WO2006037930A1 - Procede d'obtention d'un support pour electrophoserese incluant des cyclodextrat ines - Google Patents
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Definitions
- L 1 invention also covers the obtained carrier and the method of separation of proteins using this support.
- the present invention aims to improve the resolution of the support for the separation of proteins by electrophoresis while maintaining their biological activity, that is to say without denaturing. It also aims to improve the limit of detection of proteins difficult to visualize because of their small size.
- FIG. 3A represents the results of two-dimensional electrophoresis separation of E. coli with a first dimension in native gel including propane diamine- ⁇ -CD, and a second dimension in standard native gel.
- FIGS. 3A and 3B make it possible to compare the results obtained with a second dimension in native gel without cyclodextrin and a second dimension in gel including propane diamine- ⁇ -CD manufactured according to the method of Example 3, the first dimension being carried out for the two separations on native propane-diamine- ⁇ -CD gel.
- Example 5 Two-dimensional IEF / SDS electrophoresis with a first dimension ready-to-use gel ready-to-use (ready-to-use IEF)
- the ready-to-use gel is rehydrated in a solution containing:
- the gel can be used to perform the first dimension of electrophoresis.
- a first mixture which comprises:
- a second mixture which comprises:
- Example 6 Two-dimensional IEF / SDS electrophoresis with a first dimension in a ready-to-use gel and prior introduction of cyclodextrins into the extraction buffer
- the proteins to be separated are extracted in an extraction buffer consisting of:
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Abstract
L'objet de l'invention est un procédé d'obtention d'un support pour la séparation de protéines par électrophorèse, caractérisé en ce qu'il consiste à intégrer des cyclodextrines dans ledit support. L'invention couvre aussi le support obtenu ainsi que le procédé de séparation de protéines à l'aide de ce support.
Description
PROCEDE D ' OBTENTION D ' UN SUPPORT POUR ELECTROPHOSERESE INCLUANT DES CYCLODEXTRAT INES
La présente invention concerne un procédé d'obtention d'un support incluant des cyclodextrines pour permettre la séparation de protéines et peptides par électrophorèse.
L1 invention couvre aussi le support obtenu ainsi que le procédé de séparation de protéines à l'aide de ce support.
L'électrophorèse est une des techniques les plus utilisées en biologie moléculaire pour la séparation des macromolécules.
Elle permet de séparer des molécules chargées de nature et de taille très différentes telles que des protéines, des peptides, des acides aminés, des acides nucléiques ou encore des nucléotides.
L'électrophorèse est basée sur le principe de la mise en mouvement différentiel.
Les molécules à séparer sont placées dans un champ électrique et se déplacent vers un pδle de signe opposé à leur charge et à une vitesse proportionnelle à cette charge. Elles sont généralement déposées sur un support convenable poreux et imprégné d'un tampon. A cet effet, on peut utiliser par exemple du papier, de l'acétate de cellulose, du gel de polyacrylamide, du gel d'agarose, du gel d'amidon ou du gel de silice.
La plupart des techniques d'électrophorèse actuelles utilisent un gel ou un équivalent. Le gel se comporte comme un tamis moléculaire, les molécules migrant d'autant moins vite qu'elles sont plus grosses.
Plusieurs facteurs influencent donc la vitesse de migration et de ce fait la séparation des molécules durant l'électrophorèse. Ces facteurs sont la charge et la taille des molécules ainsi que leur affinité pour le gel et le pH du milieu. Les protéines sont des molécules couramment séparées par électrophorèse. La séparation des protéines par électrophorèse se fait essentiellement en gel, et plus particulièrement en gel de polyacrylamide. Les protéines à séparer peuvent être natives ou dénaturées par des agents tel que le sodium dodécylsulfate (SDS).
On appelle pour la suite de la description : - gel natif, un gel pour électrophorèse dans lequel on fait migrer des protéines non dénaturées,
- gel SDS, un gel pour électrophorèse dans lequel on fait migrer des protéines dénaturées par du SDS,
- gel IEF, un gel pour électrophorèse dans lequel on fait migrer les protéines selon la technique d'isoélectrofocalisation.
