TW451062B - Total protein detection method - Google Patents

Description

A7 B7 481062 五、發明説明（1 ) 發明背景 用來__尿蛋白的方法通常對於白蛋白的靈敏度高於斜 其他尿蛋白。然而，偵測非白蛋白之蛋白質，尤其戽針斜 本斯凌斯蛋白尿（Bence-Jones proteinuria)病例中很重要。蛋 白質的偵測應涵蓋廣泛蛋白質濃度，因爲臨床醫師會根據 病患尿液中檢測出來的蛋白質濃度，來決定等級並採取建 議動作。例如，蛋白尿持續高於5〇毫克/分井代表腎臟病的 強力證據，而蛋自質含量超過300毫克/分升則與腎病症狀 的診斷相符。尿液中蛋白質濃度高於800毫克/分升表示有 大量的蛋白質流失，證明要腎臟活體组織檢査及/或類固醇 治療。因此，頬然尿液中蛋白質的測試應對廣泛蛋白質含 量均具有效力。 文獻中已記錄鏍定水溶液中蛋白質的多種方法〇這些方 法包括克氏（Kjeldahl).,法、雙縮尿、羅氏（Lowery)法、染劑 結合法、紫外線法以及螢光測定法❶通常蛋白質會與多種 不同物質反應*特別是和染劑（如漠餘藍、枯摩（coomassie) 亮Μ和四漢勞光劑（eosine»及金屬離子（如銀（I)、铜（Π)、鋅 (II)和鉛（11)>。典型地，將蛋白質加入染劑和金屬離子的反 應後，導致在染劑-金屬離子溶劑中光譜的變化。富士塔等 人（Fujita et al.)在 Bunseki Kagaku VoI_32，Ρρ· E379-E386 中揭 示將蛋白質加入近苯三敵紅（pyroga!lol red)和麵（VI))反應 後，產生了不同於近苯三酚紅-鉬（VI)複合物溶液的光譜。 曰本公開專利號SHO 62 [1987]·6170揭示一種鑑定蛋白質的 測式條，包含有鉬酸蓽以及可與鉬酸鹽形成複合物之色 -4- 本紙張尺度適州中國國家標埤（（'NS ) Λ4現輅（210><297公鏟） {請先閎讀背面之注f項再填寫本頁) 訂 A 5 ' 〇 6 2 Α7 Β7 五、發明説明（2 ) 素，而且在蛋白質及與鉬酸鹽離子接合的螯合劑存在下， 複合物岭吸收帶會移動。曰本公開專利61-155757揭示類似 的痕量蛋白質分析法，其中描迷使用舆鉬結合的螯合劑， 或與乙二酸、檸檬酸、磷酸或其一般存在於尿液中測試檢 體的盪類相結合之金屬離子。此分析法爲使用近苯三酚紅 和銨的複合物之染劑結合法。在低pH下，染劑-金屬複合 物呈紅色。而在較高pH與去蛋白質化時，顏色會變成藍 色。藉由正償胺棊酸基朗與穩定負價去蛋白質染劑-鉬酸鹽 複合物之交互作用，蛋白質很容易引發染劑的去蛋白質作 用（在低pH下）》 最近發現在蛋白質和染劑存在下，鎢酸鹽的行爲和鉬酸 里相似。本發明關於總蛋白質偵測法中的有用鉬酸躉和鎢 酸藍包括鈉、卹、鋰和銨鹽，或是帶有烷基、二烷基、三 烷基或四烷基銨離子的鎢酸S/鉬酸鹽，或是帶有相似陽離 子的 _ 鎮竇（phosphotungstate)。 美國專利第5,399,498號揭示使用含某種離子化磷酸鹽之 化合物中以降低蛋白寶分析中背景反應，該分析法使用鉬 酸鹽或鎢酸鹽及與彼等產生複合物的染谢，其吸收帶在蛋 白質存在下會改變。然而，該文獻並未證明該方法可以在 超過蛋白質濃度的總範圍下作用0美國專利第5,374,561號 揭示經亞硝基取代聚由化酚磺酜可以用來偵測白蛋白，但 並未證明這類染劑可用於和近笨三酚染劑合併使用。美國 專利第5,279,790號揭示一種分析法，使經硝基鹵化酚磺酜 可以和部花青（merocyanine)染劑給合，以備測白蛋白。 -5 _ 尺度ϊϋϋ家^T( (，NS ) Λ4^"( 2!0x297公釐) (請先閲讀背面之注f項再填寫本頁) I訂 A7 B7 Λ51〇6 2 五、發明説明（3 ) 故以鉬酸歲或鎢酸鹽與近苯三酚紅之交互作用之癸白質 分析法，可在廣泛蛋白質濃度的反應，係所欲的且爲本發 ί 明之標的。 發明摘要 本發明係爲一種改良鑑定水性受試溶液中總蛋白質之分 析法，該分析法涉及將受試液與鉬酸鹽或鎢酸躉以及近笨 三酚紅染劑的結合，其中近苯三酚紅染劑在低pH下，即約 1.〇到3.〇，會和鉬酸鹽或鎢酸a形成複合物》在此分析法 中，複合物的吸收帶在有蛋白質的存在下會被改變，而此 反應可用反射比儀器測得。本發明涉及此種分析法的改 良，其包括引入一經取代酚磺酜染劑，該染劑的pKa在pH約 1.0到3.0時可發揮作用，且其訝蛋白質的親和力使得該染劑 僅在水性偵測檢礅中胥白質含量大於50毫克/分升時才會提 供可偵測的反應。 發明就明 本發明之蛋白質分枰法可以溼式或乾式的形式進行p最 方便的方式是呈吸收測試條之形式，該測試條充滿緩衝溶 液、作爲第一指示物的近苯三酚紅和鉬酸躉或鎢酸薄，以 及作爲第二指示物的酚磺酜染劑。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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本紙张尺度诮川中®國家標卑（（’NS ) Λ4現格（210X297公釐） A7 B7 451〇62 五、發明説明（4 ) H0

