CN116046935A - 一种利用液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇的方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及生物样品检测领域，尤其涉及一种利用液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇的方法；包括：将定标品溶液和待测尿液样本分别与皮质醇同位素内标工作溶液进行混合，后进行离心，取上清液，分别得到定标品上清液和待测样本上清液；采用液相色谱串联质谱对定标品上清液进行检测，并绘制标准曲线；采用液相色谱串联质谱对待测样本上清液进行检测，并根据所述标准曲线得到待测尿液样本游离皮质醇的含量；其中，皮质醇同位素内标工作溶液的溶质包括皮质醇‑d和/或皮质醇‑13C；本发明前处理简单、样本用量小、试剂耗材成本低，有利于实现规模化的液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇。

Description

一种利用液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇的方法

技术领域

本申请涉及生物样品检测领域，尤其涉及一种利用液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇的方法。

背景技术

皮质醇是一种类固醇激素，在糖代谢、维持血管张力、免疫调节以及压力应激方面起着关键作用，主要受下丘脑-垂体的反馈调节。尿游离皮质醇(UFC)是各类肾上腺皮质功能障碍的敏感指标，尤其是皮质醇增多症(库欣综合征)的敏感指标，同时24小时UFC的测定被指南推荐为库欣综合征筛查的一线测试。

UFC的传统检测方法有放射免疫法、发光免疫法、液相色谱-紫外检测法，气相色谱-质谱法，这些方法均存在前处理过程复杂且步骤繁琐的缺点，其中临床常用的放射免疫法和发光免疫法还存在易发生交叉反应，且检测灵敏度有限的问题。近年来，液相色谱串联质谱法(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)越来越多的被用于UFC的检测，该方法具有灵敏度高、特异性好、通量高和耗时短的优点。在液相色谱串联质谱法中，为了除去样品蛋白的干扰，检测前通常需要对样本进行前处理，目前所报道的针对样本前处理方法多为蛋白沉淀法、液液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)或固相萃取法(solid phase extraction，SPE)，而目前这些前处理方法不仅操作步骤繁琐、样本用量大、而且耗时长、试剂耗材成本高且存在环境污染，此外用于绘制标准曲线的定标品溶液多采用4％(w/w)的牛血清白蛋白溶液或纯溶液，与真实人样基质存在较大差别，从而无法准确反映待测样品的实际情况，导致该方法难以规模化的应用于尿游离皮质醇的检测，因此如何提供一种规模化的利用液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇的方法，是目前亟需解决的技术问题。

发明内容

本申请提供了一种利用液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇的方法，以解决现有技术中液相色谱串联质谱法难以被大规模应用于尿游离皮质醇检测的技术问题。

第一方面，本申请提供了一种利用液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇的方法，所述方法包括：