L'électrophorèse en gel natif permet de séparer les protéines en fonction de leur poids moléculaire et de leur charge, tout en permettant le maintien des interactions et de l'activité biologique.
Cependant, cette technique ne permet pas de séparer correctement les protéines. En effet, comme deux facteurs interviennent, à savoir le poids moléculaire et la charge, le pouvoir de résolution est faible et les résultats ne sont pas faciles à analyser.
Il est possible d'utiliser du SDS qui impose une charge fixe à toutes les protéines. Ainsi, les protéines sont séparées uniquement en fonction de leur poids moléculaire et la résolution est meilleure.
Toutefois cette technique souffre d'un inconvénient majeur, puisque le SDS dénature les protéines qui perdent leur activité biologique et ne sont plus complexées les unes avec les autres.
On connaît encore l'électrophorèse en gel IEF qui consiste à séparer les protéines en fonction de leur point isoélectrique, c'est-à-dire le pH pour lequel la somme de leurs charges positives et négatives périphériques s'annulent. Cette méthode exclut certaines classes de protéines, notamment les protéines hydrophobes et nécessite l'utilisation de dithiothréitol (DTT) ou d'urée à forte concentration qui dénature les protéines.
De plus, quel que soit le support utilisé, l'électrophorèse ne permet pas de détecter les protéines peu abondantes mais qui peuvent jouer un rôle essentiel, comme les protéines membranaires. II subsiste donc un besoin pour un outil d'électrophorèse qui permettrait d'améliorer le pouvoir de séparation, de résolution et de détection des protéines tout en maintenant leur activité biologique.
Pour y répondre, la présente invention se propose d'introduire des cyclodextrines dans le support. Dans le domaine des techniques de séparation de composés, il existe un certain nombre de documents relatifs à l'utilisation des cyclodextrines. Les procédés qui y sont décrits concernent l'augmentation de l'énantiosélectivité en HPLC, en chromatographie gazeuse et en électrophorèse capillaire. Les cyclodextrines sont des molécules amphiphiles qui possèdent une structure supramoléculaire originale en forme de cage, à l'intérieur de laquelle il peut y avoir des interactions intramoléculaires de type « hôte-invité ». Cette structure supramoléculaire engendre des différences de stabilité des complexes formés entre les différents énantiomères d'une même molécule. A ce sujet, Eva Schneiderman et Apryll M. Stalcup, Journal of Chromatography B, vol.745, p.83-102, décrivent l'utilisation des cyclodextrines dans de nombreuses techniques de séparation pour leur capacité à différencier des isomères de position, des groupes fonctionnels, des homologues ou encore des énantiomères.
Une constatation identique en chromatographie en phase gazeuse est décrite par Carlito B. Lebπlla, Ace. Chem. Res., vol.34, p 653-661. Dans ces techniques, les cyclodextrines se limitent à la séparation d'énantiomères et ne sont pas appliquées à la séparation des protéines par électrophorèse.
La présente invention a pour objectif d'améliorer le pouvoir de résolution du support pour la séparation des protéines par électrophorèse tout en maintenant leur activité biologique, c'est-à-dire sans les dénaturer. Elle a également pour but d'améliorer la limite de détection de protéines difficiles à visualiser du fait de leur petite taille.
Pour cela, l'invention propose un procédé d'obtention de gels non dénaturants pour électrophorèse qui consiste à introduire des cyclodextrines lors de la polymérisation d'un gel apte à provoquer une discrimination par électrophorèse et plus particulièrement un gel appartenant aux gels de polyacrylamide. Selon une variante, dans le cas d'un gel prêt à l'emploi, déjà fabriqué et conservé sous forme déshydratée, le procédé d'obtention selon la présente invention consiste à introduire des cyclodextrines dans la solution de réhydratation du gel. Par « cyclodextrines » on entend toutes cyclodextrines naturelles ou modifiées. De façon avantageuse on utilise des cyclodextrines modifiées. Dans le cas de cyclodextrines mono-modif iées, on choisit préf érentiellement les cyclodextrines modifiées sur l'hydroxyle primaire et en particulier la 6A-(3- Aminopropylamino)-6A-desoxy-cyclomatoheptaose (propane diamine-β-CD) et la 6A-(3-Aminoethylamino)-6A-desoxy-cyclomatoheptaose (éthane diamine-β-CD) décrites dans le brevet FR2714067. Dans le cas de cyclodextrines poly-modifiées, on peut citer comme particulièrement efficace pour la présente invention, la 6I-(3a, 7a, 12a- tπhydroxy-5β-cholan-24-amido)-6I-desoxy-2I-0-méthyl-hexakis(2II-VII,
6II-VII-di-O-methyl) cyclomαltoheptαose (DIMEB-αcide cholique) décrite dans le brevet FR2792942.
