CN112461946A - 测定人血浆中托法替布浓度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药检测技术领域，具体公开了一种测定人血浆中托法替布浓度的方法，通过LC‑MS/MS系统对血浆中托法替布的浓度进行鉴定分析，采用氘代托法替布作为内标，采用Waters Xselectable HSS T3柱洗脱，ESI串联质谱检测，使得本发明方法的提取回收率为101.9％，基质效应、高血脂基质效应和溶血基质效应均无干扰，准确度和精密度高，用量小，可用于临床大批量样品分析需求。

Description

测定人血浆中托法替布浓度的方法
技术领域
本发明涉及医药检测技术领域，具体涉及一种测定人血浆中托法替布浓度的方法。
背景技术
枸橼酸托法替布片(Tofacitinib Citrate Tablets)，主要成分为托法替布，其化学名为：(3R,4R)-4-甲基-3-(甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氨基)-β-氧代-1-哌啶丙腈。枸橼酸托法替布片(Tofacitinib Citrate Tablets)是辉瑞公司开发的一种JAK(Janus-activated kinase)抑制剂，可有效抑制JAK1和JAK3的活性，阻断多种炎性细胞因子的信号转导。枸橼酸托法替布片作为最新的靶向合成型DMARDs口服片剂，于2012年11月06日经美国FDA批准上市，商品名
Figure BDA0002743326310000011
该药用于对甲氨蝶呤治疗反应不足或不耐受的中度至重度活动性类风湿性关节炎成人患者的治疗。目前，
Figure BDA0002743326310000012
已获全球80多个国家批准上市，于2017年03月10日获NMPA批准上市许可。既有研究表明托法替布对类风湿关节炎、溃疡性结肠炎、银屑病等多种炎症相关疾病有良好的治疗效应。
中国专利CN201410783309.2公开了一种枸橼酸托法替布的含量测定及有关物质检测方法，该方法主要采用高效液相色谱法对枸橼酸托法替布原料药的含量，以及其有关物质进行了测定和检查。但该方法，检测下限不能满足较小给药量时生物体内的含量测定，具有一定的局限性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定人血浆中托法替布浓度的方法，采用LC-MS/MS法测定人血浆中托法替布浓度，样本预处理过程简化，避免基质效应，色谱峰形极佳，实现了对血浆中药物快速、灵敏、特异性分析，为体内药代动力学的检测提供了简便的分析方法，实现在血浆中较低浓度水平的精准定量。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一方面，本发明提供一种测定人血浆中托法替布浓度的方法，包括如下步骤：
1)样品制备：取待测血浆样本，加入内标工作溶液，涡旋，沉淀蛋白，涡旋离心，取上清液；
2)液相色谱-质谱联用检测：
色谱条件如下：色谱柱：Waters Xselectable HSS T3；流动相：流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；洗脱方式：梯度洗脱；流速：0.400～0.600mL/min；
质谱条件如下：采用ESI源，正离子MRM模式检测；
3)标准曲线制备：取托法替布标准工作溶液，稀释到空白血浆中，配制托法替布标准曲线血浆样品；取标准曲线血浆样品，加入内标工作溶液，涡旋，沉淀蛋白，涡旋离心，取上清液进样LC-MS/MS系统，记录每个浓度的托法替布对应的峰面积，以托法替布和内标的峰面积比值为纵坐标，以托法替布浓度为横坐标，制备标准曲线回归方程；
4)待测物托法替布测定：将待测血浆按步骤1)制备样品，按步骤2)采用LC-MS/MS方法检测，记录待测物托法替布对应的峰面积，将待测物托法替布的色谱峰面积与内标峰面积的比值代入获得的标准曲线回归方程，计算测定的待测物托法替布的相应浓度。
进一步地，所述内标工作溶液中的内标为托法替布-d3。
进一步地，所述沉淀蛋白使用的沉淀剂为乙腈。
进一步地，所述涡旋的时间为3s；所述涡旋离心的条件为：涡旋5min，离心2490g，4℃，10min。
进一步地，其中所述液相色谱-质谱联用的条件如下：
色谱条件
