FR2794758A1 - Gels de polyacrylamide contenant en outre un polymere hydrophile - Google Patents
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Abstract
L'invention a pour objet une nouvelle composition pour la préparation d'un gel de polyacrylamide caractérisée en ce qu'elle comprend un polymère hydrophile n'étant pas sous la forme d'un dispersoïde, les procédés de préparation de gels de polyacrylamide à partir desdites compositions ainsi que l'utilisation desdits gels pour la séparation des acides nucléiques par électrophorèse, notamment pour le sequençage et/ ou la détection de mutation d'acides nucléiques, la séparation des protéines et éventuellement des complexes acides nucléiques-protéines.
Description
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L'invention a pour objet une nouvelle composition pour la préparation d'un gel de polyacrylamide caractérisée en ce qu'elle comprend un polymère hydrophile n'étant pas sous la forme d'un dispersoïde, les procédés de préparation de gels de polyacrylamide à partir desdites compositions ainsi que l'utilisation desdits gels pour la séparation des acides nucléiques par électrophorèse, notamment pour le séquençage et/ou la détection de mutation d'acides nucléiques, la séparation des protéines et éventuellement des complexes acides nucléiques-protéines.
Les molécules d'origine biologique ou synthétique peuvent être séparées sur la base de leur différence de poids moléculaire ou de leur charge électrique. Parmi les méthodes de séparation utilisant ces différences, la chromatographie et l'électrophorèse sont les plus couramment utilisées.
Dans la méthode par électrophorèse qui dépend à la fois de la taille et/ou de la charge de la molécule, d'autres variables comme la déformabilité et la forme tridimentionnelle des composés séparer peuvent également affecter la mobilité électrophorétique. En général, les composés à séparer sont des protéines ou des acides nucléiques qui sous l'influence d'un champ électrique migrent dans une solution tampon au travers d'un gel qui sert de milieu de séparation.
Parmi les méthodes utilisant le principe de l'électrophorèse, on peut citer l'électrophorèse en zone continue ou en zone discontinue, en une ou deux dimensions, dans lesquelles la séparation peut être réalisée à pH constant ou en gradient de pH, et leurs variantes comme l'isoélectrophorèse, l' isoélectric focusing ou l'isotachophérèse, bien connues de l'homme de fart et qui ne seront pas développées dans la présente description.
Parmi les gels les plus couramment utilisés comme milieu de séparation de macromolécules par électrophorèse, on trouve les gels d'agarose et de polyacrylamide. Les gels de polyacrylamide sont préparés partir de solution aqueuse de monomères d'acrylamide et d'agent de couplage, telle que les monomères de bisacrylamide, dans laquelle est ajouté un initiateur de la réaction de polymérisation. Le gel inclut généralement un tampon aqueux afin d'obtenir un milieu électriquement conducteur. La solution aqueuse de monomères d'acrylamide et d'agent de couplage
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peut être réalisée à partir de monomères d'acrylamide et d'agent de couplage de source très variée ou obtenue à partir de mélange de monomères d'acrylamidc et d'agent de couplage pré-préparé comme par exemple la composition TMLong Ranger de la société FMC, TMRapid gel de la société Amersham ou encore TMPhage+ de la société Ameresco.
Afin d'améliorer le stockage des gels de polyacrylamide sous forme déshydratée, il est possible d'ajouter après polymérisation du gel certains composés appelés stabilisateurs comme des polyols, des polysaccharides ou des polyamines. Ces méthodes de stabilisation, telles que par exemple celles décrites dans les document US 4,746,551, et US 5,159,049 permettent d'obtenir des gels de polyacrylamide dont les cinétiques de réhydratation sont supérieures aux gels déshydratés ne contenant pas de stabilisateurs.
Il est possible également d'ajouter après polymérisation du gel des polymères hydrophiles à la surface du gel polymérisé dans certaines applications comme l'électrophorèse en gel capillaire telle que décrite par exemple dans le document US 5,370,777. Ces polymères hydrophiles sont adsorbés et fixés à la surface du gel polymérisé par interactions de type liaison de type van der Wall ou de radicaux libres.