On suppose que le procédé de séparation selon la présente invention est basé sur une interaction entre les cyclodextrines présentes dans le gel, et les acides aminés aromatiques hydrophobes des protéines à identifier. Dans cette hypothèse, les cyclodextrines provoquent un effet d'empilement et entraînent un retard de la migration des protéines qui sont ainsi mieux séparées. Préalablement à l'étape de séparation selon la présente invention, afin d'augmenter le pouvoir de séparation des protéines, il est possible d'introduire en supplément des cyclodextrines dans le tampon d'extraction. Cette étape préalable permet à la fois une meilleure solubilisation des protéines hydrophobes dans le gel et une réduction des phénomènes d'agrégation, en particulier au voisinage de leur point isoélectrique. On présume que les cyclodextrines s'intercalent entre les résidus hydrophobes des protéines et entrent en compétition avec les interactions qui peuvent exister entre ces résidus de manière à empêcher l'agrégation des protéines et permettre ainsi la visualisation de ces protéines dans le gel.
De façon surprenante, l'effet des cyclodextrines sur le pouvoir de résolution et la limite de détection n'est pas limité à certaines classes de protéines. Un effet identique sur le pouvoir de résolution est observé en présence d'un agent chaotropique, particulièrement l'urée.
De même, la présente invention permet d'améliorer la visualisation des protéines en utilisant aussi bien une coloration au nitrate d'argent qu'une coloration au bleu de coomassie. Elle permet aussi d'améliorer la visualisation des peptides en augmentant le pouvoir de résolution en gel Tris/Tricine, qui est un gel de polyacrylamide spécifique à la séparation des peptides.
La présente invention présente également un intérêt pour la séparation des protéines par électrophorèse bidimensionnelle qui combine deux électrophorèses l'une par rapport à l'autre. Il est possible d'utiliser un gel obtenu selon la présente invention et un gel standard, ou bien deux gels obtenus selon la présente invention.
Les protéines ainsi séparées peuvent ensuite faire l'objet d'une identification par spectrométrie de masse, sans que les cyclodextrines présentes n'induisent de perturbations.
D'autres caractéristiques et avantages ressortiront des exemples qui vont suivre, exemples donnés en regard des figures annexées sur lesquelles :
- la figure IA représente les résultats de séparation par électrophorèse de protéines totales d'Escherichia coli (E. coli) en gel natif standard.
- la figure IB représente les résultats de séparation par électrophorèse de protéines totales d'E. coli en gel natif incluant de la propane diamine- β-CD.
- La figure ZA représente les résultats de séparation par électrophorèse de la lactalbumine, de l'anhydrase carbonique, de l'ovalbumine et de la sérumalbumine en gel natif standard en présence d'urée 6 M.
- La figure 2B représente, de la gauche vers la droite, les résultats de séparation par électrophorèse de la lactalbumine, de l'anhydrase carbonique, de l'ovalbumine et de la sérumalbumine en gel natif incluant de la propane diamine-β-CD en présence d'urée 6 M.
- la figure 3A représente les résultats de séparation par électrophorèse bidimensionnelle de protéines totales d'E. coli avec une première dimension en gel natif incluant de la propane diamine-β-CD, et une seconde dimension en gel natif standard.
