JP2009186479A - ピロカテコールバイオレット−金属タンパク質分析 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ピロカテコールバイオレット-金属錯体を利用してタンパク質定量を行うための方法、タンパク質定量分析において使用される組成物およびキット。
【選択図】図1
Description
940mlの超純水に、5.9gのコハク酸、0.14gのシュウ酸ナトリウムおよび0.5gの安息香酸ナトリウムを溶解した。ピロカテコールバイオレット溶液(40mlのメタノールに100mg溶解)を添加し、次いで16mlのモリブデン酸ナトリウム溶液(50mlの超純水に120mg溶解)を添加した。50%v/vHCl溶液を用いてpHを2.5に調節し、次いで2gのポリビニルアルコール(30〜70kD)および1gのポリビニルピロリドン(55kD)を添加した。溶液を、約20℃〜約25℃、例えば室温で一晩攪拌した。
50mMコハク酸
1.0mMシュウ酸ナトリウム
3.5mM安息香酸ナトリウム
0.26mMピロカテコールバイオレット
0.16mMモリブデン酸ナトリウム
4%(w/v)メタノール
0.2%(w/v)ポリビニルアルコール
0.1%(w/v)ポリビニルピロリドン
吸収スペクトルを、340nm-800nmのVarian Cary分光光度計で記録し、結果のスペクトルを図2に示す。ウシ血清アルブミン(BSA)の濃度は、PCV+モリブデン酸塩(Mo(IV))+BSAでは100μgであり、PCV+モリブデン酸塩(Mo(IV))+2×BSAでは200μgであった。図2に示す結果は、660nmがタンパク質濃度を測定するのに適切な波長であることを示した。
生理食塩水に各BSA標準複製(25、50、125、250、500、750、1,000、1,500および2,000μg/ml)を0.1ml含有する各試験管に、1.5mlの分析用試薬溶液を添加し、よく混合し、約20℃〜約25℃、例えば室温で5分間インキュベートした。全ての試料および対照の吸光度を測定した。ブランク複製(対照)についての660nmでの平均吸光度を、他の全ての個々の標準複製についての660nmでの吸光度から減算した。図3に示す標準曲線は、各標準物に関する平均ブランク補正660nm測定値をその濃度(単位:μg/ml)に対してプロットすることによって生成した。結果は、BSAについての分析の直線検出範囲が25μg/ml〜2,000μg/mlであることを示していた。図4は、ウシガンマグロブリン(BGG)を用いた同手順を示しており、結果として、BGGについての分析の直線検出範囲は50μg/ml〜2,000μg/mlであった。
生理食塩水中に各BSA標準複製(25、50、125、250、500、750、1,000、1,500および2,000μg/ml)を0.01ml含有する各ウェルに、0.15mlの分析用試薬溶液を添加した。プレートを封止テープで覆い、プレートシェーカー上で1分間混合し、約20℃〜約25℃、例えば室温で5分間インキュベートした。プレートリーダーを660nmに設定し、対照をブランクとして使用し、全ての試料の吸光度を測定した。図5に示す標準曲線は、各標準物に関する平均ブランク補正660nm測定値をその濃度(単位:μg/ml)に対してプロットすることによって生成した。結果は、BSAについての分析の直線検出範囲が50μg/ml〜2,000μg/mlであることを示していた。図6は、ウシガンマグロブリン(BGG)を用いた同手順を示しており、結果として、BGGについての分析の直線検出範囲は50μg/ml〜2,000μg/mlであった。
大部分のイオン性および非イオン性洗剤、還元剤、バッファー、塩、有機溶媒などのいくつかの物質は、クマシー系ブラッドフォードタンパク質分析を妨害することが知られている。物質は、試料中の該物質の存在により生じる1mg/mlのBSAのタンパク質濃度予測の誤差が10%未満または10%に等しければタンパク質定量分析に適合していると考えられる。1mg/mlのBSA標準物+物質についての、ブランク補正した660nmでの吸光度測定値を、水中で調製した1mg/mlのBSA標準物の正味の660nm吸光度と比較した。多くの物質についての最大適合濃度を表1に示す。
表1に示すように、SDSは、最大0.0125%の濃度では、PVM法に適合性であった。分析用試薬組成物に50mMのα-シクロデキストリンを添加すると、SDSの適合濃度が最大約5%に増大した。また、α-シクロデキストリンの添加により、該分析が、トリス-グリシンSDS試料バッファー(63mM Tris-HCl、10%グリセロール、2%SDS、0.0025%ブロモフェノールブルー)と適合性になった。