Les gels de polyacrylamide peuvent être également modifiés dans le but d'obtenir une matrice polymérique permettant d'effectuer des séparations combinées par chromatographie et par électrophorèse (US 5,135,627). Pour cela, on incorpore dans la composition avant polymérisation des dispersoïdes généralement sphériques de nature macromoléculaire, hydrophiles ou hydrophobes, non miscibles avec la composition habituelle de base servant à préparer le gel de polyacrylamide. Après la polymérisation du système dispersée ainsi obtenue, les gels contiennent des microdomaines présentant des caractéristiques propres de séparation par chromatographie qui viennent amplifier et altérer les caractéristiques liées au pouvoir séparateur du gel de polyacrylamide standard. Les dispersoïdes utilisés dans ces matrices combinées sont par exemple des microsphères de TMséphadex ou de TMsépharose de 0,5 m de diamètre.
Néanmoins, il reste que les méthodes de séparation par électrophorèse sont encore limitées dans leur capacité à réaliser des séparations pour l'analyse de certains
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composés macromoléculaires, en particulier dans le domaine de la séparation et de l'analyse d'acides nucléiques, avec des vitesses de séparation compatibles avec les performances souhaitées par l'utilisateur, notamment avec l'apparition d'analyseurs automatiques de séquence.
En général, il est possible de raccourcir le cycle de durée de la séparation et de l'analyse en jouant sur certains paramètres de l'électrophorèse comme par exemple l'intensité du courant traversant le gel, le voltage, la puissance ou la température à laquelle est réalisée la séparation. La consistance des gels de polyacrylamide existant actuellement ne permet pas d'augmenter de manière significative les vitesses de séparation de certains composés macromoléculaires sans que ces gels subissent des déformations irréversibles, en particulier d'autant plus importantes que l'on s'éloigne du centre du gel (cf. Figure 1A). Ces déformations altèrent l'homogénéité des caractéristiques du gel utilisé et la qualité des résultats obtenus. Il reste en outre que ces gels sont peu maniables, fragiles et peu résistants à l'étirement, à l'échauffement, ou à toute déformation ou toute distorsion pouvant apparaître lors de leur utilisation.
D'autre part, il n'existe pas de matrice gel standard de base pour l'électrophorèse permettant de réaliser à partir de cette matrice gel standard de base l'ensemble des applications d'intérêt de l'électrophorèse à la biologie moléculaire. Par exemple, pour les applications de l'électrophorèse au séquençage et au génotypage, et à la recherche de mutation, l'homme de l'art doit utiliser une matrice gel de base de composition différente pour chacune de ses applications.
Ainsi, il existe aujourd'hui un grand besoin pour des gels d'électrophorèse permettant de réaliser un cycle de séparation et de séquençage automatique d'acide nucléique de longueur supérieure à 500 bases dans une période de temps beaucoup plus courte que celle obtenue avec les gels actuels.
D'autre part, il existe également un besoin d'améliorer la résistance mécanique et l'élasticité des gels d'électrophorèse tout en permettant d'améliorer les vitesses de séparation et d'analyse de certains composés.
Enfin, il existe un besoin pour une matrice gel standard de base pour l'électrophorèse permettant à la fois de réaliser l'ensemble des applications d'intérêt pour la biologie moléculaire, telles que notamment le séquençage, le génotypage et
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l'identification d'acide nucléique muté avec une grande sensibilité. Ceci est justement l'objet de la présente invention.
Les inventeurs ont en effet de façon tout à fait surprenante mis en évidence une nouvelle composition de base pour la préparation d'un gel de polyacrylamide ayant non seulement une résistance mécanique et une élasticité nettement améliorée permettant de réduire de manière importante la durée du cycle de séparation et d'analyse, telle que le séquençage, pour certains composés macromoléculaires mais également permettant d'effectuer partir de cette composition de base la recherche de mutation avec une grande sensibilité.
Ainsi, la présente invention a pour objet une composition pour la préparation d'un gel de polyacrylamide, caractérisée en ce qu'elle comprend une solution aqueuse homogène contenant des monomères d'acrylamide, un agent de couplage et un polymère hydrophile, ledit polymère hydrophile n'étant pas sous la forme d'un dispersoïde et étant choisi parmi le dextran, l'agarose, le ficoll, ou un mélange de cesdits polymères.