B 結構A表示酚磺蚨衍生物在質子溶劑中（如水或酒精）的 一般結構，而結構B則表示在乾燥狀態或無質子溶劑中（如 醚和乙鯖）的主要形式〇酚磺蚨的錯誤指示物爲pH指示 物，包含離子化質子，其pKa值使得質子可以在蛋白質的存 在下被取代β紛續缺指示物的pKa値，是在該pH之下指示 物分子數量的一半，其中包含去質子C環酚羥基。在上迷 的紛續歧蛋白質錯誤指示物中，經由二個去質子過程而導 致顏色的變化。第一去質子化是從A環上的芳基磺酸中把 質子移除，產生如下式C所示的離子： (請先閲讀背面之注項再填寫本頁>

Ο C 由於該質子的PKa値小於卜導致在所有使用PH值中此部 7 A7 B7 451062 五、發明説明（5 ) 份的離子化β離子化基亦負贵這些化合物之水性溶解度。 第立去$子化涉及從C環酚羥基釋出質手，而產生二陰離 子。用此型蛋白質錯誤指示物，第二去離子化作用會產生 可察覺的顏色變化，以表示受測檢體中有蛋白寶存在。紛 磺缺蛋白質錯誤指示物典型應用在吸收劑間質物質舆可維 持環境pH値怪定的緩衝溶液，使人們相信的顏色變化，是 因爲蛋白質存在所導致，而葬與受測溶液接觸後造成pH改 變的結果。只有那些紛確缺蛋白質錯誤指示物其第二pKa值 在pH介於約1.0到3，0間使第二去質子化作用發生，才可用於 本發明，因爲在這稜強酸的pH下，近苯三紛紅/鉬酸麋或越 酸鹽會和蛋白質產生反應。 許多酚磺酜蛋白質錯誤指示物;ip有呈連當範面内的第二 pKa ’故適用於本發明。可用的鼢磺呋包括用拉電子基和給 電子基取代者，如在A、B或C環上的胺基、芳基、烷基、 羥基、羧基、烷氧基、〇磕基、由素、硝基或花音基。只 要所得染劑呈現速當的範園之PKa，染劑分子上啲特殊取代 基及其位置並不重要〇未經取代酚磺映不遴用，因爲它們 的pKa値不在逋當範固内a已發現八重取代的酚磺酜指示 物，即在3，、3”、5'、5”、3、4、5和6位置被取代的酚 * 磺酜衍生物，特別適用於本發明。這些指示物最好是被鹵 素和硝基取代且以下式代表：

