、Ｘはニトロであり、Ｙ及びＺはクロ
ロ、ブロモ又はヨードである。同じく有用なものは、米
国特許第５，２７９，７９０号明細書に開示されてい
る、Ｙ及びＺがニトロであるニトロ置換ポリハロゲン化
フェノールスルホンフタレインである。これらの指示薬
は、流体試料中の約２〜５００mg/dLのタンパク質を検
出する能力を有するといわれている。しかし、本発明の
検定系の使用は、３０mg/dLを超えるタンパク尿を測定
し、かつ２mg/dLのミクロアルブミン尿を測定しない状
況で望ましいであろう。たとえば、子供の腎疾患を診断
する場合、ミクロアルブミンを測定することは望ましく
ない。この応答は、その可変性のため、誤った疾患の指
示を出すおそれがあるからである。本発明の範囲を逸す
ることなく、本発明に有用なフェノールスルホンフタレ
イン指示薬の芳香環が多様な置換基を有してもよいこと
は明らかである。このような置換基は、本発明で使用す
るに適したものにする適当なタンパク質誤差指示薬特性
を有する安定な化合物を調製する当業者の能力によって
のみ限定される。
ロ、ブロモ又はヨードである。同じく有用なものは、米
国特許第５，２７９，７９０号明細書に開示されてい
る、Ｙ及びＺがニトロであるニトロ置換ポリハロゲン化
フェノールスルホンフタレインである。これらの指示薬
は、流体試料中の約２〜５００mg/dLのタンパク質を検
出する能力を有するといわれている。しかし、本発明の
検定系の使用は、３０mg/dLを超えるタンパク尿を測定
し、かつ２mg/dLのミクロアルブミン尿を測定しない状
況で望ましいであろう。たとえば、子供の腎疾患を診断
する場合、ミクロアルブミンを測定することは望ましく
ない。この応答は、その可変性のため、誤った疾患の指
示を出すおそれがあるからである。本発明の範囲を逸す
ることなく、本発明に有用なフェノールスルホンフタレ
イン指示薬の芳香環が多様な置換基を有してもよいこと
は明らかである。このような置換基は、本発明で使用す
るに適したものにする適当なタンパク質誤差指示薬特性
を有する安定な化合物を調製する当業者の能力によって
のみ限定される。
【００１６】フェノールスルホンフタレインタンパク質
誤差指示薬は、流体試料を、モリブデン酸塩もしくはタ
ングステン酸塩及びそれらとで錯体を形成し、吸収バン
ドがタンパク質の存在下で移動する染料と合わせる、タ
ンパク質のモリブデン酸塩又はタングステン酸塩検定に
関して使用される。米国特許第５，３９９，４９８号明
細書で開示されているように、タングステートが指示薬
と反応すると、モリブデンとの錯体と同様に、タンパク
質の存在下で色が移動する錯体を形成する。この特許は
また、この種の検定におけるバックグラウンド干渉を減
らすため、フィチン酸又はその誘導体の使用を開示して
いる。この検定は、流体試料、たとえば尿中の低濃度の
タンパク質を検出するのには非常に良好であるが、より
高いタンパク質濃度、特に約１５０mg/dLを超えるタン
パク質濃度では、その分解能が劇的に低下する。この方
法は、応答が試料中に存在するタンパク質のタイプに依
存しないため、全タンパク質的検定である。たとえば、
１５mg/dLのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、１５mg/
dLのＩｇＧと同じ応答を提供する。全タンパク質的検定
は特定の疾病状態の検出に有用であり、尿中への総タン
パク質溢流量が多ければ多いほど潜在的な問題が深刻で
あるため、高いタンパク質濃度で検出可能な応答を提供
する全タンパク質的検定が望ましい。しかし、モリブデ
ン酸塩／タングステン酸塩検定は、タンパク質に対する
染料の強い親和力のため、高い濃度、すなわち約１５０
mg/dLを超える濃度のタンパク質の検出には効果がな
い。本発明は、二次染料としてのフェノールスルホンフ
タレインの追加が、検定範囲を拡大する効果を有して、
モリブデン酸塩／タングステン酸塩のみによる検定によ
って可能であるよりも高い濃度のタンパク質の間で視覚
的分解能を提供することが可能になるという発見に基づ
く。表１に提示するデータから明らかであるように、他
のタイプのタンパク質誤差指示薬は、この増強された分
解能を提供しない。これは、これらの染料がピロガロー
ルレッドの赤〜紫色とで色適合性ではないことが理由で
あると考えられる。さらに、第二のpKaが、モリブデン
酸塩／タングステン酸塩検定が作用することができるpH
範囲にあるフェノールスルホンフタレインだけが、第二
の指示薬として使用するのに適している。適当なフェノ
ールスルホンフタレインのさらなる要件は、染料が５０
mg/dLを超える濃度のタンパク質にさらされた場合にの
み検出可能な応答が得られるような、タンパク質に対す
る親和力を有するということである。理由は、より高い
親和力を有する染料は、ピロガロールレッドよりも優先
してタンパク質に結合するからである。
誤差指示薬は、流体試料を、モリブデン酸塩もしくはタ
ングステン酸塩及びそれらとで錯体を形成し、吸収バン
ドがタンパク質の存在下で移動する染料と合わせる、タ
