CN101871858B - 一种sds-page快速脱色方法及其专用脱色杯 - Google Patents

Abstract

一种SDS-PAGE快速脱色方法及其脱色杯，其方法包括以下步骤：1)凝胶清洗：电泳凝胶染色结束后，用去离子水等将胶清洗2-3遍；2)预脱色：将凝胶放入盛有上述水的脱色杯中，加热达到80℃左右时，将脱色杯中水放出，该过程重复2次；3)脱色：向脱色杯中加入足量上述水，加热至80℃时后换水，再加热，如此反复循环，直到背景干净、条带清晰，脱色完成。本发明优点是：1、以去离子水等取代传统的甲醇-冰醋酸溶液作为脱色液，成本低廉，无环境污染。2、配合专用脱色装置利用加热方法在30-40分钟内完成整个脱色过程，方便快捷，加快试验进度。3、操作简单，本方法无需配制特殊脱色液，只需利用实验室现有加热设备，采用本专业脱色装置，就可以非常方便的进行脱色试验。

Description

一种SDS-PAGE快速脱色方法及其专用脱色杯

技术领域

本发明属于电泳凝胶脱色技术，具体涉及一种SDS-PAGE快速凝胶脱色方法及其专用脱色杯，本发明采用蒸馏水或去离子水作为脱色剂，结合专门的脱色仪，在特定温度下利用加热脱色剂方式进行凝胶脱色。

背景技术

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基磺酸钠)，SDS与蛋白质疏水部分相结合，断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构的折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仪保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW＝K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量(Harnes，B.D and Rickwood，D，1981，GelElectrophoresis of Proteins：A Practical Approach.Oxford and Washington.D.C.：IDL.Press.；Creighton，R.F.et al.，1989，Protein Structure：Apractical approach.Oxford：IRL Press.)。

SDS-PAGE已成为现代生物学研究中重要技术手段，是对蛋白质进行分离、量化、比较及特性鉴定的一种经济、快速、可重复的方法。SDS-PAGE易于操作和用途广泛，它已成为许多研究领域中一种重要的分析技术(郭尧君，1999，蛋白质电泳实验技术，P123～156，科学出版社；汪家政，范明，2000，蛋白质技术书册，P77～108，科学出版社)。SDS-PAGE包括四个主要步骤，即：凝胶制备、电泳、染色、脱色。其中凝胶制备和电泳已有成熟的技术和专用设备，目前SDS-PAGE的凝胶染色主要方法有考马斯亮蓝染色、银染、CaCl、KCl等方法(郭尧君，1999，蛋白质电泳实验技术，P123～156，科学出版社；汪家政，范明，2000，蛋白质技术书册，P77～108，科学出版社)，其中考马斯亮蓝染色由于其清晰度最好，灵敏度较高而被广泛采用。然而考马斯亮蓝染色后需进行脱色，将PAGE胶上非特异结合的考马斯亮篮脱掉后，才能显示出清晰的电泳条带。凝胶脱色需要用醋酸-甲醇或醋酸-乙醇脱色液在脱色摇床上脱色2～3小时，中间需要更换几次脱色液，脱色一次至少需要60ml脱色液，不仅浪费材料，而且用过的脱色液会造成环境污染，同时脱色液中甲醇和醋酸对人健康危害严重，还不能及时看到试验结果。很多研究者对传统的方法进行了不同程度的改进，肖亚中等(肖亚中，王军，蒲春雷，2002，一种简易的聚丙烯酰氨凝胶脱色方法，生物学杂志19(4)，P34～35)发现使用20％乙醇和10％冰醋酸作为脱色剂，脱色液中放置纸巾吸附色素，此方法可以缩短脱色时间，减少脱色液用量；最近张晓楠等(张晓楠，王爽，候颖，2008，聚丙烯酰氨凝胶的快速脱色及干胶的简易制作，医学分子生物学杂志5(1)；P40～41)在此基础上建立了一种更为简便的方法，用自来水作为脱色液，加入滤纸后，用微波炉加热到70℃后，然后在脱色摇床震摇脱色。然而我们在试验中发现，自来水中加热很容易将凝胶变成白色，不能恢复，更不能进行结果验证，此方法可行性不高。

发明内容

本发明的目的在于改进SDS-PAGE胶传统脱色技术，彻底摆脱使用传统脱色液脱色带来的种种不便，而提供一种更加高效、快捷、安全的SDS-PAGE快速脱色方法，该技术结合专门配备的仪器可以在1.5～2小时内完成染色脱色过程，并且电泳条带清晰可辨、背景干净。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：本发明的SDS-PAGE快速脱色方法，包括以下步骤：

1)凝胶清洗：电泳凝胶染色结束后，用蒸馏水、去离子水或超纯水将胶清洗2-3遍；

2)预脱色：将凝胶放入盛有蒸馏水、去离子水或超纯水的脱色杯中，水量以刚刚没过凝胶为宜，加热脱色杯，使脱色杯中水达到80℃时，停止加热，将脱色杯中水全部放出，重新加入冷水，加热使温度再次升高到80℃停止加热，将水再次放出，预脱色结束；(此步的目的是为了防止PAGE胶中高浓度的SDS在高温下析出，造成泡沫溢出，甚至将胶冲烂。)

