CN104928183A - 一种微藻细胞壁的破壁方法及从微藻中提取蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种微藻细胞壁的破壁方法及从微藻中提取蛋白质的方法，涉及蛋白质提取技术领域，以解决微藻细胞壁破壁效率低下所导致的蛋白质提取效率低的问题。该微藻细胞壁的破壁方法包括冷冻固化造粒步骤和机械破壁步骤；冷冻固化造粒步骤为：将微藻液进行冷冻固化造粒，得到处在冷冻固化温度下的固化微藻粒；机械破壁步骤为：将处在冷冻固化温度下的固化微藻粒进行机械破壁处理，得到破壁微藻溶浆，完成微藻细胞壁的破壁。从微藻中提取蛋白质的方法包括上述技术方案的微藻细胞壁的破壁方法。本发明提供的微藻细胞壁的破壁方法用于从微藻中提取蛋白质的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白质提取技术领域，尤其涉及一种微藻细胞壁的破壁方法及从微藻中提取蛋白质的方法。
背景技术
微藻是一种古老低等植物，广泛存在于海洋、湖泊、河流等水体环境中；其中含有蛋白质、脂类、藻多糖、β-胡萝卜素、多种无机元素(如Cu、Fe、Se、Mn和Zn等)等生物活性成分，因此，人类可以从微藻中提取出这些生物活性成分，以应用于食品、医药、化工、生物燃料等领域。但是，由于大多数种类的微藻细胞壁为纤维素性细胞壁，有些种类的微藻细胞壁厚、质地坚硬，其中甚至还含有一些其他难以消化分解的成分，因此，人们很难以从微藻中提取出上述生物活性成分。因此，需要开发出一种微藻细胞壁的破壁方法，以有效提高微藻的生物利用效率。
现有的微藻细胞壁的破壁方法采用冻融法或机械破壁法进行破壁；其中，冻融法进行破壁需要反复冻融，存在能耗高、耗时长、破壁效率低的缺点，破壁后得到的蛋白质收率较低；而机械破壁法由于在破碎微藻细胞过程中产生热，使微藻细胞内的蛋白质失活，破壁效率低；可见，不管是冻融法进行破壁，还是采用机械破壁法进行破壁，其破壁效率均较为低下，严重影响了微藻细胞内蛋白质的提取效率，限制了微藻蛋白质产品的产业化开发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微藻细胞壁的破壁方法及从微藻中提取蛋白质的方法，用以解决微藻细胞壁破壁效率低下所导致的蛋白质提取效率低的问题。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种微藻细胞壁的破壁方法，包括冷冻固化造粒步骤和机械破壁步骤；其中，
所述冷冻固化造粒步骤为：将微藻液进行冷冻固化造粒，得到处在冷冻固化温度下的固化微藻粒；
所述机械破壁步骤为：将处在冷冻固化温度下的固化微藻粒进行机械破壁处理，得到破壁微藻溶浆，完成微藻细胞壁的破壁。
优选的，所述冷冻固化造粒步骤中，所述微藻液中的微藻为眼点拟微绿球藻和/或小球藻。
优选的，所述冷冻固化造粒步骤前，还包括将微藻液的pH值调至碱性；
或，所述机械破壁步骤后，将破壁微藻溶浆的pH值调至碱性。
较佳的，所述微藻液的pH值或所述破壁微藻溶浆的pH值是通过NaOH或三羟甲基氨基甲烷调节的。
较佳的，所述微藻液的pH值或所述破壁微藻溶浆的pH值均调节至9-13。