色谱柱：Waters Xselectable HSS T3(2.1×100mm，3.5micron)
流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈
流速0.400～0.600mL/min；停止时间4.00min；
洗针液冲洗：2s；进样量：20μL；柱温：35℃；
流动相比例设置如下：
Figure BDA0002743326310000031
质谱条件
采用ESI源，正离子MRM模式检测：
Figure BDA0002743326310000032
质谱切换阀设置如下：
Figure BDA0002743326310000033
Figure BDA0002743326310000041
离子源参数设置如下：
Parameter Value(+)
IS 5500
Gas 1 60
Gas 2 60
CAD 10
CUR 35
Temp(℃) 550
。
进一步地，所述标准系列的托法替布工作溶液的浓度范围为10～10000ng/mL；优选浓度为10000、2000、1600、1000、500、200、100、20、10ng/mL。
进一步地，所述托法替布标准曲线血浆样品的浓度范围为0.5～100ng/mL，优选为0.5、1、5、10、25、50、80、100ng/mL。
进一步地，所述托法替布标准工作溶液的配制：称取托法替布于容量瓶中，经DMSO溶解配制成1mg·mL-1标准对照品储备液；将标准对照品储备液用DMSO稀释，配制成标准系列的托法替布工作溶液。
进一步地，所述标准曲线回归方程的获取过程如下：取标准曲线血浆样品各50μL，加入内标工作溶液20μL，涡旋30s，加入300μL乙腈沉淀剂沉淀后，涡旋5min，离心2490g，4℃，10min；20μL进样LC-MS/MS系统，得到色谱图；根据得到的色谱图中托法替布色谱峰面积与内标峰面积的比值计算托法替布在血浆中的浓度，制定托法替布标准曲线回归方程。
进一步地，所述内标工作溶液的配制过程如下：称取托法替布-d3柠檬酸盐于容量瓶中，经50％甲醇水溶液溶解配制成10ug·mL-1内标对照品储备溶液；
取托法替布-d3内标工作液250μL置于50ml棕色容量瓶中，用50％甲醇水定容至刻度线，摇匀，即得浓度为50ng·mL-1的内标工作液。
进一步地，所述LC-MS/MS系统检测后，托法替布在2.26min左右出峰，峰形良好，且人血浆中无杂质峰干扰上述化合物的测定，表明该方法具有较强的专属性。
进一步地，所述标准曲线的回归方程如下：
测得的托法替布在人血浆中的标准曲线回归方程为y＝0.0451x+0.00026，R2为0.9996；托法替布的线性范围为0.5ng/mL～100ng/mL，托法替布的血药浓度的最低定量下限为0.5ng/mL。
进一步地，运用本发明所述的方法进行样品的检测，具体过程如下：向待测血浆样品中加入内标工作溶液，涡旋，加入乙腈沉淀剂沉淀后，涡旋、离心后，进样LC-MS/MS系统，得到色谱图；将待测血浆样品中目标药物的色谱峰面积与内标峰面积的比值代入获得的标准曲线回归方程，计算测定的药物的相应浓度
进一步地，所述样品的检测过程如下：向50μL待测血浆样品中加入20μL内标工作溶液，加入300μL乙腈沉淀剂沉淀后，涡旋5min，离心2490g，4℃，10min；20μL进样LC-MS/MS系统，得到色谱图；将待测血浆样品中目标药物的峰面积与内标峰面积比值代入获得的标准曲线回归方程，计算测定的药物的相应浓度。
定性方法：待测药物与药物标准品的保留时间一致，结合质谱参数中的定性和定量离子对确定为目标药物。
定量方法：以分析物峰面积与内标峰面积比对标准曲线中分析物的理论浓度进行线性最小二乘法回归计算，以所得回归方程计算样品中分析物的实测浓度。
本发明采用液相色谱-质谱联用法进行检测，既结合了液相色谱仪有效分离不同化合物的分离能力，又结合质谱仪很强的组分鉴别能力，能够有效分离和鉴别血浆中托法替布，并进行定量检测。
本发明方法可获得高回收率且有效降低杂质峰的干扰，避免传统方法由于溶剂效应带来的影响，避免传统方法的繁琐和条件不受控的情况。
本发明采用氘代托法替布作为内标物，可使测定的血浆中的托法替布浓度的重现性好、准确度高；
本发明方法具有系统适用性，对不同来源空白血浆无选择性，能够专一性测定托法替布，分离度好。