将定标品溶液和待测尿液样本分别与皮质醇同位素内标工作溶液进行混合，后进行离心，取上清液，分别得到定标品上清液和待测样本上清液；

采用液相色谱串联质谱对所述所取定标品上清液直接进行检测，并绘制标准曲线；

采用液相色谱串联质谱对所述待测样本上清液进行检测，并根据所述标准曲线，得到待测尿液样本游离皮质醇的含量；

其中，所述皮质醇同位素内标工作溶液包皮质醇同位素内标溶质和皮质醇同位素内标溶剂；

所述皮质醇同位素内标溶质包括皮质醇-d和/或皮质醇-13C；

所述皮质醇同位素内标溶剂包括甲醇和/或水。

可选的，所述方法还包括：

对离体的尿液样本进行固相萃取至不含皮质醇为止，得到空白尿基质；

配制皮质醇的母液，并进行第一稀释，后以空白尿基质进行第二稀释，得到定标品溶液；

其中，所述定标品溶液的浓度为0.625ng/mL～500ng/mL。

可选的，所述第一稀释的稀释溶剂为甲醇和水的混合物，其中，所述甲醇和所述水的体积之比为1:3～3:1。

可选的，所述第二稀释包括以逐级稀释的方式进行第二稀释，所述第二稀释的终点溶液浓度为0.625ng/mL～500ng/mL。

可选的，所述待测尿液样本的体积和所述皮质醇同位素内标工作溶液的体积之比为1:2～1:6。

可选的，所述皮质醇同位素内标溶剂包括甲醇和水的混合物，其中，所述甲醇和所述水的体积之比为1:3～3:1。

可选的，所述待测尿液样本的取样量为10μL～100μL。

可选的，所述离心的转速≥12000rpm，所述离心的时间为2min～10min。

可选的，所述液相色谱串联质谱包括液相色谱，所述液相色谱的色谱柱为反相色谱柱，所述液相色谱的柱温为30℃～50℃，所述液相色谱的进样量为2μL～10μL，所述液相色谱的流速为0.3mL/min～0.5mL/min；所述液相色谱采用梯度洗脱方式进行色谱分离，所述梯度洗脱的流动相A包括质量分数为0％～0.1％甲酸的水溶液，所述梯度洗脱的流动相B包括质量分数为0％～0.1％甲酸的甲醇溶液。

可选的，所述液相色谱串联质谱包括质谱；

所述质谱包括电喷雾离子源，所述质谱的工作模式为负离子模式，所述质谱的离子源参数包括气帘气：30psi±5psi，碰撞气：9.0psi±0.2psi，离子源电压：-4500V±10V，离子源温度：500℃±10℃，雾化气：40psi±5psi，辅助加热气：50psi±5psi。本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：

本申请实施例提供的一种利用液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇的方法，区别于传统的液相色谱串联质谱检测皮质醇，本方法仅仅在待测尿液样本中加入皮质醇同位素内标工作溶液，混匀后进行离心，得到上清液再通过液相色谱实现分离并通过质谱进行检测，其中同位素内标溶液含有一定比例的有机溶剂，可对尿液中少量蛋白进行沉淀，实现了无需现有技术中的固相萃取(SPE)；而同位素内标溶液含有一定比例的水可使待测上清液更接近色谱流动相的组成和极性，有利于降低背景化学噪音的影响，提高信噪比。由于该方法简化了样品的前处理，使得对样本的前处理简单、快速、样本用量少且试剂耗材成本低，并且待测样本和同位素内标工作液混合离心即可上机检测的前处理操作有利于实现规模化的液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇，因此通过采用该方法能实现规模化的液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请实施例提供的方法的流程示意图；

图2为本申请实施例提供的方法的详细流程示意图；

图3为本申请实施例提供的定标品溶液的色谱图；

图4为本申请实施例提供的待测尿液样本的色谱图；

图5为本申请实施例提供的基质效应图。

具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

由于血液中含有蛋白，皮质醇容易与蛋白形成结合态，只有少部分以游离态的形式存在并排泄到尿液中来，因此尿皮质醇在进行液相色谱-串联质谱检测前需要进行样本的前处理，除去基质的干扰物质以便于定量测定，通常采用的液液萃取或固相萃取方法。液液萃取需要加入有机溶剂对水相中的分析物进行萃取，然后取有机相层进行吹干浓缩，再复溶后上机，整个过程不仅操作复杂，还会使用到有毒的有机溶剂正己烷、乙酸乙酯、氯仿等。固相萃取需要经过柱平衡、上样、淋洗、洗脱、氮吹和复溶等多个步骤，整个过程不仅十分繁琐、耗时长，条件优化过程中也需要比较多种溶剂而污染环境，而且萃取小柱都是一次性使用的，试剂耗材成本较高。再者由于操作步骤过多，每个步骤中都存在分析物的损失，这样需要使用的样本量也会随之加大。目前已发表的专利或文献中所报道的前处理方法多为蛋白沉淀法、液液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)或固相萃取法(solid phaseextraction，SPE)，如CN 201610220199.8：“高相液相色谱串联质谱技术检测唾液中皮质醇的方法及试剂盒”中样品预处理包括500μL唾液样本与内标溶液混匀后加入乙酸乙酯-正己烷的混合液进行液液萃取，再氮气吹干复溶，整个过程至少需要21min(不包括氮吹)；CN202011000429.2：“生物体液中糖皮质激素的液相色谱串联质谱检测方法”中样本的预处理包括将100-500μL生物体液样本进行蛋白沉淀后离心，取上清液进行固相萃取，收集洗脱液并氮气吹干，复溶后上机，整个过程至少需要7min(不包括氮吹)，这些处理方法不仅操作步骤繁琐、样本用量大、而且耗时长、试剂耗材成本高且存在环境污染。

