CN117074555A - 一种血浆中氟比洛芬的检测方法 - Google Patents

一种血浆中氟比洛芬的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种血浆中氟比洛芬的检测方法，包括：采用氟比洛芬标准曲线工作液加入空白血浆配制成标准曲线血浆样品；采用同位素内标配制内标工作溶液。取待测血浆样品，加入内标工作溶液；再加入沉淀剂、涡旋，离心，取上层清液用于LC‑MS/MS检测。通过检测预处理后的标准曲线血浆样品绘制标准曲线；根据标准曲线计算待测血浆中氟比洛芬的含量。本发明血浆样品的预处理方法简单便捷，同时灵敏度高，氟比洛芬的血浆最低检测限为20.00pg/mL。本发明方法的检测下限能满足较小给药量时生物体内的含量测定要求，检测过程中信噪比符合标准要求，无杂质峰的干扰，测定的药物的含量准确度高。

Description

一种血浆中氟比洛芬的检测方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种采用LC-MS检测血浆中氟比洛芬的方法。
背景技术
氟比洛芬是由英国布兹(Boots)公司开发的非甾体类抗炎药(NSAIDS)，其作用机制主要为非选择性地抑制环氧合酶，阻断前列腺素的生物合成，从而发挥药效。氟比洛芬已被广泛地用于炎症和疼痛的治疗。
目前，对血浆样品的预处理方法主要有蛋白沉淀法、液液萃取法和固相萃取法。现有的氟比洛芬血药浓度的检测方法中，采用蛋白沉淀法预处理，检测限较高，线性范围为0.05～50μg/mL(LC-MS/MS法测定人血清中氟比洛芬含量[J].药物分析杂志，2008，28(08)：1248-1251)；采用液液萃取法预处理，加入含有盐酸的甲基叔丁基醚溶液进行提取，分离有有机层，氮吹干燥后使用流动相复溶，检测限降低至2.0～1000ng/mL，但是预处理步骤复杂且耗时(对映体选择性HPLC-MS用于氟比洛芬贴剂药物动力学研究[J].中国药学杂志，2013，48(13)：1099-1103)。
现有的检测方法存在检测限高、预处理效率低的问题，并不能很好的满足临床开展氟比洛芬血药浓度的检测、药物动力学及生物利用度的研究需求。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种血浆中氟比洛芬的检测方法，该方法采用蛋白沉淀法预处理血浆样品，并采用同位素内标作为校正，通过LC-MS/MS法进行检测。本发明血浆样品的预处理方法简单便捷，同时灵敏度高。本发明方法的检测下限能满足较小给药量时生物体内的含量测定要求，检测过程中信噪比符合标准要求，无杂质峰的干扰，测定的药物的含量准确度高。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案具体如下所述：
一种血浆中氟比洛芬的检测方法，该方法包括如下步骤：
S1：采用氟比洛芬对照品配制不同浓度的标准曲线工作溶液；向标准曲线工作液加入空白血浆配制成标准曲线血浆样品；采用同位素内标配制内标工作溶液；
S2：血浆样品预处理：
取待测血浆样品，加入稀释剂、内标工作溶液；混匀后再加入沉淀剂，涡旋，离心，取上层清液用于LC-MS/MS检测；
S3：氟比洛芬的定量计算：
标准曲线血浆样品经预处理后，进行LC-MS/MS检测，(氟比洛芬峰面积与内标峰面积比)对(标准曲线中氟比洛芬的理论浓度与内标浓度比)进行线性最小二乘法回归计算，得到回归方程，进而计算样品中氟比洛芬的实测浓度。
进一步地，步骤S1中，所述标准曲线工作液的配制：称取氟比洛芬对照品，加入溶剂，最终配制成的氟比洛芬浓度为1.000mg/mL的标准对照品储备液。取体积的标准对照品储备液，用稀释剂逐级稀释得到多个浓度的标准曲线工作溶液。
进一步地，步骤S1中，所述标准曲线工作溶液的浓度范围为10.00～4000ng/mL。优选地，标准曲线工作液各浓度为4000、3200、1600、800.0、400.0、160.0、20.00、10.00ng/mL。
