CN112697562A - 免脱色聚丙烯酰胺凝胶蛋白快速染色液及制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了免脱色聚丙烯酰胺凝胶蛋白快速染色液及制备和使用方法，涉及蛋白质分析检测技术领域。本发明包括如下配方：考马斯亮蓝G‑250、乙醇、硫酸铵、环糊精、盐酸调pH值至1.2‑1.4；制备方法包括如下步骤：S1、称取硫酸铵溶解于去离子水中；S2、加入环糊精；S3、称取考马斯亮蓝G‑250，溶于去离子水中；加入至S2步骤混合液中；S4、加入乙醇至混合液；S5、加入盐酸，调节pH值至1.2‑1.4；S6、定容至1L，室温避光保存。本发明极大地提高了考马斯亮蓝染色的检测灵敏度，在染色过程中，胶体状态的染料被排阻在胶外，很难对凝胶进行染色，防止了背景的生成；染色结束后无需洗脱，大大缩短了检测时间。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质分析检测技术领域，特别是免脱色聚丙烯酰胺凝胶蛋白快速染色液、免脱色聚丙烯酰胺凝胶蛋白快速染色液制备方以及免脱色聚丙烯酰胺凝胶蛋白快速染色液的使用方法。
背景技术
聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳技术已成为分子生物学实验中最常用的蛋白质分析检测方法。蛋白质经过电泳分离后，在凝胶中可以通过几种染色方法检测，如考马斯蓝染色法(Coomassie Brilliant Blue CBB)、银染和荧光染色法等。
银染是最敏感的蛋白染色方法之一，可以检测纳克水平蛋白，但其缺点是操作难度大，重复率低。此外，与传统的考马斯蓝染色相比，银染色的质谱(MS)相容性更差，因为它在敏化溶液中含有戊二醛。它也被认为是一种与MS不相容的方法。
荧光染色也可以在纳克水平上检测蛋白质，无需特殊技术要求。目前，SYPROorange、SYPRO red、Deep Purple和Flamingo是蛋白质组学研究中常用的荧光染色剂。然而，荧光染色试剂价格昂贵，且需要相对较长的处理时间。它还需要特殊的设备，如荧光成像扫描仪。
尽管银染的灵敏度高，各种荧光检测方法的动态范围广，但考马斯亮蓝染色法仍是电泳分离蛋白最常用的检测技术。CBB染色在1963年首次用于在醋酸纤维素片上染色蛋白质。1965年Meyer等，将此方法用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。CBB染色具有以下优点:成本低，可直观观察，操作简单，便于图像采集扫描程序，比银染色更适合定量分析，可进行快速或高灵敏度染色。
经典的CBB染色法：需要先进行固定，再进行染色和脱色。固定液，染色液和脱色液成分复杂且含有对人体有害的甲醇、冰醋酸等。该方法的灵敏度不高，检测下限仅为200-500ng，背景较高，而且整个过程时间较长。U.S.application No.US2001046709报道不用甲醇、乙酸等有害物质，但是需要染色前将凝胶放入水中，微波炉加热漂洗，染色时也需要放入微波炉，操作繁琐。CN 109520804 B报道染色液中加入木寡糖，染色迅速；染色后不需要脱色液脱色，但任然需要用蒸馏水漂洗30分钟，至凝胶基本无背景。
本发明提供一种无甲醇、冰醋酸等对人体有害物质；无需固定，染色快，灵敏度高，且染色后不需脱色液脱色也不需蒸馏水漂洗即可直接观察拍照的蛋白染色液。节省操作时间。
发明内容
本发明提供了免脱色聚丙烯酰胺凝胶蛋白快速染色液及制备和使用方法，解决了以上问题。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的免脱色聚丙烯酰胺凝胶蛋白快速染色液，包括如下配方：0.025％(W/V)的考马斯亮蓝G-250、10-20％(V/V)的乙醇、1-10％(W/V)的硫酸铵、0.5-5％(W/V)的环糊精、盐酸调pH值至1.2-1.4。
进一步地，所述环糊精采用α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精或其它改性环糊精中任意一种。
免脱色聚丙烯酰胺凝胶蛋白快速染色液的制备方法，以定容1L为基准，包括如下步骤：
S1、称取10-100g的所述浓度的硫酸铵，溶解于600ml去离子水中，搅拌溶解；
S2、加入5-50g的所述浓度的环糊精，搅拌溶解；
S3、称取0.1-0.25g的所述浓度的考马斯亮蓝G-250，溶于20ml去离子水中，搅拌溶解；将所得溶液加入至S2步骤混合液中；
S4、加入100-200ml的所述浓度乙醇至混合液，并搅拌混匀；
S5、向混合液中加入盐酸，调节pH值至1.2-1.4；
S6、用去离子水定容至1L，室温避光，保存至少一年。
进一步地，以定容1L为基准，包括如下步骤：
S1、称取40g的所述浓度的硫酸铵，溶解于600ml去离子水中，搅拌溶解；
S2、加入15g的所述浓度的α-环糊精，搅拌溶解；
