CN100573093C

CN100573093C - 一种考马斯亮蓝染色法及其专用凝胶固定液和染色剂

Info

Publication number: CN100573093C
Application number: CNB2006100890935A
Authority: CN
Inventors: 李银心; 王旭初
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2006-08-02
Filing date: 2006-08-02
Publication date: 2009-12-23
Anticipated expiration: 2026-08-02
Also published as: CN1904578A

Abstract

本发明公开了一种考马斯亮蓝染色法及其专用凝胶固定液和染色剂。该考马斯亮蓝染色法包括以下步骤：1)将SDS-PAGE胶置于本发明的凝胶固定液中，常温下固定0.5-2.0小时；2)将胶转移至体积百分浓度为0.5-3.0%的醋酸溶液中，常温下延展1.0-3.0小时；3)将胶转移至本发明的考马斯亮蓝染色剂中，常温下染色8-24小时；4)将胶转移至脱色液I中，振荡脱色1-3小时，再转移至脱色液II中继续脱色至背景干净。本发明考染法比Blue Silver法更加灵敏，可以在纳克级水平上检测SDS-PAGE胶上的蛋白质，且比银染法的操作要简单得多，具有方便快捷的优点，将在蛋白质组学的研究中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

一种考马斯亮蓝染色法及其专用凝胶固定液和染色剂

技术领域

本发明涉及一种考马斯亮蓝染色法及其专用凝胶固定液和染色剂。

背景技术

虽然目前在蛋白质组学研究中有很多种蛋白质染色方法可供选择，但是，应用最为广泛的还是考马斯亮蓝染色法(考染法)、银染法和荧光染色法。由于灵敏度高，操作程序相对简便，SYPRO家族的荧光染料成为目前最为流行的染料(T.H.Steinberg，L.J.Jones，R.P.Haugland，V.L.Singer，SYPRO Orange and SYPRO Red ProteinGel Stains：One-Step Fluorescent Staining of Denaturing Gels for Detectionof Nanogram Levels of Protein，Anal.Biochem.239(1996)223-227；M.F.Lopez，K.Berggren，E.Chernokalskaya，A.Lazarev，M.Robinson，W.F.Patton，Acomparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect toprotein detection in two-dimensional gels and identification by peptide massprofiling.Electrophoresis 21(2000)3673-3683.)。最近，一种名为DIGE的染色技术也被用来检测2-DE胶上的差异表达蛋白(W.F.Patton，A thousand points oflight：the application of fluorescence detection technologies totwo-dimensional gel electrophoresis and proteomics，Electrophoresis 21(2000)1123-1144.)。然而，美中不足的是这些荧光染料价格昂贵，并且荧光通常在几分钟就淬灭了。另外，荧光染色技术的应用，离不开专用的仪器设备和特殊的蛋白定量软件。银染法是目前公认的除放射性标记以外的一种最为灵敏的蛋白检测方法，可以在纳克级水平上检测SDS-PAGE胶上的蛋白质，但是，由于步骤繁琐，操作要高，稍有不慎，就会造成很深的背景，影响结果的清晰度和分辨率。最为严重的是，很多银染胶脱色困难，所用到的戊二醛等醛类物质会对蛋白质进行不可逆修饰，严重干扰后期的质谱鉴定工作，因此，在蛋白质组学研究中，通常并不推荐使用银染(G.Candiano，M.Bruschi，L.Musante，L.Santucci，G.M.Ghiggeri，B.Carnemolla，P.Orecchia，L.Zardi，P.G.Righetti，Blue silver：A very sensitive colloidal CoomassieG-250staining for proteome analysis，Electrophoresis 25(2004)1327-1333.)。

