CN112649488B - 一种低背景银染聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种低背景银染聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法，该方法包括对经电泳分离蛋白质处理后的聚丙烯酰胺凝胶依序进行固定处理、敏化处理、水洗处理、银染处理、显色处理、终止处理和水洗处理后，实现对蛋白质的染色处理，其中，敏化处理过程中，还加入有聚乙烯吡咯烷酮、2‑氨基‑2‑甲基‑丙醇和吐温的混合液，本方案具体在敏化处理过程中加入浓度均为0.5％的聚乙烯吡咯烷酮PVP(分子量58000D)、AMP(2氨基‑2甲基‑丙醇)和吐温‑80进行同步处理，提高聚丙烯酰胺凝胶中蛋白条带的显色亮度且操作简单便利；在银染过程中，加入浓度为0.5％的二甲苯降低银染过程中的背景，使得胶块更白，提高目的片段的亮度和对比度，更方便检测仪器的扫描定量分析。

Description

一种低背景银染聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及蛋白质检测、生物化学凝胶电泳染色领域，尤其涉及一种低背景银染聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法。
背景技术
聚丙烯酰胺凝胶电泳具有高分辨的性能，是现代研究蛋白质分子各种性质特征的常用方法。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，再结合电泳后的转硝酸纤维素膜，PVDF膜等处理方法，被称之为Western Blot蛋白印记技术。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，尤其是目前使用最多的SDS聚丙酰胺凝胶电泳，可以方便的分离各种蛋白，进而对蛋白分子进行定性和定量的鉴定，是研究基因表达和功能的重要方法。
目前，蛋白经过SDS聚丙酰胺凝胶电泳后，将会分成不可见的，按分子量大小分布的条带，条带深浅与该处位点的蛋白质含量呈正相关。但电泳所获得的这些条带不可见，需要通过合适的染色方法，在透明的聚丙烯酰胺凝胶上进行蛋白条带显色，才能有效的获取所需分析的蛋白特征表达，分子大小，分子含量等信息。
基于蛋白的聚丙烯酰胺凝胶染色技术已开发出银染、锌染和铜染等金属离子染色方法，以及考马斯亮蓝、氨基黑B10和中性红等可逆染色方法。这些染色方法都有各自不同的优缺点。目前，蛋白银染方法是灵敏度最高的方法，其灵敏度是马斯亮蓝等染色方法的200-400倍，是铜染、锌染染色方法的10-50倍，据称其最低能够实现在聚丙稀酰胺凝胶上对0.5ng含量的蛋白检测。在某些情况下，使用蛋白银染进行聚丙稀酰胺凝胶蛋白染色是唯一能够检测超低浓度蛋白的方法。但是传统的蛋白银染需要加入的甲醛导致胶块发黄、染色背景过高，降低了检测的灵敏度，使检测低浓度蛋白受到影响。因此，改善提升银染的灵敏度，增大目的片段的沉淀亮度，降低银染背景出现黄色，进一步提高银染效果，实现极超微量蛋白的检测是发展方向。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种显色充分、降低银染染色背景、灵敏度高且实施可靠的低背景银染聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法。
为了实现上述的技术目的，本发明所采用的技术方案为：
一种低背景银染聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法，该方法包括对经电泳分离蛋白质处理后的聚丙烯酰胺凝胶依序进行固定处理、敏化处理、水洗处理、银染处理、显色处理、终止处理和水洗处理后，实现对蛋白质的染色处理，期中，敏化处理过程中，还加入有聚乙烯吡咯烷酮、2-氨基-2-甲基-丙醇和吐温的混合液。
作为一种可能的实施方式，进一步，所述的聚乙烯吡咯烷酮、2-氨基-2-甲基-丙醇和吐温的终浓度均为5％。
作为一种较优的选择实施方式，优选的，所述聚乙烯吡咯烷酮的分子量为58000D。
作为一种较优的选择实施方式，优选的，所述的吐温为吐温-80。
作为一种可能的实施方式，进一步，银染处理过程中，还加入有二甲苯。
作为一种较优的选择实施方式，优选的，银染处理过程中，所加入二甲苯的终浓度为0.5％。
作为一种较优的选择实施方式，优选的，所述的低背景银染聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法，其包括如下具体步骤：
(1)将经电泳分离蛋白质处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于固定液中固定处理30min；
(2)将固定处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于敏化处理液中敏化处理40min，其中，敏化处理液中还同步加入有聚乙烯吡咯烷酮、2-氨基-2-甲基-丙醇和吐温的混合液；
(3)将步骤(2)处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于乙醇、醋酸钠、戊二醛和五水硫代硫酸钠的混合液中浸泡处理30min；
