CN101473228A - 使用染料和糊精的蛋白质检测试剂和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于检测蛋白质和定量确定蛋白质浓度的试剂、方法和试剂盒。所述试剂包括蛋白质－复合染料，诸如考马斯染料和一种或多种糊精，从而消除由去污剂引起的干扰。

Description

使用染料和糊精的蛋白质检测试剂和方法
技术领域
本发明涉及用于检测蛋白质和定量确定蛋白质浓度的试剂、方法和试剂盒。
背景技术
存在许多用于检测蛋白质和确定溶液蛋白质浓度的方法。这些包括本领域中熟知的染料-结合方法，并包括非特异性反应，在该反应中，蛋白质-复合染料与蛋白质结合。染料-蛋白质复合物的形成导致染料光学性质的改变，以致存在着与样品中存在的蛋白质的量成比例的颜色变化。用于体外蛋白质量化的蛋白质-复合染料包括溴甲酚绿(Gindler，美国专利号3,884,637)、HABA和甲基橙，但是由于它们几乎排他地结合于白蛋白并通常不是非常灵敏，所以具有局限的应用。
其他确定蛋白质浓度的方法包括缩二脲(Biuret)方法(Mokrasch和McGilvery，生物学和化学杂志(J.Biol.Chem.)(1956).221，第909页)，其中含有至少两个肽键的肽结构与碱性溶液中的Cu2+反应，从而形成紫色螯合物。
Lowry等(实验室临床医学杂志(J.Lab.Clin.Med.)(1951).39，663)使用了利用碱性铜溶液的蛋白质预处理，类似于缩二脲方法，随后添加福林-西奥卡特(Folin-Ciocalteu)试剂(其含有磷钨酸和磷钼酸的锂盐)。产生的颜色是由Cu-蛋白络合物和由该蛋白质的色氨酸和酪氨酸将磷钨酸和磷钼酸还原为钨和钼蓝的结果。
缩二脲和Lowry方法的严重缺点是它们不能耐受蛋白质样品中经常存在的还原剂。
已经描述了利用考马斯亮蓝G-250作为蛋白质-复合染料形成染料/蛋白质复合物(Bradford美国专利号4,023,933)。考马斯亮蓝染料与广泛多样的蛋白质结合。而且，使用处于适当的酸性介质中的G-250导致这样的蛋白质测定试剂，所述蛋白质测定试剂具有是缩二脲和常规染料结合技术的大约100倍，是Lowry方法的大约3-5倍的灵敏度(Bradford美国专利号4,023,933)。在美国4,023,933中公开的程序中使用考马斯亮蓝G-250，即″Bradford测定″，具有许多超越使用其他染料方法的优点，包括高灵敏度，这允许了当样品中存在还原剂时，使用小样品尺寸和效用。
考马斯亮蓝G-250以两种不同的颜色形式，即红色和蓝色存在。该染料的蓝色形式出现在中性和碱性溶液中，而红色形式出现在明显酸性的溶液(pH0-1)中。在酸性溶液中，考马斯亮蓝G-250处于红色和蓝色形式的平衡状态；这样的溶液在外表上呈褐色。认为当蛋白质与染料结合时，染料被引入不同的微环境中，并且然后受到保护以免遭遇为该染料提供红颜色的酸性介质。酸性介质的强度对于利用考马斯染料的蛋白质测定的灵敏度很重要，因为酸性介质强度的增高导致该测定灵敏度的显著降低。蛋白质-染料复合物倾向于聚集，这影响颜色产物的稳定性。增溶剂，诸如乙醇的存在倾向于在合理的时期内保持蛋白质-染料复合物不聚集；然而，太多的乙醇导致向该染料蓝色形式的显著偏移，即将环境改变为较小极性的。假定该测定的机制是染料碳负离子与蛋白质较小极性环境的结合。这可能也解释了大量去污剂和丙酮对该测定的负作用，因为这些化合物通常是天然非-极性的，且应该倾向于改变该染料的环境。
Bradford测定的主要缺点是显著缺乏在延长时期内的颜色稳定性，这主要归因于蛋白质-染料复合物的沉淀；基本不显示出对不同蛋白质相同的反应性；不服从Beer法则；和最重要地，样品中存在的去污剂对该测定的不利作用(Bradford，M.，分析生物化学(Anal.Biochem.)，72248-254，1976和美国专利号4,023,933)。
染料/蛋白质复合物的形成还用于对凝胶中的蛋白质，诸如电泳中使用的那些进行染色。例如，如此使用了处于高氯酸溶液中的染料考马斯亮蓝G-250(Reisner，A.H.等(1975)分析生物化学(Anal.Biochem.)64，509-516)。
目前，许多商业上的、以考马斯为基础的制剂可以用于在电泳分离后对凝胶中的蛋白质进行染色。对于许多电泳应用，使用去污剂诸如SDS促进蛋白质的分离。因为去污剂不利地影响由于考马斯染料与蛋白质结合引起的颜色改变，所以必须通过若干清洗程序去除去污剂，这导致冗长和复杂的染色程序。
因此，基于染料的蛋白质检测和量化，特别是利用Lowry测定试剂或考马斯染料的主要缺陷是来自去污剂、表面活性剂和其他两亲性分子的干扰。