3)脱色：向脱色杯中加入足量蒸馏水、去离子水或超纯水，水量是预脱色时的2-3倍，加热至80℃时，一边放出热水，一边加入冷水，温度始终保持在80℃，直到胶上背景干净、条带清晰，脱色完成。

4)结果保存：将胶进行扫描以及制备干胶。

所述电泳凝胶染色是考马斯亮蓝染色。

适用于SDS-PAGE快速脱色方法的专用脱色杯，包括适于加热的杯体，在杯体上、下部分别设置有由热敏开关控制的进水口和出水口，热敏开关由设置在杯体上的温度传感器控制。

其脱色过程具体如下：

1.电泳凝胶的染色后处理(60-70分钟)：

电泳凝胶经过考马斯亮蓝R-250染色后，将染色液回收，凝胶用去离子水、蒸馏水或超纯水清洗3次，然后将凝胶轻轻放入装有300ml去离子水或蒸馏水的电泳脱色装置中。

2.凝胶预脱色(10-15分钟)：

将脱色杯置于电炉或电磁炉上加热，待脱色杯中水达到80℃时，停止加热，将杯中水放出，重复2次。

3.凝胶脱色(20-25分钟)

预脱色后，向装有凝胶的脱色杯中加入足量(根据凝胶数量)去离子水、蒸馏水或超纯水，置于电炉上(金属脱色仪可置于电磁炉上)加热，待温度升高到80℃时，温度传感器将温度传导到脱色仪上的热敏感开关，热敏感开关跳起放出热水，流入冷水，温度降低，开关闭合，温度上升，如此反复循环，脱色杯中温度一直维持在80℃左右，直到凝胶上电泳条带清晰、背景干净为止。

4.然后将胶进行扫描以及制备干胶。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1.以去离子水、蒸馏水或超纯水取代传统的甲醇-冰醋酸溶液作为脱色液，成本低廉，无环境污染。

2.配合专用脱色装置利用加热方法在30-40分钟内完成整个脱色过程，比常规脱色方法(3-4小时)更加快捷，加快试验进度。

3.操作简单，本方法无需配制特殊脱色液，只要利用一般生化实验室现有加热设备，采用本方法中脱色杯(或实验室中烧杯，但需要实验者在旁边用冷水控制温度，防止沸腾)，可以非常方便的进行脱色试验。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图。

图2为本发明专用脱色杯结构示意图。

图2中标号：1为热敏开关，2为温度传感器，3为脱色杯。

图3为烟草花粉蛋白SDS-PAGE电泳图。

图4为百合与马铃薯花粉蛋白SDS-PAGE电泳图。

图5为原核表达植物蛋白及纯化过程SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

本发明以下结合附图将脱色过程进一步描述：

如图1所示：本发明的脱色方法按以下步骤完成：

1)凝胶清洗：电泳结束后，用蒸馏水、去离子水或超纯水(不能用自来水)将胶清洗2-3遍；

2)预脱色：将凝胶放进脱色杯(脱色杯结构如图2所示)，加入少量蒸馏水、去离子水或超纯水，水面刚刚没过凝胶即可，加热使脱色杯(3)中水达到80℃时，停止加热，将杯中水放出，重复2次。

3)脱色：向脱色杯(3)中加入足量蒸馏水、去离子水或超纯水，水量为预脱色时2-3倍，加热80℃时，热敏开关(1)开启，热水流出，冷水流入，温度降低，热敏开关关闭，温度再次升高，如此反复循环，脱色杯(3)中水温一直维持在80℃左右，直到蛋白胶背景干净、条带清晰，脱色完成。热敏开关(1)由设置在杯体上的温度传感器(2)控制开启或关闭。

4)结果保存：将脱色完成的胶利用较大分辨率进行扫描，制备干胶保存。

Claims (2)

1.一种SDS-PAGE快速脱色方法，其特征在于：它包括以下步骤：

1)凝胶清洗：电泳凝胶考马斯亮蓝染色结束后，用蒸馏水、去离子水或超纯水将胶清洗2-3遍；

2)预脱色：将凝胶放入盛有蒸馏水、去离子水或超纯水的脱色杯中，水量以刚刚没过凝胶为宜，加热脱色杯，使脱色杯中水达到80℃时，停止加热，将脱色杯中水全部放出，重新加入冷水，加热使温度再次升高到80℃停止加热，将水再次放出，预脱色结束；

3)脱色：向脱色杯中加入足量蒸馏水、去离子水或超纯水，水量是预脱色时的2-3倍，加热至80℃时，一边放出热水，一边加入冷水，温度始终保持在80℃，直到胶上背景干净、条带清晰，脱色完成；

4)结果保存：将胶进行扫描以及制备干胶。

2.一种适用于权利要求1所述的SDS-PAGE快速脱色方法的专用脱色杯，其特征在于：包括适于加热的杯体，在杯体上、下部分别设置有由热敏开关控制的进水口和出水口，热敏开关由设置在杯体上的温度传感器控制。

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