- la figure 3 B représente les résultats de séparation par électrophorèse bidimensionnelle de protéines totales d'E. coli avec une première
dimension en gel natif incluant de la propane diamine-β-CD, et une seconde dimension en gel natif incluant de la propane diamine-β-CD.
- la figure 4A représente les résultats de séparation par électrophorèse bidimensionnelle de l'anhydrase carbonique avec une première dimension en gel natif incluant de le propane diamine-β-CD, et une seconde dimension en gel SDS.
- la figure 4B représente les résultats de séparation par électrophorèse bidimensionnelle de l'anhydrase carbonique avec une première et une seconde dimension en gel natif incluant de la propane diamine-β-CD. - la figure 5 A représente les résultats de séparation par électrophorèse bidimensionnelle de protéines totales d'E. coli avec une première dimension en gel natif standard et une seconde dimension en gel SDS.
- la figure 5B représente les résultats de séparation par électrophorèse bidimensionnelle de protéines totales d'E. coli avec une première dimension en gel natif incluant de la propane diamine-β-CD et une seconde dimension en gel SDS.
- la figure 6A représente les résultats de séparation par électrophorèse bidimensionnelle de protéines d'une fraction enrichie en membranes d'E. coli extraites avec une solution d'extraction standard, avec une première dimension en gel IEF prêt à l'emploi réhydraté de façon standard et une seconde dimension en gel SDS.
- la figure 6B représente les résultats de séparation par électrophorèse bidimensionnelle de protéines d'une fraction enrichie en membranes d'E. coli, extraites avec une solution d'extraction standard, avec une première dimension en gel IEF prêt à l'emploi réhydraté avec une solution incluant de la propane diamine-β-CD et une seconde dimension en gel SDS.
- la figure βC représente les résultats de séparation par électrophorèse bidimensionnelle de protéines d'une fraction enrichie en membranes d'E. coli extraites dans une solution d'extraction incluant de la propane diamine-β-CD, avec une première dimension en gel IEF réhydraté avec une solution incluant de la propane diamine-β-CD et une seconde dimension en gel SDS.
Exemple 1 : Electrophorèse en gel natif On réalise un premier mélange qui comprend : - 10% de solution d'acrylamide (30%T / 2.6%C), (T : concentration totale ; C : concentration en agent réticulant),
- 10 à 100 mM de propane diamine-β-CD, plus particulièrement 20 à 7O mM,
- 0,375 M de Tris-HCI, pH 8,8, - 0,67% Ammonium Persulfate (APS), et
- 0,12% TEMED.
Ce mélange est versé à 1 cm de l'extrémité des puits entre deux plaques de verre séparées d'1 mm. Il est ensuite recouvert à 95% avec une solution d'isobutanol. On réalise un second mélange qui comprend :
- 4% de solution d'acrylamide (30%T , 2.6%C),
- 0,125 M de Tris-HCI, pH 6,8,
- 10 à 100 mM de propane diamine-β-CD, plus particulièrement 20 à 7O mM, - 0,67% APS, et
- 0,12% TEMED.
Finalement on verse ce second mélange sur le premier pour obtenir le gel. Ce gel peut être utilisé pour séparer des protéines par électrophorèse.
Les figures IA et IB permettent de comparer les résultats obtenus avec un gel natif sans cyclodextrine et un gel incluant de la propane diamine-β-CD fabriqué selon le procédé de l'exemple 1.
Sur le gel incluant de la propane diamine-β-CD obtenu selon l'exemple 1, on constate une forte augmentation du pouvoir de résolution qui se traduit par des bandes moins floues et l'apparition de nouvelles bandes.
On observe également un léger retard de la migration dans le gel à base de propane diamine-β-CD, mais le profil reste inchangé.
Ainsi le gel incluant la propane diamine-β-CD permet de faciliter la visualisation des bandes et d'identifier plus de protéines qu'un gel natif standard.