因此，存在着对这样的检测和定量确定蛋白质的试剂和方法的需要，所述试剂和方法对样品中存在去污剂具有提高的耐受性，并具有提高的蛋白质-染料颜色稳定性。
发明内容
本发明提供用于检测蛋白质的试剂，其包括或由下列各项组成：
(a)蛋白质-复合染料，和
(b)一种或多种糊精。
所述蛋白质-复合染料是这样的染料，其典型地由于形成蛋白质-染料复合物而经历光学性质的变化，这可以是如使用考马斯TM亮蓝染料、溴甲酚绿、HABA、甲基橙、缩二脲试剂、具有福林-西奥卡特试剂的缩二脲试剂(Lowry试剂)出现的吸收光谱中的变化；或如对形成荧光蛋白/染料复合物的染料，例如考马斯橙TM、荧光素、Alexofluor、藻红蛋白、德克萨斯红TM(Texas RedTM)出现的发射光谱中的变化。
优选地，所述蛋白质-复合染料不包括蛋白质，优选地，所述蛋白质-复合染料不包括抗体或肽。
所述蛋白质-复合染料优选地是考马斯染料，诸如考马斯亮蓝染料，例如考马斯亮蓝染料G-250或考马斯亮蓝染料R-250。对于一些蛋白质复合染料，且特别是考马斯染料，需要低pH，从而在蛋白质/染料复合物的形成时获得光学性质的必要变化。
因此，本发明还提供用于检测蛋白质的试剂，其包括：
(a)蛋白质-复合染料，
(b)一种或多种糊精，和，
(c)具有4或更低pKa的酸。
在所述试剂中，优选地，  所述染料以约0.001％-约0.1％(w/v)，优选地约0.005％-0.05％(w/v)范围内的浓度存在。在使用中，可以稀释所述试剂，典型地，试剂与稀释剂，例如包含蛋白质的溶液的比例应该处于约1:1-约1:60的范围内。为了检测含有25μg/ml或更少蛋白质的溶液中的蛋白质，可以使用1：1的试剂与包含蛋白质的溶液的体积比例。对于具有更高蛋白质浓度的溶液，例如，0.1mg/ml-2mg/ml，试剂与包含蛋白质的溶液的体积比1:60应该是合适的。
有用的酸具有处于0-4范围内，优选地3或更低的pKa，以致所述试剂具有-1到1的pH；更优选地，所述酸应该具有处于约1-约3范围内的pKa，以致所述试剂具有0-1的pH。在Bradford专利(US 4,023,933)和Gindler专利(US 4,239,495)中确定了许多有用的酸，合适的酸包括磷酸、亚磷酸(膦酸)、高碘酸、硒酸、马来酸、草酸和二氯乙酸。磷酸和膦酸是优选的。优选的膦酸是次氨基三(亚甲基)三膦酸(Nitrilotris(methylene)triphosphonic acid，NTP)，其为一种可商购的多元酸。
在按照本发明的试剂中，当酸存在时，通常以约4％-约20％，优选地，约4％-约12％，优选地，约7.5％-约9.5％(w/v)的浓度存在。在使用中可以稀释所述试剂，这样酸的最终浓度在约2％-约20％的范围内。
所述酸可以是多元和一元酸的混合物，在所述混合物中，优选地，多元与一元酸的比在约2：1-约3:1的范围内。在所述试剂中，多元/一元酸混合物通常以约1-约15％(v/v)，优选地，约2％-约5％(v/v)范围内的浓度存在。为了使用，可以稀释所述试剂，从而提供处于约0.5-约15％的范围内的多元/一元酸混合物的最终浓度。
按照本发明的试剂包括一种或多种糊精，所述糊精优选地选自线性糊精(D)、环糊精(CD)、环化直链淀粉(CA)和它们的衍生物。优选的试剂包括一种或多种环糊精。合适的线性糊精包括6个或更多个葡萄糖单位，优选地，10个或更多个葡萄糖单位，例如15个葡萄糖单位；环糊精通常具有6个(α-CD)、7个(β-CD)、或8个(γ-CD)葡萄糖单位；环化直链淀粉通常包括8个或更多个葡萄糖单位。合适的衍生物包括heptakis2，6-二-邻-丁基β-环糊精、羧甲基β-环糊精和羧甲基α-环糊精。
可以使用糊精的混合物，例如环状糊精的混合物，诸如两种或更多选自α-CD，β-CD和γ-CD的环状糊精的混合物；两种或更多选自α-CD、β-CD、γ-CD和CA的环状糊精的混合物；线性和环状糊精的混合物，诸如线性糊精与α-CD、β-CD和γ-CD中的一种或多种的混合物；或线性糊精与α-CD、β-CD、γ-CD和CA中的一种或多种的混合物。除非上下文另外指出，术语“糊精”用于本文时，包括糊精和糊精衍生物。
环糊精、糊精和某些环化直链淀粉的一些衍生物可以起到表面活性剂的作用，并且可能更不适合用于本发明的试剂、方法和试剂盒中。一些处于一定浓度下的糊精，由于该糊精的表面-活化性质，将干扰某些染料。本领域技术人员能够容易地确定所述糊精以及它们对不同染料各自的干扰浓度。
对于给定的蛋白质，可以对所使用的糊精或糊精混合物的选择进行最优化，并且当使用一种或多种糊精时，可以调节比例，从而获得对检测和/或量化给定的蛋白质或蛋白质样品最有效的条件。