本发明方法用量小，每次血浆样品测试仅需50μL，进样量仅需20μL，可准确测定出化合物。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明首次基于LC-MS-MS法建立人血浆的采集、分离分析方法，并成功的应用于人血浆中托法替布的浓度检测。
本发明提供了一种预处理方法简便的测定人血浆中的托法替布浓度的方法，首先采用蛋白沉淀法处理人血浆样本，以托法替布-d3为内标运用高效液相色谱-质谱连用(HPLC-MS-MS)方法检测人血浆中托法替布的含量。质谱采集方法选用ESI正离子及多反应监测模式(MRM)。在本实验所采用的色谱条件下，托法替布保留时间为2.26min左右，峰形良好，无杂峰干扰测定，基线平稳；本方法具有较高的特异性，能准确测定血浆中的托法替布的浓度，灵敏度较高，托法替布的血浆最低定量限为0.5ng/mL；本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为托法替布的血药浓度测定提供依据。本方法托法替布的血浆标准曲线线性范围为0.5ng/mL～100ng/mL，线性关系良好，批内和批间精密度RSD均小于±10％。本发明方法重现性好，准确度高，不受基质、高血脂基质和溶血基质的干扰，不同人群的血浆对本发明方法无干扰现象。
本发明方法能够满足人体药代动力学要求，可应用于临床药代动力学研究。
附图说明
图1 LC-MS/MS法测得的人血浆中托法替布的标准曲线图；
图2 LC-MS/MS法测得的人血浆中托法替布的定量下限图；
图3 LC-MS/MS法测得的人血浆中托法替布-d3的定量下限图；
图4托法替布离子扫描质谱图；
图5托法替布-d3离子扫描质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
1.主要仪器
API 5500型三重四极杆液质联用仪(AB Sciex公司)，配有电喷雾电离源及Analys(Version1.6.3)数据处理系统，配有AB Sciex ExionLCAD液相色谱仪(含自动进样器、柱温箱等)；METTLER TOLEDO AB135-S型十万分之一天平(METTLER，瑞士)。
2.色谱条件
色谱柱：Waters Xselectable HSS T3(2.1×100mm，3.5micron)
流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈
流速0.400～0.600mL/min；停止时间4.00min；
洗针液冲洗：2s；进样量：20μL；柱温：35℃；
流动相比例设置如下：
Figure BDA0002743326310000081
3.质谱条件
采用ESI源，正离子MRM模式检测。
Figure BDA0002743326310000082
质谱切换阀设置如下：
Start Time Position
1 1.0 B
2 3.5 A
离子源参数设置如下：
Parameter Value(+)
IS 5500
Gas 1 60
Gas 2 60
CAD 10
CUR 35
Temp(℃) 550
4.抗凝剂：肝素钠
5.内标：托法替布-d3
6.数据处理
色谱保留时间及色谱峰面积由Agilent Mass Hunter Workstation Software采集处理与定量分析，采用Agilent ECM网络系统。以分析物峰面积与内标峰面积比对标准曲线中分析物的理论浓度进行线性最小二乘法回归计算，以所得回归方程计算样品中分析物的实测浓度。样品中分析物的实测浓度由仪器采用以下回归方程计算：
y＝ax+b
其中，y＝分析物/内标峰面积比；a＝标准曲线之斜率；x＝药物浓度/内标浓度；b＝标准曲线之截距；(权重因子为1/x2)
所有计算和统计分析所使用小数点位数与软件输出保持一致。所有与浓度相关的数据保留小数点后3位，色谱峰保留时间保留小数点后3位，百分数保留1位小数，色谱峰面积保留整数，峰面积比保留小数点后6位。
数据的RSD值、偏差、均值等采用Microsoft Office Excel 2010进行计算。
7.样品进行检测前的预处理方法：
取全血，加入抗凝剂肝素钠，通过蛋白沉淀法进行处处理后制得空白血浆，冷藏用于进行样品稀释或配制，使用前解冻。
采用50μL肝素钠抗凝的血浆样本采取乙腈蛋白沉淀提取后，取上清液100μL加入200μL超纯水稀释后，20μL待进样。