S3、称取0.15g的所述浓度的考马斯亮蓝G-250，溶于20ml去离子水中，搅拌溶解；将所得溶液加入至S2步骤混合液中；
S4、加入150ml的所述浓度乙醇至混合液，并搅拌混匀；
S5、向混合液中加入盐酸，调节pH值至1.3；
S6、定容至1L，室温避光，保存至少一年。
免脱色聚丙烯酰胺凝胶蛋白快速染色液的使用方法，包括如下步骤：电泳结束后，将凝胶剥离玻璃板，放入染色盒中，将所述染色液颠倒混匀后，倒入适量染色液，摇床上摇2-10min，根据所需得到蛋白条带的清晰程度需要，适当增加染色时间。
本发明相对于现有技术包括有以下有益效果：
1、本发明提供的快速蛋白染色液，通过向染色液中添加环糊精大大提高染色的速度，2min-5min即可看到蛋白条带，极大地提高了考马斯亮蓝染色的检测灵敏度，染色灵敏度达到纳克水平。
2、本发明的染色液中添加了硫酸铵，得到一种胶体状态的染料，在染色过程中，胶体状态的染料被排阻在胶外，很难对凝胶进行染色，防止了背景的生成。
3、本发明提供的蛋白染色液的使用方法，由于背景较低，染色结束后无需洗脱，大大缩短了检测时间，可用于SDS-PAGE的快速蛋白质染色，提高工作效率。
4、本发明的染色液使用步骤简单，无需固定、煮沸、脱色等复杂操作，背景低，染色快速，2min可见蛋白条带；灵敏度高，可检测5-10ng蛋白；无需甲醇，冰醋酸等有害物质。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明具体实施例1染色5min后拍照图片；
图2为本发明具体实施例1染色60min后b组合d组拍照图片；
图3为本发明具体实施例2染色30min后拍照图片；
图4为本发明具体实施例3染色30min后拍照图片；
图5为本发明具体实施例4同市售产品对比拍照图片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
为了使本领域技术人员能更好了解本发明的技术方案和有益效果。下面用实施例来进一步说明本发明，以下实施例不应视为对本发明保护范围的限定。实施例中所用材料和试剂均为市售产品，未进一步注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：考马斯亮蓝染色液中添加硫酸铵和环糊精对蛋白染色的影响
本实施例的蛋白染色液的配置:各组各个组分比例如下表
配12.5％1.0mm厚度SDS-PAGE凝胶，150V电泳45min。蛋白样本分别为预染蛋白marker，非预染蛋白marker，BSA 2000ng 1000ng，500ng，250ng，125ng，62.5ng，30ng，20ng，15ng，10ng，5ng，细菌裂解液。
电泳结束将凝胶放入适量配制好的蛋白染色液中，分别染色5min，60min取出观察分析。
图1为染色5min后拍照图片。a组和c组只可染出1000ng以上蛋白条带，b组和d组染色液可染出30ng以上蛋白条带，由此可以分析，a-环糊精可以有效提高染色速度和染色灵敏度；
图2为染色时间60min后拍照。b组和d组都可染出10ng条带，5ng肉眼可见痕迹，a-环糊精可以使蛋白染色灵敏度提高至5-10ng。而硫酸铵对染色灵敏度没有显著影响，但b组背景较d组低。所以硫酸铵在降低染色背景起到一定作用。
具体实施例2：考马斯亮蓝浓度对染色的影响
本实施例提供的蛋白染色液，包括如下成分：无水乙醇15％(v/v)，硫酸铵4％(w/v)，1.5％β-环糊精(w/v)。考马斯亮蓝G-250浓度分别为：a组0.01％(w/v)；b组0.015％(w/v)；c组0.025％(w/v)；
本实施电泳条件，蛋白样品同实施一。
电泳结束再将凝胶放入适量配制好的蛋白染色液中，分别染色5min，15min，30min，60min，观察分析。
结果显示随着染色时间增加，染色条带越来越深。相同染色时间，含有较高浓度的考马斯亮蓝染色液会使蛋白条带着色更深，但是没有观察到灵敏度的显著增加，以及染色速度加快。图3为染色30min的图片。增加考马斯亮蓝浓度虽然可以增加蛋白条带着色深度，但是背景也相应增加。
实施例3：硫酸铵浓度优化
本实施例提供的蛋白染色液，包括如下成分：无水乙醇15％(v/v)，G-250 0.015％(w/v)，1.5％β-环糊精(w/v)。硫酸铵浓度分别为：a组2％(w/v)；b组4％(w/v)；c组6％(w/v)；d组8％(w/v)。
本实施电泳条件，蛋白样品同实施一。
电泳结束再将凝胶放入适量配制好的蛋白染色液中，分别染色5min，15min，30min，60min，过夜，取出观察分析。
结果显示硫酸铵浓度增加，染色背景随之降低。如图4所示：染色30min后拍照显示染色背景差异不显著。染色时间1小时，或者更久，含有高浓度硫酸铵染色液，染色背景更低。无需清水脱色，背景极低。可以直接拍照观察。
具体实施例4：染色背景与市售同类产品对比
本实施例提供的蛋白染色液，包括如下成分：无水乙醇15％(v/v)，G-250 0.015％(w/v)，1.5％α-环糊精(w/v)。2％(w/v)硫酸铵。同市面买的同类产品absci对比。