ンパク質のモリブデン酸塩又はタングステン酸塩検定に
関して使用される。米国特許第５，３９９，４９８号明
細書で開示されているように、タングステートが指示薬
と反応すると、モリブデンとの錯体と同様に、タンパク
質の存在下で色が移動する錯体を形成する。この特許は
また、この種の検定におけるバックグラウンド干渉を減
らすため、フィチン酸又はその誘導体の使用を開示して
いる。この検定は、流体試料、たとえば尿中の低濃度の
タンパク質を検出するのには非常に良好であるが、より
高いタンパク質濃度、特に約１５０mg/dLを超えるタン
パク質濃度では、その分解能が劇的に低下する。この方
法は、応答が試料中に存在するタンパク質のタイプに依
存しないため、全タンパク質的検定である。たとえば、
１５mg/dLのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、１５mg/
dLのＩｇＧと同じ応答を提供する。全タンパク質的検定
は特定の疾病状態の検出に有用であり、尿中への総タン
パク質溢流量が多ければ多いほど潜在的な問題が深刻で
あるため、高いタンパク質濃度で検出可能な応答を提供
する全タンパク質的検定が望ましい。しかし、モリブデ
ン酸塩／タングステン酸塩検定は、タンパク質に対する
染料の強い親和力のため、高い濃度、すなわち約１５０
mg/dLを超える濃度のタンパク質の検出には効果がな
い。本発明は、二次染料としてのフェノールスルホンフ
タレインの追加が、検定範囲を拡大する効果を有して、
モリブデン酸塩／タングステン酸塩のみによる検定によ
って可能であるよりも高い濃度のタンパク質の間で視覚
的分解能を提供することが可能になるという発見に基づ
く。表１に提示するデータから明らかであるように、他
のタイプのタンパク質誤差指示薬は、この増強された分
解能を提供しない。これは、これらの染料がピロガロー
ルレッドの赤〜紫色とで色適合性ではないことが理由で
あると考えられる。さらに、第二のpKaが、モリブデン
酸塩／タングステン酸塩検定が作用することができるpH
範囲にあるフェノールスルホンフタレインだけが、第二
の指示薬として使用するのに適している。適当なフェノ
ールスルホンフタレインのさらなる要件は、染料が５０
mg/dLを超える濃度のタンパク質にさらされた場合にの
み検出可能な応答が得られるような、タンパク質に対す
る親和力を有するということである。理由は、より高い
親和力を有する染料は、ピロガロールレッドよりも優先
してタンパク質に結合するからである。
【００１７】
【実施例】以下の実施例によって本発明を実施する方法
をさらに説明する。
をさらに説明する。
【００１８】実施例Ｉ この実験に使用したタンパク質試薬は、緩衝剤（コハク
酸）、ピロガロールレッド、モリブデン酸ナトリウム及
びフィチン酸を含有する水／メタノール混合物でJ.C.Bi
nzer T467ろ紙を１回含浸させることによって製造し
た。表１に示す第二の指示薬染料を加えた。水酸化ナト
リウム及び／又は塩酸を使用して混合物のpHを１．５に
調節した。混合物は、染料の結合に基づくタンパク質検
出方法とともに使用するための、当該技術で公知である
いかなる数の界面活性剤、洗浄剤、バックグラウンド染
料、増強剤ポリマー又はキレート化剤を含むことができ
る。含浸後、ろ紙を細片に裁断し、種々のタンパク質濃
度でタンパク質応答を試験した。
酸）、ピロガロールレッド、モリブデン酸ナトリウム及
びフィチン酸を含有する水／メタノール混合物でJ.C.Bi
nzer T467ろ紙を１回含浸させることによって製造し
た。表１に示す第二の指示薬染料を加えた。水酸化ナト
リウム及び／又は塩酸を使用して混合物のpHを１．５に
調節した。混合物は、染料の結合に基づくタンパク質検
出方法とともに使用するための、当該技術で公知である
いかなる数の界面活性剤、洗浄剤、バックグラウンド染
料、増強剤ポリマー又はキレート化剤を含むことができ
る。含浸後、ろ紙を細片に裁断し、種々のタンパク質濃
度でタンパク質応答を試験した。
【００１９】尿中０、１５、５０、１５０及び４５０mg
/dLのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の場合のピロガロ
ールレッド法の応答を、いくつかのタイプの二次染料の
存在又は不在下で測定した。これは、カラースケールを
使用し、標準溶液中で出た色を比較する目視測定によっ
て達成した。
/dLのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の場合のピロガロ
ールレッド法の応答を、いくつかのタイプの二次染料の
存在又は不在下で測定した。これは、カラースケールを
使用し、標準溶液中で出た色を比較する目視測定によっ
て達成した。
【００２０】各染料混合物（及び二次染料を含まない対
照）を使用して得た結果を、目視により、分解能なし
「０」から分解能優秀「３」までで定格した。この実験
の結果を表１にまとめる。
照）を使用して得た結果を、目視により、分解能なし