50μL标准曲线血浆样品使用前加入内标工作溶液20μL，涡旋30s，加入300μL乙腈，涡旋5min，离心，2490g，4℃，10min，取上清液100μL加入200μL超纯水稀释后，待进样。
50μL SST使用前加入内标工作溶液20μL，涡旋30s，加入300μL乙腈，涡旋5min，离心，2490g，4℃，10min，取上清液100μL加入200μL超纯水稀释后，待进样。
50μL质控血浆样品使用前加入内标工作溶液20μL，涡旋30s，加入300μL乙腈，涡旋5min，离心，2490g，4℃，10min，取上清液100μL加入200μL超纯水稀释后，待进样。
50μL空白血浆使用前加入50％甲醇水溶液20μL，涡旋30s，加入300μL乙腈，涡旋5min，离心，2490g，4℃，10min，取上清液100μL加入200μL超纯水稀释后，待进样，记作：Double blank或Carryover样品。
或者50μL空白血浆使用前加入内标工作溶液20μL，涡旋30s，加入300μL乙腈，涡旋5min，离心，2490g，4℃，10min，取上清液100μL加入200μL超纯水稀释后，待进样，记作：Blank样品。
50μL超纯水使用前加入50％甲醇水溶液20μL，涡旋30s，加入300μL乙腈，涡旋5min，离心，2490g，4℃，10min，取上清液100μL加入200μL超纯水稀释后，待进样，记作：Reagent and Materials blank样品。
备注：Double blank为双空白样品、carryover为残留考察用双空白样品、blank为只加内标的单空白样品、Reagent and Materials blank为试剂耗材验收空白样品。
实施例1
1.溶液配制
流动相A(0.1％甲酸水溶液)：取1L超纯水于适当溶剂瓶中，加入1mL甲酸，混匀。
流动相B(乙腈)：量取1L的乙腈(Merck)转移至适当的溶剂瓶中。
稀释溶液(50％甲醇水溶液)：取50mL甲醇和50mL的超纯水转移至适当的溶剂瓶中，混匀。
洗针溶液配制(甲醇)：取1L甲醇于适当溶剂瓶中，混匀。
沉淀剂(乙腈)：量取200mL乙腈转移至适当的溶剂瓶中。
2.标准溶液配制：
标准对照品储备液的配制
精密称取托法替布柠檬酸盐对照品于20mL容量瓶中，根据实际称量值及托法替布含量与去除柠檬酸盐的含量计算分析物实际重量，用20mL移液管吸取20mL DMSO配置成浓度为1mg·mL-1的托法替布标准对照品储备溶液，置于-20℃条件下保存。
标准系列工作溶液的配制：
取标准对照品储备液适量，用DMSO稀释，得到托法替布工作溶液为：10000、2000、1600、1000、500、200、100、20、10ng/mL。
标准曲线血浆样品的配制
取标准系列工作溶液各10μL，稀释到空白血浆中使得总体积为0.2mL，配制的标准曲线血浆样品中托法替布浓度值为0.5、1、5、10、25、50、80、100ng/mL。
SST样品：取标准系列工作溶液10μL，稀释到空白血浆中使得总体积为0.2mL，配制的SST样品中托法替布浓度值为0.5ng/mL。
3.内标标准溶液配制
内标储备溶液配制
在规格为1.01mg的托法替布柠檬酸盐-d3对照品中加入603μL DMSO，摇匀。即得含托法替布-d3(TFTB-d3)浓度为1mg·mL-1的内标对照品储备溶液，置于-20℃条件下保存。
内标工作溶液配制(IS Spike,50ng·mL-1)
吸取10μL托法替布-d3内标对照品储备液(1mg·mL-1)加50％甲醇水990μL，得浓度为10ug·mL-1的TFTB-d3 Spike。
取TFTB-d3 Spike溶液250μL置于50ml棕色容量瓶中，加入50％甲醇水定容至刻度，混匀得IS Spike(50ng/mL)。
4.质控标准溶液配制
质控对照品储备液的配制：
称取一定量托法替布柠檬酸盐对照品，记录重量，置于自制杯状铝箔纸中，将铝箔纸置于20mL棕色广口玻璃瓶中，根据实际称量值及托法替布含量与去除柠檬酸盐的含量计算分析物实际重量，加入适量DMSO，最终配制成的托法替布浓度为1.000mg/mL，摇匀。置于-20℃条件下保存。
质控工作溶液的配制：
取质控对照品储备液，稀释到DMSO中，配制成的托法替布质控工作液的浓度为10000、1500、300、30、10ng/mL
质控血浆样品的配制：