(4)将步骤(3)处理后的聚丙烯酰胺凝胶进行水洗处理；
(5)将步骤(4)处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于质量浓度为0.1％硝酸银和20％甲醛混合的处理剂中银染处理20min，其中，处理剂中还加入了终浓度为0.5％的二甲苯；
(6)将银染处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于显色处理剂中进行显色处理10min；
(7)将显色处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于乙二胺四乙酸二钠中终止处理10min；
(8)将终止处理后的聚丙烯酰胺凝胶进行水洗处理，实现对蛋白质的染色处理。
作为一种较优的选择实施方式，优选的，步骤(1)中，固定液为50％的乙醇、10％的冰乙酸和40％双蒸水的混合而成；
步骤(2)中，敏化处理液为30％的乙醇，6.8％的醋酸钠，0.6％戊二醛混合而成，且聚乙烯吡咯烷酮、2-氨基-2-甲基-丙醇和吐温的终浓度均为5％；
步骤(3)中，所述的混合液为7.5％的乙醇、1.7％的醋酸钠、0.125％的戊二醛和0.2％的五水硫代硫酸钠混合而成；
步骤(4)中，使用双蒸水对聚丙烯酰胺凝胶进行水洗处理3次，每次5min；
步骤(6)中，显色处理剂为质量浓度为2.5％的碳酸钠和10％的甲醛混合而成；
步骤(7)中，乙二胺四乙酸二钠的质量浓度为2％；
步骤(8)中，采用双蒸水进行水洗处理3次，每次5min。
基于上述方案，本发明还提供一种蛋白质检测方法，其包括上述所述的低背景银染聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法。
采用上述的技术方案，本发明与现有技术相比，其具有的有益效果为：
(1)由于传统的银染方法染色表征图片不清晰，且对低浓度蛋白的检测较为困难，而本方案银染染色背景低，且显色充分；
(2)本方案在染色时在敏化处理过程中加入适量的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、(2-氨基-2-甲基-丙醇)AMP和吐温-80，在银染处理过程中加入二甲苯试剂，能够提高银染检测的灵敏度，降低银染时聚丙稀酰胺凝胶的染色背景，提高目的片段的亮度和银染效果，实现对低敏度银染蛋白，如细胞中表达的低丰度蛋白的检测；
(3)本方案具体在敏化处理过程中加入浓度均为0.5％的聚乙烯吡咯烷酮PVP(分子量58000D)、AMP(2氨基-2甲基-丙醇)和吐温-80进行同步处理，提高聚丙烯酰胺凝胶中蛋白条带的显色亮度且操作简单便利；在银染过程中，加入浓度为0.5％的二甲苯降低银染过程中的背景，使得胶块更白，提高目的片段的亮度和对比度，更方便检测仪器的扫描定量分析。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为对比例方法与本发明方法在BSA蛋白电泳染色检测结果上的对比图，其中，图1(a)为对比例方法的检测结果，图1(b)为本发明方法的检测结果，图1(a)和图1(b)的条带从左到右的蛋白裂解液分别为20ng、50ng、100ng和蛋白Marker，直观对比可见，本方案同批次检测的结果背景更薄、条带更清晰；
图2为本发明实施例加入不同浓度和不同添加物后BSA蛋白电泳的染色图，总3组，各组从左到右的电泳条带为蛋白裂解液20ng、50ng和100ng，其中，图2(a)为蛋白凝胶未加入二甲苯处理的原始图(图2(a)为未处理的原始图，图2(b)为加入了PVP、AMP和吐温80后的图)，图2(c)为染色过程中加入二甲苯处理后的图；
图3为本发明实施例超微量BSA蛋白定量结果图对比，本实验除了Marker外，从左到右条带蛋白浓度依次为0.1ng、0.2ng、0.5ng和10ng，图3(a)为原始处理组，图3(b)为二甲苯处理组，图3(c)为加入了二甲苯，PVP，AMP和吐温-80后处理组，直观对比可见，图3(b)比图3(c)胶块更白，而且图3(c)黑框处蛋白浓度为0.5ng的条带最为明显，显色效果明显改善。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明作进一步的详细描述。特别指出的是，以下实施例仅用于说明本发明，但不对本发明的范围进行限定。同样的，以下实施例仅为本发明的部分实施例而非全部实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种低背景银染聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法，其包括如下具体步骤：
(1)将经电泳分离蛋白质处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于固定液(50％的乙醇，10％的冰乙酸，40％双蒸水)中固定处理30min；
(2)将固定处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于敏化处理液(30％的乙醇，6.8％的醋酸钠，0.6％戊二醛)中敏化处理40min，其中，敏化处理液中还同步加入有终浓度均为5％的聚乙烯吡咯烷酮、2-氨基-2-甲基-丙醇和吐温-80混合液；