鉴于上述银染法和荧光染色法的不足，许多研究人员在进行蛋白质组学研究时，更倾向于采用较为经典的考马斯亮蓝染色法。考染法之所以受到大家的青睐，主要是由于其具有良好的重复性、极低的染色背景、较高的灵敏度(大约0.5μg/mm²)以及其优良的质谱兼容性。特别是经过Neuhoff等人的开创性工作之后，考染法的灵敏度得到了显著提高，可以检测到蛋白质总量约为30纳克的条带(V.Neuhoff，A.Norbert，D.Taube，W.Ehrhardt，Improved staining of proteins inpolyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear backgroundat nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250and R-250，Electrophoresis 9(1988)255-262.)。随后，在Neuhoff等人的研究基础上，Candiano及其合作者发明了一种被称为Blue Silver的考染方法，该法能够检测到仅含有1纳克蛋白的条带，灵敏度接近银染法，据称是目前所报道的考染方法中灵敏度最高的一种，但这种方法需要在水中脱色很长的时间，使得胶吸水膨大，变得非常脆，极易破裂(G.Candiano，M.Bruschi，L.Musante，L.Santucci，G.M.Ghiggeri，B.Carnemolla，P.Orecchia，L.Zardi，P.G.Righetti，Blue silver：A very sensitivecolloidal Coomassie G-250staining for proteome analysis，Electrophoresis 25(2004)1327-1333.)。

发明内容

本发明的目的是提供一种蛋白质组学研究领域中的考马斯亮蓝染色法及其转用凝胶固定液和染色剂。

本发明所提供的凝胶固定液，是含有体积百分浓度为8-12％醋酸，30-50％乙醇和5-15％甲醇的水溶液。

上述凝胶固定液中的醋酸的含量优选为10％，乙醇的含量优选为40％，甲醇的含量优选为10％。

本发明所提供的考马斯亮蓝染色剂，是含有体积百分浓度为4-6％醋酸，35-55％乙醇和质量体积浓度为0.1-0.15％考马斯亮蓝R-250的水溶液。

上述考马斯亮蓝染色剂中的醋酸的含量优选为5％，乙醇的含量优选为45％，考马斯亮蓝R-250的含量优选为0.12-0.125％。

本发明的另一个目的是提供一种灵敏度较高的改进型考马斯亮蓝染色法。

本发明所提供的考马斯亮蓝染色法，包括以下步骤：

1)将SDS-PAGE胶置于上述凝胶固定液中，常温下固定0.5-2.0小时；

2)将胶转移至体积百分浓度为0.5-3.0％的醋酸溶液中，常温下延展1.0-3.0小时；

3)将胶转移至上述考马斯亮蓝染色剂中，常温下染色8-24小时；

4)将胶转移至脱色液I中，振荡脱色1-3小时，再转移至脱色液II中继续脱色至背景干净为止；所述脱色液I是含有体积百分浓度为4-6％醋酸，30-50％乙醇的水溶液；所述脱色液II是含有体积百分浓度为2-4％醋酸，20-40％乙醇的水溶液。

在上述染色方法中，步骤1)中的固定时间优选为1小时。

步骤2)中醋酸溶液的体积百分浓度优选为1.0％，延展时间优选为2小时。

步骤4)中SDS-PAGE胶在脱色液I的脱色时间优选为2小时；所述脱色液I中的醋酸含量优选为5％，乙醇含量优选40％；所述脱色液II中的醋酸含量优选为3％，乙醇含量优选为30％；所述振速优选为50-100rpm。

本发明提供了一种考马斯亮蓝染色法及其专用凝胶固定液和染色剂。与常规凝胶固定液相比，本发明的凝胶固定液添加了体积百分浓度8-12％甲醇，使得蛋白固定更为牢固，尽可能地避免了小分子量蛋白的丢失。与常规考马斯亮蓝染色剂相比，本发明考马斯亮蓝染色剂中考马斯亮蓝的质量百分浓度提高到0.1-0.15％，使得染色效果更加明显。此外，与常规的考染法相比，本发明的考染法增加了延展步骤，使得胶膨大，孔隙度变大，利于染料更好的与胶中的蛋白结合。通过对单向和双向电泳胶的不同染色效果比较发现，本发明考染法比Blue Silver法更加灵敏，可以在纳克级水平上检测SDS-PAGE胶上的蛋白质，且比银染法的操作要简单得多，具有方便快捷的优点。本发明的染色方法及其专用凝胶固定液和染色剂将在蛋白质组学的研究中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为银染、Blue Silver染色及本发明考染法染色效果的比较结果及本发明本发明考染法的灵敏度检测结果

图2为银染、Blue Silver染色及本发明考染法对2-DE胶的染色效果比较结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、银染、Blue Silver染色及本发明考染法染色效果的比较

