CN102604425B - 考马斯亮蓝染色液及其染色方法和在蛋白检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蛋白质染色领域，具体涉及一种考马斯亮蓝染色液及其染色方法和在蛋白检测中的应用。所述考马斯亮蓝染色液是包含10％～20％(v/v)的醇，4.5％～10％(v/v)的酸，5％～10％(w/v)的硫酸铵，0.01％～0.1％(w/v)的考马斯亮蓝的水溶液。所述方法包括以下步骤：A.染色：将SDS-PAGE胶置于考马斯亮蓝染色液中，染色45min以上；B.脱色：用水冲洗染色后的SDS-PAGE胶，将染色液冲洗干净即可。本发明的考马斯亮蓝染色液和染色方法能够在保证灵敏度不降低的情况下，以更低的成本实现对SDS-PAGE胶的染色，且脱色后的胶不易破碎，不会给后续的质谱等研究工作造成困难。

Description

考马斯亮蓝染色液及其染色方法和在蛋白检测中的应用

技术领域

本发明涉及蛋白质染色领域，更具体地说，涉及考马斯亮蓝染色液及其染色方法和在蛋白检测中的应用。

背景技术

目前，在蛋白质组学研究中的蛋白质染色方法大致有以下四种，考马斯亮蓝染色法、荧光染色法、硝酸银染色法、同位素显色法等。其中，荧光染色以SYPR0试剂为主，蛋白质检测灵敏度高，能兼容质谱，但由于需要配备特殊的检测仪器及昂贵的试剂，未被作为常规方法使用；同位素显色法则存在安全性和操作局限性等问题，也未能被广泛使用；硝酸银染色法是目前公认的除放射性标记以外的一种最为灵敏的蛋白检测方法，可在纳克级水平上检测SDS-PAGE胶上的蛋白质，但是，其步骤繁琐，成本高，对环境的污染严重；更为严重的是，其在脱色过程中所使用的戊二醛等醛类物质会对蛋白质进行不可逆的修饰，严重干扰后期的质谱鉴定工作。因此，在蛋白质组学研究中，更倾向于采用经典的考马斯亮蓝染色法。

经典的考马斯亮蓝染色法具有良好的重复性、极低的染色背景、较高的灵敏度(大约0.5μg/mm²)以及优良的质谱兼容性。特别是经过Neuhoff等人(Neuhoff，V.，Arold，N.，Taube，D.，Ehrhardt W.，Electrophoresis 1988，9，255)的开创性工作之后，发明了改良型考马斯亮蓝染色法，该方法的灵敏度得到了显著提高，可以检测到蛋白质总量约为30纳克的条带，其所使用的考马斯亮蓝染色液的成分如下：2％磷酸、10％硫酸铵、20％甲醇、0.1％考马斯亮蓝G250。随后，在Neuhoff等人的研究基础上，Candiano及其合作者(Giovanni C.，Maurizio B.，Luca M.，Electrophoresis 2004，25，1327-1333)发明了一种被称为Blue Silver的考马斯亮蓝染色方法，该方法能够检测到仅含有10纳克蛋白的条带，灵敏度接近银染法，据称是目前所报道的考马斯亮蓝染色方法中灵敏度最高的一种，其所使用的考马斯亮蓝染色液的成分与Neuhoff等人的研究相比，区别在于增加考马斯亮蓝G250的含量(由0.1％升至0.12％)、磷酸的含量(由2％升至10％)。但这种方法需要在水中脱色很长的时间，使得胶吸水膨大，变得非常脆，极易破裂，不利于后续的研究工作。

因此，需要一种新的考马斯亮蓝染色液和染色方法，能够在保证灵敏度的情况下，以更低的成本实现对SDS-PAGE胶的染色。

发明内容

本发明的目的在于提供一种考马斯亮蓝染色液及其染色方法和在蛋白检测中的应用，旨在保证灵敏度(10ng)的情况下，进一步降低SDS-PAGE胶染色成本，并解决脱色后胶容易破碎的问题。

为了实现发明目的，本发明提供了一种考马斯亮蓝染色液，所述染色液是包含体积百分浓度为10％～20％的醇，体积百分浓度为4.5％～10％的酸，质量体积浓度为5％～10％的硫酸铵，质量体积浓度为0.01％～0.1％的考马斯亮蓝的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一种；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一种；所述考马斯亮蓝包括G250和R250中的至少一种。

