JP5698904B2 - 色素及びデキストリンを含むタンパク質検出試薬及び方法 - Google Patents
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Description
(a)タンパク質複合体形成色素及び、
(b)1種又は複数のデキストリンと、
を含むか、又はそれらからなるタンパク質検出試薬を提供する。
(a)タンパク質複合体形成色素、
(b)1種又は複数のデキストリン及び、
(c)4以下のpKaを有する酸と
を含む、タンパク質検出試薬を提供する。
23236 クーマシープラス−ベターブラッドフォードアッセイキット(Coomassie Plus−The Better Bradford Assay Kit)(標準のものを包含する)
23238 クーマシープラス−ベターブラッドフォードアッセイ試薬
23200 クーマシー(Bradford)タンパク質アッセイキット(Protein Assay Kit)
23296 クーマシー(Bradford)乾燥タンパク質アッセイプレート(Dry Protein Assay Plates) 2×96ウェル
23596 クーマシー(Bradford)乾燥タンパク質アッセイプレート 5×96ウェル
500−0201EDU クイックスタートブラッドフォードタンパク質アッセイキット(Quick Start Bradford Protein Assay Kit)1
500−0202EDU クイックスタートブラッドフォードタンパク質アッセイキット2
500−0203EDU クイックスタートブラッドフォードタンパク質アッセイキット3
500−0204EDU クイックスタートブラッドフォードタンパク質アッセイキット4
500−0006EDU バイオラッドタンパク質アッセイ色素試薬濃縮物(Bio−Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate)
B6916 ブラッドフォード試薬(Sigma)
27813 クーマシー(登録商標)タンパク質アッセイ試薬バイオケミカ(BioChemika)(Fluka)
(a)タンパク質複合体形成色素、及び
(b)1種又は複数のデキストリン
を含む溶液と、タンパク質含有試料とを接触させ、
色素/タンパク質複合体の形成を検出することを含む、タンパク質検出方法を提供する。
(a)タンパク質複合体形成色素、
(b)1種又は複数のデキストリン、及び
(c)4以下のpKaを有する酸
を含む溶液と、タンパク質含有試料とを接触させ、
色素/タンパク質複合体の形成を検出することを含む、タンパク質検出方法を提供する。
(a)タンパク質複合体形成色素、
(b)1種又は複数のデキストリン
を含む溶液と、タンパク質含有試料とを接触させ、
色素/タンパク質複合体の形成を定量することを含む、タンパク質定量方法を提供する。
(a)タンパク質複合体形成色素、
(b)1種又は複数のデキストリン、及び
(c)4以下のpKaを有する酸
を含む溶液と、タンパク質含有試料とを接触させ、
色素/タンパク質複合体の形成を定量することを含む、タンパク質定量方法を提供する。
(a)タンパク質を含む支持体を提供し、
(b)(i)タンパク質複合体形成色素、及び
(ii)1種又は複数のデキストリンを含む溶液と、前記タンパク質とを接触させ、
色素/タンパク質複合体の形成を検出することを含む、タンパク質検出方法を提供する。
(a)タンパク質を含む支持体を提供し、
(b)(i)タンパク質複合体形成色素、
(ii)1種又は複数のデキストリン、及び
(iii)4以下のpKaを有する酸を含む溶液と、前記タンパク質とを接触させ、
色素/タンパク質複合体の形成を検出することを含む、タンパク質検出方法を提供する。
ブラッドフォード試薬の調製
100mgのクーマシーブリリアントブルー(G−250)に、47gのエタノール、85gのリン酸及び850gの水を添加した。この溶液を20分間混合して、確実に全成分を溶解させた結果、0.01%(w/v)のクーマシーブリリアントブルーG−250、4.7%のエタノール(w/v)及び8.5%(w/v)のリン酸を含む試薬が得られた。特定の実施例において示したように、この溶液に異なるデキストリンを添加した。
