CN104710520A - 一种提取海洋微藻油体的蛋白的方法 - Google Patents

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薛松
申培丽
曹旭鹏
吴霜
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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Abstract

本发明涉及一种提取海洋微藻油体(lipid droplet,也被称为油珠、脂滴）及提取纯化油体相关蛋白方法。油体是多数海洋微藻贮存甘油酸三酯（triacylglyeerols,TAG）的主要亚细胞结构。其提取过程包括利用高压（French press1500-20000psi）、研磨/Beadsshocker、超声(3w-100w)或渗透压调节破碎微藻细胞；利用蔗糖梯度(1.0M、0.6M、0.4M、0.2M、0M)离心和高速或超高速（1,0000g-15,0000g）离心获得低密度油体层；收集后洗涤非特异性粘附油体膜上蛋白；利用氯仿：甲醇或丙酮沉淀油体上蛋白。

Description

一种提取海洋微藻油体的蛋白的方法
技术领域
本发明属于海洋生物技术领域，具体为通过分离纯化微藻油体及油体相关蛋白，对微藻油脂代谢，油体膜生物合成，膜运输和信号转导机理进行研究。 
背景技术
随着化石能源的日趋枯竭和生态环境的日渐恶化,可再生且清洁的生物能源的研究开发已成为近年来的热点话题，海洋微藻具有种类多、固定CO2光合作用效率高、生物产量高、生长周期短及自身油脂含量高、不占耕地、易于人工控制等优点，被认为是制备生物柴油最佳的生物质能源原料之一。微藻积累大量油脂以甘油酸三酯（triacylglyeerols,TAG）的结构贮存在胞浆油体中，油体外部包被一层磷脂单分子层，以及镶嵌其中或附着其上的油体相关蛋白质。这些蛋白或是油体结构蛋白，或是其它发挥生物学功能蛋白，在油体形成、稳定以及油脂代谢利用过程中起着关键作用。 
目前在多种生物体中中已经发现并解析了油体相关蛋白，在动物和真菌中分离得到油体相关蛋白属于PAT家族，如Perilipin、ADRP、TIP47等；植物油因其特殊营养贮存形式也被选作过生物柴油原料，种子植物油体研究日渐成熟，油体成分主要是甘油酸三酯TAG，磷脂PL和油体相关蛋白。内部液态基质为TAG，外围包裹一层磷脂单分子层，磷脂疏水基团与TAG相互作用，亲水基团暴露在油体外层，油体表面亲水。组成膜的蛋白质主要是油体蛋白Oleosins，有保守区域：Pro-knot motif，中间72个连续非极性残基包括三个pro残基和一个ser残基，PX5SPX3P。后来也发现短链残基Oleolike，二者在维持油体稳定性方面发挥重大作用，随后的Caleosin、Steroleosin也被发现。Oleosin保守区域在JGI/NCBI中查找，发现没有能编码oleosin不等鞭毛藻-棕藻/金藻/硅藻/卵藻以及等鞭毛藻；Oleolike在绿藻中有，MLDP（major LD protein）则在微藻中普遍存在。 
提取微藻油体，进而纯化油体相关蛋白，通过解析油体蛋白质生理生化特性，研究磷脂膜蛋白结构功能，阐明微藻在胁迫条件下积累油体过程，油脂代谢和油体变化机制，深入了解微藻产油机理，改良微藻品种，提高油脂含量和油脂组分，为更好利用第三代生物能源海洋微藻提供理论基础。 
发明内容
本发明目的是提供一种提取纯化微藻油体及其相关蛋白的方法。 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 
一种提取微藻油体的蛋白的方法： 
（1）利用高压、超声、研磨或高渗破碎藻细胞后，油体因其密度低与其它亚细胞器经超速离心后分离，油体浮在所有水相梯度顶层，收集油层，洗涤，具体为分离缓冲液中加入0.6-1.0M蔗糖，保护胞内细胞器，利用高弗式压碎器15000-20000psi破碎微藻细胞，选择蔗糖梯度、离心速率或离心力，油体直径在0.5-5um之间，收集顶层油体，洗涤； 
（2）将油脂和蛋白分离，用氯仿：甲醇（V/V1:2）或2-4倍体积冷丙酮12-20h,-20℃处理油体，离心，收集油相和沉淀；0.1%SDS复溶沉淀蛋白，冻干，即可得到目的蛋白。 
利用研磨（Beads shocker/Beadbeater）破碎微藻细胞，显微镜观察藻细胞破碎情况，测破碎后上清蛋白浓度，计算破碎率。 
利用超声破碎微藻细胞，功率在3-100w,超声5s,间隔1-5s,超声1-5min。 
利用高渗破碎微藻细胞，将耐盐微藻从高盐营养液中转移到无盐缓冲液中，温和破碎且不破碎其它亚细胞器，然后再利用密度梯度离心分离纯化油体。 
分离缓冲液可以用0.15M tricine-KOH缓冲液或25-50mMHEPES-KOH缓冲液或10-20mM MOPS或PBS或Tris-HCl缓冲液，pH在7.0-8.0之间；缓冲液中加入KCl、MgCl2、EDTA、EGTA、DTT,高浓度蔗糖以及PMSF或Cocktail蛋白酶抑制剂。 
蔗糖梯度为1.0M、0.6M、0.4M、0.2M、0M或30%、20%、10%、5%、0；离心力在10,000g-150,000g；离心时间30min-2h 