目前已发表的专利或文献中用于绘制标准曲线的定标品溶液多采用4％(w/w)的牛血清白蛋白溶液(CN201610220199.8)或纯溶液(CN202011000429.2)配制，但是模拟人样基质和纯溶剂与真实人样基质存在较大差别，基质效应也不一样，无法反映体液样本的实际分析情况，不适合临床实验室的常规分析检测。

因此现有的液相色谱串联质谱的检测方法存在的缺点使得其无法规模化的用于皮质醇的检测中。

如图1所示，本申请提供了一种利用液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇的方法，所述方法包括：

S1.将定标品溶液和待测尿液样本分别与皮质醇同位素内标工作溶液进行混合，后进行离心，取上清液，分别得到定标品上清液和待测样本上清液；

S2.采用液相色谱串联质谱对所述定标品上清液进行检测，并绘制标准曲线；

S3.采用液相色谱串联质谱对所述待测样本上清液进行检测，并根据所述标准曲线，得到待测尿液样本游离皮质醇的含量；

其中，所述皮质醇同位素内标工作溶液包皮质醇同位素内标溶质和皮质醇同位素内标溶剂；

所述皮质醇同位素内标溶质包括皮质醇-d((≥3))和/或皮质醇-13C(≥1)；

所述皮质醇同位素内标溶剂包括甲醇和/或水。

本申请实施例中，控制皮质醇同位素内标工作溶液的溶质和溶剂的具体种类，能除去杂质干扰和/或提高信噪比，从而保证待分析物及其同位素内标在液相色谱串联质谱中被检测出。

定标品溶液是由皮质醇工作液通过一定的溶剂定容和/或稀释得到的用于定标的溶液，溶剂包括合成的纯溶液基质或模拟基质，也包括对离体尿液进行皮质醇去除的尿液。

在一些可选的实施方式中，如图2所示，所述方法还包括：

S101.对离体的尿液样本进行固相萃取至不含皮质醇为止，得到空白尿基质；

S102.配制皮质醇的母液，并进行第一稀释，后以空白尿基质进行第二稀释，得到定标品溶液

其中，所述定标品溶液的浓度为0.625ng/mL～500ng/mL。

本申请实施例中，控制定标品溶液的浓度为0.625ng/mL～500ng/mL的积极效果是在该浓度范围内，能保证定标品溶液的浓度梯度符合预期并覆盖临床样本中待测物的分析浓度范围，保证通过已知浓度定标品和内标绘制标准曲线图得到准确的定量校正方程，从而根据尿液检测样品的信号响应程度，能准确的反映出皮质醇的含量。

在一些可选的实施方式中，所述第一稀释的稀释溶剂为甲醇和水的混合物，其中，所述甲醇和所述水的体积之比为1:3～3:1。

本申请实施例中，控制甲醇和水的体积之比为1:3～3:1的积极效果是在该体积之比的范围内，能保证皮质醇同位素内标溶液的溶质被充分溶解，同时有效去除尿液中的少量蛋白及降低背景信号。

在一些可选的实施方式中，所述第二稀释包括以逐级稀释的方式进行第二稀释，所述第二稀释的终点溶液浓度为0.625ng/mL～500ng/mL。

本申请实施例中，控制第二稀释的终点溶液浓度为0.625ng/mL～500ng/mL的积极效果是在该浓度范围内，能保证通过已知浓度标准品和内标绘制标准曲线图得到准确的定量校正方程，从而根据尿液检测样品的信号响应程度，能准确的反映出皮质醇的含量。