Par l'expression polymère hydrophile n'étant pas sous la forme d'un dispersoïde , on entend désigner dans la présente description un polymère hydrophile qui, dans ladite solution aqueuse homogène contenant des monomères d'acrylamide et un agent de couplage, ne forme pas de particule, telle qu'une particule colloïdale, notamment de forme sphérique ou cylindrique, en suspension dans ladite solution aqueuse. Ainsi, ladite solution aqueuse homogène contenant les monomères d'acrylamide, l'agent de couplage et le polymère hydrophile, ne forme pas un système dispersé dans lequel la solution aqueuse contenant les monomères d'acrylamide et l'agent de couplage serait la phase dispersante et ledit polymère hydrophile la phase dispersée.
On préfère notamment les compositions selon l'invention, caractérisées en ce que le polymère hydrophile est le dextran.
Parmi ces polymères hydrophiles, on préfère notamment ceux dont le poids moléculaire moyen permet d'obtenir dans ladite solution aqueuse des molécules de polymère hydrophile sous une forme déroulée, telle qu'une forme linéaire pouvant être légèrement branchée, afin d'éviter la présence de particules colloïdales en
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suspension ayant par exemple une porosité moléculaire ou un comportement spécifique vis-à-vis des composés à séparer susceptibles de modifier le cheminement de ces composés à séparer travers le gel. En effet, la présence de particules colloïdales, telles que par exemple des particules sphériques comme le TMséphadex pour le dextran ou le TMsépharose pour l'agarose, incorporées après polymérisation dans le gel de polyacrylamide, formeraient des microdomaines dispersés l'intérieur du gel susceptibles d'ajouter des caractéristiques propres au pouvoir séparateur de ces dispersoïdes et ainsi d'altérer et de modifier très significativement les caractéristiques propres au gel de polyacrylamide.
Plus particulièrement, on préfère les polymères hydrophiles dont le poids moléculaire est compris entre 10. 000 et 2.000.000, de préférence compris entre 50. 000 et 500.000, de manière plus préférée voisin de 136. 000 lorsqu'il s'agit du dextran.
Selon un mode préféré de l'invention, les compositions seront caractérisées en ce que le polymère hydrophile est à une concentration comprise entre 0,15 g et 15 g par litre de ladite solution aqueuse, en particulier comprise entre 0,75 g et 7,5 g par litre de ladite solution aqueuse. De manière particulièrement préférée, la concentration de polymère hydrophile sera comprise entre 1,5 g et 3 g par litre de ladite solution aqueuse.
Les gels de polyacrylamide préparés à partir de composition selon l'invention peuvent présenter des tailles de pores variables qu'il est possible de contrôler par la concentration de monomères d'acrylamide et d'agents de couplage présents dans la composition. En général, la taille des pores obtenus après polymérisation, est une fonction inverse de la concentration totale de monomères d'acrylamide et d'agents de couplage présents. D'autre part, il est également possible de contrôler la taille des pores obtenus pour un gel de polyacrylamide en modifiant le rapport de monomères d'acrylamide et d'agents de couplage présents dans la composition avant polymérisation. Par exemple il est possible de réduire la taille des porcs d'un gel de polyacrylamide en augmentant la concentration de monomères d'acrylamide et en maintenant une concentration faible d'agents de couplage. La concentration totale de monomères d'acrylamide et d'agents de couplage ainsi que le rapport en poids de
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monomères d'acrylamide par rapport aux agents de couplage présents dans la composition avant polymérisation seront choisis tout particulièrement en fonction de la taille moléculaire des composés de l'échantillon que l'on désire séparer et analyser. Le choix de ces paramètres est bien connu des techniques d'électrophorèse visant à séparer des protéines ou des acides nucléiques.
L'invention comprendra de préférence les compositions de l'invention, caractérisées en ce que le rapport en poids de monomères d'acrylamide par rapport à l'agent de couplage est compris entre 9/1 et 99/1, de préférence compris entre 29/1 et 69/1, de manière très préférée voisin de 59/1.
Les agents de couplage susceptibles d'être utilisés pour réaliser l'invention sont bien connus de l'homme de l'art, on peut citer notamment le N,N'-méthylène bisacrylamide.
Font bien entendu également partie de l'invention, les compositions de l'invention dans lesquelles la solution aqueuse de monomères d'acrylamide et d'agent de couplage peut être réalisée à partir de monomères d'acrylamide et d'agent de couplage de source très variée ou obtenue à partir de mélange de monomères d'acrylamide et d'agent de couplage pré-préparé comme par exemple la composition TMLong Ranger de la société FMC, TMRapid gel de la société Amcrsham ou encore TMPhage + de la société Ameresco.