1、盐角草(Salicornia europaea L.)地上部分总蛋白的单向电泳检测

凝胶固定液：含有体积百分浓度为10％醋酸，40％乙醇和10％甲醇的水溶液。

考马斯亮蓝染色母液：将2.5克考马斯亮蓝R-250溶于1升体积百分浓度为95％的乙醇中，在37℃摇床中振荡3个小时，配制成考马斯亮蓝染色母液，室温保存，使用前过滤。

考马斯亮蓝染色剂：用考马斯亮蓝染色母液配成含有体积百分浓度为5％醋酸，45％乙醇和质量体积浓度为0.125％考马斯亮蓝R-250的水溶液。

脱色液I：含有体积百分浓度为5％醋酸，40％乙醇的水溶液。

脱色液II：含有体积百分浓度为3％醋酸，30％乙醇的水溶液。

用0(对照)、200、400、600和800mM NaCl对盐角草(Salicornia europaea L.)进行处理，采用酚抽法(S.C.Carpentier，E.Witters，K.Laukens，P.Deckers，R.Swennen，B.Panis，Preparation of protein extracts from recalcitrant planttissues：An evaluation of different methods for two-dimensional gelelectrophoresis analysis，Proteomics 5(2005)2497-2507.)提取上述经NaCl处理的盐角草地上部分的总蛋白，然后用安马西亚公司的2-DE电泳仪并参照说明书及Yan等人(J.X.Yan，W.Robin，B.Tom，A.H.Rachel，A.W.Jules，Westbrook，H.W.Colin，J.D.Michael，A modified silver staining protocol forvisualization of proteins compatible with matrix-assisted laserdesorption/ionization and electrospray ionization-mass spectrometry.Electrophoresis 21(2000)3666-3672.)的方法进行单向电泳检测，每个泳道的上样量均为20微克，然后采用不同染色方法对SDS-PAGE胶上的蛋白质进行染色，比较最终的染色效果，银染法按上述Yan等人的方法进行，Blue Silver染色法依照Candiano等人的方法进行(G.Candiano，M.Bruschi，L.Musante，L.Santucci，G.M.Ghiggeri，B.Carnemolla，P.Orecchia，L.Zardi，P.G.Righetti，Blue silver：A verysensitive colloidal Coomassie G-250staining for proteome analysis，Electrophoresis 25(2004)1327-1333.)，用本发明的方法进行考马斯亮蓝染色，包括以下步骤：

1)将SDS-PAGE胶置于上述凝胶固定液中，常温下固定1小时；

2)将胶转移至体积百分浓度为1.0％的醋酸溶液中，常温下延展2小时；

3)将胶转移至上述考马斯亮蓝染色剂中，常温下染色12小时；

4)将胶转移至脱色液I中，在80rpm下振荡脱色2小时，再转移至脱色液II中继续振荡脱色至背景干净为止。脱色干净的胶可以在7％醋酸中保存1-3个月。

三种染色方法对单向电泳胶染色的染色效果如图1所示(图A：本发明考染法的染色结果，图B：Blue Silver法的染色结果，图C：银染法的染色结果；泳道1-5分别为经0、200、400、600和800mM NaCl处理的盐角草地上部分总蛋白，泳道M为Marker)，本发明考染法染色的胶条带清晰，背景非常干净(见图1中的A部分)，而利用Candiano等人的Blue Silver法染色的胶(见图1中B部分)以及按照Yan等人的银染法染出的胶(见图1中C部分)均表现出很深的染色背景。在所有单向胶上，均有许多蛋白质条带，分布范围覆盖了大于94kDa和小于14kDa分子量的区域，但是，经Blue Silver染色的胶上，许多次要条带、特别是位于低分子量区域的次要带，很难被染出来，虽然用银染法可以检测到几乎所有的蛋白条带，但是，由于银染背景太深，许多次要条带很难从如此深的染色背景中区分开来。