本紙張尺度適/fl中國國家標嗥（（'NS } Λ4规格（2丨0X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

*1T 軤逆部屮决#-1-灼一3!:--1.消於^作沿印免 4 51 0 6 2 A7 ______B7 五、發明説明（β ) 其中：X係確基而爲氣、溪或碘。亦可使用美國專利 第5,279,790號所揭示經硝基取代聚由化酚磺蚨，其中γ*ζ 爲硝基。據説這些指示物能偵測溶液受試檢體中約2到5〇〇 毫克/分升的蛋白質。然而，使用本發明的分析系統，在可 以測出大於30毫克/分升的蛋白尿，但測不出2毫克/分升微 白蛋情況下爲理想的。例如，於被診斷出患有腎病的幼童 之情況中’不欲測量微白蛋白’原因係此反應可因其多變 性質而引起該病之僞指示。證明用於本發明中酚磺缺指示 物之芳環，可帶有多種取代基而不致脱離本發明的範_。 此種取代基只被熟習該項技藝人士限制於製備穩定的化合 物，使具有適當的蛋白質錯誤指示物特性，以讓彼等遑用 本發明中。 酚磺酜蛋白質錡誤指示物和分析蛋白質的鉬酸蠆或鎮酸 鹽侦測同時使用，其中溶液受試檢體和鉬酸瘺或鎢酸顰及 染劑結合並形成複合物，並在蛋白質存在下改變吸收帶 的。如美闺專利第5,399,498號揭示，鎮酸鹽和麵酸里與指 示物反應產生複合物，並在相似於鉬酸蜃條件下及蛋白質 的存在下改變顏色。該專利亦揭示使用肌醇六磷酸或其衍 生物來降低此分析法所產生的背景干擾反應。雖然該分析 法對於偵測溶液受試檢體（如尿液）中低合音的蛋白質有相 當好的效果，但很明顧地在高濃度蛋白質，特別是當蛋白 質濃度高於150毫克/分升時，分析度會減少。此方法爲一 種總蛋白質分析法，原因在於該反應並非依賴受試檢體中 的蛋白質種類因此15毫克/分升的人類血清白蛋白（HSA) _ _-9- 本纸張尺庶洎用中國國家榡埤（（’NS ) Λ4規格（210Χ297公楚） (讀先W讀背面之注f項再填寫本頁) :於' 卜訂 451062 μ _B7_ 五、發明説明（7 ) 和15毫克/分升的IgG有相同的反應。因爲總蛋白質分析用 於偵測爷種疾病狀態，且在溢至尿液中的總蛋白質量愈高 則潛在問題愈嚴重情形下，期望能提供一種在高蛋白質濃 度下提供一可偵測反應之總蛋白質分析法〇然而，因爲染 劑對蛋白質有強烈的親和力，故钼酸鹽/鎢酸癱分析法無法 有效债測高濃度的蛋白質，即高於1$0毫克/分升本案祭 現，加入作爲第二染射的酚磺蚨可有效增加分析範囲，使 彼在較高蛋白質濃度下可提供比單獨使用鉬酸鹽/鎢酸鹽分 析法更高的可視分析度。如同表1所列數據，其他種類的 蛋白質錯誤指示物不能提供加栽分析皮。咸信由於那些染 劑無法和由紅色到紫色的近苯三酚紅相容的緣故。另外， 只有酚磺酜其第二pKa値介於鉬酸蜃/鎢酸鹽分析之pH範® 内的酚磺蚨，才適合作爲第二指示物。適當酚磺酜的其他 要求爲對蛋白質的親和力必需只能在染劑暴露在大於5〇毫 克/分升蛋白質濃度時，才會產生可測得的反應結果。