取质控工作溶液，稀释到空白血浆中，配制成的托法替布质控血浆样品液的浓度为750、75、15、1.5、0.5ng/mL；对应AQL、HOQ QC、MOQ QC、LOQ QC、LLOQ。
5.方法学验证
5.1线性范围和定量下限
取标准系列工作溶液各10μL，稀释到空白血浆中使得总体积为0.2mL，配制的标准曲线血浆样品中托法替布浓度值为0.5、1、5、10、25、50、80、100ng/mL。
取标准曲线血浆样品、空白血浆Double blank样品、Blank样品；20μL进样到色谱系统分析。
结论：所得标准曲线样品的线性曲线图如1所示，其中LC-MS/MS法测得的托法替布在人血浆中的标准曲线方程为：y＝0.0451x+0.00026，R2为0.9996；平均测定6次，R2的SD为0.0003，CV为0.0；斜率的SD为0.0011，CV为2.4％；托法替布的线性范围为0.5ng/mL～100ng/mL，托法替布的血药浓度的最低定量下限为0.5ng/mL，在线性范围内线性关系良好。
5.2精密度与准确度
取四个不同浓度的质控血浆样品，托法替布质控血浆样品液的浓度为75、15、1.5、0.5ng/mL；对应为HOQ QC、MOQ QC、LOQ QC、LLOQ浓度，并将其进行检测。作为批内及批间准确度和精密度的考察。每一个浓度平行制备6份，至少测试三次。采用平均值来评估批间准确度和精密度。结果如下表：
表1：LC-MS/MS法测定血浆中托法替布批内、批间的精密度和准确度
Figure BDA0002743326310000131
Figure BDA0002743326310000141
结果表明：托法替布的血浆样品批内精密度最大值6.0％，批内准确度范围-5.6～-0.5％，批间精密度最大值5.5％、批间准确度范围-2.7～5.6％，偏差均小于10％。低、中、高浓度水平标准血浆样品测得值应为标示值的85.0％～115.0％范围内，批内与批间精密度(RSD)小于15.0％。说明本发明方法对血浆中的托法替布的检测具有良好的精密度和准确度。
5.3系统适用性：
取经预处理过的托法替布质控血浆样品，浓度为0.025ng/mL；20μL进样检测，重复分析6次；
取经预处理过的空白血浆Blank样品；20μL进样检测，重复分析6次；
记录待测物与内标的色谱峰面积值及保留时间，并计算待测物与内标的色谱峰面积比值及色谱峰保留时间的变异系数。具体结果如下表2所示：
表2：托法替布的系统适用性
Figure BDA0002743326310000151
结论：待测物信噪比(S/N不小于5)，5次重复分析所得待测物与内标色谱峰面积比值的变异系数应小于5％；5次重复分析所得待测物与内标色谱峰保留时间的变异系数应小于0.5％。待测物TFTB保留时间变异系数0.0～0.1％、内标保留时间变异系数0.0～0.1％、面积比的变异系数0.9～8.3％。说明本发明方法对血浆中药物的检测方法适用测定托法替布。
5.4选择性
选择性是指色谱方法测定分析物时，区分生物基质中干扰的能力。方法验证之前，需要至少筛选6个不同批次的空白基质用于方法验证。
取6个中国人群不同来源的空白血浆50μL，经预处理为Carryover样品后，20μL进样到色谱系统分析。
取50μL 6份来自不同来源的空白血浆，配制成的托法替布质控血浆样品液的浓度为0.025ng/mL，经预处理后，20μL进样到色谱系统分析；
取50μL 6份来自不同来源的空白血浆，经预处理为Blank样品后，20μL进样到色谱系统分析；
记录各份空白样品及定量下限浓度水平的标准血浆样品的结果如下表。
表3：六个不同来源空白健康人体血浆对分析物、内标的选择性考察对比表(托法替布)
Figure BDA0002743326310000161
Figure BDA0002743326310000171
结论：至少6份不同来源空白基质样品中的分析物保留时间处色谱峰峰面积低于相对应的不同来源空白基质LLOQ浓度待测物峰面积的20.0％，且内标保留时间处内标峰面积低于相对应的不同来源空白基质LLOQ浓度内标峰面积的5.0％。6份不同来源空白基质配制的LLOQ浓度测得值在理论值的80.0％～120.0％范围内。本发明方法针对不同来源空白基质样品中的分析物的干扰范围为0.1～2.263％，内标干扰响应值为0。可见，不同人体的空白血浆对托法替布的检测结果没有造成干扰，该方法可以用于检测不同人体血浆中托法替布，不同人群的血浆对本发明检测方法无影响。
5.5回收率
5.5.1分析物的提取回收率