步骤（1）整个过程在4℃条件下进行。 
以海洋微藻等鞭金藻(Isochrysis zhanjianggensis，属于金藻门、普林藻纲、等鞭藻目、等鞭藻科、等鞭藻属)为例，+N/-N培养微藻，收集缺氮后1d,2d,3d,4d,5d藻细胞，含高浓度蔗糖匀浆缓冲液研磨/超声破碎细胞，加入等体积低浓度蔗糖缓冲液，离心，收集最上层油体层；高pH缓冲液洗涤，除去污染蛋白或膜，镜检油体纯度及完整度，评估油体提取效率；氯仿：甲醇（V/V1：2）或2-4倍体积冷丙酮过夜沉淀富集油体蛋白，收集油相；0.1%SDS复溶沉淀蛋白，变性电泳SDS-PAGE，从电泳条带上找到纯化目的蛋白，+N/-N及-N后不同天内发生变化的蛋白条带，切胶，LC-MS/MS，根据质谱结果设计合适抗体，通过Western blot定量分析，缺氮负氮时哪些油体相关蛋白表达发生了变化，缺氮后几天里蛋白量是增加还是降低，进一步验证 
油体相关蛋白生理生化特性。 
本发明的优点如下： 
1.研究了海洋微藻体系在不同生长条件下油体积累变化，发现微藻中油体相关蛋白在油体积累过程中所起作用。 
2.提取纯化过程简单易行，藻细胞破碎程度高，油体完整度得以保证，可以得到高纯度、有生物活性油体；能拿到全部油体相关蛋白，分析数据可靠，结果可重复。 
3.对有无细胞壁微藻油体及相关蛋白提取均适用。 
附图说明：
图1微藻生长过程中油脂积累：单位体积细胞密度、叶绿素荧光、单位细胞Nile red荧光强度随生长天数变化； 
图2金藻细胞破碎前后显微镜观察结果； 
图3密度梯度离心后顶层油体； 
图4提取油体Nile red染色图。 
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法和结果进行说明。 
本发明以海洋微藻湛江等鞭金藻（Isochrysis zhangjiangensis，藻种来自FACHB藻种保存中心）为实验材料，在光照生物反应器通入4%CO2,3×f/2培养，3d缺氮，收集不缺氮以及缺氮后3d、4d、5d、6d、7d、8d藻细胞。 
实施例1 
油体获得：收集4d培养藻细胞，藻细胞密度在2500～3500×104cell.ml-1。离心后湿重5～10g。 
选择适宜的缓冲液作破碎细胞匀浆液，15-30ml GMI4℃研磨4-15min，镜检藻细胞破碎程度。GMI：0.15M tricine-KOH pH7.5,1mMEDTA,10mM KCl,1mM MgCl2,2mM DTT,0.6M蔗糖。1500-3000g,10min,4℃离心；上清加入15-30ml FMI：与GMI相同，只加入0.4M蔗糖。10,000g,30min,4℃离心；取上层油体重悬在15-30mlGMII（GMI+2M Nacl）中，在其上加入15-30ml FMII(FMI+2M Nacl),10,000-100,000g,30min,4℃离心；取上层油体重悬在GMI中，再加入15-30ml FMI,10000g,30min,4℃离心；取上层油体重复上述步骤，直到无沉淀；最终获取油体重悬在3ml GMI中。 
蛋白提取：用氯仿：甲醇（V/V1:2）或2-4倍体积冷丙酮16h,-20℃处理油体，8500g,15min,收集油相和沉淀；0.1%SDS复溶沉淀蛋白，冻干；TLC分析油脂，检测提取效率。 
实施例2 
油体获得：收集8d培养藻细胞，藻细胞密度在5000～6000×104cell.ml-1。离心后取湿重5～10g。 
选择适宜的缓冲液作破碎细胞匀浆液，破碎缓冲液：25-50mMHEPES（or MOPS）,pH7.5,5mM KCl,5mM MgCl2,5mM EDTA,1mMDTT,1mMPMSF,cocktail,0.6M蔗糖，超声3w-100w，超声5s，间隔1-5s，时间1-5min,镜检藻细胞破碎程度，检测细胞上清总蛋白浓度，计算破碎率。1500-3000g,10min,4℃离心；上清转移到15-30ml HEPES+0.4M蔗糖中，10,000-100,000g,30min,4℃离心；取上层油体，在其上加入15-30ml HEPES+0.2M蔗糖,10,000-100,000g,30min,4℃离心；取上层油体重悬在离子洗涤缓冲液中,HEPES+0.6M蔗糖+2M NaCl,在其上加入上述含0.2M蔗糖离子洗涤缓冲液，10000g,30min,4℃离心；上层油体重悬在HEPES+0.6M蔗糖中，在其上加HEPES+0.4M蔗糖，10000g,30min,4℃离心，收集上层油体，-20℃保存。 
实施例3 
油体获得：收集缺氮后3d-8d培养藻细胞，离心后取湿重5～10g。 
选择适宜的缓冲液作破碎细胞匀浆液，破碎缓冲液：25-50mMHEPES,pH7.5,5mM KCl,5mM MgCl2,5mM EDTA,1mMDTT,1mMPMSF,cocktail,0.6M蔗糖，研磨或超声3w-100w，超声5s，间隔1-5s，时间1-5min,镜检藻细胞破碎程度，检测细胞上清总蛋白浓度，计算破碎率。1500-3000g,10min,4℃离心；加入15-30ml HEPES缓冲液，10,0000-15,0000g,30min-1h,4℃离心；取上层油体，取上层油体重悬在离子洗涤缓冲液中,洗涤，重复上述离心步骤，收集上层油体，-20℃保存。 