优选的，所述染色液是包含体积百分浓度为10％～20％的醇，体积百分浓度为4.75％～8.5％的酸，质量体积浓度为5％～8.5％的硫酸铵，质量体积浓度为0.01％～0.1％的考马斯亮蓝的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一种；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一种；所述考马斯亮蓝包括G250和R250中的至少一种。

更优选的，所述染色液是包含体积百分浓度为15％～20％的乙醇，体积百分浓度为4.75％～8.5％的磷酸，质量体积浓度为5％～8.5％的硫酸铵，质量体积浓度为0.01％～0.03％的考马斯亮蓝G250的水溶液。

本发明还提供了一种基于上述任一种考马斯亮蓝染色液的染色方法，包括以下步骤：

A.染色：将SDS-PAGE胶置于考马斯亮蓝染色液中，染色45min以上；

B.脱色：用水冲洗染色后的SDS-PAGE胶，将染色液冲洗干净即可；

所述考马斯亮蓝染色液是包含体积百分浓度为10％～20％的醇，体积百分浓度为4.5％～10％的酸，质量体积浓度为5％～10％的硫酸铵，质量体积浓度为0.01％～0.1％的考马斯亮蓝的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一种；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一种；所述考马斯亮蓝包括G250和R250中的至少一种；。

其中，在步骤A之前还包括步骤：

A’.固定：将SDS-PAGE胶在固定液中固定5min～30min；所述固定液是包含体积百分浓度为20％～50％的醇，体积百分浓度为1％～5％的酸的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一种；所述酸包括磷酸、乙酸和三氯乙酸中的至少一种。

优选的，步骤A’所述固定液是包含体积百分浓度为25％～35％的乙醇，体积百分浓度为3％～5％的磷酸的水溶液；固定时间为10min～20min。

其中，在步骤A’之前还可包括步骤A”.漂洗：用水冲洗SDS-PAGE胶。

上述任一方案中，优选的，步骤A所述染色液是包含体积百分浓度为10％～20％的醇，体积百分浓度为4.75％～8.5％的酸，质量体积浓度为5％～8.5％的硫酸铵，质量体积浓度为0.01％～0.1％的考马斯亮蓝的水溶液；

所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一种；

所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一种；

所述考马斯亮蓝包括G250和R250中的至少一种。

更优选的，步骤A所述染色液是包含体积百分浓度为15％～20％的乙醇，体积百分浓度为4.75％～8.5％的磷酸，质量体积浓度为5％～8.5％的硫酸铵，质量体积浓度为0.01％～0.03％的考马斯亮蓝G250的水溶液，染色时间为45min～70min。

通过上述任一种染色液处理过的SDS-PAGE胶均能应用于蛋白质的定性和/或定量检测。

与现有技术Blue Sliver法相比，本发明通过降低考马斯亮蓝等的浓度，使得本发明的考马斯亮蓝染色液和染色方法能够在保证灵敏度(10ng)的情况下，以更低的成本实现对SDS-PAGE胶的染色，且脱色后的胶不易破碎，不会给后续的质谱等研究工作造成困难。

附图说明

图1是本发明的实验组一的染色结果图；

图2是本发明的实验组二的染色结果图；

图3是本发明的实验组三的染色结果图；

图4是本发明的实验组四的染色结果图；

图5是本发明的实验组五的染色结果图；

图6是本发明的对照组的染色结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

一种考马斯亮蓝染色液，所述染色液是包含体积百分浓度(v/v)为10％～20％的醇，体积百分浓度(v/v)为4.5％～10％的酸，质量体积浓度(w/v)为5％～10％的硫酸铵，质量体积浓度(w/v)为0.01％～0.1％的考马斯亮蓝的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一种；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一种；所述考马斯亮蓝包括G250和R250中的至少一种。