优选的，所述冷冻固化造粒步骤前，还包括向微藻液中加入助溶剂；
或，所述机械破壁步骤后，还包括向破壁微藻溶浆中加入助溶剂。
较佳的，所述助溶剂为尿素、表面活性剂中的一种或两种。
较佳的，所述助溶剂为十二烷基磺酸钠时，所述助溶剂的质量与所述微藻液中微藻的干重之比为(2～5)：100；所述助溶剂为尿素时，所述助溶剂的质量与所述微藻液中微藻的干重之比为(0.05～0.5):100。
优选的，所述冷冻固化造粒的温度小于-10℃，冷冻固化造粒的时间为4h～10h。
本发明还提供了一种从微藻中提取蛋白质的方法，包括上述技术方案所述的微藻细胞壁的破壁方法。
与现有技术相比，本发明提供微藻细胞壁的破壁方法的有益效果在于：
本发明提供的微藻细胞壁的破壁方法中，固化微藻粒是通过微藻液冷冻固化造粒获得的，这种方法能够保证得到的固化微藻粒处在冷冻固化温度下，直接对该固化微藻粒进行机械破壁时，机械破壁所产生的热量只会促进固化微藻粒的解冻，且确保解冻过程微藻粒温度升高不多，这样就避免了蛋白质因为温度过高而失活的问题。因此，本发明固化微藻粒将冷冻固化造粒过程中所消耗的能量用以抵消机械破壁所产生的热能，不仅节约了能耗，而且避免了机械破壁过程中，温度升过高所造成的蛋白质失活的问题；另外，与传统的冻融法或机械破壁法相比，由于冷冻固化造粒的过程中，微藻细胞内的水结晶化，形成冰晶粒，使微藻细胞体积膨胀而破裂，而经过冷冻固化造粒后的微藻细胞在进一步经过机械破壁步骤后，微藻细胞的破壁效率显著提高。因此，虽然冷冻固化造粒步骤和机械破壁步骤是两个独立的破壁步骤，但是冷冻固化造粒步骤又为机械破壁步骤提供了抑制温度升高冷环境，机械破壁步骤又为微藻细胞进一步破壁提供了融化热，所以，冷冻固化造粒步骤和机械破壁步骤是相互独立却又不可分割的，两个步骤共同作用提高了细胞破壁的效率以及蛋白质的提取效率。
具体实施方式
为了进一步说明本发明提供的微藻细胞壁的破壁方法及从微藻中提取蛋白质的方法，下面进行详细描述。
本发明提供的微藻细胞壁的破壁方法包括冷冻固化造粒步骤和机械破壁步骤；其中，
冷冻固化造粒步骤为：将微藻液进行冷冻固化造粒，得到处在冷冻固化温度下的固化微藻粒；
机械破壁步骤为：将处在冷冻固化温度下的固化微藻粒进行机械破壁处理，得到破壁微藻溶浆，完成微藻细胞壁的破壁。
本发明提供的微藻细胞壁的破壁方法中，固化微藻粒是通过微藻液冷冻固化造粒获得的，这种方法能够保证得到的固化微藻粒处在冷冻固化温度下，直接对该固化微藻粒进行机械破壁时，机械破壁所产生的热量只会促进固化微藻粒的解冻，且确保解冻过程微藻粒温度升高不多，这样就避免了蛋白质因为温度过高而失活的问题。因此，本发明固化微藻粒将冷冻固化造粒过程中所消耗的能量用以抵消机械破壁所产生的热能，不仅节约了能耗，而且避免了机械破壁过程中，温度升过高所造成的蛋白质失活的问题；另外，与传统的冻融法或机械破壁法相比，由于冷冻固化造粒的过程中，微藻细胞内的水结晶化，形成冰晶粒，使微藻细胞体积膨胀而破裂，而经过冷冻固化造粒后的微藻细胞在进一步经过机械破壁步骤后，微藻细胞的破壁效率显著提高。因此，虽然冷冻固化造粒步骤和机械破壁步骤是两个独立的破壁步骤，但是冷冻固化造粒步骤又为机械破壁步骤提供了抑制温度升高冷环境，机械破壁步骤又为微藻细胞进一步破壁提供了融化热，所以，冷冻固化造粒步骤和机械破壁步骤是相互独立却又不可分割的，两个步骤共同作用提高了细胞破壁的效率以及蛋白质的提取效率。