进一步地，步骤S1中，所述标准曲线血浆样品的浓度范围为0.500～200ng/mL。优选地，准曲线血浆样品各浓度为200、160.0、80.00、40.00、20.00、8.000、1.000、0.500ng/mL。
进一步地，步骤S1中，所述内标工作溶液的配制：称取同位素内标对照品，加入溶剂，摇匀，即得内标储备液，置于-20℃条件下保存。取内标储备液，加入稀释剂，定容稀释得到内标工作溶液。
进一步地，所述溶剂是甲醇；所述稀释剂是体积比为1∶1的甲醇-水溶液。
进一步地，步骤S1中，所述同位素内标是氟比洛芬-13C-d3或氟比洛芬-d3。进一步地，步骤S1中所述内标溶液浓度为50～100ng/mL。
进一步地，步骤S2中，所述待测血浆样品与内标溶液的的体积比为2：1。优选地，所述待测血浆样品为100μL，所述内标工作溶液为50μL。进一步地，步骤S2中，所述沉淀剂为甲醇。进一步地，所述沉淀剂的体积为300μL。
进一步地，步骤S2中，所述涡旋的时间为3～10min。进一步地，步骤S2中，所述离心的条件为4℃、2450g、10min。
进一步地，步骤S2中，所述LC-MS/MS检测的液相条件：色谱柱：GL SciencesInertSustain C18 3μm 3.0×100mm；预柱：Security GuardTM Cartridges C18 4×3.0mm；梯度洗脱；流速：0.4～0.6mL/min；进样量：20μL；柱温：40℃；洗针液：体积比为1：1的甲醇-水溶液。
所述流动相选自：(1)流动相A：2mM乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；(2)流动相A：0.1％甲酸水；流动相B：体积比为40：60的甲醇-乙腈混合溶液；(3)流动相A：2mM乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；
所述梯度洗脱的程序为：
或
Time(min) A(％) B(％)
1 0.00 70.0 30.0
2 0.20 70.0 30.0
3 2.20 10.0 90.0
4 4.00 10.0 90.0
5 4.01 70.0 30.0
6 4.80 70.0 30.0
。
进一步地，步骤S2中，所述LC-MS/MS检测的质谱条件：电喷雾离子化源(ESI源)，多反应监测(MRM)模式，负离子模式扫描。
进一步地，步骤S2中，所述质谱条件还包括检测离子对设置、质谱切换阀设置和离子源参数设置；
检测离子对设置如下：
Name Q1 Mass(Da) Q3 Mass(Da) Dwell(msec) DP EP CE CXP
FBLF 243.2 199.1 200 -40 -10 -12 -16
FBLF-13C-d3 247.1 202.7 200 -40 -10 -12 -16
或
Name Q1 Mass(Da) Q3 Mass(Da) Dwell(msec) DP EP CE CXP
FBLF 243.2 199.1 200 -40 -10 -12 -16
FBLF-d3 246.3 201.9 200 -40 -10 -12 -16
质谱切换阀设置如下：
Total time(min) Position
1 1.0 B
2 3.0 A
离子源参数设置如下：
与现有技术相比较，本发明的有益技术效果如下：
1)本发明采用氟比洛芬-13C-d3作为内标，氟比洛芬对其没有干扰，检测结果更为准确。
2)本发明的检测方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中的氟比洛芬的浓度，灵敏度较高，氟比洛芬的血浆最低定量限为20.00pg/mL。
3)在本发明所采用的色谱条件下，氟比洛芬保留时间为1.84min左右，氟比洛芬-13C-d3保留时间为1.83min左右，峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳。