在本发明的试剂中，糊精通常以0.01-200mg/ml范围内，优选地，0.5-50mg/ml范围内的浓度存在。当使用糊精混合物时，这些浓度涉及总糊精浓度。可以调节所述试剂的稀释，以使最终糊精浓度对于给定蛋白质和蛋白质浓度是最优的。当蛋白质样品中存在去污剂时，可以针对给定的去污剂和该去污剂的具体浓度最优化糊精的选择和浓度。本领域技术人员，例如通过在不同浓度的糊精或糊精混合物的存在下，在适当的时候，测量蛋白质-染料复合物的吸收或发射光谱，能够容易地确定合适的最终糊精浓度。对于考马斯亮蓝G-250，能够在吸收峰，即595nm处测量吸收。
按照本发明的试剂还可以包括增溶剂，诸如醇，从而维持染料-蛋白质复合物的溶解性。所述增溶剂可以是任何减少或延迟染料-蛋白质复合物沉淀的试剂。
所述试剂中可以包括一种或多种醇，合适的醇包括乙醇、甲醇和丙醇。其他合适的醇是具有良好水溶解性的那些，其几乎不或不作用为去污剂。当所述试剂中存在醇时，其浓度通常是0.1％-约10％(v/v)，优选地，约0.1％-约5％(v/v)，更优选地，约1％-约5％(v/v)。
本发明的试剂可以包括去污剂。
能够以多部分系统，例如作为一种或多种水性组分提供所试剂，所述水性组分结合形成本发明的试剂。如果以两部分提供，则一个部分可以包括所述染料，任选地，酸和/或任选地，醇，而另一个部分可以包括所述糊精。每个单独的组分具有长期的稳定性(当冷冻保存时，约1年)，且当相混合形成所述试剂时，该试剂自身在被冷冻保存在4℃时，保持稳定超过6个月。通过使一种或多种糊精与可商购的蛋白质染色剂，例如Bradford测定试剂或其他考马斯蛋白质染色剂相结合，可以生成按照本发明的试剂。通过掺入一种或多种按照本发明所述的糊精，能够改造可商购的蛋白质染色剂、方法和试剂盒；特别是可商购的Bradford测定试剂、方法和试剂盒。所述可商购的试剂盒的实例包括下列各项：
Pierce：
23236考马斯加(Coomassie Plus)-更好的Bradford测定试剂盒(TheBetter Bradford Assay Kit)(包括标准物)
23238考马斯加-更好的Bradford测定试剂
23200考马斯(Bradford)蛋白质测定试剂盒
23296考马斯(Bradford)干蛋白质测定平板2 x 96孔
23596考马斯(Bradford)干蛋白质测定平板5 x 96孔
BioRad：
500-0201EDU快速起始Bradford蛋白质测定试剂盒(Quick StartBradford Protein Assay Kit)1
500-0202EDU快速起始Bradford蛋白质测定试剂盒2
500-0203EDU快速起始Bradford蛋白质测定试剂盒3
500-0204EDU快速起始Bradford蛋白质测定试剂盒4
500-0006EDU Bio-Rad蛋白质测定染料试剂浓缩(Bio-Rad ProteinAssay Dye Reagent Concentrate)
西格玛-奥德里奇(Sigma Aldrich)：
B6916 Bradford试剂(西格玛(Sigma))
27813考马斯
Figure A200780021434D00121
蛋白质测定试剂BioChemika(Fluka)
常规地，利用一些蛋白质-复合染料检测和量化蛋白质常受到来自去污剂的非常显著的干扰；受到特别不利影响的是蛋白质复合染料考马斯蓝G-250、考马斯红G-250、考马斯橙、缩二脲试剂和具有福林-西奥卡特试剂的缩二脲试剂。本发明克服了这些难题。在不希望受到理论限制的条件下，认为所述去污剂与所述糊精形成复合物，且所述去污剂对所述糊精的亲和力高于所述去污剂对所述染料的亲和力。通过使用合适量的糊精或糊精混合物，所述去污剂能够被糊精-去污剂复合物捕获，由此，限制该去污剂抑制蛋白质-染料反应的程度。
与目前可用于蛋白质检测的试剂相比，当包含蛋白质的样品中存在去污剂时，能够成功地使用本发明的试剂。这具有极重大的意义，因为本发明的试剂容许在富含去污剂或表面活性剂的环境中检测蛋白质，所述去污剂或表面活性剂诸如可以是增溶膜蛋白所必需的，或利用富含去污剂的溶液，例如可商购的提取溶液，诸如
Figure A200780021434D00131
和CelLyticTM直接从微生物中提取蛋白质所必需的。
本发明还提供检测蛋白质的方法，其包括使包含蛋白质的样品与包含下列各项的溶液相接触：
(a)蛋白质-复合染料，和，
(b)一种或多种糊精，和检测染料/蛋白质复合物的形成。
对于需要强酸性条件的染料，本发明提供了检测蛋白质的方法，其包括使包含蛋白质的样品与包含下列各项的溶液相接触：
(a)蛋白质-复合染料，
(b)一种或多种糊精，和，
(c)具有4或更低pKa的酸；
和检测染料/蛋白质复合物的形成。
检测染料/蛋白质复合物的形成可以包括量化所形成的染料/蛋白质复合物的量，由此确定所述样品中的蛋白质浓度。