上述微藻细胞壁的破壁方法中，冷冻固化造粒步骤所使用的微藻液是将微藻溶于蒸馏水中得到的，也可以是采收后的微藻泥或微藻液。其中的微藻为眼点拟微绿球藻(眼点拟微绿球藻的拉丁文名称为nannochloropsisoculata)和/或小球藻(小球藻的拉丁名称为Chlorella)，但不仅限于此，只要属于微藻类的自养植物均适用于本发明微藻细胞壁的破壁方法。
需要说明的是，由于冷冻固化造粒的过程中，微藻细胞内的水结晶化，形成冰晶粒，使微藻细胞体积膨胀而破裂，而决定微藻细胞体积膨胀的大小的因素不仅包括温度，也包括微藻细胞中水的含量，因此，通过调节微藻原料与水的质量比，可以吸收一部分水到微藻细胞中，加速微藻细胞的破裂，而且，通过调节微藻原料与水的质量比，也能够在微藻细胞破裂后，使蛋白质更好的溶解到水中，因此，优选的，本发明冷冻固化造粒的温度小于-10℃，冷冻固化造粒的时间为4h～10h，形成微藻液的微藻原料和水的质量比为(20-100)：(215-400)。进一步优选的，冷冻固化造粒的温度小于-30℃～-16℃，冷冻固化造粒的时间为4h～7h，微藻液中的微藻与水的质量比为(20-80)：(215-300)。
本发明提供的微藻细胞壁的破壁方法的机械破壁步骤中，机械破壁处理采用的方法为震动破壁法或珠磨破壁法，该步骤的目的是为了实现对冷冻固化微藻粒的机械破壁，其采用常规的机械破壁方法均可实现，在此不一一列出。至于机械破壁的时间长短均是本领域技术人员根据实际情况可以选择的，因此不做要求。
当以珠磨破壁法对固化微藻粒进行机械破壁时，为了使固化微藻粒的粒径与机械破壁采用的设备的参数(如设备腔体、介质规格等)相适应，优选的，固化微藻粒的粒径为10nm～100mm，进一步优选的，固化微藻粒的形状为粒径在10nm～25mm的球状。
为了进一步提高微藻细胞壁的破壁效率，本发明提供的微藻细胞壁的破壁方法中，在冷冻固化造粒步骤前，还包括将微藻液的pH值调至碱性，或机械破壁步骤后，将破壁微藻溶浆的pH值调至碱性。将微藻液的pH值或破壁微藻溶浆的pH值调整成碱性，而在碱性条件下能够使微藻细胞中的蛋白质在水中的溶解度增加，因此，本发明将微藻液的pH值或破壁微藻溶浆的pH值调整成碱性能够提高蛋白质的提取效率。
当然，不管是微藻液的pH值，或破壁微藻溶浆的pH值只要碱性可优选调节至9-13，具体范围可以根据实际情况决定。
本发明为了调节微藻液的pH值或破壁微藻溶浆的pH值，可以采用常见的碱性物质，如NaOH或三羟甲基氨基甲烷。优选的，本发明调节微藻液的pH值或破壁微藻溶浆的pH值采用的碱性物质为NaOH，NaOH不仅能够调节pH值，而且，其能够水解微藻细胞壁的组分纤维素，进一步增加胞内蛋白质释放到胞外，提高蛋白质提取效率。
需要说明的是，本发明调节微藻液的pH值或破壁微藻溶浆的pH值，优选调节微藻液的pH值，这是因为调节微藻液的pH值后，微藻液还需要经过冷却固化造粒步骤以及机械破壁步骤，因此，微藻液能够有更长的时间保持在碱性条件下，不言而喻，其微藻细胞壁的破壁效率以及微藻细胞内蛋白质提取效率均会有相应提高。