他の一般に使用される全タンパク質分析法は、タンパク質に対してある程度異なる応答を示す。これらの差異は、アミノ酸配列、等電点、構造、およびタンパク質の色応答を改変し得るいくつかの側鎖または補欠分子族の存在に関連する。多くのタンパク質分析法は、試料中のタンパク質濃度を決定する標準物としてBSAまたはBGGを使用する。表2は、典型的なPVMタンパク質分析のタンパク質間変動を示す。分析された全てのタンパク質を、試験管プロトコルを用いて、125μg/ml〜2,000μg/mlの一連の標準濃度で調製した。1mg/mlのBSAに関する平均応答を1に正規化し、1mg/mlの他のタンパク質に対する平均応答を、BSAによる応答との比として表した。表2に示すように、分析のタンパク質間変動性は中程度であり、許容可能であった。
PVM法を、試験管プロトコル用の上述のような標準物としてBSAを使用して行った。使用したブラッドフォードタンパク質法は、QUICK START(登録商標)(Bio-Rad、Hercules、CA)であり、製造業者の説明書に従って行われた。図7に示すように、PVM法は、クマシー系ブラッドフォード法と比べ、25μg/ml〜2,000μg/mlのBSAの作用範囲においてより直線的であった。
生理食塩水中BSAの各標準複製(0、125、250、500、750、1,000、1,500および2,000μg/ml)を0.01ml含有する各ウェル(96ウェルプレート)に、0.15mlの分析用試薬溶液を添加した。プレートを封止テープで覆い、プレートシェーカー上で1分間混合し、約20℃〜約25℃、例えば室温で5分間インキュベートした。660nmでのブランク測定値は、試料台上に2μlの対照を装填することによって得られた。その後、全ての試料の吸光度を660nmで測定した。図8に示すような標準曲線は、各標準物に関する平均ブランク補正660nm測定値をその濃度(単位:μg/ml)に対してプロットすることによって生成した。
Claims (24)
- 約0.1mM〜約0.5mMの濃度のピロカテコールバイオレットと、
約0.05mM〜約0.4mMの濃度の金属と、
約0.05%w/v〜約0.4%w/vの濃度のポリビニルアルコールと、
場合により、約0%v/v〜約10%v/vの濃度のメタノールと、
約0.05%w/v〜約0.2%w/vの濃度のポリビニルピロリドンと、
約25mM〜約200mMの濃度のバッファーと、
約0.05mM〜約2mMの濃度のキレーター、または
約1mM〜約6mMの濃度の安息香酸ナトリウム
の少なくとも1つと
を含み、
pHが約pH 1〜約pH 4である、タンパク質分析用試薬組成物。 - 前記金属が、モリブデン酸塩(molybdate)、タングステン、ビスマス、トリウム、ウラニウム、バナジウム、銅およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記金属が、ナトリウム、カリウム、リチウムまたはアンモニウム塩として存在する、請求項1に記載の組成物。
- 前記バッファーが、モノもしくはジ脂肪族もしくは芳香族カルボン酸または無機酸である、請求項1に記載の組成物。
- 前記キレーターが、シュウ酸ナトリウム、フィチン酸、シュウ酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 約25mM〜約100mMの濃度のα-シクロデキストリンを更に含む、請求項1に記載の組成物。
- 0.26mMの濃度のピロカテコールバイオレットと、
0.16mMの濃度のモリブデン酸ナトリウムと、
約0.2%w/vの濃度のポリビニルアルコールと、
約4%の濃度のメタノールと、
約50mMの濃度のコハク酸と、
約1.0mMの濃度のシュウ酸ナトリウムと、
3.5mMの濃度の安息香酸ナトリウムと、
約0.1%w/vの濃度のポリビニルピロリドンと
を含み、
pHが約pH 2.5である、タンパク質分析用試薬組成物。 - 約50mMの濃度のα-シクロデキストリンを更に含む、請求項7に記載の組成物。
- 試料中のタンパク質濃度を測定するための方法であって、
(a)前記試料を、
約0.1mM〜約0.5mMの濃度のピロカテコールバイオレットと、
約0.05mM〜約0.4mMの濃度の金属と、
約0.05%w/v〜約0.4%w/vの濃度のポリビニルアルコールと、
場合により、約0%v/v〜約10%v/vの濃度のメタノールと、
約0.05%w/v〜約0.2%w/vの濃度のポリビニルピロリドンと、
約25mM〜約200mMの濃度のバッファーと、
約0.05mM〜約2mMの濃度のキレーター、または
約1mM〜約6mMの濃度の安息香酸ナトリウム
の少なくとも1つと
を含み、