「０」から分解能優秀「３」までで定格した。この実験
の結果を表１にまとめる。
【００２１】
【表１】
【００２２】糖尿病患者の尿中に見いだされる優勢なタ
ンパク質はアルブミンである。したがって、タンパク尿
試験のモデル系はアルブミンである。
ンパク質はアルブミンである。したがって、タンパク尿
試験のモデル系はアルブミンである。
【００２３】表１から、染料６及び７を使用した場合に
最適な分解能が得られたと判断することができる。二次
染料１〜４は、タンパク質１５０〜４５０mg/dLの間で
は分解能を改善しなかった。理由は、これらの染料は、
pKaが高すぎた、すなわち１〜３の範囲外であったから
である。したがって、二次染料６及び７の場合のよう
に、二次フェノールスルホンフタレイン染料は、タンパ
ク質に対してより低い親和力を有しなければならず、５
０mg/dLを超える濃度のみを検出するということがわか
る。二次フェノールスルホンフタレイン染料は、ピロガ
ロールレッド−モリブデート／タングステート染料がタ
ンパク質と結合し、それによって両方が相互に作用し
て、比較的広い範囲のタンパク質濃度にわたって区別し
うる結果を出すことを妨げてはならない。二次染料５
は、１．５のpKaを有するにもかかわらず、１５０〜４
５０mg/dLのタンパク質で分解能を改善しなかった。理
由は、この染料は、０〜５０mg/dLの範囲のタンパク質
に対する親和力が高すぎたからである。他方、非常に低
い親和力を有する（１５０mg/dLを超えるタンパク質の
みを検出する）二次染料８は、分解能を改善しなかっ
た。この場合、タンパク質に対するより高い親和力を有
するピロガロールレッド染料は、二次染料８よりも優先
してタンパク質を拘束する。
最適な分解能が得られたと判断することができる。二次
染料１〜４は、タンパク質１５０〜４５０mg/dLの間で
は分解能を改善しなかった。理由は、これらの染料は、
pKaが高すぎた、すなわち１〜３の範囲外であったから
である。したがって、二次染料６及び７の場合のよう
に、二次フェノールスルホンフタレイン染料は、タンパ
ク質に対してより低い親和力を有しなければならず、５
０mg/dLを超える濃度のみを検出するということがわか
る。二次フェノールスルホンフタレイン染料は、ピロガ
ロールレッド−モリブデート／タングステート染料がタ
ンパク質と結合し、それによって両方が相互に作用し
て、比較的広い範囲のタンパク質濃度にわたって区別し
うる結果を出すことを妨げてはならない。二次染料５
は、１．５のpKaを有するにもかかわらず、１５０〜４
５０mg/dLのタンパク質で分解能を改善しなかった。理
由は、この染料は、０〜５０mg/dLの範囲のタンパク質
に対する親和力が高すぎたからである。他方、非常に低
い親和力を有する（１５０mg/dLを超えるタンパク質の
みを検出する）二次染料８は、分解能を改善しなかっ
た。この場合、タンパク質に対するより高い親和力を有
するピロガロールレッド染料は、二次染料８よりも優先
してタンパク質を拘束する。
【００２４】本発明の検定系の基本成分は、ピロガロー
ルレッド、モリブデン酸塩もしくはタングステン酸塩、
緩衝剤及び二次指示薬としてのフェノールスルホンフタ
レイン染料である。これらの成分は通常、プロトン性溶
剤、たとえば水／メタノール混合物中に、表２に示す濃
度で溶解される。通常、その溶液は、尿試料中の他の成
分による干渉を防ぐためにキレート化剤、たとえばフィ
チン酸及び／又はシュウ酸を含有する。
ルレッド、モリブデン酸塩もしくはタングステン酸塩、
緩衝剤及び二次指示薬としてのフェノールスルホンフタ
レイン染料である。これらの成分は通常、プロトン性溶
剤、たとえば水／メタノール混合物中に、表２に示す濃
度で溶解される。通常、その溶液は、尿試料中の他の成
分による干渉を防ぐためにキレート化剤、たとえばフィ
チン酸及び／又はシュウ酸を含有する。
【００２５】その溶液を吸収性マトリックス、たとえば
ろ紙に適用し、乾燥させると、いずれかの染料だけで達
成することができるよりも広い範囲の試験流体中のタン
パク質濃度を検出するのに適した試験片が得られる。
ろ紙に適用し、乾燥させると、いずれかの染料だけで達
成することができるよりも広い範囲の試験流体中のタン
パク質濃度を検出するのに適した試験片が得られる。
【００２６】
【表２】
【００２７】コハク酸は、pHを制御するのに使用するこ
とができる多くの緩衝剤の一つにすぎない。他の適当な
緩衝剤には、ホスフェート、シュウ酸、フィチン酸、リ
ン酸、クエン酸、トリクロロ酢酸、安息香酸、硫酸水素
ナトリウム、サリチル酸、塩酸、マレイン酸、グリシ
ン、フタル酸、グリシルグリシン及びフマル酸がある。
とができる多くの緩衝剤の一つにすぎない。他の適当な
緩衝剤には、ホスフェート、シュウ酸、フィチン酸、リ
ン酸、クエン酸、トリクロロ酢酸、安息香酸、硫酸水素
ナトリウム、サリチル酸、塩酸、マレイン酸、グリシ
ン、フタル酸、グリシルグリシン及びフマル酸がある。
Claims (10)