分析物回收样品
取浓度为75、15、1.5ng/mL托法替布质控血浆样品液，平行制备6份；
均不加入内标工作溶液，沉淀后，取合适体积的上清溶液，加入与上清相同体积的5ng/mL内标溶液，涡流混合后测定。
回收率参比样品：
提取过程与分析物回收样品操作相同，但是内标工作溶液在沉淀后加入，再取上清涡流后进行测定。
5.5.2内标物的提取回收率
内标的提取回收率样品
由空白血浆样品平行制备6份，加入内标工作溶液，沉淀后，取合适体积的上清溶液，加入与MOQ QC质控样品浓度相当的标准品溶液。
内标的回收率参比样品：
提取过程与内标的提取回收率样品的提取操作相同，但是MOQ QC质控样品和内标溶液均在沉淀后加入。
结论：1)本发明方法的待测物托法替布在高、中、低三个浓度范围内的提取回收率为98.4％、98.0％、109.1％，对应的变异系数CV值为2.1％、1.5％、1.4％；总回收率为101.9％，总体回收率变异CV值为5.4％。
2)本发明方法的内标物托法替布的提取回收率为101.9％，回收率CV值为1.6％。
5.6基质效应
1)基质效应系指生物基质中存在的组分对分析物的离子化所产生的抑制或增强作用。取6个不同批次的空白人血浆，每个批次配制一份，经前处理后加入与处理后的低浓度和高浓度质控样品浓度相当的标准品溶液及内标溶液进行分析。
无基质存在的与低浓度和高浓度质控样品浓度相当的纯溶液，平行6份，进行分析。
2)溶血基质的配制：取20μL空白全血，将其超声破坏血细胞，取其20μL加入980μL正常空白血浆，混匀，即为2％经超声破坏的溶血血浆，视为严重溶血。
使用模拟的溶血血浆制备待测物两个浓度水平(LOQ QC、HOQ QC)样品各6份，并将其处理后，进样到色谱系统分析。
3)使用高血脂血浆样品制备待测物低、高浓度水平(LOQ QC、HOQ QC)样品各6份，并将其处理后，进样到色谱系统分析。
结论：经内标归一化的基质因子的变异系数CV％：2.0～2.6％；溶血基质效应的平均准确度偏差范围：1.3～7.1％；高血脂基质效应的平均准确度偏差范围：1.1～8.1％；说明本发明方法没有明显的基质效应，也没有明显的溶血和高血脂基质效应。
5.7稳定性
将待测物低、高(LOQ QC、HOQ QC)两个浓度的人血浆质控样品，在如下条件下进行稳定性考察：
1)-70℃反复冻融5次稳定。
2)室温放置17h稳定。
3)-20℃条件下55d稳定。
4)全血稳定性：考察加入含低、高(LOQ QC、HOQ QC)两个浓度水平分析物在全血中冰水浴下放置(0h)、(2h)峰面积之比的变化，在放置相应考察时间点后，将全血样品离心分离血浆，加入内标按照相应血浆样品处理操作方法处理，每个浓度水平平行6份。
通过稳定性考察后的样品与现配制的样品同时检测，每个浓度对比结果如下：
表4室温放置17h稳定-短期稳定性结果：
Figure BDA0002743326310000191
表5 -20℃条件下55d稳定-长期稳定性结果：
Figure BDA0002743326310000192
表6 -70℃反复冻融5次稳定性结果：
Figure BDA0002743326310000193
Figure BDA0002743326310000201
表7全血稳定性结果：
Figure BDA0002743326310000202
本发明的方法检测的血浆中各药物的浓度在上述考察条件下得出的CV值小于5％，提示在上述考察条件下本发明方法对全血和血浆中托法替布的检测具有较强的稳定性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种测定人血浆中托法替布浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)样品制备：取待测血浆样本，加入内标工作溶液，涡旋，沉淀蛋白，涡旋离心，取上清液；
2)液相色谱-质谱联用检测：
色谱条件如下：色谱柱：Waters Xselectable HSS T3；流动相：流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；洗脱方式：梯度洗脱；流速：0.400～0.600mL/min；
质谱条件如下：采用ESI源，正离子MRM模式检测；