本发明微藻细胞壁的破壁方法中，在冷冻固化造粒步骤前还包括向微藻液中加入助溶剂；或机械破壁步骤后，还包括向破壁微藻溶浆中加入助溶剂。本发明通过加入助溶剂提高微藻细胞内的蛋白质的溶解，以增加蛋白质的产量。
而助溶剂可以为表面活性剂或尿素，表面活性剂可以通过分子间作用力与蛋白质形成蛋白质-表面活性剂复合物，而这种蛋白质-表面活性剂复合物具有良好的水溶性，因此，本发明在冷冻固化造粒步骤前，或在机械破壁步骤和蛋白质提取步骤之间加入表面活性剂均能够提高蛋白质的溶解性。
而且，当助溶剂选择十二烷基磺酸钠这种表面活性剂时，十二烷基磺酸钠的质量与微藻液中微藻的干重之比为(2～5)：100。本发明在这种比例下加入的表面活性剂能够使微藻细胞中的蛋白质最大化的与表面活性剂通过分子间作用力形成蛋白质-表面活性剂复合物，增加蛋白质的溶解度，提高蛋白质的提取效率，增加蛋白质的产量。另外，虽然助溶剂可以选择十二烷基磺酸钠这种表面活性剂，但不排除其他可使用的表面活性剂。
当助溶剂选择尿素时，尿素的质量与微藻液中微藻的干重之比为(0.05～0.5):100，尿素能够通过与微藻细胞内蛋白质所含的多肽链竞争氢键来破坏微藻细胞蛋白质的高级结构的氢键，增加蛋白质疏水性侧链在水中的溶解性，从而辅助溶解蛋白质，提高蛋白质的提取效率和产率。
此外，本发明在冷冻固化造粒步骤前，还包括向微藻液中加入表面活性剂；或机械破壁步骤后，还包括向破壁微藻溶浆中加入助溶剂，两种加入顺序优选机械破壁步骤后，还包括向破壁微藻溶浆中加入助溶剂。这是因为破壁后加入助溶剂可以与胞内释放出蛋白质充分作用，促进蛋白质溶解。
值得注意的是，当调节pH值和加入助溶剂均在冷冻固化造粒步骤前或机械破壁步骤后进行时，调节pH值和加入助溶剂的顺序不受约束，可以根据实际情况安排顺序。优选的，先调节pH值，再加入助溶剂时，蛋白质的提取效率最佳。这是因为本发明提供的微藻含有的蛋白质位于细胞内，需要破坏细胞壁才能提取，因此，不管是在冷冻固化造粒步骤前还是在机械破壁步骤后调节pH值和加入助溶剂，优选的，调节pH值后加入助溶剂，蛋白质的提取效率最佳。
本发明提供的从微藻中提取蛋白质的方法，包括破壁步骤和蛋白质提取步骤；其中，
破壁步骤采用上述技术方案的微藻细胞壁的破壁方法，得到破壁微藻溶浆；
蛋白质提取步骤：将破壁微藻溶浆固液分离，得到含有蛋白质的上清液；然后从含有蛋白质的上清液中分离出蛋白质。
需要说明的是，蛋白质提取步骤为常规步骤，分离出蛋白质溶液的方法很多，一般先通过离心分离实现破壁微藻溶浆的固液分离，且固液分离体系中底层沉淀为微藻细胞残渣，收集上清液，即得到含有蛋白质的上清液；而从含有蛋白质的上清液中分离出蛋白质是通过调节含有蛋白质的上清液的pH值至等电点4.5，使蛋白质析出，接着静置使蛋白质沉淀，去掉上清液后，得到蛋白质沉淀，将蛋白质沉淀冷冻干燥即可。
上述实施方式的描述中，具体特征、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
