CN105004589B

CN105004589B - 一种快速去除干扰的蛋白含量测定方法

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Publication number: CN105004589B
Application number: CN201510434175.8A
Authority: CN
Inventors: 田志刚; 郑晓东; 程永凤; 魏海明; 刘玉玲; 孙汭
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2015-07-21
Filing date: 2015-07-21
Publication date: 2018-05-29
Anticipated expiration: 2035-07-21
Also published as: CN105004589A

Abstract

本发明公开一种用蔗糖促进蛋白沉淀的方法，以及基于此的快速去除表面活性剂干扰的微量蛋白测定的方法。该方法特征是加入有机溶剂和蔗糖将溶液中的蛋白沉淀，用离心方法有效将蛋白和其它组分如表面活性剂分离，获得去除其它组分如表面活性剂的蛋白沉淀。该蛋白沉淀不仅可以用考马斯亮蓝G250法测定其蛋白含量，也可以用于SDS‑PAGE或HPLC检测。此方法特别适用于含有表面活性剂的蛋白质药物进行蛋白定量。本发明具有蛋白回收率高，检测灵敏度高，操作步骤简单、检测快速等特点。

Description

一种快速去除干扰的蛋白含量测定方法

技术领域

本发明涉及一种用蔗糖促进蛋白沉淀的方法，以及基于此的快速去除干扰物质如表面活性剂干扰的蛋白含量测定方法。

背景技术

由于蛋白质药物具有作用靶点专一、疗效明显等优点，因而蛋白质药物的研究越来越被广泛关注，近年来已有多种重组蛋白药物被国家食品药品监督管理批准应用于临床治疗各种疾病。但蛋白质本身具有容易降解和聚集而失活的特性，因而如何长期保持其活性一直是生物制药领域的难点。为了使蛋白质药物不失活，通常需要在蛋白质药物配方中加入某些非蛋白的辅料(如蔗糖、甘露醇、乳糖等)或非离子型的表面活性剂，如聚山梨醇酯(Tween)、山梨醇酯(Span)等。

蛋白质药物生产过程中需要对其质量进行严格监控，其中对其有效活性成分即蛋白含量进行检定是最重要检测指标之一。蛋白含量的测定方法有多种，包括凯氏定氮法、双缩脲法、紫外分光光度法、Lowry法、BCA法、考马斯亮蓝G250法(Bradford法)等。凯氏定氮法是测出氮的含量，再作蛋白质含量的估算，容易被氮源干扰，而且灵敏度较低。双缩脲法、紫外分光光度法测定的灵敏度较低，适用于高浓度蛋白的测定。Lowry法、BCA法、Bradford法测定的灵敏度高，可以应用于低浓度蛋白含量的测定(微克级的蛋白含量)。因而这3种方法为常用的微量蛋白测定方法。然而蛋白质药物中添加的各种辅料和表面活性剂会干扰这些蛋白含量测定方法。例如：蔗糖会干扰Lowry法和BCA法测定结果，表面活性剂会干扰Lowry法和Bradford法的测定。

为了能去除干扰精确测定蛋白质药物的中的蛋白含量，通常采用2种方法，一是稀释法，即将测定样品进行稀释，以降低干扰物质的浓度，使其不再干扰蛋白测定方法。但是对测定样品进行稀释，不仅降低了干扰物质的浓度，同时也降低了蛋白浓度，常常会使蛋白浓度低于各蛋白测定方法的检测下限，无法被检测出。其二是蛋白沉淀法。即采用某种方法将蛋白沉淀，使其与干扰因素分离，从而不影响蛋白检测。蛋白沉淀法既可以去除干扰因素又可以浓缩蛋白。常用的微量蛋白沉淀法为丙酮沉淀法和三氯乙酸沉淀法(TCA法)等。但丙酮沉淀蛋白的效率较低，通常需要较长时间(6小时以上)，为了增加沉淀的效果，缩短沉淀时间，常与三氯乙酸联合沉淀蛋白。然而三氯乙酸又能与考马斯亮蓝G250发生显色反应，影响检测结果。