Exemple 2 : Electrophorèse en gel natif en présence d'un agent chaotropique On réalise un premier mélange qui comprend :
- 10% de solution d'acrylamide (30%T / 2.6%C),
- 10 à 100 mM de propane diamine-β-CD, plus particulièrement 20 à 70 mM,
- 6 à 9 M d'urée,
- 0,375 M de Tris-HCI, pH 8,8,
- 0,67% APS, et
- 0,12% TEMED. Ce mélange est versé à 1 cm de l'extrémité des puits entre deux plaques de verre séparées d'1 mm. Il est ensuite recouvert à 95% avec une solution d'isobutanol. On réalise un second mélange qui comprend :
- 4% de solution d'acrylamide (30%T , 2.6%C), - 0,125M de Tris-HCI, pH 6,8,
- 10 à 100 mM de propane diamine-β-CD, plus particulièrement 20 à 7O mM,
- 6 à 9 M d'urée,
- 0,67% APS, et
- 0,12% TEMED.
Finalement on verse ce second mélange sur le premier pour obtenir le gel. Ce gel peut être utilisé pour séparer des protéines par électrophorèse.
Les figures ZA et 2B permettent de comparer les résultats obtenus avec un gel natif sans cyclodextrine et un gel incluant de la propane diamine-β-CD fabriqué en présence d'urée selon le procédé de l'exemple 2.
L'urée est un agent chaotropique qui permet d'augmenter le pouvoir de résolution de l 'électrophorèse mais qui dénature les protéines s'il est utilisé en trop grande quantité. On constate qu'utilisé en petite quantité en présence de cyclodextrines dans le gel, le pouvoir de résolution est fortement augmenté sans dénaturer les protéines.
Exemple 3 : Electrophorèse en deux dimensions natif /natif 1ère dimension (natif) On mélange :
- 4% de solution d'acrylamide (30%T / 5.4%C),
- 10 à 100 mM de propane diamine-β-CD, plus particulièrement 20 à 70 mM,
- 0,375 M de Tris-HCI, pH 8,8,
- 0,67% APS, et
- 0,12% TEMED.
On peut également éventuellement ajouter au mélange : - un surfactant ou un détergent dans des conditions non dénaturantes, par exemple 20 à 50OmM d'acide aminocaproïque, et/ou
- un agent chaotropique non dénaturant, par exemple 2 à 8 mM d'urée, et/ou
- des molécules de type ampholyte destinées à établir un gradient de pH. Ce mélange est versé à 1 cm de l'extrémité des puits entre deux plaques de verre séparées d'1 mm.
Ce gel est utilisé pour réaliser la première dimension de l'électrophorèse. 2ème dimension (natif) On réalise un premier mélange qui comprend : - 10% de solution d'acrylamide (30%T / 2,6%C),
- 10 à 100 mM de propane diamine-β-CD, plus particulièrement 20 à 7O mM,
- 0,375 M de Tris-HCI, pH 8,8,
- 0,67% APS (Ammonium Persulfate), et - 0,12% TEMED,
On verse ce mélange à 1 cm de l'extrémité des puits entre deux plaques de verre séparées d'1 mm. Il est ensuite recouvert à 95% avec une solution d'isobutanol. On réalise un second mélange qui comprend :
- 4% de solution d'acrylamide (30%T , 2,6%C), - 0,125M de Tris-HCI, pH 6,8,
- 10 à 100 mM de propane diamine-β-CD, plus particulièrement 20 à 7O mM,
- 0,67% APS, et
- 0,12% TEMED. Finalement on yerse ce second mélange sur le premier pour obtenir le gel utilisé pour séparer les protéines suivant la seconde dimension.
Les figures 3A et 3B permettent de comparer les résultats obtenus avec une seconde dimension en gel natif sans cyclodextrine et une seconde dimension en
gel incluant de la propane diamine-β-CD fabriqué selon le procédé de l'exemple 3, la première dimension étant réalisée pour les deux séparations sur gel natif à base de propane diamine-β-CD.