在一些可选的实施方式中，所述待测尿液样本的体积和所述皮质醇同位素内标工作溶液的体积之比为1:2～1:6。

本申请实施例中，控制待测尿液样本的体积和皮质醇同位素内标工作溶液的体积之比为1:2～1:6的积极效果是在该体积之比的范围内，能保证皮质醇同位素内标工作溶液中皮质醇同位素内标和待测尿液样本中皮质醇的合适信号响应，从而保证液相色谱串联质谱检测的准确性，进而准确测定皮质醇的含量。

在一些可选的实施方式中，所述皮质醇同位素内标溶剂包括甲醇和水的混合物，其中，所述甲醇和所述水的体积之比为1:3～3:1。

本申请实施例中，控制甲醇和水的体积之比为1:3～3:1的积极效果是在该范围之比内，能保证皮质醇同位素内标溶液的溶质被充分溶解，同时有效去除尿液中的少量蛋白及降低背景信号，从而能得到预期功能的内标溶液。

固相萃取中所用固相萃取柱的柱容量≥60mg，柱填料为C18或HLB。

使尿液样本中不含皮质醇的具体步骤为通过液相色谱-串联质谱在保留时间处的出峰情况判断尿基质中的皮质醇是否除干净，如果仍能检出，采用新的萃取柱重复上述操作，直到尿基质中不含皮质醇为止

在一些可选的实施方式中，所述待测尿液样本的取样量为10μL～100μL。

本申请实施例中，控制待测尿液样本的取样量为10μL～100μL的积极效果是在该取样量的范围内，能通过控制样本的取样量保证检测的样本足够，从而保证检测的准确性。

在一些可选的实施方式中，所述离心的转速≥12000rpm，所述离心的时间为2min～10min。

本申请实施例中，控制离心的具体参数，能保证对待测尿液样本中杂质的去除，从而提高后续液相色谱串联质谱的检测准确性。

在一些可选的实施方式中，所述液相色谱串联质谱包括液相色谱，所述液相色谱的色谱柱为反相色谱柱，所述液相色谱的柱温为30℃～50℃，所述液相色谱的进样量为2μL～10μL，所述液相色谱的流速为0.3mL/min～0.5mL/min；

所述液相色谱采用梯度洗脱方式进行色谱分离，所述梯度洗脱的流动相A包括质量分数为0％～0.1％甲酸的水溶液，所述梯度洗脱的流动相B包括质量分数为0％～0.1％甲酸的甲醇溶液。

本申请实施例中，控制液相色谱的具体参数，能通过反相色谱柱配合具体的柱温、进样量和流速这些参数，并且进一步限定梯度洗脱的流动相A和流动相B，能保证经过液相色谱后尿液检测样品中的各物质被分离出，从而保证后续质谱检测的准确性。

反相色谱柱在该方法实际应用过程中，一般采用C8或者C18柱。

在一些可选的实施方式中，所述梯度洗脱具体包括：

0～2.80min,流动相A的体积百分比为25％～45％，流动相B的体积百分比为55％～75％；

2.81min,流动相A的体积百分比降为0～20％，流动相B的体积百分比升高为80％～100％；

2.81min～3.50min,流动相A的体积百分比为0～20％，流动相B的体积百分比为80％～100％；

3.51min,流动相A的体积百分升高为25％～45％，流动相B的体积百分比为升高为55％～75％；

3.51min～4.50min，流动相A的体积百分比为25％～45％，流动相B的体积百分比为55％～75％。

本申请实施例中，控制具体的梯度洗脱的流动相A和流动相B的比例，能保证皮质醇和其它干扰物的完全分离。

在一些可选的实施方式中，所述液相色谱串联质谱包括质谱；

所述质谱包括电喷雾离子源，所述质谱的工作模式为负离子模式，所述质谱的离子源参数包括气帘气：30psi±5psi，碰撞气：9.0psi±0.2psi，离子源电压：-4500V±10V，离子源温度：500℃±10℃，雾化气：40psi±5psi，辅助加热气：50psi±5psi。

在一些可选的实施方式中，所述质谱的离子对包括：皮质醇-d离子对：407.2/331.1，407.2/297.1，407.2/282；

皮质醇-d和/或皮质醇-13C离子对：由皮质醇同位素内标中同位素标记特征所决定(例如：皮质醇-13C3离子对为410.2/334.1，410.2/300.2，410.2/285.2)。