4)本发明提供的方法，采用蛋白沉淀法，预处理过程简单快捷，提高了临床生物样品检测的效率；本发明方法能够满足人体药代动力学要求，可应用与临床药代动力学研究。
5)本方法氟比洛芬的血浆标准曲线线性范围为0.5000～200.0ng/mL，最低定量下限为0.5000ng/mL，最低检测下限为20.00pg/mL，批内和批间精密度RSD均小于9.1％；本发明方法重现性好，准确度高，不受基质、高血脂基质和溶血基质的干扰，不同人群的血浆对本发明方法无干扰现象。
附图说明
图1使用组成1作为流动相时，氟比洛芬和氟比洛芬-13C-d3的色谱图
图2使用组成2作为流动相时，氟比洛芬和氟比洛芬-13C-d3的色谱图
图3使用组成3作为流动相时，氟比洛芬和氟比洛芬-13C-d3的色谱图
图4使用流动相洗脱梯度1洗脱时，氟比洛芬和氟比洛芬-13C-d3的色谱图
图5使用流动相洗脱梯度2洗脱时，氟比洛芬和氟比洛芬-13C-d3的色谱图
图6LC-MS/MS法测得的人血浆中氟比洛芬的标准曲线图
图7LC-MS/MS法测得的最低检测限样品中氟比洛芬的色谱图
图8LC-MS/MS法测得的最低检测限样品中氟比洛芬-13C-d3的色谱图
图9氟比洛芬负离子多反应检测扫描质谱图
图10氟比洛芬-13C-d3负离子多反应检测扫描质谱图
具体实施方式
下面对本发明的技术方案进行举例说明，本发明请求保护的范围包括但不限于以下实施例。
1.主要仪器
API 5500型三重四极杆液质联用仪(AB Sciex公司)，配有电喷雾离子化源及Analyst(Version1.6.3)数据处理系统，配有ExionLCAD液相色谱仪(含自动进样器、柱温箱等)，Watson LIMS Software7.6.1；
METTLER TOLEDO XPR2/A型百万分之一天平；
Sartorius BS224S型万分之一天平。
2.色谱条件
色谱柱：GL Sciences InertSustain C18 3μm 3.0×100mm；
预柱：Security GuardTM Cartridges C18(4×3.0mm)；
流速：0.6mL/min；进样量：20μL；柱温：40℃；洗针液：体积比为1∶1的甲醇-水溶液；
3.质谱条件
采用电喷雾离子化源(ESI源)，多反应监测(MRM)模式，负离子扫描；
检测离子对设置如下表1和表2所示：
Name Q1 Mass(Da) Q3 Mass(Da) Dwell(msec) DP EP CE CXP
FBLF 243.2 199.1 200 -40 -10 -12 -16
FBLF-13C-d3 247.1 202.7 200 -40 -10 -12 -16
或
Name Q1 Mass(Da) Q3 Mass(Da) Dwell(msec) DP EP CE CXP
FBLF 243.2 199.1 200 -40 -10 -12 -16
FBLF-d3 246.3 201.9 200 -40 -10 -12 -16
质谱切换阀设置如下表3所示：
Total time(min) Position
1 1.0 B
2 3.0 A
离子源参数设置如下表4所示：
Parameter Value
IS -4500.00
Gas 1 55.00
Gas 2 50.00
CAD Medium/9.00
CUR 30.00
4.抗凝剂：EDKA-K2
5.数据处理
色谱保留时间及色谱峰面积由Analyst(Version1.6.3)采集处理与定量分析。以氟比洛芬峰面积与内标峰面积比对标准曲线中氟比洛芬的理论浓度与内标浓度比进行线性最小二乘法回归计算，以所得回归方程计算样品中氟比洛芬的实测浓度。
测试例1
一、流动相的优化
考察表5中不同流动相对氟比洛芬的色谱峰峰形的影响。以不同组成流动相来洗脱检测工作溶液中的氟比洛芬和氟比洛芬-13C-d3。
表5不同流动相组成
组成1 组成2 组成3
流动相A 5mM乙酸铵水溶液 0.1％甲酸水 2mM乙酸铵水溶液