這是 因爲具有高親和力的染劑會在近苯三紐紅之前就先和蛋白 質結合。 以下列實例進一步説明實施本發明之方法： 實例I : 用於本實驗中蛋白質試劑係以飽和jX. Binzer T467濾紙 和水/甲醇混合物共同備製，其中該混合包括有缓衝溶液 (丁二酸（succinic acid))、近苯三紛紅、鉬酸鈉和肌酵六轉 酸。如表1所示，加入第二指示物。混合物的1)11値用氩氧 化納和/或鹽酸調整到15。混合物中可以包含任何教量的 ______________ ________ _ 10 - 本紙掁尺度1S則，關丨:料（（'NS )八4娜（2IOX297公着) I t ^^1 n^. ^^1 —a - —5 - -1\ {請先《讀背面之注^K項再填寫本真) I訂 451 0 6 2 a? B7 五、發明説明（β ) 表命活性劑、清潔劑、背景染劑、增钱聚合物或螯合制， 彼等係_藝中已知，以染劑結合，合併用於蛋白質憤測 法。飽和後，將濾紙剪成條狀並在不同蛋白質濃度下測試 蛋白質反應。 在有無數種類型第二染劑存在下，測量近苯三酚紅法對 於尿液中人類i清白蛋白（HSA)在濃度0，15，50，150和450 毫克/分升的反應。該反應係用視度計目視測量且比較標準 溶液中發展類色而完成** 目視評定用個染劑的组合（及在沒有第二染刻下的對照组) 結果，沒有分析度的〇到絕佳分析度的3。實驗結果如表1 所列。 C請先聞讀背而之注^^項再镇寫本頁) J. —訂 本紙張尺度k +關家標率{ TNS ) ( 210X297^# ) 451062 五、發明説明（δ ) 表1 第二染劑的比較 以目視解析度來表示不同濃度蛋白質的 試劑反應(毫克/分升） Ka 第二染谢 0-15 15-50 5Q-15〇 150-450 pKa (xlO'5) 0 無第二染劑 2 2 1 0 1 溴酚蓝 2 2 1 0 3.7 〜5 2 四溴紛藍 2 2 1 0 3.5 〜5 3 溴氣粉n 2 2 1 0 3.8 ~5 4 四碘紛續缺 2 2 1 0 4.0 〜5 5 5·，5"-二硝基二碘- 6-四溴酚續故 3 2 1 0 1.5 '65 6 5·，5”-二硝基 溴紛械 3 3 2 0 1.6 '5 7 51-硝基-5h-碘-3’，3”，3,4,5,6-ό溴酴舰 3 2 3 2 1.6 '5 S 0 部花青染刑 =無分析度 2 1 2 = 0 好分析度 0 1.5 1 請 先 閎 讀 背 δ 之 注 意 事 項 再 貪 1=輕微分析度 3 =絕隹分析度 在糖尿病患者的尿液中所發現數量最多的蛋白質是白蛋 白。因此，蛋白尿測試的模式系統爲白蛋白。 從表1中可以決定，最佳的分析度是來自於染劑6和7。 第二染劑1-4因爲有太高的pKa，亦即在1到3的範圍外，故 在150_45〇毫克./分升蛋白質時沒有分析度 由此可知，第 二酚磺蚨染劑對蛋白質必需具有較低的親和力，而且只能 在濃度大於50毫克/分升時才可被測試出來，例如第二染劑 6和t。