pHが約pH 1〜約pH 4である、タンパク質分析用試薬組成物と混合する工程であって、前記試料を前記タンパク質分析用試薬組成物と組み合わせることにより、タンパク質定量混合物が得られる工程と、
(b)前記タンパク質定量混合物を、着色錯体を形成するのに十分な時間インキュベートする工程と、
(c)前記着色錯体の吸光度を測定する工程と、
(d)前記測定された吸光度と、既知の濃度のタンパク質を含有する少なくとも1つの試料から得られた吸光度とを比較することによって、前記試料中のタンパク質濃度を測定する工程と
を含む、方法。 - 前記金属が、モリブデン酸塩、タングステン、ビスマス、トリウム、ウラニウム、バナジウム、銅およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記金属が、ナトリウム、カリウム、リチウムまたはアンモニウム塩として存在する、請求項9に記載の方法。
- 前記バッファーが、モノもしくはジ脂肪族もしくは芳香族カルボン酸または無機酸である、請求項9に記載の方法。
- 前記キレーターが、シュウ酸ナトリウム、フィチン酸、シュウ酸およびエチレンジアミン四酢酸(EDTA)からなる群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記タンパク質分析用試薬組成物が、約25mM〜約100mMの濃度のα-シクロデキストリンを更に含む、請求項9に記載の方法。
- (a)、(b)または(c)の少なくとも1つが、試験管内またはマルチウェルプレートのウェル内で行われる、請求項9に記載の方法。
- タンパク質定量分析の、少なくとも1つの阻害物質を含有する試料との適合性を向上させる方法であって、
(a)前記試料を、
約0.1mM〜約0.5mMの濃度のピロカテコールバイオレットと、
約0.05mM〜約0.4mMの濃度の金属と、
約0.05%w/v〜約0.4%w/vの濃度のポリビニルアルコールと、
場合により、約0%v/v〜約10%v/vの濃度のメタノールと、
約0.05%w/v〜約2%w/vの濃度のポリビニルピロリドンと、
約25mM〜約200mMの濃度のバッファーと、
約0.05mM〜約2mMの濃度のキレーター、または
約1mM〜約6mMの濃度の安息香酸ナトリウム
の少なくとも1つと、
を含み、
pHが約pH 1〜約pH 4である、タンパク質分析用試薬組成物と混合する工程であって、前記試料を前記タンパク質分析用試薬組成物と組み合わせることにより、タンパク質定量混合物が得られる工程と、
(b)前記タンパク質定量混合物を、着色錯体を形成するのに十分な時間インキュベートする工程と、
(c)前記着色錯体の吸光度を測定する工程と、
(d)前記測定された吸光度と、既知の濃度のタンパク質を含有する少なくとも1つの試料から得られた吸光度とを比較することによって、前記試料中のタンパク質濃度を測定する工程とを含み、
前記阻害物質が、洗剤、還元剤、キレート剤、バッファー、試薬、溶媒およびこれらの組み合わせからなる群から選択され、前記タンパク質定量分析の、少なくとも1つの阻害物質を含有する試料との適合性を向上させる、方法。 - 前記金属が、モリブデン酸塩、タングステン、ビスマス、トリウム、ウラニウム、バナジウム、銅およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記金属が、ナトリウム、カリウム、リチウムまたはアンモニウム塩として存在する、請求項16に記載の方法。
- ピロカテコールバイオレット、金属、ポリビニルアルコール、場合によりメタノール、ポリビニルピロリドン、バッファー、および、キレーターまたは安息香酸ナトリウムの少なくとも1つを含むタンパク質分析用試薬組成物と、
前記キット構成要素を用いてタンパク質濃度を測定するための説明書と
を具備する、タンパク質濃度を測定するためのキット。 - 前記金属が、モリブデン酸塩、タングステン、ビスマス、トリウム、ウラニウム、バナジウム、銅およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項19に記載のキット。
- 前記金属が、ナトリウム、カリウム、リチウムまたはアンモニウム塩として存在する、請求項19に記載のキット。
- 前記バッファーが、モノもしくはジ脂肪族もしくは芳香族カルボン酸または無機酸である、請求項19に記載のキット。
- 前記キレーターが、シュウ酸ナトリウム、フィチン酸、シュウ酸およびエチレンジアミン四酢酸(EDTA)からなる群から選択される、請求項19に記載のキット。
- 前記タンパク質分析用試薬組成物の成分として、または別個に、α-シクロデキストリンを更に含む、請求項19に記載のキット。
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