在另一个实施方案中，本发明提供量化蛋白质的方法，其包括使包含蛋白质的样品与包含下列各项的溶液相接触：
(a)蛋白质-复合染料，
(b)一种或多种糊精，
和量化染料/蛋白质复合物的形成。
对于需要强酸性环境的染料，本发明提供量化蛋白质的方法，其包括使包含蛋白质的样品与包含下列各项的溶液相接触：
(a)蛋白质-复合染料，
(b)一种或多种糊精，和，
(c)具有4或更低pKa的酸；
和量化染料/蛋白质复合物的形成。
包含蛋白质的样品可以是溶液，或者可以在支持体，诸如凝胶、溶胶、层析平板、滤纸、硝化纤维膜或树脂上提供包含蛋白质的样品。
因此，在另一个实施方案中，本发明还提供检测蛋白质的方法，其包括：
(a)提供包括蛋白质的支持体，
(b)使所述蛋白质与包括下列各项的溶液相接触：
(i)蛋白质-复合染料，和，
(ii)一种或多种糊精
和检测染料/蛋白质复合物的形成。
对于需要酸性条件的蛋白质复合物染料，本发明提供了检测蛋白质的方法，其包括：
(a)提供包括蛋白质的支持体，
(b)使所述蛋白质与包括下列各项的溶液相接触：
(i)蛋白质-复合染料，
(ii)一种或多种糊精，和，
(iii)具有4或更低pKa的酸；
和检测染料/蛋白质复合物的形成。
以上描述了本发明方法中所使用的合适的蛋白质复合染料、糊精和如果需要，用于掺入所述溶液中的酸。按照本发明的试剂能够提供所述蛋白质-复合染料、一种或多种糊精、和如果存在，具有4或更低pKa的酸，本发明的试剂可以进行稀释形成溶液。所述溶液可以包括增溶剂，诸如如本文中所述的醇。
所述支持体可以是凝胶、溶胶、层析平板、滤纸、硝化纤维膜或树脂。所述支持体可以包括去污剂。利用本发明的方法，接触可以是在存在去污剂的条件下进行的。这些方法特别适合于检测聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶或多聚体合成凝胶中的蛋白质，例如在已经利用电场，例如通过电泳分离蛋白质样品时。
本文中所述的用于检测和定量确定凝胶中的蛋白质，诸如在利用电场，例如通过电泳分离后产生的那些蛋白质的试剂和方法简化了常规程序，这样不再需要去除去污剂诸如SDS和过量染色(背景染色)的清洗程序。
典型地，在室温下执行该方法。
在本发明的方法中，检测染料蛋白质复合物的形成可以包括检测所述染料/蛋白质复合物的吸收或发射光谱中的变化。在有些情形中，可以检测颜色变化；例如当使用考马斯亮蓝染料，诸如G-250时。颜色变化可以利用常规设备，诸如，例如能够测量在570nm-620nm范围内波长处吸收的比色计。
对于由于形成蛋白质/染料复合物而经历了吸收光谱中变化的染料，检测可以通过，例如利用分光光度法测量吸收而实现。可以使用常规设备进行分光光度法分析，诸如使用具有400-700nm波长范围的UV/VIS分光光度计。
对于由于形成蛋白质/染料复合物而经历了发射光谱中变化的染料，检测可以通过，例如利用合适地具有190nm-800nm波长范围的分光荧光计(发光分光计)，测量发射而实现。
检测所述蛋白质/染料复合物可以包括量化存在的蛋白质/染料复合物的量，从而确定蛋白质的量或浓度。量化可以是通过包括测量所述染料/蛋白质复合物吸收或发射光谱中变化的方法实现。量化可以包括，例如测量颜色变化。如所述，吸收可以通过分光光度法测量，且可以测量吸收随着时间的变化。通常在约400-约700nm的波长范围内测量吸收。
对于考马斯亮蓝G-250，在约595nm的波长处测量吸吸收，当该染料与蛋白质复合时，其吸收最大。当利用考马斯亮蓝G-250时，能够通过监测由于形成染料/蛋白质复合物而引起的595nm处吸收的增加，而检测蛋白质。
为了确定蛋白质浓度，可以将测量到的吸收或发射与标准数值、标准数值组、或标准曲线相比较。如实施例中所示，该结果是高度可重现的和精确的。
由于利用本发明的试剂和方法所展示的高灵敏性，能够选择低如约0.1μg/1ml样品的蛋白质浓度。而且，所述精确灵敏的测定所需的时间少于约2分钟/样品，与之相反地，传统Lowry或缩二脲类型的测定通常需要30-40分钟。因此，本发明的方法高度适合于大量样品的自动化和分析。
本发明还提供用于检测和/或量化蛋白质的试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种糊精。用于检测和/或量化蛋白质的试剂盒可以包括一种或多种糊精和蛋白质-复合染料。另外，试剂盒可以包括一种或多种如本文中所述的酸和/或醇。按照本发明用于检测和/或量化蛋白质的试剂盒可以包括本发明的试剂，所述试剂可以作为多部分系统提供，其中组分相混合形成本发明的试剂。
本发明还提供一种或多种糊精，在存在去污剂的条件下，增强蛋白质-结合染料/蛋白质复合物的形成的应用。