发明内容

本发明中，研究人员发现蔗糖能增加丙酮的沉淀蛋白的效率，缩短沉淀时间，并且蔗糖不与考马斯亮蓝G250发生显色反应，不影响检测结果，因而特别适合对蛋白质药物进行蛋白定量。为了能够快速有效的分离表面活性剂和蛋白，又不干扰后续的蛋白定量检测，本发明涉及一种微量蛋白测定的方法，该方法特征是加入丙酮和蔗糖将溶液中蛋白沉淀，用离心方法分离蛋白和表面活性剂，然后用Bradford法测定蛋白含量。此方法特别适用于对含有表面活性剂的蛋白质药物进行蛋白定量。

具体地，本发明涉及以下各项：

1.一种用蔗糖促进蛋白沉淀的方法，所述方法包括：

1)将蔗糖加入要沉淀的蛋白样品的溶液中；

2)加入用于沉淀蛋白的有机溶剂并静置；

3)将沉淀的蛋白分离。

2.根据1所述的方法，所述有机溶剂包括但不限于丙酮、甲醇、乙醇或其组合。

3.一种快速去除蛋白溶液中干扰物质的蛋白含量测定方法，所述方法包括：

1)将蔗糖加入待测蛋白样品溶液中；

2)加入用于沉淀蛋白的有机溶剂并静置；

3)将沉淀的蛋白分离；

4)将分离的蛋白沉淀溶解，并进行蛋白浓度测定。

4.根据3所述的方法，所述有机溶剂包括但不限于丙酮、甲醇、乙醇或其组合。

5.根据3所述的方法，所述干扰物质是表面活性剂。

6.根据5任一项所述的方法，所述表面活性剂包括但不限于Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80、Span20、Span 40、Span 60、Span 80、SDS、Triton X100、苯扎溴铵或其组合。

7.根据3所述的方法，所述蛋白浓度测定的方法包括但不限于凯氏定氮法、双缩脲法、紫外分光光度法、Lowry法、BCA法、考马斯亮蓝G250法。

8.根据1或3所述的方法，所述方法均在预冷条件下或在冰浴中进行。

本发明的涉及一种用蔗糖促进蛋白沉淀的方法，其包括以下步骤：样品处理，沉淀蛋白。

(1)样品处理：

对于固体型样品，如果样品中含蔗糖且浓度不小于50mg/ml，用合适的溶剂溶解。如果不含蔗糖或浓度达不到50mg/ml，可以用含蔗糖50mg/ml溶液溶解。

对于液体型样品，不含蔗糖或含蔗糖量达不到50mg/ml，直接加入适量的蔗糖制成含蔗糖不低于50mg/ml蛋白溶液。

本领域的普通技术人员知晓蔗糖浓度并不特指50mg/ml，可以根据实际情况选择其它的蔗糖浓度，以有效地沉淀蛋白。

(2)沉淀蛋白

a)预冷样品和有机溶剂如丙酮：取适量样品EP管中，在冰浴中放置1h。

b)沉淀蛋白：加入预冷的有机溶剂如丙酮(样品与有机溶剂如丙酮比例为3:7)，摇匀，在冰浴中放置1h以上。

c)分离蛋白和其它成分如表面活性剂：4℃，12000g，离心15min。离心结束后，立即轻轻的倒去上清。

d)洗涤蛋白沉淀：加入1ml预冷的有机溶剂如丙酮摇匀，冰上静置15min，离心12000g，10min，立即轻轻的倒去上清，将沉淀物放置冰浴中。重复操作1次。

e)干燥蛋白沉淀去除残留的有机溶剂如丙酮。

本领域的普通技术人员可以预见蔗糖可以促进其它多种有机溶剂如甲醇、乙醇等对蛋白的沉淀。本领域的普通技术人员也可以预见丙酮-蔗糖沉淀也可以去除多种表面活性剂的干扰，所述表面活性剂包括且不限于聚山梨醇酯(如Tween 20、Tween 40、Tween 60等)、山梨醇酯(如Span20、Span 40、Span 60、Span 80等)、SDS、Triton X100、苯扎溴铵等。