流动相B 乙腈 甲醇-乙腈(V：V＝40：60) 乙腈
洗脱结果如图1～3所示，组成1作为流动相时，未检测到氟比洛芬、内标氟比洛芬-13C-d3响应过低；组成2作为流动相时，氟比洛芬及内标氟比洛芬-13C-d3色谱峰基线过高；组成3作为流动相时，氟比洛芬及内标氟比洛芬-13C-d3色谱峰峰形标准，基线稳定，且响应均较高。上述结果说明，流动相A为2mM乙酸铵水溶液、流动相B为乙腈时得到的色谱峰较优。
二、洗脱梯度的优化
采用不同流动相洗脱梯度洗脱，检测工作溶液中的氟比洛芬、内标氟比洛芬-13C-d3。
流动相洗脱梯度1，如表6所示
Time(min) A(％) B(％) Flow(mL/min) Max Pressure(MPa)
1 0.00 70.0 30.0 0.6 130
2 0.20 70.0 30.0 0.6 130
3 2.20 10.0 90.0 0.6 130
4 4.00 10.0 90.0 0.6 130
5 4.01 70.0 30.0 0.6 130
6 4.80 70.0 30.0 0.6 130
流动相洗脱梯度2，如表7所示
Time(min) A(％) B(％) Flow(mL/min) Max Pressure(MPa)
1 0.00 75.0 25.0 0.6 130
2 0.20 75.0 25.0 0.6 130
3 2.20 10.0 90.0 0.6 130
4 4.00 10.0 90.0 0.6 130
5 4.01 75.0 25.0 0.6 130
6 4.80 75.0 25.0 0.6 130
采用不同流动相洗脱梯度检测得到的氟比洛芬和到的氟比洛芬-13C-d3的色谱图如图4～5所示，从色谱峰结果可知，采用流动相洗脱梯度1洗脱时，氟比洛芬和到的氟比洛芬-13C-d3的响应低，杂峰明显；采用流动相洗脱梯度2洗脱时，氟比洛芬和氟比洛芬-13C-d3的响应较高，峰分离度较好，基线较稳。可见，使用流动相洗脱梯度2检测结果更优。
三、内标的筛选
检测氟比洛芬对不同内标的干扰，
检测未加内标的含有10.00ng/mL氟比洛芬(FBLF)的空白血浆，在离子通道246.3→201.9(氟比洛芬-d3(FBLF-d3)的检测离子对，样品编号为IF FBLF to FBLF-d3)和离子通道247.1→202.7(氟比洛芬-13C-d3(FBLF-13C-d3)的检测离子对，样品编号为IF FBLF toFBLF13C-d3)中是否存在氟比洛芬对内标的干扰。检测结果如表8所示。
质控血浆样品的制备：称取一定量氟比洛芬对照品，加入适量甲醇，最终配制成的氟比洛芬浓度为1.000mg/mL，摇匀。取一定体积的质控对照品储备液，用体积比为1：1的甲醇-水溶液逐级稀释至浓度分别为3000、1200、120.0、30.00、10.00ng/mL的质控工作溶液。分别取一定体积各浓度水平的质控曲线工作溶液，加入空白血浆，配制成浓度为150.0、60.00、6.000、1.500、0.5000ng/mL的质控血浆样品。
待测样品预处理未加内标的含有10.00ng/mL氟比洛芬(FBLF)的空白血浆、质控血浆样品的样品预处理：取待测血浆样品，加入50μL内标工作溶液；再加入300μL甲醇、涡旋3min，离心，4℃、2450g、10min，取20μL上层清液用于LC-MS/MS检测。
表8中质控血浆样品1加入的内标为50ng/mL的FBLF-d3，质控血浆样品1加入的内标为100ng/mL的FBLF-13C-d3。分析物干扰％＝内标峰面积/质控血浆样品内标峰面积均值*100％。
表8氟比洛芬对不同内标的干扰
根据表8结果可知，在选择FBLF-d3为内标时，检测到了FBLF-d3的内标峰，说明FBLF对内标FBLF-d3存在干扰；而在选择FBLF-13C-d3为内标时，检测到了FBLF-13C-d3的内标峰，说明FBLF对内标FBLF-13C-d3无干扰；因此，后续检测中选用FBLF-13C-d3作为内标。