此外，本发明提供一种或多种糊精，在存在去污剂的条件下，降低去污剂在蛋白质-结合染料/蛋白质复合物形成中的干扰的应用。
本发明还提供一种或多种糊精，在存在去污剂的条件下，改变染料，诸如蛋白质-复合染料的光学性质的应用。
附图说明
图1：无去污剂的蛋白质样品的标准曲线。两种方法对无去污剂的样品提供合理的线性响应。两种方法的曲线斜率和相关系数相似，这说明该试剂中包括的糊精不干扰蛋白质-染料的结合。
图2：包括去污剂(0.25％CTAB)的蛋白质样品的标准曲线。只有包括糊精的试剂提供具有与无去污剂样品的斜率或相关系数相似的斜率和相关系数的线性响应。
图3：检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质
在每个凝胶上跑下列样品：
泳道1分子量标准，Mark 12TM
泳道2 β-乳球蛋白0.08mg/ml
泳道3 β-乳球蛋白0.16mg/ml
泳道4 β-乳球蛋白0.31mg/ml
泳道5 β-乳球蛋白0.63mg/ml
泳道6 β-乳球蛋白1.25mg/ml
泳道7 β-乳球蛋白2.5mg/ml
泳道8空白
泳道9 β-乳球蛋白5mg/ml
泳道10空白
泳道11 β-乳球蛋白10mg/ml
泳道12分子量标准
如实施例3中所述，用溶液B染色凝胶B，用溶液A染色凝胶A。在所述染色溶液中培养1小时45分钟后，给所述凝胶照相。
实施例
实施例1：
制备Bradford试剂
向100 mg考马斯亮蓝(G-250)中加入47g乙醇、85g磷酸和850g水。混合该溶液20分钟，从而确保所有的组分溶解，形成包括0.01％(w/v)考马斯亮蓝G-250、4.7％乙醇(w/v)和8.5％(w/v)磷酸的试剂。如该具体实施例中所指示地，向该溶液中加入不同的糊精。
Bradford测定(标准方法)
将5微升含有0.1mg/ml-1.5mg/ml蛋白质和/或0.00％-0.5％去污剂的样品溶液吸移到96-孔微量滴定平板的孔中。向其中加入300微升Bradford试剂。在595nm处测量吸收。
减少去污剂干扰
本实验中使用了5种不同的去污剂，即十二烷基硫酸钠(SDS)(阴离子)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(阳离子)、吐温TM-20(非-离子)、TRITONTM-X 100(非-离子)和Brij-35(非-离子)。本实验中使用了4种不同的糊精，即糊精-15(D15)、α-环糊精(α-CD)、β-环糊精(β-CD)和γ-环糊精(γ-CD)，还使用了这些糊精的等质量混合物(MIX)。另外，还检验了不同的环化直链淀粉浓度。
A)Bradford测定，含有总共100mg/ml糊精或不同糊精的饱和浓度。
以水样品作为空白，在595nm处测量的吸收表。
 
                       无糊精   D15     α-CD    β-CD   γ-CD    MIX    
SDS(0.5％w/v)       0.326   0.007 0.013 0.089 0.038 0.047
CTAB(0.25％w/v)     0.785   0.024 0.003 0.067 0.015 0.020
吐温-20(0.25％w/v)   1.027   0.453 0.134 0.077 0.344 0.041
TRITON-X 100(0.10％w/v)          0.677 0.101 0.034 0.017 0.022 0.003
Brij-35(0.50％w/v) 0.231   0.035 0.015 0.019 0.143 0.018
B)Bradford测定，含有不同糊精的总共10mg/ml的糊精。
以水样品作为空白，在595nm处测量的吸收表。
 
                         无糊精   D15     α-CD    β-CD   γ-CD    MIX    
SDS(0.5％w/v)         0.326   0.051 0.003 0.025 0.005 0.000
CTAB(0.25％w/v)       0.785   0.184 0.026 0.029 0.164 0.008
吐温-20(0.25％w/v)     1.027   0.855 0.167 0.171 0.625 0.376
TRITON-X 100(0.10％w/v)            0.677 0.076 0.003 0.006 0.019 0.095
Brij-35(0.50％w/v)   0.231   0.046 -0.02 0.001 0.007 0.026
C)Bradford测定，含有不同糊精的总共1mg/ml的糊精。
以水样品作为空白，在595nm处测量的吸收表。
 