Claims (7)

1.一种提取微藻油体的蛋白的方法，其特征在于： 
（1）利用高压、超声、研磨或高渗破碎藻细胞后，油体因其密度低与其它亚细胞器经超速离心后分离，油体浮在所有水相梯度顶层，收集油层，洗涤，具体为分离缓冲液中加入0.6-1.0M蔗糖，保护胞内细胞器，利用高弗式压碎器15000-20000psi破碎微藻细胞，选择蔗糖梯度、离心速率或离心力，油体直径在0.5-5um之间，收集顶层油体，洗涤； 
（2）将油脂和蛋白分离，用氯仿：甲醇（V/V1:2）或2-4倍体积冷丙酮12-20h,-20℃处理油体，离心，收集油相和沉淀；0.1%SDS复溶沉淀蛋白，冻干，即可得到目的蛋白。 
2.按照权利1所述方法，其特征在于：利用研磨（Beadsshocker/Beadbeater）破碎微藻细胞，显微镜观察藻细胞破碎情况，测破碎后上清蛋白浓度，计算破碎率。 
3.按照权利1和2所述方法，其特征在于：利用超声破碎微藻细胞，功率在3-100w,超声5s,间隔1-5s,超声1-5min。 
4.按照权利1和2所述方法，其特征在于：利用高渗破碎微藻细胞，将耐盐微藻从高盐营养液中转移到无盐缓冲液中，温和破碎且不破碎其它亚细胞器，然后再利用密度梯度离心分离纯化油体。 
5.按照权利1所述方法，其特征在于：分离缓冲液可以用0.15Mtricine-KOH缓冲液或25-50mM HEPES-KOH缓冲液或10-20mM MOPS或PBS或Tris-HCl缓冲液，pH在7.0-8.0之间；缓冲液中加入KCl、MgCl2、EDTA、EGTA、DTT,高浓度蔗糖以及PMSF或Cocktail蛋白酶抑制剂。 
6.按照权利1所述方法，其特征在于：蔗糖梯度为1.0M、0.6M、0.4M、0.2M、0M或30%、20%、10%、5%、0；离心力在10,000g-150,000g；离心时间30min-2h 。
7.按照权利1所述方法，其特征在于：步骤（1）整个过程在4℃条件下进行。 
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