第二酚磺蚨染劑不會阻礙近苯三酚紅/鎢酸鹽染劑 __ ___-12- >本紙张尺度州中國國家標,（) Λ4規格（210X297公釐） ~ ----- Α7 ________Β7 五、發明説明（1〇 ) 和蛋白質的結合’如此使二者都可在大範園蛋白質濃度卞 反應而今到獨特的結果。第二染劑5即使pKa鈕爲1.5，但在 蛋白質介於150及450毫克/分井時仍無法提供分析度，這是 因爲該染劑在範固0· 50毫克/分升時有太高的蛋白質親和 力。另一方面，插有非常低親和力（只能在大於150毫克/分 升時偵測蛋白質）的第二染劑8也無分析度〇在這個案例 中，對蛋白質有高親和力的近苯三酚紅染劑，早左第二染 劑8之前已和蛋白質結合。 本發明中偵測系統的基本组成物爲近苯三酚紅、鉬酸鹽 或鎢酸璺、緣衝溶液以及作爲第二指示物的酚磺酜染劑。 傳統上這些成分都以表2所列的滾度，溶解於親質子性溶 劑如水/甲缚混合物中。一般來説，溶液中會包含螯合劑如 肌醇六磷酸和/或乙二酸，以避免來自於待測尿液檢禮中其 他物質的干擾。 將溱液羼用在吸收劑間質（如濾紙）上並乾燥，而產生一 測試條片，將比單獨使用任何染劑更適用於測量較廣範团 的待測溶液蛋白質濃度。 (錆先鬩讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣 訂. 赶：¾.部中少枵卑^KJ-消於合竹ii印；* -13 ^ 本紙張尺度適ζίΠϊ國家標今(CNS > Λ4規格（2丨0X297公釐) -14- 451062 ab 五、發明説明（11 ) 表2 分析混合组合物 成分 功能 ， 使用濃度 容許範困 水 落劑 95 mL -- 甲醇 溶劑 5 mL 0-40 mL 丁二酸 緩衝溶液 5.9 g (500 mM) 50-1000 mM 肌醇六磷酸 螯合物 1 g (15 mM) 0-500 mM 近苯三酚紅 指示物 28.0 mg (0.7 mM) 0.03-10 mM 鉬酸鹽 指示物 24.3 mg (1 mM) 0.05-10 mM 見表1 第二指示物 0.3 mM 0.02-20 mM 乙二酸 螯合物 0.11 g (12 mM) 0-40 mM pH -- 1.5 1.0-3.0 丁二酸是很多可用来控制pH的緩衝溶液之一。其他適當 的緩衝溶液包括有磷酸鹽、乙二酸、肌醇六磷酸、磷酸 (phosphoric acid)、檸檬酸、三氣乙酸、苯甲酸、碟酸氫鈉 (sodium bisulfate)、水揚酸、鹽酸、順丁稀二酸、糖膠· (glycine)、苯二甲酸（phthalic acid)、氨基乙酸（glycylglycine) 及反丁烯二酸。 本紙張尺度通用中國囷家標瑋（（’NS ) Λ4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