(3)将步骤(2)处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于乙醇、醋酸钠、戊二醛和五水硫代硫酸钠的混合液(7.5％的乙醇，1.7％的醋酸钠,0.125％的戊二醛，0.2％的五水硫代硫酸钠)中浸泡处理30min；
(4)将步骤(3)处理后的聚丙烯酰胺凝胶进行水洗处理(双蒸水洗3次，每次5分钟)；
(5)将步骤(4)处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于质量浓度为0.1％硝酸银和20％甲醛混合的处理剂中银染处理20min，其中，处理剂中还加入了终浓度为0.5％的二甲苯；
(6)将银染处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于显色处理剂(2.5％的碳酸钠，10％的甲醛)中进行显色处理10min；
(7)将显色处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于2％的乙二胺四乙酸二钠中终止处理10min；
(8)将终止处理后的聚丙烯酰胺凝胶进行水洗处理(双蒸水洗3次，每次5分钟)，实现对蛋白质的染色处理。
(9)照胶观察，加入适量双蒸水保存。
其中，本实施例内所有的蛋白样本均采用市售BSA(Sigma无脂肪酸类型)标准样本，样本采用SDS-PAGE经典电泳方法，浓缩胶为5％，分离胶为10％，采用北京六一电泳槽电泳，浓缩胶电压80伏，分离胶电压140伏，5x的上样商用SDS缓冲液(Tris-HCL PH6.8，60mM；SDS 2％；溴酚兰0.1％；甘油25％；β-巯基乙醇14.4mM)。
试剂均采用优级纯配制，上样前混匀煮样5分钟再电泳，双色25-250KD的蛋白Marker作为电泳标记，iBright 50智能成像系统凝胶成像仪照胶。
结合图3所示的表征结果可知，本发明方法中，在银染处理步骤内加入二甲苯使得胶块更为透明，胶块整体黄色状况改善，而敏化处理过程中加入PVP、AM和吐温-80等试剂盒联合使用使蛋白条带染色更清晰，很容易检测出蛋白浓度为0.5ng的样品。
对比例
一种银染聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法，其包括将经电泳分离蛋白质处理后的聚丙烯酰胺凝胶进行如下步骤处理：
(1)将经电泳分离蛋白质处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于固定液(50％的乙醇，10％的冰乙酸，40％双蒸水)中固定处理30min；
(2)将固定处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于敏化处理液(30％的乙醇，6.8％的醋酸钠，0.6％戊二醛)中敏化处理40min；
(3)将步骤(2)处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于乙醇、醋酸钠、戊二醛和五水硫代硫酸钠的混合液(7.5％的乙醇，1.7％的醋酸钠,0.125％的戊二醛，0.2％的五水硫代硫酸钠)中浸泡处理30min；
(4)将步骤(3)处理后的聚丙烯酰胺凝胶进行水洗处理(双蒸水洗3次，每次5分钟)；
(5)将步骤(4)处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于质量浓度为0.1％硝酸银和20％甲醛混合的处理剂中银染处理20min；
(6)将银染处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于显色处理剂(2.5％的碳酸钠，10％的甲醛)中进行显色处理10min；
(7)将显色处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于2％的乙二胺四乙酸二钠中终止处理10min；
(8)将终止处理后的聚丙烯酰胺凝胶进行水洗处理(双蒸水洗3次，每次5分钟)，实现对蛋白质的染色处理。
(9)照胶观察，加入适量双蒸水保存。
结合图3所示的表征结果可知，本对比例方法银染使用硝酸银和蛋白形成络合物染色，依靠甲醛在蛋白位点产生银镜反应，最终还原形成银沉淀。棕色银沉淀从而在胶上沉积，实现微量蛋白检测，而该方法实际对0.5ng级别蛋白检测难以分辨，不能有效检测。
基于实施例1的对比例的操作方法进行蛋白质检测，采用要素省略法进行对比测试，得到图1至图3所示的表征结果，其大致如下：
图1为对比例方法与本发明方法在BSA蛋白电泳染色检测结果上的对比图，其中，图1(a)为对比例的检测结果，图1(b)为本发明方法的检测结果，图1(a)和图1(b)的条带从左到右的蛋白裂解液分别为20ng、50ng、100ng和蛋白Marker，直观对比可见，本方案同批次检测的结果背景更薄、条带更清晰；
图2为对本发明实施例1进行加入不同浓度和不同添加物后BSA蛋白电泳的染色图，同时，采用变量控制中的要素省略对比测试，进行总3组的论证测试，各组从左到右的电泳条带为蛋白裂解液20ng、50ng和100ng，其中，图2(a)为对实施例1在蛋白凝胶中省去加入二甲苯处理的原始图(图2(a)为未处理的原始图，图2(b)为加入了PVP、AMP和吐温-80后的图)，图2(c)为染色过程中加入二甲苯处理后的表征图；