进一步地，在用蔗糖促进蛋白沉淀的基础上，本发明还涉及一种去除表面活性剂干扰的快速微量蛋白测定方法，所述方法进一步包括以下步骤：

(3)测定蛋白含量

a)制备供试品：加入适量的水或PBS溶液于含蛋白沉淀的EP管中，震荡混匀。

b)制备标准蛋白溶液，制成浓度为0、2.5、5、10、15、20μg/ml蛋白溶液。

c)测定吸光值

各标准品和样品加入考马斯亮蓝G250染液，混匀，吸取适量，在595nm处测定吸光值。

d)计算蛋白含量

根据各标准品的吸光值和蛋白浓度制定标准曲线，根据回归方程计算蛋白含量。

本发明的方法具有以下有益效果：

(1)本发明能够去除表面活性剂的干扰，快速测定溶液中微量蛋白的含量。

(2)本发明丙酮-蔗糖蛋白沉淀的回收率较丙酮沉淀法回收率高，沉淀时间短，

(3)本发明蛋白含量检测基于Bradford法，检测灵敏度高，能够应用于微量的蛋白制剂。

附图说明

图1，丙酮沉淀前后BSA溶液的吸收光谱变化

图2，蛋白标准曲线

图3，不同浓度蔗糖对丙酮沉淀蛋白回收率的影响。

图4，不同浓度蔗糖对考马斯亮蓝G250吸光度的影响。

图5，SDS-PAGE电泳检测丙酮-蔗糖沉淀的蛋白

图6，HPLC-SEC检测丙酮-蔗糖沉淀的蛋白

图7，蔗糖促进乙醇对蛋白的沉淀作用

具体实施方式

以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术。无特殊说明所有的化学试剂均为分析纯，无特殊说明所有试剂均为商用常规试剂，可以购买或按说明书配制。例如，考马斯亮蓝染液可以按以下配方配制：考马斯亮蓝G250 100mg溶于50ml 95％乙醇，加入100ml 85％磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml,0.45μm滤膜过滤；也可以从BioRad或Thermo等公司等购买。

实施例1丙酮沉淀去除聚山梨醇酯80(Tween 80)：

1)样品制备：取合适的Tween 80溶液加入牛血清白蛋白(BSA)溶液中，使Tween 80溶液的终浓度为0、0.5、2mg/ml，BSA终浓度为20μg/ml。各取0.6ml于2ml EP管中，预冷。

2)沉淀蛋白：向各样品溶液中加入1.4ml预冷的丙酮，摇匀，冰浴放置1h，12000g离心15min去除上清；再将各管中加入0.6ml预冷丙酮，充分混匀，冰浴放置10min，12000g离心10min去除上清，再重复1次。自然吹干，去除丙酮残留液。最后向蛋白沉淀中加入0.6ml水。

3)光谱扫描：取含0、0.5、2mg/ml Tween 80的BSA溶液0.6ml，以及沉淀后的各样品中，加入0.15ml考马斯亮蓝G250染液(购于BioRad公司)，混匀放置10min，在350-700nm处进行连续光谱扫描。

4)结果见图1，丙酮沉淀前，550nm-650nm处的吸光值随着Tween 80浓度的增加而上升，对蛋白检测产生严重干扰。而丙酮沉淀后，各样品的光谱扫描结果几乎无差别。这提示丙酮沉淀可以去除Tween 80的干扰。

实施例2蛋白标准曲线

1)标准品制备：将BSA标准蛋白，用水配制成0、2.5、5、10、15、20μg/ml 6个浓度，平行2管，每管0.6ml。

2)显色：各加入0.15ml考马斯亮蓝G250染液(购于BioRad公司)混匀，放置10min，混匀，吸取0.2ml至酶标板中，复孔3个，在595nm处测定OD值。