实施例1
1.溶液配制
流动相A(2mM乙酸铵水溶液)：称取308.3mg乙酸铵溶于2L超纯水中，超声脱气，混匀。
流动相B(乙腈)：量取2L的乙腈至棕色溶剂瓶中。
稀释溶液(体积比为1∶1的甲醇-水溶液)：量取100mL甲醇和100mL的超纯水转移至适当的溶剂瓶中，混匀，超声。
洗针溶液配制(体积比为1∶1的甲醇-水溶液)：量取500mL甲醇和500mL的超纯水转移至适当的溶剂瓶中，混匀，超声。
2.标准溶液配制：
标准对照品储备液的配制：
称取一定量氟比洛芬对照品，记录重量，置于自制杯状铝箔纸中，将铝箔纸置于20mL棕色广口玻璃瓶中，根据实际称量值及氟比洛芬含量计算分析物实际重量，加入适量甲醇，最终配制成的氟比洛芬浓度为1.000mg/mL，摇匀。置于-20℃条件下保存。
标准曲线工作溶液的配制：
取一定体积的标准对照品储备液，用体积比为1∶1的甲醇-水溶液逐级稀释至浓度分别为4000、3200、1600、800.0、400.0、160.0、20.00、10.00ng/mL的标准曲线工作溶液。
标准曲线血浆样品的配制：
分别取一定体积各浓度水平的标准曲线工作溶液，加入空白血浆，配制成浓度为200.0、160.0、80.00、40.00、20.00、8.000、1.000、0.5000ng/mL的标准曲线血浆样品。
3.内标工作溶液配制
内标储备溶液配制：
称取一定量氟比洛芬-13C-d3对照品，加入适量甲醇，摇匀，即得浓度为1.000mg/mL的内标储备溶液，置于-20℃条件下保存。
内标工作溶液配制：
取一定体积内标储备液，加入体积比为1：1的甲醇-水溶液，定容稀释至100ng/mL，得到内标工作溶液。
4.质控标准溶液配制
质控对照品储备液的配制：
称取一定量氟比洛芬对照品，记录重量，置于自制杯状铝箔纸中，将铝箔纸置于20mL棕色广口玻璃瓶中，根据实际称量值及氟比洛芬含量计算分析物实际重量，加入适量甲醇，最终配制成的氟比洛芬浓度为1.000mg/mL，摇匀。置于-20℃条件下保存。
质控工作溶液的配制：
取一定体积的质控对照品储备液，用体积比为1：1的甲醇-水溶液逐级稀释至浓度分别为3000、1200、120.0、30.00、10.00ng/mL的标准曲线工作溶液。
质控血浆样品的配制：
分别取一定体积各浓度水平的质控曲线工作溶液，加入空白血浆，配制成浓度为150.0、60.00、6.000、1.500、0.5000ng/mL的质控血浆样品。
5.血浆样品的处理
1)取空白血浆100μL至Double blank、blank、carryover样品孔中，取超纯水100μL至Reagent blank样品孔中，取各验证项样品各100μL至对应的样品孔中。
2)取稀释液(体积比为1：1的甲醇-水溶液)50μL至Reagent blank、Double blank、carryover样品孔中；取内标工作溶液50μL至对应样品孔中。
3)取甲醇沉淀剂300μL至对应样品孔中。
4)封板，涡旋3min。
5)离心，4℃，2450g，10min。
6)20μL进样到色谱系统分析。
备注：Double Blank为双空白样品、Carryover为残留考察用双空白样品、Blank为只加内标的单空白样品、Reagentblank为试剂空白样品。
6.LC-MS/MS检测条件：
流动相组成：流动相A为2mM乙酸铵水溶液，流动相B为乙腈；流动相洗脱梯度为洗脱梯度2；质谱检测离子对：氟比洛芬为243.2→199.1、氟比洛芬-13C-d3为247.1→202.7。
7.方法学验证
7.1线性范围、定量下限和检测下限
所得标准曲线样品的线性曲线如图6所示，其中LC-MS/MS法测得的氟比洛芬在人血浆中的标准曲线方程为y＝0.00182X-6.601e-004，R为0.9988；氟比洛芬的线性范围为0.5000～200.0ng/mL，氟比洛芬的血药浓度的最低定量下限为0.5000ng/mL，在线性范围内线性关系良好。该方法最低检测下限为20.00pg/mL(如图7-8所示)。