                       无糊精   D15     α-CD    β-CD   γ-CD    MIX    
SDS(0.5％w/v)       0.326   0.195 0.010 0.056 0.079 0.020
CTAB(0.25％w/v)     0.785   0.674 0.163 0.176 0.603 0.407
吐温-20(0.25％w/v)   1.027   0.999 0.842 0.803 0.952 0.947
 
TRITON-X 100(0.10％w/v)             0.677 0.248 0.288 0.040 0.032 0.003
Brij-35(0.50％w/v)   0.231   0.098 0.003 0.033 0.040 0.002
D)Bradford测定，含有不同浓度的环化直链淀粉(CA)。
以水样品作为空白，在595nm处测量的吸收表。
 
无糊精 CA10mg/ml CA1mg/ml  
SDS(0.1％w/v)           -0.063   -0.072   -0.023  
CTAB(0.1％w/v)          0.412     -0.081   0.003   
吐温-20(0.1％w/v)        0.462     0.074    0.352   
TRITON-X100(0.1％w/v)   0.677     -0.024   0.410   
Brij-35(0.1％w/v)      -0.024   -0.025   -0.011  
595nm处的吸收提供对考马斯G-250染料蓝色形式的量的指示。在给定的具体去污剂浓度下，高吸收值表示高背景，由于该去污剂的存在，以致检测到的蓝色不代表存在的蛋白质-染料复合物的量，并且由此不代表蛋白质的浓度。可以看到，对于每种检验的去污剂，溶液中一种或多种糊精的存在导致较低的吸收值，这说明存在较低的背景干扰，并且糊精的存在增高了蛋白质检测的灵敏性和精确性。对于给定的去污剂，能够通过在存在不同浓度的糊精及其组合的条件下，测量染料/蛋白质复合物吸收峰处的吸收而确定对糊精和糊精浓度的最佳选择。
实施例2：存在去污剂条件下标准曲线的线性
在0.1mg/ml-1.5mg/ml的浓度范围内，创建了两种不同蛋白质的稀释系列，所述两种不同蛋白质为牛血清白蛋白(BSA)(Pierce，23209)和牛免疫球蛋白(IgG)(西格玛(Sigma)，I5506)。选择CTAB作为去污剂，并将其加入到蛋白质样品中达到浓度0.25％(w/v)。用含有0.25mg/ml糊精-15(D15)、0.25mg/ml α-环糊精(α-CD)、0.25mg/ml β-环糊精(β-CD)和0.25mg/mlγ-环糊精(γ-CD)的Bradford试剂进行Bradford测定，将这些与利用不包含糊精的Bradford试剂进行的Bradford测定进行比较。
实施例3：检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质
制备凝胶染色溶液
向80mg考马斯亮蓝(G-250)中加入50g乙醇、80g磷酸和850g水。混合该溶液20分钟，从而确保所有的组分溶解-这是溶液A。随后，通过将250mg糊精-15,250mg α-环糊精(α-CD)、250mg β-环糊精(β-CD)和250mgγ-环糊精(γ-CD)加入到100ml溶液A中，制成溶液B。
制备样品和凝胶
在0.08mg/ml-10mg/ml的浓度范围内，制备β-乳球蛋白(BLG)(西格玛(Sigma)，L-0130)的稀释系列。用10微升Nupage LDS样品缓冲液(Invitrogen，NP0007)稀释30微升样品。制造所述凝胶一式两份，将15微升每种样品上样到每块凝胶(Nupage 10％ Bis-Tris，Invitrogen，NP0302)上。将10微升Mark12TM分子量标准(Invitrogen，LC5677)也上样到该凝胶上。在恒定电压(200V)下，标准MES缓冲液中，跑凝胶35分钟。随后，将一块凝胶浸没在25ml溶液B(由25ml如上所述的溶液A组成的染色溶液，其含有糊精的混合物如下：2.5mg/ml糊精-15(D 15)、2.5mg/ml α-环糊精(α-CD)、2.5mg/ml β-环糊精(β-CD)和2.5mg/ml γ-环糊精(γ-CD))中。将另一块凝胶浸没在由25ml溶液A组成的染色溶液中。在染色溶液中培养1小时45分钟后，对凝胶照相(图3)。

Claims (62)

1.用于检测蛋白质的试剂，所述试剂包括：
(a)蛋白质-复合染料，和，
(b)一种或多种糊精.