3)标准曲线制备：取托法替布标准工作溶液，稀释到空白血浆中，配制托法替布标准曲线血浆样品；取标准曲线血浆样品，加入内标工作溶液，涡旋，沉淀蛋白，涡旋离心，取上清液进样LC-MS/MS系统，记录每个浓度的托法替布对应的峰面积，以托法替布和内标的峰面积比值为纵坐标，以托法替布浓度为横坐标，制备标准曲线回归方程；
4)待测物托法替布测定：将待测血浆按步骤1)制备样品，按步骤2)采用LC-MS/MS方法检测，记录待测物托法替布对应的峰面积，将待测物托法替布的色谱峰面积与内标峰面积的比值代入获得的标准曲线回归方程，计算测定的待测物托法替布的相应浓度。
2.根据权利要求1所述的测定人血浆中托法替布浓度的方法，其特征在于，所述内标工作溶液中的内标为托法替布-d3；所述沉淀蛋白使用的沉淀剂为乙腈；所述涡旋的时间为3s；所述涡旋离心的条件为：涡旋5min，离心2490g，4℃，10min。
3.根据权利要求1所述的测定人血浆中托法替布浓度的方法，其特征在于，所述液相色谱-质谱联用的条件如下：
色谱条件
色谱柱：Waters Xselectable HSS T3(2.1×100mm，3.5micron)
流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈
流速0.400～0.600mL/min；停止时间4.00min；
洗针液冲洗：2s；进样量：20μL；柱温：35℃；
流动相比例设置如下：
Figure FDA0002743326300000021
质谱条件
采用ESI源，正离子MRM模式检测：
Figure FDA0002743326300000022
质谱切换阀设置如下：
Start Time Position 1 1.0 B 2 3.5 A
离子源参数设置如下：
Parameter Value(+) IS 5500 Gas1 60 Gas2 60 CAD 10 CUR 35 Temp(℃) 550
。
4.根据权利要求1所述的测定人血浆中托法替布浓度的方法，其特征在于，
所述托法替布标准工作溶液的浓度为10～10000ng/mL；
所述托法替布标准曲线血浆样品的浓度为0.5～100ng/mL。
5.根据权利要求4所述的测定人血浆中托法替布浓度的方法，其特征在于，所述托法替布标准工作溶液的配制：称取托法替布于容量瓶中，经DMSO溶解配制成1mg·mL-1标准对照品储备液；将标准对照品储备液用DMSO稀释，配制成标准系列的托法替布工作溶液。
6.根据权利要求1所述的测定人血浆中托法替布浓度的方法，其特征在于，所述标准曲线回归方程的获取过程如下：取标准曲线血浆样品各50μL，加入内标工作溶液20μL，涡旋30s，加入300μL乙腈沉淀剂沉淀后，涡旋5min，离心2490g，4℃，10min；20μL进样LC-MS/MS系统，记录每个浓度的托法替布对应的峰面积，以托法替布和内标的峰面积比值为纵坐标，以托法替布浓度为横坐标，制备标准曲线回归方程。
7.根据权利要求1所述的测定人血浆中托法替布浓度的方法，其特征在于，所述内标工作溶液的配制过程如下：称取托法替布-d3柠檬酸盐于容量瓶中，经50％甲醇水溶液溶解配制成10ug·mL-1内标对照品储备溶液；
取托法替布-d3内标工作液250μL置于50ml棕色容量瓶中，用50％甲醇水定容至刻度线，摇匀，即得浓度为50ng·mL-1的内标工作液。
8.根据权利要求1所述的测定人血浆中托法替布浓度的方法，其特征在于，所述LC-MS/MS系统检测后，托法替布在2.26min左右出峰，峰形良好，且人血浆中无杂质峰干扰上述化合物的测定，表明该方法具有较强的专属性。
9.根据权利要求1所述的测定人血浆中托法替布浓度的方法，其特征在于，所述标准曲线的回归方程如下：
测得的托法替布在人血浆中的标准曲线回归方程为y＝0.0451x+0.00026，R2为0.9996；托法替布的线性范围为0.5ng/mL～100ng/mL，托法替布的血药浓度的最低定量下限为0.5ng/mL。
10.权利要求1～9任一项所述的方法在测定人血浆中托法替布浓度中的应用，其特征在于，具体检测过程如下：向待测血浆样品中加入内标工作溶液，涡旋，加入乙腈沉淀剂沉淀后，涡旋、离心后，进样LC-MS/MS系统，记录待测物托法替布对应的峰面积，将待测物托法替布的色谱峰面积与内标峰面积的比值代入获得的标准曲线回归方程，计算测定的待测物托法替布的相应浓度。
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