- 【請求項１】 試験流体を、モリブデン酸塩もしくはタ
ングステン酸塩及び約１．０〜３．０のpHでモリブデン
酸イオンもしくはタングステン酸イオンと錯体（コンプ
レックス）を形成する染料と合わせる工程を含み、タン
パク質の存在下で該錯体の吸収バンドが移動して、検出
可能な応答を提供する水性試験流体中の全タンパク質を
測定する検定法において、 約１．０〜３．０のpHで作用可能にするpKaを有し、５
０mg/dLを超えるタンパク質の存在下でのみ検出可能な
応答を提供するような、タンパク質に対する親和力を有
する置換フェノールスルホンフタレイン染料を検定に導
入する工程を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 染料がピロガロールレッドである、請求
項１記載の方法。 - 【請求項３】 フェノールスルホンフタレイン染料が、
アミノ、芳香族基、アルキル、ヒドロキシル、カルボン
酸基（carboxylic）、アルコキシ、アセチル、シアニ
ン、ハロゲン、ニトロ又はこれらの基の組み合わせでオ
クタ置換されている、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 フェノールスルホンフタレイン染料が、
その５′、５″位がニトロで置換され、その３′、
３″、３、４、５及び６位がクロロ、ブロモ又はヨード
で置換されている、請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 スルホンフタレイン染料が、５′，５″
−ジニトロ−３′，３″，３，４，５，６−ヘキサブロ
モフェノールスルホンフタレイン又は５′−ニトロ−
５″−ヨード−３′，３″，３，４，５，６−ヘキサブ
ロモフェノールスルホンフタレインである、請求項１記
載の方法。 - 【請求項６】 緩衝剤、ピロガロールレッド、モリブデ
ン酸塩もしくはタングステン酸塩及びフェノールスルホ
ンフタレインが、吸収性材料の試験片に吸収されてい
る、請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 流体試料中のタンパク質レベルを測定す
るのに使用するための試験具を製造する方法において、 ａ）マトリックス材料を、ピロガロールレッドと、モリ
ブデン酸塩もしくはタングステン酸塩と、再水和すると
マトリックス内のpHを約１．０〜約３．０のレベルに維
持することができる緩衝系と、ピロガロールレッド、モ
リブデン酸塩もしくはタングステン酸塩及びタンパク質
の存在下で、タンパク質が約５０mg/dLを超える濃度で
流体試料中に存在するとき、約１．０〜約３．０のpHで
検出可能な応答を提供するスルホンフタレインである第
二の染料とを含有する溶液と接触させる工程と、 ｂ）溶剤をマトリックスから除去して乾式試験具を残す
工程と、を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項８】 該溶液が、再水和したマトリックス材料
のpHを所望のレベルに維持するのに適当な量の緩衝剤及
びフィチン酸を含む、請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 該溶液が、ピロガロールレッド０．０３
〜１０mM、モリブデン酸塩０．０５〜１０mM及びスルホ
ンフタレイン染料０．０２〜２０mMを含有する、請求項
７記載の方法。 - 【請求項１０】 流体試料中のタンパク質レベルを測定
するのに使用するための乾式試験具であって、 約１．０〜３．０のpHでモリブデートもしくはタングス
テートと錯体を形成する染料と、 可溶性のモリブデン酸塩もしくはタングステン酸塩と、 １．０〜３．０のpHで作用することを可能にするpKaプ
ロフィールを有し、５０mg/dLを超えるタンパク質の存
在下でのみ検出可能な応答を提供するような、タンパク
質に対する親和力を有するフェノールスルホンフタレイ
ン染料と、 試験具と流体試料とが接触したとき、試験具内のpHを約
１．０〜３．０のレベルに維持することができる緩衝系
と、をその中に吸収した吸収性材料を含むことを特徴と
する試験具。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/935977 | 1997-09-23 | ||
| US08/935,977 US5908787A (en) | 1997-09-23 | 1997-09-23 | Total protein detection method |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11153602A true JPH11153602A (ja) | 1999-06-08 |
Family
ID=25468001
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10262606A Withdrawn JPH11153602A (ja) | 1997-09-23 | 1998-09-17 | 全タンパク質検出法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5908787A (ja) |