3)直线回归分析：以BSA的浓度为纵坐标、OD值为横坐标作直线回归分析，得到标准曲线的回归方程。

4)结果见图2，在0-20μg/ml范围内，蛋白浓度与OD值呈直线关系，相关系数R²>0.99。

实施例3不同浓度的蔗糖对丙酮沉淀蛋白的影响

1)样品制备：配制含0、10、50、100mg/ml蔗糖的BSA溶液，BSA终浓度为20μg/ml，各取0.6ml于2ml的EP管中。

2)沉淀蛋白：加入1.4ml的预冷丙酮摇匀，冰浴分别放置15min、30min、60min，12000g离心15min去除上清；各管中再加入0.6ml预冷丙酮，充分混匀，冰浴放置10min，12000g离心10min去除上清，重复一次。自然吹干，去除丙酮残留液。

3)蛋白标准曲线：同实施例2。

4)测定蛋白含量：沉淀后样品加入0.6ml水容液，混匀，各加入0.15ml考马斯亮蓝G250染液(购于BioRad公司)。测定OD值，根据标准曲线计算蛋白含量。

5)结果见图3，丙酮单独沉淀蛋白的效率较低，沉淀1h后回收率只能达到78.8％，当加入10mg/ml的蔗糖后就能提高到88.9％。如果蔗糖浓度超过50mg/ml，那么沉淀1h后，蛋白回收率超过95.5％。

实施例4不同浓度蔗糖对考马斯亮蓝G250吸光度的影响

1)样品制备：配制含0、10、50、100mg/ml蔗糖的BSA溶液，BSA终浓度为20μg/ml，

2)光谱扫描：加入0.15ml考马斯亮蓝G250染液(购于BioRad公司)，混匀放置10min，在350-700nm处进行连续光谱扫描。

3)结果见图4，含不同浓度蔗糖的BSA溶液，其吸收光谱几乎无差异，这说明蔗糖对考马斯亮蓝G250吸光度的无影响。

实施例5应用丙酮-蔗糖沉淀测定蛋白含量的精密度和准确度分析。

1)样品制备：配制含2mg/ml Tween80，50mg/ml蔗糖的BSA溶液，BSA浓度分别2.5、5、10、20、40μg/ml，各取0.6ml于2ml的EP管中，

2)沉淀蛋白：同实施例3。

3)蛋白标准曲线：同实施例2。

4)测定蛋白含量：同实施例3，40μg/ml的BSA组加入1.2ml水。

5)结果见表1：使用丙酮-蔗糖沉淀测定蛋白含量，其精密度<5％，准确度在-4.3％-4.3％之间。

表1丙酮-蔗糖沉淀测定蛋白含量的精密度和准确度

实施例6SDS-PAGE电泳检测丙酮-蔗糖沉淀的蛋白

1)样品制备：配制含2mg/ml Tween 80的BSA溶液，BSA浓度为100μg/ml

2)蛋白沉淀：同实施例3。

3)SDS-PAGE电泳法检测沉淀蛋白

a)分离胶制备(12％)：4X Tris-HCL/SDS(pH8.8)2.5ml、40％Acr+Bis(Acr-甲叉-Bis-丙烯酰胺)3.0ml、10％APS(过硫酸铵)100μl、TEMED(四甲基乙二胺)4μl、水4.4ml混匀，小心倒入胶膜中，再在胶面上覆上一层水，水平静置至胶体凝固。

b)浓缩胶的制备(5％)：4X Tris-HCL/SDS(pH6.8)1.0ml、40％Acr+Bis(Acr-甲叉-Bis-丙烯酰胺)0.5ml、10％APS(过硫酸铵)40μl、TEMED(四甲基乙二胺)4μl、水2.46ml。将分离胶中的水去除，混匀浓缩胶，小心倒入胶膜中，插入适当型号的梳子，水平静置至胶体凝固。

c)供试品溶液的制备：将丙酮-蔗糖沉淀BSA吹干的后，加入0.6ml水复溶混匀后，取出20ul，加入4μl 5X上样缓冲液，置水浴中煮沸3-5分钟，冷却。同取20ul 100ug/ml的BSA溶液同样方法处理作为对照。