2.按照权利要求1的试剂，所述试剂包括具有4或更低pKa的酸。
3.按照权利要求1或2的试剂，其中所述染料是考马斯染料。
4.按照权利要求3的试剂，其中所述染料是考马斯亮蓝染料。
5.按照权利要求4的试剂，其中所述考马斯亮蓝染料是G-250。
6.按照以上权利要求中任一项的试剂，其中所述染料以约0.001％-约0.1％(w/v)范围内的浓度存在。
7.按照权利要求2-6中任一项的试剂，其中所述酸具有约1-约3范围内的pKa。
8.按照权利要求2-7中任一项的试剂，其中所述酸是选自下列各项中的酸：磷酸、亚磷酸(膦酸)、高碘酸、硒酸、马来酸、草酸、二氯乙酸、和次氨基三(亚甲基)三膦酸。
9.按照权利要求2-8中任一项的试剂，其中所述酸是一元酸。
10.按照权利要求2-9中任一项的试剂，其中所述酸以约4％-约20％(w/v)的浓度存在。
11.按照权利要求2-6中任一项的试剂，其中所述酸是多元酸和一元酸的混合物。
12.按照权利要求11的试剂，其中所述多元酸与一元酸的比例处于约2:1-约3:1的范围内。
13.按照权利要求11或权利要求12的试剂，其中所述酸以约1-约15％(v/v)范围内的浓度存在。
14.按照以上权利要求中任一项的试剂，其中所述一种或多种糊精选自线性糊精、环糊精、环化直链淀粉和它们的衍生物。
15.按照以上权利要求中任一项的试剂，其中所述糊精浓度处于约0.01-约200mg/ml的范围内。
16.按照以上权利要求中任一项的试剂，包括减少所述染料/蛋白质复合物沉淀的增溶剂。
17.按照以上权利要求中任一项的试剂，包括一种或多种醇。
18.按照权利要求17的试剂，其中所述一种或多种醇选自乙醇、甲醇和丙醇。
19.按照权利要求17或18的试剂，其中所述醇浓度是约0.1％-约10％v/v。
20.按照以上权利要求中任一项的试剂，所述试剂包括去污剂。
21.检测蛋白质的方法，所述方法包括使含有蛋白质的样品与包括下列各项的溶液相接触：
(a)蛋白质-复合染料，和
(b)一种或多种糊精，
和检测染料/蛋白质复合物的形成。
22.权利要求21的方法，其中所述溶液包括具有4或更低pKa的酸。
23.按照权利要求21或权利要求22的方法，其中所述溶液包括按照权利要求1-20中任一项所述的试剂。
24.按照权利要求21-23中任一项的方法，其中所述含有蛋白质的样品是溶液。
25.按照权利要求21-23中任一项的方法，其中在支持体上提供所述含有蛋白质的样品。
26.按照权利要求21-25中任一项的方法，其中检测包括检测所述染料/蛋白质复合物吸收或发射光谱中的变化。
27.按照权利要求21-26中任一项的方法，其中检测包括检测颜色变化。
28.按照权利要求21-27中任一项的方法，其中检测包括测量吸收。
29.按照权利要求28的方法，其中通过分光光度法测量吸收。
30.按照权利要求29的方法，其中在约400-约700nm范围内的波长处测量吸收。
31.按照权利要求29的方法，其中所述蛋白质-复合染料是考马斯亮蓝G-250，并在约595nm波长处测量吸收。
32.按照权利要求21-31中任一项的方法，其中所述检测包括量化。
33.按照权利要求32的方法，其中通过随着时间测量吸收进行量化。
34.量化蛋白质的方法，所述方法包括使含有蛋白质的样品与包括下列各项的溶液相接触：
(a)蛋白质-复合染料，和，
(b)一种或多种糊精，
和量化染料/蛋白质复合物的形成。
35.按照权利要求34的方法，其中所述溶液包括具有4或更低pKa的酸。
36.按照权利要求34或权利要求35的方法，其中所述溶液包括按照权利要求1-20中任一项所述的试剂。
37.按照权利要求34-36任一项的方法，其中量化包括检测所述染料/蛋白质复合物吸收或发射光谱中的变化。
38.按照权利要求34-37中任一项的方法，其中量化包括检测颜色变化。
39.按照权利要求34-38中任一项的方法，其中量化包括测量吸收。
40.按照权利要求39的方法，其中通过分光光度法测量吸收。
41.按照权利要求40的方法，其中在约400-约700nm范围内的波长处测量吸收。
42.按照权利要求39或40的方法，其中所述蛋白质-复合染料是考马斯亮蓝G-250，并在约595nm波长处测量吸收。
43.按照权利要求26-33或37-42中任一项的方法，其中将测量到的吸收或发射与标准数值、标准数值组、或标准曲线进行比较。
44.检测蛋白质的方法，所述方法包括：
(a)提供包括蛋白质的支持体，
(b)使所述蛋白质与包括下列各项的溶液相接触：
(i)蛋白质-复合染料，和，
(ii)一种或多种糊精
和检测染料/蛋白质复合物的形成。
45.按照权利要求44的方法，其中所述溶液包括具有4或更低pKa的酸。