L'invention concerne en outre les compositions selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles contiennent un tampon aqueux.
La nature des tampons aqueux ainsi que leurs pH d'utilisation seront choisis suivant la nature des composés de l'échantillon à analyser, suivant le mode de séparation choisi, en fonction de leur charge et/ou de leur poids moléculaire, de la nature des surfactants utilisés si le mode de séparation choisi nécessite par exemple la neutralisation des charges des composés à séparer. La force ionique des tampons pourra être également sélectionnée en fonction de l'intensité du courant que l'on désire faire passer à travers la composition ou du gradient de tampon que l'on veut réaliser.
La nature des tampons pourra être aussi fonction du mode de détection choisi des composés, il est préférable par exemple d'éviter des tampons constitués de composés
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aromatiques pouvant absorber aux longueurs d'ondes des Ultra-Violets si ce mode de détection est sélectionné.
Parmi les tampons habituellement utilisés, on peut citer par exemple mais sans s'y limiter, les tampons borates, notamment le TBE (Tris acide Borique EDTA, Tris pour tri-hydroxyméthyl amino méthane), acétates, notamment le TAE (Tris Acétate EDTA), phosphates, citrates, carbonates, Tris-IICl, IIEPES (N-2-hydroxy- éthylpipérazine-N'-2-éthanesulfonique acide), TES (N,N-bis(2-hydroxy-éthyl)-2aminoéthane sulfonique acide) ou MES (2-(N-morpholine) éthane sulfonique acide), les tampons TBE et TAE étant parmi les plus préférés.
D'autres composés peuvent être incorporés dans les compositions selon l'invention en fonction de la nature de l'échantillon à séparer, de la variante de la méthode d'électrophorèse que l'on veut réaliser ou de l'application envisagée. Ces composés sont connus de l'homme de l'art et ne seront pas développés ici de manière exhaustive. Parmi les composés qui peuvent être incorporés dans les compositions selon l'invention, on peut néanmoins citer, mais sans s'y limiter, notamment les agents de dissociation ou de dénaturation, les agents permettant de modifier la mobilité électrophorétique des acides nucléiques ou des protéines, les agents surfactants, les agents antioxydants permettant la préservation des gels contre les phénomènes d'oxydation durant leur stockage, ou des mélanges de cesdits agents.
Par exemple, la présence d'agent de dissociation ou dénaturation tel que l'urée dans ces compositions permet la séparation de protéines dissociées ou le maintien d'ADN ou d'ARN sous forme simple brin pour leur séquençage et leur analyse, ces séparations pouvant être réalisées avec des systèmes tampons continus ou discontinus.
Ces agents dénaturants ou de dissociation sont nécessaires par exemple pour réduire ou pour prévenir la formation de structure secondaire d'acide nucléique simple brin par appariement de bases complémentaires situées le long du brin.
Parmi les agents permettant de modifier la mobilité électrophorétique des acides nucléiques ou des protéines, on peut citer en particulier certains polyols présentant un nombre d'atomes de carbones peu élevé comme l'éthylène glycol ou le glycérol. Ces composés sont connus pour interagir avec les acides nucléiques ou les
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protéines en modifiant leur mobilité élcctrophorétiquc, en particulier dans les électrophorèses à haute résolution.
Comme exemples de surfactants, on peut citer en particulier les surfactants non
ioniques tels que les polysorbates, #Triton, T'"Twcen ou T"'l3rij, les surfactants anioniques tels que le sodium dodécyl sulfate (SDS), ou cationiques tels que le CTAB (cétyltriméthylammonium bromide).
ioniques tels que les polysorbates, #Triton, T'"Twcen ou T"'l3rij, les surfactants anioniques tels que le sodium dodécyl sulfate (SDS), ou cationiques tels que le CTAB (cétyltriméthylammonium bromide).
Ainsi, l'invention comprend les compositions selon l'invention, caractérisées en ce que la solution aqueuse contient en outre un agent dénaturant ou de dissociation, notamment de l'urée dont la concentration est de préférence comprise entre 1 M et 15 M, de manière plus préférée entre 6 M et 10 M, de ladite solution aqueuse.