本实施电泳条件，蛋白样品同实施一。
电泳结束将凝胶放入本实施配置的蛋白染色液中以及对比染色液中(按照其说明书操作)，分别染色5min，15min，30min，60min，取出观察分析。
结果显示实验组的染色速度同对照组相当，但是染色灵敏度较对照组高，染色背景更低。染色1h后，取出直接观察，如图5(a)，对比组明显背景较高。
染色1h后，将对照组凝胶放如蒸馏水中，摇床漂洗；实验组放入染色液中静置，30min后取出观察。对照组漂洗半个小时同实验组背景相当，如图5(b)。
由上述结果可见，本申请中的蛋白染色液，染色速度快，灵敏度高，且背景极低。可以节省操作时间。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
本发明的关键点在于：
考马斯亮蓝染料通过静电作用与质子化的碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)结合，并与芳香残基疏水结合。染料不会与聚丙烯酰胺高亲和性的结合，但会穿透凝胶基质，并与其低亲和性结合，所以会有背景，需要脱色步骤本申请的蛋白染色液添加环糊精，尤其使a-环糊精，具有“内疏水、外亲水”的特殊锥形的中空圆筒立体环状结构，能够对考马斯亮蓝分子进行包合，使其更好的于蛋白分子结合，而不进入凝胶基质。从而提高染色的速度，和灵敏度，降低染色背景。优化了考马斯亮蓝和硫酸铵的比例，使背景极低，可以之间观察，无需脱色，无需蒸馏水漂洗，节省操作时间。通过添加环糊精可以大大提高考马斯亮蓝蛋白染色液的染色速度，并且大大降低背景。
有益效果：
1、本发明提供的快速蛋白染色液，通过向染色液中添加环糊精大大提高染色的速度，2min-5min即可看到蛋白条带，极大地提高了考马斯亮蓝染色的检测灵敏度，染色灵敏度达到纳克水平。
2、本发明的染色液中添加了硫酸铵，得到一种胶体状态的染料，在染色过程中，胶体状态的染料被排阻在胶外，很难对凝胶进行染色，防止了背景的生成。
3、本发明提供的蛋白染色液的使用方法，由于背景较低，染色结束后无需洗脱，大大缩短了检测时间，可用于SDS-PAGE的快速蛋白质染色，提高工作效率。
4、本发明的染色液使用步骤简单，无需固定、煮沸、脱色等复杂操作，背景低，染色快速，2min可见蛋白条带；灵敏度高，可检测5-10ng蛋白；无需甲醇，冰醋酸等有害物质。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
Claims (5)
1.免脱色聚丙烯酰胺凝胶蛋白快速染色液，其特征在于，包括如下配方：0.025％(W/V)的考马斯亮蓝G-250、10-20％(V/V)的乙醇、1-10％(W/V)的硫酸铵、0.5-5％(W/V)的环糊精、盐酸调pH值至1.2-1.4。
2.根据权利要求1所述的免脱色聚丙烯酰胺凝胶蛋白快速染色液，其特征在于，所述环糊精采用α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精或其它改性环糊精中任意一种。
3.如权利要求1-2任一项所述的免脱色聚丙烯酰胺凝胶蛋白快速染色液的制备方法，其特征在于，以定容1L为基准，包括如下步骤：
S1、称取10-100g的所述浓度的硫酸铵，溶解于600ml去离子水中，搅拌溶解；
S2、加入5-50g的所述浓度的环糊精，搅拌溶解；
S3、称取0.1-0.25g的所述浓度的考马斯亮蓝G-250，溶于20ml去离子水中，搅拌溶解；将所得溶液加入至S2步骤混合液中；
S4、加入100-200ml的所述浓度乙醇至混合液，并搅拌混匀；
S5、向混合液中加入盐酸，调节pH值至1.2-1.4；
S6、用去离子水定容至1L，室温避光，保存至少一年。
4.根据权利要求3所述的免脱色聚丙烯酰胺凝胶蛋白快速染色液的制备方法，其特征在于，以定容1L为基准，包括如下步骤：
S1、称取40g的所述浓度的硫酸铵，溶解于600ml去离子水中，搅拌溶解；
S2、加入15g的所述浓度的α-环糊精，搅拌溶解；
S3、称取0.15g的所述浓度的考马斯亮蓝G-250，溶于20ml去离子水中，搅拌溶解；将所得溶液加入至S2步骤混合液中；
S4、加入150ml的所述浓度乙醇至混合液，并搅拌混匀；
S5、向混合液中加入盐酸，调节pH值至1.3；
S6、用去离子水定容至1L，室温避光，保存至少一年。
5.如权利要求1-2任一项所述的免脱色聚丙烯酰胺凝胶蛋白快速染色液的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：电泳结束后，将凝胶剥离玻璃板，放入染色盒中，将所述染色液颠倒混匀后，倒入适量染色液，摇床上摇2-10min，根据所需得到蛋白条带的清晰程度需要，适当增加染色时间。
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