0.1mg/ml〜1.5mg/mlのタンパク質及び/又は0.00%〜0.5%の界面活性剤を含有する試料溶液5mlを、96ウェルマイクロタイタープレートのウェル内にピペットで移した。これに、300mlのブラッドフォード試薬を添加した。吸光度を595nmで測定した。
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)(アニオン性)、セチルトリメチル臭化アンモニウム(CTAB)(カチオン性)、TWEEN(商標)−20(非イオン性)、TRITON(商標)−X100(非イオン性)及びBrij−35(非イオン性)の5種類の異なる界面活性剤を実験に使用した。デキストリン−15(D15)、α−シクロデキストリン(α−CD)、β−シクロデキストリン(β−CD)及びγ−シクロデキストリン(γ−CD)の4種類の異なるデキストリンを実験に使用し、これらデキストリンの等質量(equimass)混合物(MIX)も使用した。更に、異なるシクロアミロース濃度も試験した。
595nmで測定した吸光度(水試料をブランクとする)の表
595nmで測定した吸光度(水試料をブランクとする)の表
595nmで測定した吸光度(水試料をブランクとする)の表
595nmで測定した吸光度(水試料をブランクとする)の表
界面活性剤の存在下における標準曲線の線形性
ウシ血清アルブミン(BSA)(Pierce、23209)及びウシ免疫グロブリン(IgG)(Sigma、15506)の2種類の異なるタンパク質の希釈系列を、0.1mg/ml〜1.5mg/mlの濃度範囲で作製した。CTABを界面活性剤として選択し、0.25%(w/v)の濃度になるまでタンパク質試料に添加した。0.25mg/mlのデキストリン−15(D15)、0.25mg/mlのα−シクロデキストリン(α−CD)、0.25mg/mlのβ−シクロデキストリン(β−CD)及び0.25mg/mlのγ−シクロデキストリン(γ−CD)を含有するブラッドフォード試薬を用いてブラッドフォードアッセイを行った。これらを、デキストリンを含まないブラッドフォード試薬で行ったブラッドフォードアッセイと比較した。
ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質の検出
ゲル染色溶液の調製
80mgのクーマシーブリリアントブルー(G−250)に、50gのエタノール、80gのリン酸及び850gの水を添加した。この溶液を20分間混合して、確実に全成分を溶解させた。これは溶液Aであった。これに続いて、250mgのデキストリン−15、250mgのα−シクロデキストリン(α−CD)、250mgのβ−シクロデキストリン(β−CD)及び250mgのγ−シクロデキストリン(γ−CD)を100mlの溶液Aに添加することによって溶液Bを作製した。
β−ラクトグロブリン(BLG)(Sigma、L−0130)の希釈系列を、0.08mg/ml〜10mg/mlの濃度範囲で調製した。30mlの試料を、10mlのNupage LDS試料緩衝液(Invitrogen、NP0007)で希釈した。同じゲル2つを調製し、15mlの各試料を各ゲル(Nupage 10% Bis−Tris、Invitrogen、NP0302)上に充填した。10mlのMark 12(商標)分子量標準(Invitrogen、LC5677)もゲルに充填した。ゲルを、標準的なMES緩衝液中で35分間一定の電圧(200V)で流動させた。これに続いて、一方のゲルを25mlの溶液B(2.5mg/mlのデキストリン−15(D15)、2.5mg/mlのα−シクロデキストリン(α−CD)、2.5mg/mlのβ−シクロデキストリン(β−CD)及び2.5mg/mlのγ−シクロデキストリン(γ−CD)のデキストリン混合物を含有する25mlの上記溶液Aからなる染色溶液)に浸した。他方のゲルを、25mlの溶液Aからなる染色溶液に浸した。染色溶液中で1時間45分インキュベーションした後、ゲルを撮影した(図3)。