7.2精密度与准确度
取四个不同浓度的质控血浆样品，分别为HOQ QC(150.0ng/mL)、M1OQ QC(60.00ng/mL)、M2OQ QC(6.000ng/mL)、LOQ QC(1.500ng/mL)、LLOQ(0.5000ng/mL)浓度，并将其进行检测。作为批内及批间准确度和精密度的考察。每一个浓度平行制备6份，至少测试三次。采用平均值来评估批间准确度和精密度。结果如下表：
表9LC-MS/MS法测定血浆中氟比洛芬批内、批间的精密度和准确度
结果表明：LLOQ浓度水平标准血浆样品测得值应为标示值的80.0％～120.0％范围内，批内与批间精密度(RSD)不大于20％。低、中、高浓度水平标准血浆样品测得值应为标示值的85.0％～115.0％范围内，批内与批间精密度(RSD)小于15.0％。说明本发明方法对血浆中的氟比洛芬的检测具有良好的精密度和准确度。
7.3系统适用性：
取经预处理过的浓度为定量下限浓度(LLOQ)的标准血浆样品，浓度为0.5000ng/mL；20μL进样检测重复分析7次；
分别记录待测物与内标的色谱峰面积值及保留时间，并计算待测物与内标的色谱峰面积比值及色谱峰保留时间的变异系数。具体结果如下表10所示：
表10 LC-MS/MS法测定血浆中氟比洛芬系统适用性
结论：待测物信噪比(S/N不小于5)，7次重复分析所得待测物与内标色谱峰面积比值的变异系数应小于15％；7次重复分析所得待测物与内标色谱峰保留时间的变异系数应小于5％。待测物氟比洛芬保留时间变异系数.0.1～0.4％、内标保留时间变异系数0.1～0.7％、面积比的变异系数4.1～9.0％；说明本发明方法对检测EDTA-K2血浆中氟比洛芬适用。
7.4选择性
选择性是指色谱方法测定分析物时，区分生物基质中干扰的能力。方法验证之前，需要至少筛选6个不同批次的空白基质用于方法验证。
取6个中国人群不同来源的空白血浆100μL，不加内标，20μL进样到色谱系统分析。
取100μL 6份来自不同来源的空白血浆，配制成含氟比洛芬浓度为定量下限浓度水平的标准血浆样品的浓度为0.5000ng/mL，经预处理后，20μL进样到色谱系统分析；
分别记录各份空白样品及定量下限浓度水平的标准血浆样品的结果见表11。
表11六个不同来源空白健康人体血浆对分析物、内标的选择性考察对比表
结论：至少6份不同来源空白基质样品中的分析物保留时间处色谱峰峰面积低于相对应的不同来源空白基质LLOQ浓度待测物峰面积的20.0％，且内标保留时间处内标峰面积低于相对应的不同来源空白基质LLOQ浓度内标峰面积的5.0％。6份不同来源空白基质配制的LLOQ浓度测得值在理论值的80.0％～120.0％范围内。本发明方法针对不同来源空白基质样品中的分析物的干扰范围为0％，内标干扰响应值为0％。可见，不同人体的空白血浆对氟比洛芬的检测结果没有造成干扰，该方法可以用于检测不同人体EDTA-K2血浆中氟比洛芬，不同人群的血浆对本发明检测方法无影响。
7.5回收率
7.5.1分析物的提取回收率
分析物提取回收率样品
分别取浓度为：LOQ QC(1.500ng/mL)、M2OQ QC(60.00ng/mL)、HOQ QC(150.0ng/mL)质控血浆样品，平行制备6份；
回收率参比样品：
提取过程与分析物提取回收率样品的提取操作相同，且分析物提取回收率样品与回收率参比样品中氟比洛芬的浓度相同，但是分析物和内标溶液不参与提取过程。
7.5.2内标物的提取回收率
内标的提取回收率样品
由空白血浆样品平行制备6份，加入内标工作溶液，沉淀后，取合适体积的上清溶液，加入与中浓度质控样品浓度相当的标准品溶液。
内标的回收率参比样品：
提取过程与内标的提取回收率样品的提取操作相同，但是分析物和内标溶液均在沉淀后加入。
结论：本发明方法的待测物氟比洛芬在高、中、低三个浓度范围内的提取回收率分别为112.8％、112.9％、110.9％，对应的变异系数CV值为0.8％、1.3％、3.9％；总回收率为112.2％，总体回收率变异CV值为2.4％。本发明方法的氟比洛芬-13C-d3的提取回收率为88.5％，回收率CV值为1.3％。说明本发明方法生物样品定量分析方法验证指导原则。