Claims (1)

1. 451062 第8711〇〇〇5號專利申請案 益 申請專利範園修正本(卯年6月） gj

   (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1. 一種鑑定含蛋白質之水性受試液體中總蛋白質之分析 法’其結合含鉬酸鹽或鎢酸鹽之受試液及可與鉬酸鹽或 鎢酸鹽離子在pH介於1.0到3.0形成複合物之近苯三酚 紅’以在蛋白質存在下改變複合物之吸收帶，本方法之 改良點包括引入一經取代酚磺酜染劑，該染劑具有pKa 使該染劑能於pH約1.0到3.0間運作，且其對蛋白質的親 和力使得該染劑僅於大於50毫克/分升蛋白質存在時才 會提供可偵測的反應；其中酚磺酜染劑係以胺基、芳 基、烷基、羥基、羧基、蜣氧基、乙醯基、花青基 (cyanine)、鹵素、硝基或這些基之組合八重取代》 訂 2. 根據申請專利範圍第丨項之方法，其中酚磺酜染劑在5 _ 與5”位置被硝基取代，以及在3· ' 3”、3、4、5和6位 置被氣、溴或碘取代。 3. 根據申請專利範圍第丨項之方法，其中酚磺酜染劑為 5 ，5 ” -二硝基-3 ', 3 "，3，4，5，6 -六溴酚磺酜或5，-硝基-5"-碘_3'，3”，3,4,5,6-六溴酚磺酜。 4，根據申請專利範困第1項之方法，其中緩衝溶液、近苯 三酚紅、鉬酸鹽或鎢酸里、緩衝溶液和酚磺酜被吸入吸 收物質之測試條。 經濟部中央#窣局貝工消费合作社印*. 5. 根據申請專利範圍第丨項之方法，其中該溶液含有肌醇 六磷酸以及適量的緩衝溶液’以維持再水合基質的pH值 於所欲範圍内。 6. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該溶液含有〇 〇3_ 10 mM的.近苯三盼紅、0.05-10 mM的i目酸里及0.02-20 本紙張尺度遑用中國國家#準（CNS > A財t格（210XM7公釐） A8 B8 C8 08 451 0 6 2 六、申請專利範圍 mM的盼續S夫染劑。 7. —種用來鑑定含蛋白質之液體受試檢體中蛋白質含量的 乾式裝置，包含一已吸收近苯三酚紅的吸收物質，該近 苯三酚紅可在pH介於約1.0到3.0時，和鉬酸鹽或鎢酸逢 生成一複合物、一可溶解的鉬酸鹽或鎢酸里、一經取代 之酚磺酜染劑，其pKa讓該染劑在pH從約1.0到3.0時可運 作|且其對蛋白質的親和力使得該染劑僅在大於50毫克 /分升蛋白質時才會提供可測得的反應，及一緩衝系 統，其可使此裝置和溶液受試檢體接觸後保持裝置pH介 於約1.0到3.0間：其中酚磺酜染劑係以胺基、芳基、烷 基 '經基、幾基、燒氧基、乙链基、花音基（cyanine)、 鹵素、硝基或這些基之組合八重取代。 (請先《讀背面之注$項再壤寫本I)

   經濟部t央橾率局員工消费合作社印製 本紙張尺度逋用中國國家梯率（CNS ) A4it格（210X297公釐） 451062 第8711〇〇〇5號專利申請案 益 申請專利範園修正本(卯年6月） gj

   (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1. 一種鑑定含蛋白質之水性受試液體中總蛋白質之分析 法’其結合含鉬酸鹽或鎢酸鹽之受試液及可與鉬酸鹽或 鎢酸鹽離子在pH介於1.0到3.0形成複合物之近苯三酚 紅’以在蛋白質存在下改變複合物之吸收帶，本方法之 改良點包括引入一經取代酚磺酜染劑，該染劑具有pKa 使該染劑能於pH約1.0到3.0間運作，且其對蛋白質的親 和力使得該染劑僅於大於50毫克/分升蛋白質存在時才 會提供可偵測的反應；其中酚磺酜染劑係以胺基、芳 基、烷基、羥基、羧基、蜣氧基、乙醯基、花青基 (cyanine)、鹵素、硝基或這些基之組合八重取代》 訂 2. 根據申請專利範圍第丨項之方法，其中酚磺酜染劑在5 _ 與5”位置被硝基取代，以及在3· ' 3”、3、4、5和6位 置被氣、溴或碘取代。 3. 根據申請專利範圍第丨項之方法，其中酚磺酜染劑為 5 ，5 ” -二硝基-3 ', 3 "，3，4，5，6 -六溴酚磺酜或5，-硝基-5"-碘_3'，3”，3,4,5,6-六溴酚磺酜。 4，根據申請專利範困第1項之方法，其中緩衝溶液、近苯 三酚紅、鉬酸鹽或鎢酸里、緩衝溶液和酚磺酜被吸入吸 收物質之測試條。 經濟部中央#窣局貝工消费合作社印*. 5. 根據申請專利範圍第丨項之方法，其中該溶液含有肌醇 六磷酸以及適量的緩衝溶液’以維持再水合基質的pH值 於所欲範圍内。 6. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該溶液含有〇 〇3_ 10 mM的.近苯三盼紅、0.05-10 mM的i目酸里及0.02-20 本紙張尺度遑用中國國家#準（CNS > A財t格（210XM7公釐）