| EP (1) | EP0907081B1 (ja) |
| JP (1) | JPH11153602A (ja) |
| KR (1) | KR19990030004A (ja) |
| AU (1) | AU731530B2 (ja) |
| CA (1) | CA2242197C (ja) |
| ES (1) | ES2234057T3 (ja) |
| TW (1) | TW451062B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009041577A1 (ja) * | 2007-09-27 | 2009-04-02 | Niigata University | 尿中タンパク質定量用の尿前処理剤、尿前処理方法、及び尿中タンパク質定量方法。 |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5593895A (en) * | 1995-04-27 | 1997-01-14 | Bayer Corporation | Method for the detection of protein in urine |
| WO2000003242A2 (en) * | 1998-07-11 | 2000-01-20 | Bickar David A | Solid solventless protein assay with standards |
| WO2002004658A1 (en) * | 2000-07-06 | 2002-01-17 | Cytoskeleton, Inc. | Compositions to measure protein concentration |
| DE60225802T2 (de) * | 2001-06-25 | 2009-04-16 | Siemens Medical Solutions Diagnostics | Verfahren und gerät zum nachweis des gesamten proteingehaltes bei niedrigen ph-werten |
| AU2003206034A1 (en) * | 2002-03-05 | 2003-09-16 | Bayer Healthcare Llc | Absorbing organic reagent into diagnostic test devices by formation of amine salt complexes |
| US20110065139A1 (en) * | 2007-11-27 | 2011-03-17 | Jacob Mullerad | diagnostic device for identifying rupture of membrane during pregnancy |
| WO2014118543A2 (en) * | 2013-01-30 | 2014-08-07 | Vantix Holdings Limited | Electrochemical total protein detection system |
| CN105572117A (zh) * | 2015-12-11 | 2016-05-11 | 章丘九亚医疗器械有限公司 | 一种适合全自动生化分析仪的尿总蛋白检测试剂盒 |
| EP3500861A4 (en) * | 2016-08-17 | 2019-06-26 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | COOMASSIE BRILLANT BLAUTEST WITH IMPROVED SENSITIVITY |
| AU2018261788B2 (en) * | 2017-05-04 | 2022-06-02 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Devices and methods for minimizing hook effect interference in immunoassays |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5087575A (en) * | 1988-06-06 | 1992-02-11 | Miles Inc. | Composition for determining trace amount of protein |
| US4960710A (en) * | 1988-06-06 | 1990-10-02 | Miles Inc. | Device and method of assaying for trace mounts of proteins |