7.6基质效应
1)基质效应系指生物基质中存在的组分对分析物的离子化所产生的抑制或增强作用。分别取6个不同批次的空白人血浆，每个批次配制一份，经前处理后分别加入与处理后的低浓度和高浓度质控样品浓度相当的标准品溶液及内标溶液进行分析。
无基质存在的与低浓度和高浓度质控样品浓度相当的纯溶液，平行6份，进行分析。
2)溶血基质的配制：取100μL空白全血，将其超声破坏血细胞，取其40μL加入1960μL正常空白血浆，混匀，即为2％经超声破坏的溶血血浆，视为严重溶血。
使用模拟的溶血血浆制备待测物两个浓度水平(LOQ QC、HOQ QC)样品各6份，并将其处理后，进样到色谱系统分析。
3)使用模拟的高血脂血浆样品进行评估(配制5％的中长链脂肪乳注射液高血脂血浆样品)，使用模拟的高血脂血浆样品制备待测物低、高浓度水平(LOQ QC、HOQ QC)样品各6份，并将其处理后，进样到色谱系统分析。
结论：经内标归一化的基质因子的变异系数CV％：1.4～5.4％；溶血基质效应的平均准确度偏差范围：7.3～8.3％.；高血脂基质效应的平均准确度偏差范围：8.6～9.0％；说明本发明方法没有明显的基质效应，也没有明显的溶血和高血脂基质效应。
7.7稳定性
将氟比洛芬低、高(LOQ QC、HOQ QC)两个浓度的人血浆质控样品，在如下条件下进行稳定性考察：
1)-70℃反复冻融4次稳定。
2)室温放置21h稳定。
3)-20℃条件下5d稳定。
4)全血稳定性：分别考察加入含低、高(LOQ QC、HOQ QC)两个浓度水平分析物在全血中冰水浴下放置0h、2h峰面积之比的变化，在放置相应考察时间点后，将全血样品离心分离血浆，加入内标按照相应血浆样品处理操作方法处理，每个浓度水平平行6份。
通过稳定性考察后的样品与现配制的样品同时检测，每个浓度对比结果如下：
表12血浆稳定性考察结果(n＝6)
表13全血稳定性考察结果(n＝6)
本发明的方法检测的血浆中氟比洛芬浓度的准确度在87.5％～109.7％，全血中氟比洛芬的浓度在上述考察条件下得出的CV值小于2.5％，提说明在上述考察条件下本发明方法对血浆和全血中氟比洛芬具有较强的稳定性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种血浆中氟比洛芬的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：采用氟比洛芬对照品配制不同浓度的标准曲线工作溶液；向标准曲线工作液加入空白血浆配制成标准曲线血浆样品；采用同位素内标配制内标工作溶液；
S2：血浆样品预处理：
取待测血浆样品，加入稀释剂、内标工作溶液；混匀后再加入沉淀剂，涡旋，离心，取上层清液用于LC-MS/MS检测；所述LC-MS/MS检测的液相条件中，流动相选自以下组别之一：组别一：流动相A：2mM乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；组别二：流动相A：0.1％甲酸水；流动相B：体积比为40∶60的甲醇-乙腈混合溶液；组别三：流动相A：2mM乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；
S3：氟比洛芬的定量计算：
标准曲线血浆样品经预处理后，进行LC-MS/MS检测，(氟比洛芬峰面积与内标峰面积比)对(标准曲线中氟比洛芬的理论浓度与内标浓度比)进行线性最小二乘法回归计算，得到回归方程，进而计算样品中氟比洛芬的实测浓度。
2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述同位素内标为氟比洛芬-13C-d3或氟比洛芬-d3。
3.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述LC-MS/MS检测的液相条件：