Claims (47)
- (a)タンパク質複合体形成色素、及び
(b)1種又は複数のデキストリン
を含む一つの溶液と、タンパク質とを接触させ、
色素/タンパク質複合体の形成を検出及び又は定量することを含む、タンパク質検出及び/又は定量方法であって、該方法はタンパク質を界面活性剤又は界面活性物質と接触させた時にタンパク質の検出及び/又は定量に適している、上記方法。 - タンパク質が界面活性剤の存在下にある、請求項1に記載の方法。
- タンパク質が溶液中に存在するか、又はタンパク質が支持体上に備えられる、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記支持体が、ポリアクリルアミドゲル及びアガロースゲルからなる群から選択されるゲル、ゾル、クロマトグラフィープレート、濾過紙、ニトロセルロース膜又は樹脂である、請求項3に記載の方法。
- 前記支持体が、ポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲルであり、前記タンパク質が電界を使用して、例えば電気泳動によって分離されている、請求項4に記載の方法。
- 前記支持体が界面活性剤を含み、及び/又は接触が界面活性剤の存在下で行われる、請求項3から5までのいずれか一項に記載の方法。
- 検出及び又は定量が、前記色素/タンパク質複合体の吸収又は発光スペクトルの変化を検出することを含む、請求項1から6までのいずれか一項に記載の方法。
- 検出及び又は定量が約400nm〜約700nmの範囲の波長で分光光度法により吸光度を測定することにより色の変化を検出することを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質複合体形成色素がクーマシーブリリアントブルーG−250であり、及び吸光度が約595nmの波長で測定される、請求項8に記載の方法。
- 定量が、吸光度を経時的に測定することによって行われる、請求項1から9までのいずれか一項に記載の方法。
- 測定された吸光度又は発光が、標準値、標準値の組又は標準曲線と比較される、請求項7から10までのいずれか一項に記載の方法。
- 接触のステップの前に、タンパク質を含む支持体を提供するステップをさらに含む、請求項1から11までのいずれか一項に記載の方法。
- 界面活性剤の存在下でタンパク質結合色素/タンパク質複合体の形成を増大させるための、1種又は複数のデキストリンの使用。
- 界面活性剤の存在下でタンパク質結合色素/タンパク質複合体を形成する際に界面活性剤の妨害を低減するための、1種又は複数のデキストリンの使用。
- デキストリンがタンパク質複合体形成色素及び1種又は複数のデキストリンを含む試薬として提供される、請求項13又は14に記載の使用。
- 前記試薬が試薬濃縮物である、請求項15に記載の使用。
- 前記試薬が4以下のpKaを有する酸をさらに含む、請求項15又は16に記載の使用。
- 前記試薬が可溶化剤をさらに含む、請求項15から17までのいずれか一項に記載の使用。
- タンパク質結合色素がタンパク質を含まない、請求項15から18までのいずれか一項に記載の使用。
- 前記色素がクーマシーブリリアントブルーG−250である、請求項15から19までのいずれか一項に記載の使用。
- デキストリン濃度が約0.01mg/ml〜約200mg/mlの範囲内である、請求項15から20までのいずれか一項に記載の使用。
- デキストリン濃度が約0.5mg/ml〜約50mg/mlの範囲内である、請求項15から21までのいずれか一項に記載の使用。
- 前記色素は約0.001%から約0.1%(w/v)の濃度範囲で存在する、請求項15から22までのいずれか一項に記載の使用。
- 前記試薬は約1:1〜約1:60の範囲の試薬対希釈剤の比で希釈される、請求項15から23までのいずれか一項に記載の使用。
- 4以下のpKaを有する酸を含む、請求項15から24までのいずれか一項に記載の使用。