| US5055407A (en) * | 1988-07-05 | 1991-10-08 | Miles, Inc. | Composition and method of assaying aqueous liquids for specific gravity |
| US5049358A (en) * | 1988-09-30 | 1991-09-17 | Miles Inc. | Composition and test device for assaying for proteins |
| EP0517050B1 (en) * | 1991-06-06 | 1996-09-18 | Bayer Corporation | Test-strip containing merocyanine and nitro or nitroso substituted polyhalogenated phenol-sulfonephthaleins as protein indicators |
| US5399498A (en) * | 1993-12-17 | 1995-03-21 | Miles Inc. | Reduction of background interferences in the molybdate-dye protein assay |
-
1997
- 1997-09-23 US US08/935,977 patent/US5908787A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-06-22 TW TW087110005A patent/TW451062B/zh not_active IP Right Cessation
- 1998-07-03 CA CA002242197A patent/CA2242197C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-10 ES ES98117122T patent/ES2234057T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-10 EP EP98117122A patent/EP0907081B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-17 JP JP10262606A patent/JPH11153602A/ja not_active Withdrawn
- 1998-09-21 AU AU86132/98A patent/AU731530B2/en not_active Ceased
- 1998-09-22 KR KR1019980039145A patent/KR19990030004A/ko not_active Application Discontinuation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009041577A1 (ja) * | 2007-09-27 | 2009-04-02 | Niigata University | 尿中タンパク質定量用の尿前処理剤、尿前処理方法、及び尿中タンパク質定量方法。 |
| US8105840B2 (en) | 2007-09-27 | 2012-01-31 | Niigata University | Urine pretreatment agent for urinary protein quantitation, urine pretreatment method, and urinary protein quantitation method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| US5908787A (en) | 1999-06-01 |
| AU8613298A (en) | 1999-04-15 |
| TW451062B (en) | 2001-08-21 |
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| CA2242197C (en) | 2005-12-20 |
| KR19990030004A (ko) | 1999-04-26 |
| AU731530B2 (en) | 2001-03-29 |
| CA2242197A1 (en) | 1999-03-23 |
| EP0907081A1 (en) | 1999-04-07 |
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| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050916 |
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| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20051221 |