L'invention concerne en outre les compositions selon l'invention, caractérisées en ce que la solution aqueuse contient en outre un agent permettant d'altérer la mobilité électrophorétique de protéine ou d'acide nucléique, tel qu'un polyol, notamment le glycérol, de préférence comprise entre 1 % et 20 %, de manière plus préférée entre 3 % et 8 % en volume par volume (v/v) de ladite solution aqueuse.
L'invention a également pour objet une composition selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un initiateur de réaction de polymérisation.
Les initiateurs de réaction de polymérisation pour la préparation de gel de polyacrylamide sont connus de l'homme de l'art. On peut citer par exemple les persulfates comme le persulfate d'ammonium qui est le plus couramment utilisé, ou la lumière (photoinitiation).
A ces initiateurs peuvent être ajoutés bien entendu des co-initiateurs ou des catalyseurs de la réaction de polymérisation bien connus de l'homme de l'art tels que le TEMED (N,N,N'-tétraméthyléthylène-diamine).
L'invention comprend aussi les compositions selon l'invention, caractérisées en ce que les monomères d'acrylamides ont été polymérisés pour former un gel de polyacrylamide contenant ledit polymère hydrophile.
Les gels de polyacrylamide selon l'invention peuvent être réalisés avec une forme et une taille variable, telle que sous la forme d'une plaque, d'un film, d'un cylindre ou d'une colonne. Lorsque le gel se présente sous la forme d'une plaque, son
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épaisseur sera choisie de préférence parmi les épaisseurs conventionnelles utilisées habituellement pour cette forme telles que des épaisseurs comprises entre 0,05 mm et 4 mm, de préférence entre 0,1 mm et 0,4 mm, de manière plus préférée encore voisine de 0,2 mm.
L'invention a aussi pour objet une composition prête \ l'emploi pour la préparation d'une composition selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle contient à la fois et sous forme sèche les monomères d'acrylamide, l'agent de couplage, notamment le bisacrylamide, et le polymère hydrophile.
Sous un autre aspect, l'invention est relative à un procédé pour la production d'un gel de polyacrylamide comprenant les étapes suivantes : a) la préparation d'une composition selon l'invention ; b) la polymérisation des monomères d'acrylamides contenus dans la solution aqueuse obtenue à l'étape a) par addition d'un initiateur de la réaction de polymérisation ou par photo-initiation.
Selon un mode de réalisation particulier, un procédé pour la production d'un gel de polyacrylamide selon l'invention est caractérisé en ce que l'étape de préparation d'une composition selon l'invention comprend une étape de réhydratation d'une composition selon l'invention ou d'une composition comprenant un mélange prépréparé de monomères d'acrylamide et d'agent de couplage.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un gel de polyacrylamide préparé à partir d'une composition selon l'invention ou obtenu par un procédé selon l'invention pour la séparation d'acides nucléiques ou de protéines par électrophorèse, notamment pour le séquençage d'acide nucléique, de préférence simple brin de longueur pouvant être supérieure à 500 bases.
On entendra désigner dans la présente description également par protéines les polypeptides et les peptides, et également par acide nucléique, les oligonucléotides et les polynucléotides.
Les gels de polyacrylamide selon l'invention peuvent être utilisés comme support pour la séparation de molécules dans de nombreuses techniques utilisant le principe de l'électrophorèse en gel ou l'électrophorèse en capillaire. Parmi ces
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techniques, on peut citer par exemple l'électrophorèse standard conventionnelle en zone continue ou en zone discontinue.
En biologie moléculaire l'électrophorèse standard conventionnelle est appliquée habituellement aux réactions de séquençage, de génotypage et de recherche de mutations.
Les réactions de séquençage classique effectuées selon la méthode décrite par Sanger (Sanger et al., 1977), ou les réactions de génotypage ont pour objet, dans leur étape finale, la séparation électrophorétique de tous les produits PCR (PCR pour Réaction en Chaîne à la Polymérase) de taille comprise entre 20 paires de bases et jusqu'à plus de 1000 paires de bases. Cette séparation doit prendre en compte uniquement la taille des fragments d'ADN simple brin, d'où la nécessité d'effectuer ces électrophorèses en milieu dénaturant ( gel dénaturant ). En général, pour qu'un gel de polyacrylamide selon l'invention (dextran) puisse être un gel de polyacrylamide dénaturant, de l'urée est ajoutée à une concentration comprise de préférence entre 4 M et 8 M, et la séparation est effectuée à une température d'environ 50 C.