46.按照权利要求44或权利要求45的方法，其中所述溶液包括按照权利要求1-20中任一项所述的试剂。
47.按照权利要求44-46中任一项的方法，其中所述支持体是凝胶、溶胶、层析平板、滤纸、硝化纤维膜或树脂。
48.按照权利要求47的方法，其中所述支持体是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶或多聚体合成凝胶
49.按照权利要求48的方法，其中已经利用电场，例如通过电泳对所述蛋白质进行分离。
50.按照权利要求44-49中任一项的方法，其中所述支持体包括去污剂。
51.按照权利要求44-50中任一项的方法，其中在存在去污剂的条件下进行接触。
52.按照权利要求44-51中任一项的方法，其中检测包括检测所述染料/蛋白质复合物吸收或发射光谱中的变化。
53.按照权利要求44-52中任一项的方法，其中检测包括检测颜色变化。
54.按照权利要求44-53中任一项的方法，其中检测包括测量吸收。
55.按照权利要求54的方法，其中通过分光光度法测量吸收。
56.按照权利要求55的方法，其中在约400-约700nm范围内的波长处测量吸收。
57.按照权利要求54的方法，其中所述蛋白质-复合染料是考马斯亮蓝G-250，并在约595nm波长处测量吸收。
58.用于检测和/或量化蛋白质的试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种糊精。
59.用于检测和/或量化蛋白质的试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种糊精和蛋白质-复合染料。
60.用于检测和/或量化蛋白质的试剂盒，所述试剂盒包括按照权利要求1-20中任一项所述的试剂。
61.一种或多种糊精在存在去污剂的条件下，增强蛋白质-结合染料/蛋白质复合物的形成的应用。
62.一种或多种糊精在存在去污剂的条件下，降低去污剂在蛋白质-结合染料/蛋白质复合物形成中的干扰的应用。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104004382A (zh) * 2014-05-20 2014-08-27 北京五康新兴科技有限公司 一种考马斯亮蓝染色液和染色方法
CN105122032A (zh) * 2013-03-12 2015-12-02 生物辐射实验室股份有限公司 胶体考马斯染剂
CN106940376A (zh) * 2011-08-19 2017-07-11 艾昆西恩斯公司 蛋白质检测
CN109520804A (zh) * 2018-11-20 2019-03-26 王雨璇 一种快速考马斯亮蓝染色液
CN111474032A (zh) * 2020-05-22 2020-07-31 南开大学 一种高灵敏度快速sds-page蛋白胶染色液
CN112697562A (zh) * 2021-01-21 2021-04-23 上海雅酶生物医药科技有限公司 免脱色聚丙烯酰胺凝胶蛋白快速染色液及制备和使用方法

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106940376A (zh) * 2011-08-19 2017-07-11 艾昆西恩斯公司 蛋白质检测
CN106940376B (zh) * 2011-08-19 2020-05-05 艾昆西恩斯公司 蛋白质检测
CN105122032A (zh) * 2013-03-12 2015-12-02 生物辐射实验室股份有限公司 胶体考马斯染剂
CN104004382A (zh) * 2014-05-20 2014-08-27 北京五康新兴科技有限公司 一种考马斯亮蓝染色液和染色方法
CN104004382B (zh) * 2014-05-20 2016-01-20 北京五康新兴科技有限公司 一种考马斯亮蓝染色液和染色方法
CN109520804A (zh) * 2018-11-20 2019-03-26 王雨璇 一种快速考马斯亮蓝染色液
CN109520804B (zh) * 2018-11-20 2019-09-24 王雨璇 一种快速考马斯亮蓝染色液
CN111474032A (zh) * 2020-05-22 2020-07-31 南开大学 一种高灵敏度快速sds-page蛋白胶染色液
CN112697562A (zh) * 2021-01-21 2021-04-23 上海雅酶生物医药科技有限公司 免脱色聚丙烯酰胺凝胶蛋白快速染色液及制备和使用方法

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