d)电泳：凝胶板制好后，倒入电极缓冲液，各孔加入12ul供试品及标准品溶液，电泳条件95伏20分钟、140伏50分钟，电泳结束，取下胶板。

e)染色：将胶块放入考马斯亮蓝染液中，染色2小时。

f)脱色：将胶板置于脱色液中，脱色至背景清晰(中途换几次脱色液)。

4)结果见图5，与未经过处理BSA溶液对照品比较，含Tween 80的BSA溶液通过丙酮-蔗糖沉淀方法沉淀后复溶的样品，SDA-PAGE电泳结果无明显变化。

实施例7高效液相法检测丙酮-蔗糖沉淀的蛋白

1)样品制备：配制含50mg/ml，2mg/ml Tween 80的BSA溶液，BSA浓度为100μg/ml

2)蛋白沉淀：同实施例3。

3)高效液相检测沉淀蛋白

a)供试品制备：将丙酮-蔗糖沉淀的BSA吹干的后，加入0.25ml水溶液充分混匀。0.4mg/ml的BSA溶液作为对照

b)测定：使用分子排阻色谱柱(TSKgel G3000SW)，柱温20-25℃，紫外检测波长280nm，流动相PBS以0.5ml/min流速平衡至基线平衡。取待测样品20μl上柱，记录色谱图。

4)结果见图6，与未经过处理80BSA溶液对照品比较，含Tween 80的BSA溶液通过丙酮-蔗糖沉淀方法沉淀后样品，保留时间及峰形无明显变化。

实施例8蔗糖对乙醇沉淀蛋白的影响

1)样品制备：配制不含或含50mg/ml蔗糖的BSA溶液，BSA的终浓度为20μg/ml，各取0.6ml于2ml的EP管中。

2)沉淀蛋白：同实施例3，沉淀用的有机溶剂分别加入丙酮或乙醇。

3)蛋白标准曲线：同实施例2。

4)测定蛋白含量：同实施例3。

5)结果见图7，蔗糖不仅可以促进丙酮，也可以促进乙醇对蛋白的沉淀作用。

实施例9在不同表面活性剂中丙酮-蔗糖沉淀蛋白的回收率。

1)样品制备：分别配制含0.5％Span80、1％Triton X100、0.2％SDS、2％苯扎溴铵的蔗糖-BSA溶液，蔗糖的终浓度为50mg/ml，BSA的终浓度为20μg/ml。各取0.6ml于2ml的EP管中。

2)沉淀蛋白：同实施例3。

3)蛋白标准曲线：同实施例2。

4)测定蛋白含量：同实施例3。

5)结果见表2：在不同表面活性剂中，使用丙酮-蔗糖沉淀法都可以得到90％以上的蛋白回收率。

表2在不同表面活性剂中丙酮-蔗糖沉淀蛋白的回收率

Claims

1.一种用蔗糖促进蛋白沉淀的方法，所述方法包括：

1)将蔗糖加入要沉淀的蛋白样品的溶液中；

2)加入用于沉淀蛋白的有机溶剂并静置；

3)将沉淀的蛋白分离，

其中所述有机溶剂包括丙酮、甲醇、乙醇或其组合，并且所述方法在预冷条件下或在冰浴中进行。

2.一种快速去除蛋白溶液中干扰物质的蛋白含量测定方法，所述方法包括：

1)将蔗糖加入待测蛋白样品溶液中；

2)加入用于沉淀蛋白的有机溶剂并静置；

3)将沉淀的蛋白分离；

4)将分离的蛋白沉淀溶解，并进行蛋白浓度测定，

3.根据权利要求2所述的方法，所述干扰物质是表面活性剂。

4.根据权利要求3所述的方法，所述表面活性剂包括Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80、Span20、Span 40、Span 60、Span 80、SDS、Triton X100、苯扎溴铵或其组合。

5.根据权利要求2所述的方法，所述蛋白浓度测定的方法包括凯氏定氮法、双缩脲法、紫外分光光度法、Lowry法、BCA法、考马斯亮蓝G250法。