本申请实施例中，控制质谱的具体参数，能利用三重四级杆中的多反应监测模式特异性的检测皮质醇的含量，同时根据已知浓度的定标品溶液和内标绘制标准曲线图可以得到定量校正方程，再根据尿液检测样本中待测物的信号响应可以准确的计算皮质醇的含量，从而得以实现尿液中游离皮质醇的规模化测定。

控制质谱中皮质醇的具体离子对，配合皮质醇同位素内标溶液的溶质，将待测尿液样本中的皮质醇含量准确的测定出，从而实现尿液中游离皮质醇的规模化测定。

下面结合具体的实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1

1.空白尿基质的制备：混合人尿样本至少100mL，通过固相萃取柱HLB(3mL/60mg)吸附尿液中的游离皮质醇后，收集上样时流出液作为尿基质；通过液相色谱串联质谱在保留时间处的出峰情况判断尿基质中的皮质醇是否除干净，如果仍能检测出，采用新的萃取柱重复上述操作，直到尿基质中不含皮质醇，作为空白尿基质。将制备得到的空白尿基质用于后续制备阶段中。

2.定标品溶液的制备：称量0.0100g皮质醇固体粉末，用甲醇在容量瓶中定容至10mL容量瓶，溶解后得到浓度为1.0mg/mL的皮质醇的母液，再用甲醇和水(1:1，v/v)的混合物进行第一稀释得到浓度为10μg/mL的皮质醇工作液，最后用制备得到的空白尿基质逐级稀释得到皮质醇浓度范围为0.625ng/mL～500ng/mL的定标品溶液。

3.皮质醇同位素内标工作溶液的制备：用甲醇和水(1:1v/v)的混合物稀释内标储备液，配制浓度为5ng/mL的皮质醇同位素内标工作溶液。

4.样品前处理：分别取50μL待测尿液样本、定标品溶液或质控品，与200μL皮质醇同位素内标工作溶液的工作液混合(1:4，v/v)，涡旋1min混匀，离心5min(常温，14000rpm)，取上清液200μL至进样小瓶中，得到尿液检测样品，再上机检测。

5.仪器条件：液相色谱条件如下：

色谱柱：Kinetex-C18色谱柱(100×3.0mm,2.6μm,

pore size,Phenomenex,Torrance,CA,USA)；

柱温：40℃；

进样量：5μL；

流速：0.4mL/min；

流动相A为甲酸水溶液，流动相B为甲酸的甲醇溶液，采用等度洗脱。

所述高效液相色谱-串联质谱仪的液相梯度为：

0～2.80min,流动相A的体积百分比为35％，流动相B的体积百分比为65％；

2.81min,流动相A的体积百分比降为0％，流动相B的体积百分比升高为100％；

2.81min～3.50min,流动相A的体积百分比为0％，流动相B的体积百分比为100％；

3.51min,流动相A的体积百分升高为35％，流动相B的体积百分比为升高为65％；

3.51min～4.50min，流动相A的体积百分比为35％，流动相B的体积百分比为65％。

在此梯度洗脱条件下，待测的保留时间约为2.25min(如图3和图4所示)，内标保留时间约为2.27min。这说明本申请方法中液相色谱的检测时间短、出峰时间快和检测通量高。

6.仪器条件：质谱条件如下：

采用AB Sciex 5500三重四级杆质谱仪；采用电喷雾离子源，负离子模式，多反应监测模式(MRM)，MRM扫描模式具体质谱参数如表1所示；离子源参数包括：气帘气：30psi，碰撞气：9psi，离子源电压：-4500V，离子源温度：500℃，雾化气40psi，辅助加热气：50psi。

表1质谱参数情况表

分析物名称	MRM离子对	DP(V)	EP(V)	CE(V)	CXP(V)
						皮质醇定量离子对	407.2/297.1	-96	-10	-44	-22
皮质醇定性离子对	407.2/282.1	-71	-10	-53	-22
						皮质醇-13C3定量离子对	410.2/300.2	-92	-10	-45	-18
皮质醇-13C3定性离子对	410.2/285.2	-68	-10	-53	-18