考马斯亮蓝浓度越高，其对SD-PAGE胶中的蛋白质的杂色越深，即灵敏度越高，但可能加深凝胶的背景，Candiano等在综合考虑这两种影响以后，在改良型考马斯亮蓝染色法的基础上，将考马斯亮蓝G250的含量提高了20％，同时将磷酸的含量提高了400％，从而得出了目前灵敏度最高的考马斯亮蓝染色液(Blue Sliver法)。本发明的染色液降低了考马斯亮蓝等的浓度，但是其灵敏度与Blue Sliver法相同(10ng)或更高，又因为利用本发明的考马斯亮蓝染色液对SDS-PAGE胶进行染色时，染色液与SDS-PAGE胶体积的对应关系，与Blue Silver法中的染色液与SDS-PAGE胶体积的对应关系相同，只需将SDS-PAGE胶完全没入染色液中即可。在目前的市场上，甲醇的价格较乙醇高，G250和R250的单价相同，磷酸的价格较乙酸高，因此本发明方案中的醇的成本至多为Blue Sliver法中的50％～100％，酸的成本至多为Blue Sliver法中的45％～100％，硫酸铵的成本至多为Blue Sliver法中的50％～100％，考马斯亮蓝的成本为Blue Sliver法中的十二分之一至六分之五。所以本发明的考马斯亮蓝染色液能够在保证灵敏度(10ng)的情况下，以更低的成本实现对SDS-PAGE胶的染色。

现有技术中，染色液中使用的醇为甲醇，而在本发明的染色液中，醇包括甲醇和乙醇中的至少一种。当该醇为甲醇和乙醇的混合液时，混合液中的甲醇可用等体积的乙醇替代。本发明的考马斯亮蓝染色液能够在保证灵敏度(10ng)的情况下，以更低的成本实现对SDS-PAGE胶的染色。优选的，所述醇为乙醇，以降低染色液的毒性，使操作更安全，且能进一步降低成本。

蛋白质着色显示的灵敏度与染色试剂直接相关，本发明中采用是考马斯亮蓝G250、R250或G250和R250的混合物。因为G250与蛋白的结合速度比R250更快，因此，当仅是考马斯亮蓝种类(G250或R250)不同时，含G250的染色液能进一步的缩短染色时间；而含R250的染色液的灵敏度更高，染色后的脱色更快，背景更清晰。优选的，考马斯亮蓝含量为0.01％～0.05％(w/v)；该方案中，考马斯亮蓝的成本仅为Blue Silver法中的十二分之一至十二分之五。更优选的，考马斯亮蓝含量为0.01％～0.03％(w/v)，即该方案中，考马斯亮蓝的成本仅为Blue Silver法中的十二分之一至四分之一。与Blue Silver法相比，上述方案中的考马斯亮蓝含量更低，因为考马斯亮蓝的溶解度不高，所以，本发明的染色液在保证了灵敏度(10ng)的情况下，既降低了成本，又使得染色液的配置更为方便，不易出现沉淀；而沉淀的出现会导致染色液在染色过程中出现染色不均匀的现象。

在本发明的染色液中，所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一种。当所述酸含有多种组分时，磷酸和乙酸相互之间能够以相同的体积分数替换，例如：1％(v/v)的磷酸可用1％(v/v)的乙酸替换。在酸的体积百分比一定的情况下，磷酸的染色效果更佳。优选的，所述酸的含量为4.75％～8.5％(v/v)。更优选的，所述酸为磷酸；该方案中，磷酸的成本仅为Blue Silver法中的4.75％～8.5％。其中，磷酸在染色液中既能辅助固定蛋白质，又维持了染色液的pH值，有利于考马斯亮蓝G250或R250与蛋白质的结合，使得染色背景更清晰，有利于获得信噪比高的图像；此外，磷酸的挥发性较乙酸更低，使得本发明的染色液的刺激性降低，更易为操作者接受。上述方案均在保证了灵敏度(10ng)的情况下，降低了染色液的成本。

优选的，硫酸铵的含量为5％～8.5％(w/v)；该方案中，硫酸铵的成本仅为Blue Silver法中的50％～85％。当把本发明的染色液中的硫酸铵去除后，染色液的灵敏度仅为100ng左右，硫酸铵的加入，使得染色液成为酸性的离子溶液，在该溶液中蛋白质的葡萄胺和天冬酰胺发生质子化，使得考马斯亮蓝与蛋白的结合更为紧密，从而极大的提高了染色液的灵敏度。上述方案均在保证了灵敏度(10ng)的情况下，降低了染色液的成本。

水质对染色液的灵敏度也有一定的影响，本发明中所述的水可采用蒸馏水、双蒸水或超纯水，优选超纯水。

一种基于上述任一种考马斯亮蓝染色液的染色方法，包括以下步骤：

A.染色：将SDS-PAGE胶置于考马斯亮蓝染色液中，染色45min以上；

B.脱色：用水冲洗染色后的SDS-PAGE胶，将染色液冲洗干净即可；

所述染色液是包含体积百分浓度为10％～20％的醇，体积百分浓度为4.5％～10％的酸，质量体积浓度为5％～10％的硫酸铵，质量体积浓度为0.01％～0.1％的考马斯亮蓝的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一种；所述酸包括磷酸和乙酸中的至少一种；所述考马斯亮蓝包括G250和R250中的至少一种。