La détection des mutations peut être effectuée selon plusieurs procédures dont deux présentent un intérêt majeur compte tenu de leur semi-automatisation possible. Il s'agit de la méthode d'analyse du polymorphisme conformationnclle sur simple brin dite SSCP (SSCP pour Single Strand Conformation Polymorphism ) décrite par Orita (Orita et al., 1989a ; Orita et al., 1989b) et de la technique d'analyse de mutation sur hétéroduplex dite hétéroduplex mutation assay . Dans ces techniques, les produits PCR obtenus à partir d'allèles normaux ou mutés peuvent être séparés par électrophorèse sur gel non dénaturant. La séparation s'effectue sur la base des différences conformationnelles entre : - des molécules d'ADN ou d'ARN double brin (par analyse hétéroduplex), - des molécules d'ADN ou d'ARN simple brin (par analyse SSCP).
Est également comprise dans la présente invention, l'utilisation d'un gel de polyacrylamide préparé à partir d'une composition selon l'invention ou obtenu par un procédé selon l'invention pour la détection de mutation sur un acide nucléique, simple brin ou double brin, de longueur pouvant être supérieure à 500 bases, par électrophorèse en gradient de pH.
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Enfin, l'invention a particulièrement pour objet l'utilisation d'un gel de polyacrylamide selon l'invention sur un système automatique, notamment sur un séquenceur automatique ou semi-automatique.
Parmi les séquenceurs automatiques ou semi-automatiques, on entend désigner particulièrement, mais sans s'y limiter : - les séquenceurs avec électrophorèse verticale tels que le système ABI, modèle 377 et 373 de la société Perkin Elmer, le système LI-COR, modèle IR2ou le système
ALPH de la société Pharmacia ; -les séquenceurs avec électrophorèse capillaire tels que les modèles 310 et 3700 de la société Perkin Elmer et le système Molecular Dynamics.
ALPH de la société Pharmacia ; -les séquenceurs avec électrophorèse capillaire tels que les modèles 310 et 3700 de la société Perkin Elmer et le système Molecular Dynamics.
Les exemples et les figures qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.
Figures 1A et 1B : Représentation de manière schématique des effets de bords obtenus sur une matrice de gel de polyacrylamide classique sans incorporation de polymères hydrophiles lors d'un cycle d'électrophorèse ( phénomène de déformation et de distorsion ) (Figure 1A), et représentation de manière schématique d'une matrice de gel de polyacrylamide classique avec incorporation de polymères hydrophiles (selon l'invention) lors d'un cycle d'électrophorèse (Figure 1B).
Figure 2 : Exemple d'un électrophorétogramme obtenu lors d'un essai de séquençage avec le gel selon la présente invention sur un séquenceur ABI modèle 377.640 paires de bases (pb) ont été obtenues en 3 heures, en utilisant un voltage de 3000 V.
Figures 3A et 3B : d'un électrophorétogramme obtenu lors d'un essai de détection de mutation par la technique SSCP.
- Figure 3A : Exemple d'un fragment PCR BRCA1 de 306 pb d'un allèle normal.
- Figure 3B : Exemple d'un fragment PCR BRCA1 d'un allèle muté
Les flèches indiquent le fragment PCR BRCA1 alors que le pic sans flèche correspond au standard de poids moléculaire. La présence d'une mutation sur le fragment PCR B est définie par la différence des profils électrophorétiques obtenue entre les deux fragments PCR A et B.
Les flèches indiquent le fragment PCR BRCA1 alors que le pic sans flèche correspond au standard de poids moléculaire. La présence d'une mutation sur le fragment PCR B est définie par la différence des profils électrophorétiques obtenue entre les deux fragments PCR A et B.
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Bibliographie : M. Orita, IL Iwahana, H. Kanazawa, K. Hayashi et T. Sekiya. (1989a) Proc. Natl.
Sci. USA 86 :2766-2770.
M. Orita, Y. Suzuki, T. Sekiya et K. Hayashi. (1989b) Gcnomics, 5 :874-879.
Sanger, F. Niklcn, S and Coulson, AR (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, pp 5463-5467.
EXEMPLES Exemple 1 : Exemple de composition pouvant être utilisée pour la préparation d'un gel de polyacrylamide destiné au séquençage et au génotypage.
Les monomères d'acrylamide (Ultrapure) et de bisacrylamide (Ultrapure) sont fournis par la Société Amersham, le dextran utilisé ( Industrial Grade ) provient de la Société Sigma.