7.验证上述方法和参数，具体验证参数和验证结果如下所示：

(1)线性范围：

用于绘制标准曲线的每个浓度的定标品检测6次，并计算各浓度样本的平均值、CV和回收率，结果如表2所示。

表2各浓度线性范围的平均值、CV和回收率的情况表

由表2数据可知，尿液皮质醇的线性范围为0.625ng/mL～500ng/mL，6条曲线的拟合优度的线性相关系数为R²＝0.9998，说明该曲线线性对于测定值的拟合程度十分良好，满足临床样本检测需求。

(2)精密度：

精密度评价包括批内精密度和批间精密度评价，分别采用三个浓度水平的自制质控样品(4ng/mL,25ng/mL,200ng/mL)，每个样本测定6次得到批内精密度，连续测定6天得到批间精密度，结果如表3所示。

表3尿液中皮质醇的批内和批间精密度实验数据

由表3可知，精密度考察结果显示皮质醇的批内精密度≤2.98％，批间精密度≤2.97％，具有很好的精密度，该结果满足定量分析的要求。

(3)准确度：

采用回收实验评价准确度：向一份患者样本中以9:1(v/v)加入四个不同浓度的待测物，加标后的最终浓度需覆盖整个医学决定水平；另一份患者样本中加入等体积的溶剂，对两份样本重复测定6次，计算回收率，回收率的计算公式为：回收率％＝(实测浓度-基础浓度)/加标理论浓度*100％；结果如表4所示。

表4皮质醇回收率实验数据表

由表4的数据可知，尿液中皮质醇的加标回收率均在93.3％-109％之间，满足回收率在85％-115％之间的要求，表明该结果满足定量分析的要求。

(4)分析灵敏度：

将检测限(LOD)定义为最小的检出浓度(S/N>3)；分析灵敏度，又称定量限(LOQ)，定义为能可靠定量的分析物最低浓度，要求S/N>10,变异系数CV<20％，且理论值和实测值的偏倚不超过20％，结果如表5所示。

表5定量限和检测限实验数据表

由表5可知，该方法的定量限为0.125ng/mL，说明定量下限较低，可以满足临床检测的需求。

(5)基质效应：

采用柱后灌注法：分析物标准溶液(10μg/mL)从质谱以10μL/min的流速进样，制备纯基质在走样条件下从液相进样，观察有无基质效应。

结果如图5所示，皮质醇的保留时间为2.25min，在保留时间处并无基质增强或减弱效应。

实施例2

将实施例2和实施例1进行对比，实施例2和实施例1的区别在于：

对比实施例1所公开的方法、传统液相色谱串联质谱所用的液液萃取法和传统液相色谱串联质谱所用的固相萃取法处理样品的步骤流程和所需样本量，具体如表6所示。

表6各方法处理样品的步骤流程和所需样本量的差异情况表

再以处理1000个样本为例，分析液液萃取和固相萃取与实施例1中记载的方法在前处理时间、试剂和耗材成本等各方面的差异，结果如表7所示。

表7实施例1的直接混合稀释法、液液萃取和固相萃取法的样本前处理对比情况表

对比参数	液液萃取步骤	固相萃取步骤	直接混合稀释法
				前处理时间(96个样本)	60min	120min	10min
试剂成本/元(1000个样本)	4000	4000	2000
				耗材成本/元(1000个样本)	3000	32000	1000

由表6和表7可知，直接混合稀释法相较液液萃取法和固相萃取法，不仅所需样本量较小、总操作步骤较少、前处理时间短、耗材成本低，而且在整个过程中使用到有机溶剂的步骤少，环境污染小，在推广应用于临床实验室检测有显著优势，且可规模化用于尿液中游离皮质醇的检测。

本申请实施例中的一个或多个技术方案，至少还具有如下技术效果或优点：

(1)本申请实施例提供的一种利用液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇的方法，区别于传统的液相色谱串联质谱检测皮质醇，仅仅在待测尿液样本中加入皮质醇同位素内标工作溶液，再进行离心，使得对样本的前处理简单、快速、样本用量少且试剂耗材成本低，因此通过采用该方法能实现规模化的液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇。