上述的染色方法，能够在更短的时间内完成对SDS-PAGE胶的染色，且其染色背景较Blue Silver法更低，灵敏度为10ng或更高。

其中，在步骤A之前还包括步骤：

A’.固定：将SDS-PAGE胶在固定液中固定5min～30min；所述固定液是包含体积百分浓度为20％～50％的醇，体积百分浓度为1％～5％的酸的水溶液；所述醇包括甲醇和乙醇中的至少一种；所述酸包括磷酸、乙酸和三氯乙酸中的至少一种。通过固定步骤，SDS-PAGE胶中的蛋白被固定在凝胶中，不易扩散，进一步提高了染色液的灵敏度；且通过固定步骤可去除在电泳过程中遗留在SDS-PAGE胶上的干扰染色过程的物质，如去垢剂、还原剂和缓冲液等成分。在酸的体积百分比一定的情况下，固定液中酸的成本排列如下：乙酸≤磷酸≤三氯乙酸，但是经固定以后染色的效果以三氯乙酸最佳，其次是磷酸，最后是乙酸。

优选的，步骤A’所述固定液是包含体积百分浓度为25％～35％的乙醇，体积百分浓度为3％～5％的磷酸的水溶液；固定时间为10min～20min。本方案中，所述醇为乙醇，不含甲醇，降低了固定液的毒性，使操作更安全；所述酸为磷酸，本方案综合考虑了固定液中酸的成本，酸的挥发性对操作者的影响，以及固定液的效果。

其中，在步骤A’之前还包括步骤：

A”.漂洗：用水冲洗SDS-PAGE胶。通过漂洗步骤，可冲去在电泳过程中遗留在SDS-PAGE胶上的干扰染色过程的物质，如去垢剂、还原剂和缓冲液等成分，尤其是SDS，而SDS的存在会使染色液在染色过程中出现沉淀，干扰考马斯亮蓝与蛋白质的集合，从而影响染色效果。

优选的，步骤A所述染色液是包含体积百分浓度为15％～20％的乙醇，体积百分浓度为4.75％～8.5％的磷酸，质量体积浓度为5％～8.5％的硫酸铵，质量体积浓度为0.01％～0.03％的考马斯亮蓝G250的水溶液，染色时间为45min～70min。本方案对SDS-PAGE胶的染色效果更好，背景更低，灵敏度在5ng～10ng之间，较Blue Sliver法更高。

考马斯亮蓝染色液的配置，以体积百分浓度为20％的乙醇，体积百分浓度为5％的磷酸，质量体积浓度为5％的硫酸铵，质量体积浓度为0.02％的考马斯亮蓝G250的水溶液为例。

在终体积100mL的超纯水中加入相应的磷酸，使其终浓度为5％(v/v)，搅拌均匀；然后加入硫酸铵，使其终浓度为5％(w/v)，搅拌使其彻底溶解；然后加入考马斯亮蓝G2500.02g，边加边搅拌，当G250全部溶解后，加入600mL的超纯水，然后加入适量的无水乙醇，使其终浓度为20％(v/v)，然后用超纯水定容至1000mL。配置好后置于棕色瓶中密封保存。

其它配比的考马斯亮蓝染色液均可参照上述方法进行配置。例如：

配比一：0.01％(w/v)G250，10％(v/v)磷酸，9％(w/v)硫酸铵，18％(v/v)乙醇。本配比的考马斯亮蓝染色液的灵敏度为10ng，与Blue Sliver考马斯亮蓝染色法中的染色液相同，成本则更低。

配比二：0.1％(w/v)G250，2％(v/v)磷酸，2.8％(v/v)乙酸，5％(w/v)硫酸铵，11％(v/v)甲醇。本配比的考马斯亮蓝染色液的灵敏度为5ng，比BlueSliver考马斯亮蓝染色法中的染色液高，成本则更低。

配比三：0.07％(w/v)G250，5.5％(v/v)乙酸，7.5％(w/v)硫酸铵，7％(v/v)乙醇，7％(v/v)甲醇。本配比的考马斯亮蓝染色液的灵敏度为5ng，比Blue Sliver考马斯亮蓝染色法中的染色液高，成本则更低。