色谱柱：GL Sciences InertSustain C18 3μm 3.0×100mm；
预柱：Security GuardTM Cartridges C18 4×3.0mm；
流动相：流动相A：2mM乙酸铵水溶液；流动相B：乙腈；
梯度洗脱；
流速：0.4～0.6mL/min；
进样量：20μL；
柱温：40℃；
洗针液：体积比为1∶1的甲醇-水溶液；
所述梯度洗脱的程序为：0～2.2min，流动相A：流动相B＝70％：30％；2.2～4.01min，流动相A：流动相B＝10％：90％；4.01～4.8min，流动相A：流动相B＝70％：30％；
或
0～2.2min，流动相A：流动相B＝75％：25％；2.2～4.01min，流动相A：流动相B＝10％：90％；4.01～4.8min，流动相A：流动相B＝75％：25％。
4.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，步骤S2中，LC-MS/MS检测的质谱条件：电喷雾离子化源，多反应监测模式，负离子模式扫描；
检测离子对设置如下：
FBLF：Q1 Mass：243.2Da，Q3 Mass：199.1Da，Dwell：200msec，DP：-40，EP：-10，CE：-12，CXP：-16；
FBLF-13C-d3：Q1 Mass：247.1Da，Q3 Mass：202.7Da，Dwell：200msec，DP：-40，EP：-10，CE：-12，CXP：-16；
或
FBLF：Q1 Mass：243.2Da，Q3 Mass：199.1Da，Dwell：200msec，DP：-40，EP：-10，CE：-12，CXP：-16；
FBLF-d3：Q1 Mass：246.3Da，Q3 Mass：201.9Da，Dwell：200msec，DP：-40，EP：-10，CE：-12，CXP：-16z
质谱切换阀设置如下：
在B阀处1min，在A阀处3min；
离子源参数设置如下：
IS：-4500；Gas 1：55；Gas 2：50；CAD：Medium/9.00；CUR：30。
5.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述待测血浆样品与内标工作溶液的的体积比为2∶1；所述沉淀剂为甲醇或乙腈。
6.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述涡旋的时间为3～10min；所述离心的条件为4℃、2450g、10min。
7.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，步骤S1中，所述标准曲线工作液的配制过程：称取氟比洛芬对照品，加入溶剂，配制成的氟比洛芬浓度为1.000mg/mL的标准对照品储备液；取标准对照品储备液，用稀释剂逐级稀释得到浓度范围为10.00～4000ng/mL的标准曲线工作溶液；
所述内标工作溶的液配制：称取同位素内标对照品，加入溶剂，得到浓度为1.000mg/mL的内标储备液；取内标储备液，加入稀释剂，定容稀释得到浓度为50～100ng/mL的内标工作溶液；内标工作溶液。
8.根据权利要求7所述检测方法，其特征在于，所述溶剂为甲醇。
9.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述稀释剂为体积比为1∶1的甲醇-水溶液。
10.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述标准曲线血浆样品的线性范围为0.5000～200.0ng/mL；所述氟比洛芬的最低定量下限为0.5000ng/mL，最低检测下限为20.00pg/mL。
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