(2)本申请实施例提供的一种利用液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇的方法，仅仅通过在尿液样本中加入特定的皮质醇同位素内标工作溶液(尤其是以甲醇-水混合液为溶剂的内标溶液)，混匀并离心后就可直接进行上机分析，无需再对样本进行液液萃取和固相萃取法对样本进行前处理。

(3)本申请实施例提供的一种利用液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇的方法，在13min以内(包括上机分析时间)就可以在精密度、准确度、线性范围、分析灵敏度和基质效应均满足临床应用要求的前提下，实现对尿液游离皮质醇的检测，相比现有技术不仅样本处理步骤简单、时间短、成本低和环境污染小，而且样本量也较小。

(4)本申请实施例提供的一种利用液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇的方法，采用制备得到的空白尿基质配制定标品而绘制的标准曲线能更好地反映人样的真实浓度，这些均有利于该方法推广应用到临床实验室尿游离皮质醇的高通量准确检测。

本申请的各种实施例可以以一个范围的形式存在；应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本申请范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所述范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。

在本申请中，在未作相反说明的情况下，使用的方位词如“上”和“下”具体为附图中的图面方向。另外，在本申请说明书的描述中，术语“包括”“包含”等是指“包括但不限于”。在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。在本文中，“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。在本文中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“至少一种”、“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种利用液相色谱串联质谱检测尿液游离皮质醇的方法，其特征在于，所述方法包括：将定标品溶液和待测尿液样本分别与皮质醇同位素内标工作溶液进行混合，后进行离心，取上清液，分别得到定标品上清液和待测样本上清液；

采用液相色谱串联质谱对所述定标品上清液进行检测，并绘制标准曲线；

采用液相色谱串联质谱对所述待测样本上清液进行检测，并根据所述标准曲线，得到待测尿液样本游离皮质醇的含量；

其中，所述皮质醇同位素内标工作溶液包括皮质醇同位素内标溶质和皮质醇同位素内标溶剂；

所述皮质醇同位素内标溶质包括皮质醇-d和/或皮质醇-13C；

所述皮质醇同位素内标溶剂包括甲醇和/或水。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

对离体的尿液样本进行固相萃取至不含皮质醇为止，得到空白尿基质；

配制皮质醇的母液，并进行第一稀释，后以空白尿基质进行第二稀释，得到定标品溶液

其中，所述定标品溶液的浓度为0.625ng/mL～500ng/mL。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一稀释的稀释溶剂为甲醇和水的混合物，其中，所述甲醇和所述水的体积之比为1:3～3:1。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第二稀释包括以逐级稀释的方式进行第二稀释，所述第二稀释的终点溶液浓度为0.625ng/mL～500ng/mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测尿液样本的体积和所述皮质醇同位素内标工作溶液的体积之比为1:2～1:6。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述皮质醇同位素内标溶剂包括甲醇和水的混合物，其中，所述甲醇和所述水的体积之比为1:3～3:1。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测尿液样本的取样量为10μL～100μL。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心的转速≥12000rpm，所述离心的时间为2min～10min。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱包括液相色谱，所述液相色谱的色谱柱为反相色谱柱，所述液相色谱的柱温为30℃～50℃，所述液相色谱的进样量为2μL～10μL，所述液相色谱的流速为0.3mL/min～0.5mL/min。

所述液相色谱采用梯度洗脱方式进行色谱分离，所述梯度洗脱的流动相A包括质量分数为0％～0.1％甲酸的水溶液，所述梯度洗脱的流动相B包括质量分数为0％～0.1％甲酸的甲醇溶液。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱串联质谱包括质谱；

所述质谱包括电喷雾离子源，所述质谱的工作模式为负离子模式，所述质谱的离子源参数包括气帘气：30psi±5psi，碰撞气：9.0psi±0.2psi，离子源电压：-4500V±10V，离子源温度：500℃±10℃，雾化气：40psi±5psi，辅助加热气：50psi±5psi。

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