配比四：0.02％(w/v)R250，7.1％(v/v)磷酸，8％(w/v)硫酸铵，7％(v/v)乙醇，9％(v/v)甲醇。本配比的考马斯亮蓝染色液的灵敏度为5ng，比Blue Sliver考马斯亮蓝染色法中的染色液更高，成本则更低。

配比五：0.04％(w/v)R250，6％(v/v)磷酸，5％(w/v)硫酸铵，20％(v/v)甲醇。本配比的考马斯亮蓝染色液的灵敏度为5ng，比Blue Sliver考马斯亮蓝染色法中的染色液高，成本则更低。

配比六：0.07％(w/v)R250，4.5％(v/v)乙酸，9.5％(w/v)硫酸铵，13％(v/v)乙醇。本配比的考马斯亮蓝染色液的灵敏度为5ng，比Blue Sliver考马斯亮蓝染色法中的染色液高，成本则更低。

配比七：0.1％(w/v)R250，10％(v/v)乙酸，6.3％(w/v)硫酸铵，10％(v/v)乙醇。本配比的考马斯亮蓝染色液的灵敏度为5ng，比Blue Sliver考马斯亮蓝染色法中的染色液高，成本则更低。

配比八：0.009％(w/v)G250，0.001％(w/v)R250，10％(v/v)磷酸，10％(w/v)硫酸铵，18％(v/v)乙醇。本配比的考马斯亮蓝染色液的灵敏度为10ng，与Blue Sliver考马斯亮蓝染色法中的染色液相同，成本则更低。

配比九：0.015％(w/v)G250，0.005％(w/v)R250，9％(v/v)磷酸，9.5％(w/v)硫酸铵，10％(v/v)乙醇，5％(v/v)甲醇。本配比的考马斯亮蓝染色液的灵敏度为5ng，比Blue Sliver考马斯亮蓝染色法中的染色液更高，成本则更低。

配比十：0.01％(w/v)G250，0.03％(w/v)R250，3％(v/v)磷酸，3％(v/v)乙酸，7％(w/v)硫酸铵，12％(v/v)甲醇。本配比的考马斯亮蓝染色液的灵敏度为5ng，比Blue Sliver考马斯亮蓝染色法中的染色液更高，成本则更低。

配比十一：0.03％(w/v)G250，0.04％(w/v)R250，4.5％(v/v)磷酸，5％(w/v)硫酸铵，10％(v/v)乙醇。本配比的考马斯亮蓝染色液的灵敏度为5ng，比Blue Sliver考马斯亮蓝染色法中的染色液更高，成本则更低。

考马斯亮蓝染色液灵敏度实验：

以牛血清白蛋白(BSA)为标准样品，配置系列浓度的溶液，分别为20ng/μL、16ng/μL、10ng/μL、6ng/μL、4ng/μL、2ng/μL、1ng/μL、0.2ng/μL；各样品的上样量均为5μL，即各孔上样量分别为100ng、80ng、50ng、30ng、20ng、10ng、5ng、1ng。电泳完成后分别按下述方法进行染色处理。