2、盐角草(Salicornia europaea L.)地上部分总蛋白的双向电泳检测

用200mM NaCl对盐角草(Salicornia europaea L.)进行处理，采用酚抽法提取上述经NaCl处理的盐角草地上部分的总蛋白，然后用安马西亚公司的2-DE电泳仪进行双向电泳检测，先利用pH 3-10的24厘米IPG胶条进行等电聚焦，每根胶条上样量约为700微克，在经过第二向电泳后，对SDS-PAGE胶用与步骤一相同的方法分别进行银染、Blue Silver染色及本发明考染染色，比较染色效果。

三种染色方法对双向电泳胶染色的染色效果如图2所示(图A：本发明考染法的染色结果，图B：Blue Silver法的染色结果，图C：银染法的染色结果)，总体来说，用本发明考染法染色的2-DE胶比用Blue Silver法染色的2-DE胶具有更多的蛋白点，染色效果也要好得多，基本上达到银染的效果。值得注意的是，经本发明考染法染色的胶，背景非常干净。选取用上述三种不同方法染色的2-DE胶上具有代表性的区域(用方框标出：a，b，c，d和e)进行分析，2-DE胶上蛋白点在点数目和聚焦质量上均有许多差别，在所选定的区域，有许多蛋白点可以很容易地通过本发明考染法或银染法检测出来，但在用Blue Silver染色的胶上没有检测到(见图二中的区域c，d和e)。此外，还从用本发明考染法染色的2-DE胶中选取了一百多个蛋白点进行质谱鉴定及数据库检索，鉴定结果表明本发明的染色方法还具有很好的质谱兼容性，完全可以用于蛋白质组学研究。

实施例2、本发明考染法的灵敏度检测

实施例1的检测结果初步表现出了本发明考染法的优越性，现通过单向电泳，以牛血清白蛋白(BSA)作为标样对本发明考染法的灵敏度做进一步检测，上样量分别为10μg、5μg、3μg、1μg、0.5μg、0.3μg、0.1μg、80ng、50ng、30ng、10ng、8ng和5ng，检测结果见图1中的图D(泳道1-13依次为10μg、5μg、3μg、1μg、0.5μg、0.3μg、0.1μg、80ng、50ng、30ng、10ng、8ng和5ng上样量的BSA，泳道M为Marker)，在总蛋白质浓度降到10纳克(相当于1ng/mm²)的时候，该蛋白中分子量约为62kDa的蛋白质主带，还可以被检测出来(泳道11)，表明本发明的考染法具有较高的灵敏度，可以在纳克级水平上检测蛋白质。

Claims

1、一种考马斯亮蓝染色法，包括以下步骤：

1)将SDS-PAGE胶置于用于考马斯亮蓝染色的凝胶固定液中，常温下固定0.5-2.0小时；所述用于考马斯亮蓝染色的凝胶固定液，是含有体积百分浓度为8-12％醋酸，30-50％乙醇和5-15％甲醇的水溶液；

3)将胶转移至考马斯亮蓝染色剂中，常温下染色8-24小时；所述考马斯亮蓝染色剂，是含有体积百分浓度为4-6％醋酸，35-55％乙醇和质量体积浓度为0.1-0.15％考马斯亮蓝R-250的水溶液；

4)将胶转移至脱色液I中，振荡脱色1-3小时，再转移至脱色液II中继续脱色至背景干净；所述脱色液I是含有体积百分浓度为4-6％醋酸，30-50％乙醇的水溶液；所述脱色液II是含有体积百分浓度为2-4％醋酸，20-40％乙醇的水溶液。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述用于考马斯亮蓝染色的凝胶固定液中，所述醋酸的体积百分含量为10％，乙醇的体积百分含量为40％，甲醇体积百分含量为10％；所述考马斯亮蓝染色剂中，所述醋酸的体积百分含量为5％，乙醇的体积百分含量为45％，考马斯亮蓝R-250的质量体积浓度为0.12-0.125％。

3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的固定时间为1小时。

4、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中醋酸溶液的体积百分浓度为1.0％，延展时间为2小时。

5、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中SDS-PAGE胶在脱色液I的脱色时间为2小时；所述脱色液I中醋酸的体积百分含量为5％，乙醇的体积百分含量为40％；所述脱色液II中醋酸的体积百分含量为3％，乙醇的体积百分含量为30％；所述振荡脱色的振速为50-100rpm。

6.权利要求1-5任一项所述方法在蛋白质的定性和/或定量检测中的应用。