图3为本发明实施例超微量BSA蛋白定量结果图对比，本实验除了Marker外，从左到右条带蛋白浓度依次为0.1ng、0.2ng、0.5ng和10ng，图3(a)为原始处理组(即按对比例进行处理)，图3(b)为仅加入二甲苯处理组(即对实施例1进行省去加入PVP，AMP和吐温-80的操作)，图3(c)为加入了二甲苯，PVP，AMP和吐温-80后处理组，直观对比可见，图3(b)比图3(c)胶块更白，而且图3(c)黑框处蛋白浓度为0.5ng的条带最为明显，显色效果明显改善。
以上所述仅为本发明的部分实施例，并非因此限制本发明的保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效装置或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种低背景银染聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法，该方法包括对经电泳分离蛋白质处理后的聚丙烯酰胺凝胶依序进行固定处理、敏化处理、水洗处理、银染处理、显色处理、终止处理和水洗处理后，实现对蛋白质的染色处理，其特征在于，敏化处理过程中，还加入有聚乙烯吡咯烷酮、2-氨基-2-甲基-丙醇和吐温的混合液。
2.如权利要求1所述的低背景银染聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法，其特征在于，所述的聚乙烯吡咯烷酮、2-氨基-2-甲基-丙醇和吐温的终浓度均为5％。
3.如权利要求2所述的低背景银染聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法，其特征在于，所述聚乙烯吡咯烷酮的分子量为58000D。
4.如权利要求2所述的低背景银染聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法，其特征在于，所述的吐温为吐温-80。
5.如权利要求1所述的低背景银染聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法，其特征在于，银染处理过程中，还加入有二甲苯。
6.如权利要求5所述的低背景银染聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法，其特征在于，银染处理过程中，所加入二甲苯的终浓度为0.5％。
7.如权利要求6所述的低背景银染聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法，其特征在于，其包括如下具体步骤：
(1)将经电泳分离蛋白质处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于固定液中固定处理30min；
(2)将固定处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于敏化处理液中敏化处理40min，其中，敏化处理液中还同步加入有聚乙烯吡咯烷酮、2-氨基-2-甲基-丙醇和吐温的混合液；
(3)将步骤(2)处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于乙醇、醋酸钠、戊二醛和五水硫代硫酸钠的混合液中浸泡处理30min；
(4)将步骤(3)处理后的聚丙烯酰胺凝胶进行水洗处理；
(5)将步骤(4)处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于质量浓度为0.1％硝酸银和20％甲醛混合的处理剂中银染处理20min，其中，处理剂中还加入了终浓度为0.5％的二甲苯；
(6)将银染处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于显色处理剂中进行显色处理10min；
(7)将显色处理后的聚丙烯酰胺凝胶置于乙二胺四乙酸二钠中终止处理10min；
(8)将终止处理后的聚丙烯酰胺凝胶进行水洗处理，实现对蛋白质的染色处理。
8.如权利要求7所述的低背景银染聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法，其特征在于，
步骤(1)中，固定液为50％的乙醇、10％的冰乙酸和40％双蒸水的混合而成；
步骤(2)中，敏化处理液为30％的乙醇，6.8％的醋酸钠，0.6％戊二醛混合而成，且聚乙烯吡咯烷酮、2-氨基-2-甲基-丙醇和吐温的终浓度均为5％；
步骤(3)中，所述的混合液为7.5％的乙醇、1.7％的醋酸钠、0.125％的戊二醛和0.2％的五水硫代硫酸钠混合而成；
步骤(4)中，使用双蒸水对聚丙烯酰胺凝胶进行水洗处理3次，每次5min；
步骤(6)中，显色处理剂为质量浓度为2.5％的碳酸钠和10％的甲醛混合而成；
步骤(7)中，乙二胺四乙酸二钠的质量浓度为2％；
步骤(8)中，采用双蒸水进行水洗处理3次，每次5min。
9.一种蛋白质检测方法，其特征在于，其包括权利要求1至8之一所述的低背景银染聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的方法。
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