实验组一：

考马斯亮蓝染色液：0.02％(w/v)G250，5％(v/v)磷酸，5％(w/v)硫酸铵，20％(v/v)乙醇。

固定液：30％(v/v)乙醇、5％(v/v)磷酸。

染色方法：

1)漂洗：蒸馏水冲洗SDS-PAGE胶两次，每次30s；

2)固定：固定液固定15min；

3)染色：染色液染色1h；

4)脱色：蒸馏水冲洗染色后的SDS-PAGE胶，每次30s，重复4次。

实验组二：

考马斯亮蓝染色液：0.01％(w/v)R250，2％(v/v)乙酸，8％(v/v)磷酸，10％(w/v)硫酸铵，15％(v/v)乙醇。

染色方法：

1)漂洗：蒸馏水冲洗SDS-PAGE胶两次，每次30s；

2)染色：染色液染色70min；

3)脱色：蒸馏水冲洗染色后的SDS-PAGE胶，每次30s，重复4次。

实验组三：

考马斯亮蓝染色液：0.03％(w/v)G250，4.5％(v/v)磷酸，8.5％(w/v)硫酸铵，20％(v/v)甲醇。

固定液：20％(v/v)甲醇、3％(v/v)三氯乙酸。

染色方法：

1)漂洗：蒸馏水冲洗SDS-PAGE胶两次，每次30s；

2)固定：固定液固定30min；

3)染色：染色液染色2h；

4)脱色：蒸馏水冲洗染色后的SDS-PAGE胶，每次30s，重复4次。

实验组四：

考马斯亮蓝染色液：0.05％(w/v)G250，8.5％(v/v)乙酸，7％(w/v)硫酸铵，10％(v/v)乙醇。

固定液：50％(v/v)乙醇、0.5％(v/v)磷酸，0.5％(v/v)三氯乙酸。

染色方法：

1)漂洗：蒸馏水冲洗SDS-PAGE胶两次，每次30s；

2)固定：固定液固定5min；

3)染色：染色液染色45min；

4)脱色：蒸馏水冲洗染色后的SDS-PAGE胶，每次30s，重复4次。

实验组五：

考马斯亮蓝染色液：0.05％(w/v)G250，0.05％(w/v)R250，4.75％(v/v)磷酸，6％(w/v)硫酸铵，20％(v/v)乙醇。

固定液：40％(v/v)乙醇、2％(v/v)乙酸。

染色方法：

1)漂洗：蒸馏水冲洗SDS-PAGE胶两次，每次30s；

2)固定：固定液固定20min；

3)染色：染色液染色1h；

4)脱色：蒸馏水冲洗染色后的SDS-PAGE胶，每次30s，重复4次。

对照组的染色液按Blue Sliver法(Giovanni C.，Maurizio B.，Luca M.，Electrophoresis 2004，25，1327-1333)进行配置和染色。

实验组一至五和对照组的实验结果分别如图1至6所示。

其中，实验组一的灵敏度为5ng，较对照组(Blue Sliver法)高，且成本更低。另外，其脱色过程中，SDS-PAGE胶在水中浸泡的时间仅为2min，脱色后的胶与脱色前相比，观察不到膨大现象，仍然能够保持很好的韧性，不易破碎，不会给后续的质谱等研究工作造成困难。

实验组二的灵敏度为10ng，与对照组相同，但其成本更低。另外，其脱色过程中，SDS-PAGE胶在水中浸泡的时间仅为2min，脱色后的胶与脱色前相比，观察不到膨大现象，仍然能够保持很好的韧性，不易破碎，不会给后续的质谱等研究工作造成困难。

实验组三的灵敏度为5ng，较对照组(Blue Sliver法)高，且成本更低。另外，其脱色过程中，SDS-PAGE胶在水中浸泡的时间仅为2min，脱色后的胶与脱色前相比，观察不到膨大现象，仍然能够保持很好的韧性，不易破碎，不会给后续的质谱等研究工作造成困难。

实验组四的灵敏度为5ng，较对照组(Blue Sliver法)高，且成本更低。另外，其脱色过程中，SDS-PAGE胶在水中浸泡的时间仅为2min，脱色后的胶与脱色前相比，观察不到膨大现象，仍然能够保持很好的韧性，不易破碎，不会给后续的质谱等研究工作造成困难。

实验组五的灵敏度为5ng，较对照组(Blue Sliver法)高，且成本更低。另外，其脱色过程中，SDS-PAGE胶在水中浸泡的时间仅为2min，脱色后的胶与脱色前相比，观察不到膨大现象，仍然能够保持很好的韧性，不易破碎，不会给后续的质谱等研究工作造成困难。

总体来说，实验组背景均较对照组浅，实验组一、三、四、五的灵敏度均在5ng左右，实验组二和对照组的灵敏度在10ng左右，即本发明的考马斯亮蓝染色液和染色方法与Blue Sliver法相同或更高，本发明能在保证灵敏度的情况下，进一步降低考马斯亮蓝染色法的成本。另外，根据本发明的发明人观察，SDS-PAGE胶经本发明的染色方法染色后脱色的时间极短(SDS-PAGE胶在水中浸泡的时间为2min)，脱色后的SDS-PAGE胶未见明显胀大，仍然保持较好的韧性，而Blue Sliver法处理的SDS-PAGE胶明显胀大，在拍胶的时候需非常小心，以防胶破碎。

应当说明的是，上述实验组所体现的染色液配方及染色方法是本发明的几种具体实施方式，是为了清楚的阐述本发明的实验效果，各实验组内的染色液配方和染色方法之间并不是唯一的对应关系，脱色的时间可根据需要进行相应的调整，例如延长或缩短SDS-PAGE胶的浸泡总时间。应当说明的是，本发明的所有染色液配方均能通过本发明的染色方法，实现对SDS-PAGE胶中蛋白质的成功染色。