Préparation d'une solution dite solution pour la préparation d'une Matrice gel à 30 % de composition suivante :
Acrylamide : 29,5 g
Bisacrylamide : 0,5 g
Dextran : 1 g
Eau bidistillée qsp 100 ml Préparation du gel de polyacrylamide
Les gels sont préparés de la manière suivante :
Une solution de composition suivante est préparée :
Matrice gel à 30% : 7,6 ml
Urée :18 g
Tampon TBE (concentré 10 fois ; Tris 0,9 M, acide borique 0,9 M, EDTA 0,02 M) : 5 ml
Eau bidistillée : qsp 50 ml
La polymérisation est effectuée par addition de 250 l d'une solution de persulfate d'ammonium à 10 % et 37,5 l de TEMED
Acrylamide : 29,5 g
Bisacrylamide : 0,5 g
Dextran : 1 g
Eau bidistillée qsp 100 ml Préparation du gel de polyacrylamide
Les gels sont préparés de la manière suivante :
Une solution de composition suivante est préparée :
Matrice gel à 30% : 7,6 ml
Urée :18 g
Tampon TBE (concentré 10 fois ; Tris 0,9 M, acide borique 0,9 M, EDTA 0,02 M) : 5 ml
Eau bidistillée : qsp 50 ml
La polymérisation est effectuée par addition de 250 l d'une solution de persulfate d'ammonium à 10 % et 37,5 l de TEMED
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Ainsi, le gel final obtenu est un gel à 4,56 % d'acrylamide-bisacrylamide, à 0,152 % de dextran (poids/volume) à 6 M d'urée et en tampon TBE 1 X (Tris 0,09 M, acide borique 0,09 M, EDTA 0,002 M).
Ce gel permet d'améliorer les performances des analyses de séquence réalisées sur un séquenceur de type ABI 377 DNA. Ce gel permet en effet d'effectuer régulièrement l'analyse de séquence de longueur supérieure ou égale à 600 bases, voire supérieure à 750 bases, dans une période de temps comprise entre 3 heures et 3 heures 30 minutes (cf. Figure 2), alors que les gels classiques ne contenant pas de tels polymères hydrophiles permettent habituellement d'effectuer manuellement l'analyse de séquence de longueur supérieure ou égale à 700 bases en 7 heures, voire 12 heures pour les séquences supérieures à 800 bases. D'autre part, lorsque le séquençage est effectué de manière automatique en utilisant comme support des gels de polyacrylamide sans incorporation de tels polymères hydrophiles, les séquences analysées sur un cycle ne peuvent que très rarement dépasser une longueur de 550 bases.
Les gels de polyacrylamide incorporant de tels polymères hydrophiles comme le dextran permettent ainsi d'effectuer de manière automatique à la fois la détection et l'analyse de séquences de longueur pouvant être supérieure à 500 bases qui sont nécessaires pour recouvrir entièrement le domaine du diagnostic moléculaire, en particulier pour la caractérisation de mutation.
Exemple 2 : Exemple de composition pour la préparation d'un gel de polyacrylamide contenant un polymère hydophile de type dextran applicable à la caractérisation de mutation sur un acide nucléique de type ADN simple brin.
L'électrophorèse est réalisée en tampon TBE. Les analyses sont effectuées sur des supports gels de petite taille, 12 cm, à température de 30 C et en utilisant une puissance constante de 12 W en fixant la limite du voltage et de l'intensité du courant à 2500 V et 50mA. Cette procédure permet de discriminer chaque mutant en fonction de ses caractéristiques conformationnelles.
Exemple de composition utilisée pour la préparation d'un gel de polyacrylamide :
Les gels sont préparés de la manière suivante :
Les gels sont préparés de la manière suivante :
<Desc/Clms Page number 14>
Une solution de composition suivante est préparée :
Matrice gel à 30 % : 9,6 ml
Glycérol: 2,4 ml
Tampon TBE (concentré 10 fois) : 4,4 ml
Eau bidistillée : qsp 50 ml.
Matrice gel à 30 % : 9,6 ml
Glycérol: 2,4 ml
Tampon TBE (concentré 10 fois) : 4,4 ml
Eau bidistillée : qsp 50 ml.