- 前記酸が、リン酸、ホスホン酸、過ヨウ素酸、セレン酸、マレイン酸、シュウ酸、ジクロロ酢酸及びニトリロトリス(メチレン)トリホスホン酸からなる群から選択される酸であり、該酸が約4%から約20%(w/v)の濃度で存在する、請求項25に記載の使用。
- 1種又は複数のデキストリンがシクロデキストリン又はシクロアミロースから選択される、請求項15から26までのいずれか一項に記載の使用。
- 前記試薬がエタノール、メタノール及びプロパノールからなる群から選択される1種又は複数のアルコールを含み、アルコール濃度が約0.1%から約10%v/vである、請求項15から27までのいずれか一項に記載の使用。
- 前記試薬が界面活性剤を含む、請求項15から28までのいずれか一項に記載の使用。
- 前記試薬は複数要素で構成された系として提供される、請求項15から29までのいずれか一項に記載の使用。
- (a)タンパク質複合体形成色素、
(b)1種又は複数のデキストリン、及び
(c)1種又は複数のアルコール
を含む試薬であって、タンパク質が界面活性剤又は界面活性物質の存在下にある時、タンパク質を検出及び/又は定量する方法に使用するのに適し、試薬は約1:1〜約1:60の範囲の試薬対希釈剤の比で希釈される、上記試薬。 - アルコール濃度が約0.1%から約10%v/vである、請求項31に記載の試薬。
- (a)タンパク質複合体形成色素及び、
(b)1種又は複数のデキストリン
を含む試薬であって、タンパク質が界面活性剤又は界面活性物質の存在下にある時タンパク質を検出及び/又は定量する方法に使用するのに適し、試薬は約1:1〜約1:60の範囲の試薬対希釈剤の比で希釈され、タンパク質複合体形成色素は使用のために提供された試薬において約0.001%から約0.1%(w/v)の濃度範囲で存在する、上記試薬。 - タンパク質複合体形成色素が約0.005%から約0.05%(w/v)の濃度範囲で存在する、請求項33に記載の試薬。
- (a)タンパク質複合体形成色素、
(b)1種又は複数のデキストリン、及び
(c)4以下のpKaを有する酸
を含む試薬であって、タンパク質が界面活性剤又は界面活性物質の存在下にある時タンパク質を検出及び/又は定量する方法に使用するのに適し、試薬は約1:1〜約1:60の範囲の試薬対希釈剤の比で希釈され、酸は使用のために提供された試薬において約4%から約20%(w/v)の濃度で存在する、上記試薬。 - 前記酸が約1〜約3の範囲のpKaを有する、請求項35に記載の試薬。
- 前記酸が、リン酸、ホスホン酸、過ヨウ素酸、セレン酸、マレイン酸、シュウ酸、ジクロロ酢酸及びニトリロトリス(メチレン)トリホスホン酸からなる群から選択される酸である、請求項35又は36に記載の試薬。
- 前記酸が、約4%〜約20%(w/v)の濃度で存在する、請求項35又は36に記載の試薬。
- さらに可溶化剤を含む、請求項31から38までのいずれか一項に記載の試薬。
- 前記色素がクーマシー色素である、請求項31から39までのいずれか一項に記載の試薬。
- 前記デキストリンの濃度が、約0.01mg/ml〜約200mg/mlの範囲内である、請求項31から40までのいずれか一項に記載の試薬。
- 前記デキストリンの濃度が、約0.5mg/ml〜約50mg/mlの範囲内である、請求項31から41までのいずれか一項に記載の試薬。
- エタノール、メタノール及びプロパノールからなる群から選択される1種又は複数のアルコールを含む、請求項31から42までのいずれか一項に記載の試薬であって、アルコールの濃度が、約0.1%〜約10%v/vである、上記試薬。
- 前記1種又は複数のアルコールが、エタノール、メタノール及びプロパノールからなる群から選択される、請求項43に記載の試薬。
- 二要素構成で提供される、請求項31から44までのいずれか一項に記載の試薬。
- 二要素構成の一つの要素が色素、及び任意選択でアルコール及び/又は酸を含み、他方が1種又は複数のデキストリンを含む、請求項45に記載の試薬。
- 二要素構成が水性成分として提供される、請求項45又は46に記載の試薬。
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