另外，本发明的染色液和染色方法的应用不限于蛋白质质谱研究，在其他的蛋白质定性和定量检测中的应用也应属于本发明的保护范围。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种考马斯亮蓝染色液，其特征在于，所述染色液是包含体积百分浓度为10％～20％的醇，体积百分浓度为4.5％～10％的酸，质量体积浓度为5％～10％的硫酸铵，质量体积浓度为0.01％～0.05％的考马斯亮蓝的水溶液；

所述醇由甲醇和乙醇中的至少一种组成；

所述酸由磷酸和乙酸中的至少一种组成；

所述考马斯亮蓝由G250和R250中的至少一种组成。

2.根据权利要求1所述的考马斯亮蓝染色液，其特征在于，所述染色液是包含体积百分浓度为10％～20％的醇，体积百分浓度为4.75％～8.5％的酸，质量体积浓度为5％～8.5％的硫酸铵，质量体积浓度为0.01％～0.05％的考马斯亮蓝的水溶液；

所述醇由甲醇和乙醇中的至少一种组成；

所述酸由磷酸和乙酸中的至少一种组成；

所述考马斯亮蓝由G250和R250中的至少一种组成。

3.根据权利要求2所述的考马斯亮蓝染色液，其特征在于，所述染色液是包含体积百分浓度为15％～20％的乙醇，体积百分浓度为4.75％～8.5％的磷酸，质量体积浓度为5％～8.5％的硫酸铵，质量体积浓度为0.01％～0.03％的考马斯亮蓝G250的水溶液。

4.一种考马斯亮蓝染色方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.染色：将SDS-PAGE胶置于考马斯亮蓝染色液中，染色45min以上；

B.脱色：用水冲洗染色后的SDS-PAGE胶，将染色液冲洗干净即可；

所述考马斯亮蓝染色液是包含体积百分浓度为10％～20％的醇，体积百分浓度为4.5％～10％的酸，质量体积浓度为5％～10％的硫酸铵，质量体积浓度为0.01％～0.05％的考马斯亮蓝的水溶液；

所述醇由甲醇和乙醇中的至少一种组成；

所述酸由磷酸和乙酸中的至少一种组成；

所述考马斯亮蓝由G250和R250中的至少一种组成。

5.根据权利要求4所述的考马斯亮蓝染色方法，其特征在于，在步骤A之前还包括步骤：

A’.固定：将SDS-PAGE胶在固定液中固定5min～30min；所述固定液是包含体积百分浓度为20％～50％的醇，体积百分浓度为1％～5％的酸的水溶液；

所述醇由甲醇和乙醇中的至少一种组成；

所述酸由磷酸、乙酸和三氯乙酸中的至少一种组成。

6.根据权利要求5所述的考马斯亮蓝染色方法，其特征在于，步骤A’所述固定液是包含体积百分浓度为25％～35％的乙醇，体积百分浓度为3％～5％的磷酸的水溶液；固定时间为10min～20min。

7.根据权利要求5所述的考马斯亮蓝染色方法，其特征在于，在步骤A’之前还包括步骤A”.漂洗：用水冲洗SDS-PAGE胶。

8.根据权利要求4至7中任一项所述的考马斯亮蓝染色方法，其特征在于，步骤A所述染色液是包含体积百分浓度为10％～20％的醇，体积百分浓度为4.75％～8.5％的酸，质量体积浓度为5％～8.5％的硫酸铵，质量体积浓度为0.01％～0.05％的考马斯亮蓝的水溶液；

所述醇由甲醇和乙醇中的至少一种组成；

所述酸由磷酸和乙酸中的至少一种组成；

所述考马斯亮蓝由G250和R250中的至少一种组成。

9.根据权利要求8所述的考马斯亮蓝染色方法，其特征在于，步骤A所述染色液是包含体积百分浓度为15％～20％的乙醇，体积百分浓度为4.75％～8.5％的磷酸，质量体积浓度为5％～8.5％的硫酸铵，质量体积浓度为0.01％～0.03％的考马斯亮蓝G250的水溶液，染色时间为45min～70min。

10.根据权利要求1至3中任一项所述考马斯亮蓝染色液在蛋白质的定性和／或定量检测中的应用。

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