On observe un renforcement de l'intensité des taches ainsi que l'augmentation de leur nombre pour les protéines séparées suivant la seconde dimension dans un gel incluant de la propane diamine-β-CD obtenu selon l'exemple 3. Ainsi la combinaison de gels incluant de la propane diamine-β-CD en électrophorèse bidimensionnelle permet d'augmenter le pouvoir de résolution et d'identifier plus de protéines que l'utilisation d'un gel natif standard en seconde dimension. Les figures 4A et 4B permettent de comparer les résultas obtenus avec une seconde dimension en gel natif incluant de la propane diamine-β-CD fabriqué selon le procédé de l'exemple 3 et une seconde dimension en gel SDS. On observe le maintien des interactions protéine-protéine entre les sous-unités de l'anhydrase carbonique, qui apparaît de bas en haut dans le gel natif sous la forme de monomères, dimères et trimères, alors que seuls les monomères sont révélés en présence de SDS dans la seconde dimension.
Exemple 4 : Electrophorèse en deux dimensions natif /SDS 1ère dimension (natif) On mélange :
- 4% de solution d'acrylamide (30%T / 5,4%C),
- 10 à 100 mM de propane diamine-β-CD, plus particulièrement 20 à 7O mM,
- 0,375 M de Tris-HCI, pH 8,8, - 0,67% APS, et
- 0,12% TEMED.
Ce mélange est versé à 1 cm de l'extrémité des puits entre deux plaques de y/erre séparées d'1 mm.
Ce gel est utilisé pour réaliser la première dimension de l'électrophorèse.
2ème dimension (SDS)
On réalise un premier mélange qui comprend : - 8% de solution d'acrylamide (30%T / 2,6%C),
- 0,75 M de Tris-HCI, pH 8,8,
- 0,1% SDS,
- 0,5% APS, et
- 0,085% TEMED. On verse ce mélange à 1 cm de l'extrémité des puits entre deux plaques de verre séparées d'1 mm. Il est ensuite recouvert à 95% avec une solution d'isobutanol. On réalise un second mélange qui comprend :
- 4% de solution d'acrylamide (30%T , 2,6%C),
- 0,125M de Tris-HCI, pH 6.8, - 0,1% de SDS,
- 0,67% APS, et
- 0,12% TEMED.
Finalement on verse ce second mélange sur le premier pour obtenir le gel utilisé pour séparer les protéines suivant la seconde dimension. Les figures 5A et 5B permettent de comparer les résultats obtenus avec une première dimension en gel natif sans cyclodextrine et une première dimension dans un gel incluant de la propane diamine-β-CD fabriqué selon le procédé de l'exemple 4, la deuxième dimension étant réalisée pour les deux séparations en gel SDS. Avec une première dimension en gel natif standard sans cyclodextrine, les bandes ne sont pas très claires et présentes en très faible quantité. En revanche, si on sépare les protéines en première dimension dans un gel incluant
de la propane diamine-β-CD, on observe une augmentation de la limite de détection et du pouvoir de résolution.
Exemple 5 : Electrophorèse bidimensionnelle IEF/SDS avec une première dimension sur gel prêt à l'emploi 1ère dimension (IEF prêt à l'emploi) On réhydrate le gel prêt à l'emploi dans une solution contenant :
- 8 M d'urée,
- 50 mM de DTT, - 1 à 100 mM de propane diamine-β-CD, plus particulièrement 20 à
7O mM,
- 2% de CHAPS, et
- 0,2% d'ampholyte.
Une fois réhydraté, le gel peut être utilisé pour réaliser la première dimension de l'électrophorèse.
2ème dimension (SDS)
On réalise un premier mélange qui comprend :
- 8% de solution d'acrylamide (30%T / 2,6%C), - 0,75 M de Tris-HCI, pH 8,8,
- 0,1% SDS,
- 0,5% APS, et
- 0,085% TEMED.
On verse ce mélange à 1 cm de l'extrémité des puits entre deux plaques de verre séparées d'1 mm. Il est ensuite recouvert à 95% avec une solution d1 isobutanol. On réalise un second mélange qui comprend :
- 4% de solution d'acrylamide (30%T , 2,6%C),
- 0,125 M de Tris-HCI, pH 6.8,
- 0,67% APS, et
- 0,12% TEMED.
Finalement on verse ce second mélange sur le premier pour obtenir le gel utilisé pour séparer les protéines suivant la seconde dimension.