La polymérisation est effectuée par addition de 250 l d'une solution de persulfate d'ammonium à 10 % et 37,5 l de TEMED. Le tampon d'électrophorèse utilisé est un tampon TBE concentré 0,13 fois.
Les résultats obtenus sont représentés à la figure 3. Le profil électrophorétique d'un produit PCR d'un allèle normal est comparé avec le profil électrophorétique d'un produit PCR d'un allèle cible à analyser. Lorsque le profil électrophorétique du produit PCR de l'allèle cible est différent du profil électrophorétique témoin obtenu pour le produit PCR de l'allèle normal, l'anomalie de l'ADN peut être ainsi identifiée dans l'allèle cible.
Claims (23)
- 2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le polymère hydrophile est le dextran.
- 3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le poids moléculaire moyen dudit polymère hydrophile est compris entre 10. 000 et
- 2. 000.000.
- 4. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que ledit poids moléculaire moyen est compris entre 50. 000 et 500.000.
- 5. Composition selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le polymère hydrophile est à une concentration comprise entre 0,15 g et 15 g par litre de ladite solution aqueuse.
- 6. Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que le polymère hydrophile est à une concentration comprise entre 0,75 g et 7,5 g par litre de ladite solution aqueuse.
- 7. Composition selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le rapport en poids de monomères d'acrylamide par rapport à l'agent de couplage est compris entre 9/1 et 99/1.
- 8. Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que le rapport en poids de monomères d'acrylamide par rapport à l'agent de couplage est compris entre29/1 et 69/1.
- 9. Composition selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle contient un tampon.
- 10. Composition selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la solution aqueuse contient en outre un agent dénaturant.<Desc/Clms Page number 16>
- 11. Composition selon la revendication 10, caractérisée en ce que l'agent dénaturant est l'urée.
- 12. Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce que la concentration d'urée est comprise entre 1 M et 15 M de ladite solution aqueuse.
- 13. Composition selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que la solution aqueuse contient en outre un agent capable de modifier la mobilité électrophorétique du composé séparer.
- 14. Composition selon la revendication 13, caractérisée en ce que ledit agent capable de modifier la mobilité électrophorétique est le glycérol.
- 15. Composition selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un initiateur de réaction de polymérisation.
- 16. Composition selon la revendication 15, caractérisée en ce que les monomères d'acrylamide ont été polymérisés pour former un gel de polyacrylamide contenant ledit polymère hydrophile.
- 17. Composition prête ['emploi pour la préparation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisée en ce qu'elle contient à la fois et sous forme sèche les monomères d'acrylamide, le bisacrylamide, et le polymère hydrophile.
- 18. Procédé pour la production d'un gel de polyacrylamide comprenant les étapes suivantes : a) la préparation d'une composition selon l'une des revendications 1 à 14 ; b) la polymérisation des monomères d'acrylamide contenus dans la solution aqueuse obtenue à l'étape a) par addition d'un initiateur de la réaction de polymérisation ou par photoinitiation.
- 19. Procédé pour la production d'un gel de polyacrylamide selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'étape a) comprend une étape de réhydratation d'une composition selon la revendication 18 ou d'une composition comprenant un mélange pré-préparé de monomères d'acrylamide et d'agent de couplage.
- 20. Utilisation d'un gel de polyacrylamide préparé à partir d'une composition selon l'une des revendications 1 à 17 ou obtenu par un procédé selon l'une des revendications 18 et 19 pour la séparation d'acides nucléiques ou de protéines.<Desc/Clms Page number 17>
- 21. Utilisation d'un gel de polyacrylamide selon la revendication 20 pour la séparation d'acides nucléiques ou de protéines par électrophorèse.
- 22. Utilisation d'un gel de polyacrylamide préparé à partir d'une composition selon l'une des revendications 1 à 17 ou obtenu par un procédé selon l'une des revendications 18 et 19 pour le séquençage ou le génotypage d'acide nucléique, 23. Utilisation d'un gel de polyacrylamide préparé à partir d'une composition selon l'une des revendications 1 à 17 ou obtenu par un procédé selon l'une des revendications 18 et 19 pour la détection de mutation sur un acide nucléique.
- 24. Utilisation d'un gel de polyacrylamide selon l'une des revendications 21 à 23, sur un système automatique ou semi-automatique.
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-
2000
- 2000-06-13 WO PCT/FR2000/001637 patent/WO2000077059A1/fr active Application Filing
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