Les figures 6A et 6B permettent de comparer les résultats obtenus avec une première dimension en gel IEF réhydraté de façon standard et une première dimension dans un gel IEF réhydraté avec une solution incluant de la propane diamine-β-CD selon le procédé de l'exemple 5, la séparation des protéines en seconde dimension étant réalisée pour les deux séparations dans un gel SDS.
On constate, notamment au niveau des flèches et de la zone Z, que la présence de propane diamine-β-CD dans la solution de réhydratation du gel utilisé pour la première dimension, permet d'augmenter à la fois le nombre et l'intensité des taches visualisées. Ainsi, il est possible d'identifier plus facilement plus de protéines.
Exemple 6 : Electrophorèse bidimensionnelle IEF/SDS avec une première dimension en gel prêt à l'emploi et introduction préalable de cyclodextrines dans le tampon d'extraction Les protéines à séparer sont extraites dans un tampon d'extraction constitué de :
- 8 M d'urée,
- 50 mM de DTT,
- 2% de CHAPS, - 10 à 100 mM de propane diamine-β-CD, plus particulièrement 20 à
70 mM, et
- 0,2% d'ampholyte.
Cette solution est incubée pendant deux heures à 250C.
On supprime ensuite la matière insoluble par centrif ugation à 250C pendant une heure.
Les protéines ainsi extraites peuvent ensuite être séparées par électrophorèse. Si on compare les résultats obtenus sur les figures 6B et 6C, on constate que la présence de cyclodextrines dans la solution d'extraction des protéines permet d'obtenir des résultats très significatifs. En effet dans la zone Z, sur la figure βC on observe des nouvelles taches qui n'apparaissaient ni sur la figure 6A, ni sur la figure 6B. L'ajout de propane diamine-β-CD à la fois dans la solution d'extraction des protéines et dans la solution de réhydratation du gel permet d'augmenter signif icativement le pouvoir de séparation de l'électrophorèse.
Les protéines ainsi séparées peuvent ensuite faire l'objet d'une identification par spectrométrie de masse, les cyclodextrines présentes n'induisant aucune perturbation.
Bien entendu, l'invention n'est évidemment pas limitée aux exemples représentés et décrits ci-dessus, mais en couvre au contraire toutes les variantes, notamment en ce qui concerne les supports pour électrophorèse utilisés qui peuvent être sous forme de gel, mais également par exemple sous forme de papier ou encore d'acétate de cellulose.
Claims
1. Procédé d'obtention d'un support pour la séparation de protéines par électrophorèse, caractérisé en ce qu'il consiste à intégrer des cyclodextrines dans ledit support.
2. Procédé d'obtention d'un support pour la séparation de protéines par électrophorèse selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on choisit ledit support parmi les polymères et en ce qu'on intègre les cyclodextrines pendant la polymérisation.
3. Procédé d'obtention d'un support pour la séparation de protéines par électrophorèse selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on choisit ledit support parmi les gels déshydratés pour électrophorèse et en ce qu'on réhydrate ledit gel avec une solution incluant des cyclodextrines.
4. Procédé d'obtention d'un support pour la séparation de protéines par électrophorèse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit support est un gel de polyacrylamide.
5. Procédé d'obtention d'un support pour la séparation de protéines par électrophorèse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce les cyclodextrines utilisées sont des cyclodextrines naturelles ou modifiées.
6. Procédé d'obtention d'un support pour la séparation de protéines par électrophorèse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les cyclodextrines sont choisies parmi les cyclodextrines mono-modif iées au niveau de l'hydroxyle primaire.
7. Procédé d'obtention d'un support pour la séparation de protéines par électrophorèse selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les cyclodextrines utilisées sont de la forme 6A-(3- Aminopropylαmino)-6A-desoxy-cyclomαtoheptαose ou 6A-(3-Aminoéthylαmino)- 6A-desoxy-cyclomαtoheptαose.
8. Procédé d'obtention d'un support pour la séparation de protéines par électrophorèse selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les cyclodextrines sont choisies parmi les cyclodextrines poly-modif iées de la forme la 6I-(3a, 7a, 12a-trihydroxy-5β-cholan-24-amido)-6I-desoxy-2I-0-méthyl- hexakis (2II-VII, 6II-VII-di-O-methyl) cyclomaltoheptaose.
9. Support pour la séparation de protéines par électrophorèse obtenu par la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend de 1 à 100 mM de cyclodextrines.
10. Support pour la séparation de protéines par électrophorèse selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend un agent chaotropique.
11. Procédé de séparation de protéines utilisant le support de la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu'on introduit les protéines totales afin d'isoler des protéines sous la forme de complexes.
12. Procédé de séparation de protéines utilisant le support de la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu'on fait subir préalablement à ces protéines une mise en solution dans un milieu tamponné contenant des cyclodextrines.
13. Protéines séparées obtenues par le procédé de séparation de la revendication 11 ou 12, caractérisées en ce qu'elles peuvent être identifiées par spectrométrie de masse.
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015021418A1 (fr) * | 2013-08-09 | 2015-02-12 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Détection de protéine au moyen de cyclodextrines modifiées |
| CN112697562A (zh) * | 2021-01-21 | 2021-04-23 | 上海雅酶生物医药科技有限公司 | 免脱色聚丙烯酰胺凝胶蛋白快速染色液及制备和使用方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5104547A (en) * | 1990-03-06 | 1992-04-14 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung | Separating materials for chromatography comprising cyclodextrin chemically bonded to a support via a carbamic acid group |
| EP0483380A1 (fr) * | 1990-05-21 | 1992-05-06 | Toppan Printing Co., Ltd. | Procedes de synthese de polymere de cyclodextrine et de production de films de cyclodextrine |
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|---|---|---|---|---|
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5104547A (en) * | 1990-03-06 | 1992-04-14 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung | Separating materials for chromatography comprising cyclodextrin chemically bonded to a support via a carbamic acid group |
| EP0483380A1 (fr) * | 1990-05-21 | 1992-05-06 | Toppan Printing Co., Ltd. | Procedes de synthese de polymere de cyclodextrine et de production de films de cyclodextrine |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| KAWAGUCHI ET AL: "Chemically Bonded Cyclodextrin Stationary Phases for Liquid Chromatographic Separation of Aromatic Compounds", ANALYTICAL CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY. COLUMBUS, US, vol. 55, 1983, pages 1852 - 1857, XP002337247, ISSN: 0003-2700 * |
| MIZOBUCHI ET AL.: "Preparation and sorption behaviour of cyclodextrin polyurethane resins", J. CHROMATOGRAPHY, vol. 194, 1980, pages 153 - 161, XP002367449 * |
| QUANG ET AL: "Separation of peptides and proteins by capillary electrophoresis using acidic buffers containing tetraalkylammonium cations and cyclodextrins", ELECTROPHORESIS, WEINHEIM, DE, vol. 24, no. 5, 2003, pages 824 - 828, XP002337222, ISSN: 0173-0835 * |
| TANAKA ET AL.: "Sorption behaviour of several organic compounds on 6-deoxycyclodextrin polyurethane resins", J. CHROMATOGRAPHY, vol. 219, 1981, pages 108 - 112, XP002367448 * |
| ZHANG R ET AL: "THE EFFECT OF BETA-CYCLODEXTRINS AS BUFFER ADDITIVES ON THE (CAPILLARY) ELECTROPHORETIC SEPARATION OF PEPTIDES AND PROTEINS", JOURNAL OF CAPILLARY ELECTROPHORESIS, SHELTON, CT, US, vol. 4, no. 3, 1997, pages 105 - 112, XP009051089, ISSN: 1079-5383 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015021418A1 (fr) * | 2013-08-09 | 2015-02-12 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Détection de protéine au moyen de cyclodextrines modifiées |
| US9285359B2 (en) | 2013-08-09 | 2016-03-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Protein detection using modified cyclodextrins |
| CN112697562A (zh) * | 2021-01-21 | 2021-04-23 | 上海雅酶生物医药科技有限公司 | 免脱色聚丙烯酰胺凝胶蛋白快速染色液及制备和使用方法 |
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