下面给出几种实施例以对本发明提供的微藻细胞壁的破壁方法及从微藻中提取蛋白质的方法做进一步详细说明，以下实施例仅在于说明，而不在于限定。
实施例一：
本实施例的微藻细胞壁的破壁方法包括冷冻固化造粒步骤和机械破壁步骤；其中，
冷冻固化造粒步骤前：将1000g湿微藻泥溶于2150g蒸馏水中，得到微藻液，然后用三羟甲基氨基甲烷调节微藻液的pH值＝9；且湿微藻泥中含有的微藻为眼点拟微绿球藻(nannochloropsisoculata)；
冷冻固化造粒步骤为：将调节pH值的微藻液进行冷冻固化造粒，得到处在冷冻固化温度下的固化微藻粒；且冷冻固化造粒的温度为-16℃，冷冻固化造粒的时间为7h，处在冷冻固化温度下的固化微藻粒的粒径为10mm～30mm；
机械破壁步骤为：将处在冷冻固化温度下的固化微藻粒采用震动磨震动处理40min，得到破壁微藻溶浆，完成眼点拟微绿球细胞壁的破壁。
本实施例提供的从微藻中提取蛋白质的方法包括破壁步骤和蛋白质提取步骤；其中，
破壁步骤采用本实施例提供的微藻细胞壁的破壁方法，得到破壁微藻溶浆；
蛋白质提取步骤为：首先，将破壁微藻溶浆在10000g的离心机中离心5min，得到的固液分离体系，且固液分离体系中底层沉淀为眼点拟微绿球藻的细胞残渣，收集上清液，即得到含有蛋白质的上清液；其次，调节含有蛋白质的上清液的pH值至4.5，达到含有蛋白质的上清液中蛋白质的等电点，使蛋白质析出，接着静置20min使蛋白质沉淀，去除上清液后，得到蛋白质沉淀，将蛋白质沉淀在-55℃真空冷冻干燥，得蛋白质粉末31.4g。
实施例二：
本实施例的微藻细胞壁的破壁方法包括冷冻固化造粒步骤和机械破壁步骤；其中，
冷冻固化造粒步骤前，将1000g湿微藻泥溶于2150g蒸馏水中，得到微藻液；且湿微藻泥中含有的微藻为眼点拟微绿球藻(nannochloropsisoculata)；
冷冻固化造粒步骤为：将微藻液进行冷冻固化造粒，得到处在冷冻固化温度下的固化微藻粒；且冷冻固化造粒的温度为-22℃，冷冻固化造粒的时间为5h，处在冷冻固化温度下的固化微藻粒的粒径为10mm～50mm。
机械破壁步骤为：将处在冷冻固化温度下的固化微藻粒采用震动磨震动处理60min，得到破壁微藻溶浆；
机械破壁步骤后：然后利用NaOH调节破壁微藻溶浆的pH值＝12，完成眼点拟微绿球藻细胞壁的破壁。
本实施例提供的从微藻中提取蛋白质的方法包括破壁步骤和蛋白质提取步骤；其中，
破壁步骤采用本实施例提供的微藻细胞壁的破壁方法，得到调节pH值的破壁微藻溶浆；
蛋白质提取步骤为：首先，将调节pH值的破壁微藻溶浆在10000g的离心机中离心5min，得到的固液分离体系，固液分离体系中底层沉淀为眼点拟微绿球藻的细胞残渣，收集上清液，即得到含有蛋白质的上清液；其次，调节含有蛋白质的上清液的pH值至4.5，达到含有蛋白质的上清液中蛋白质的等电点，使蛋白质析出，接着静置20min使蛋白质沉淀，去除上清液后，得到蛋白质沉淀，将蛋白质沉淀在-55℃真空冷冻干燥，得蛋白质粉末33.5g。
实施例三：
本实施例的微藻细胞壁的破壁方法包括冷冻固化造粒步骤和机械破壁步骤；其中，
冷冻固化造粒步骤前，将1000g湿微藻泥溶于2150g蒸馏水中，得到微藻液，然后用NaOH调节微藻液的pH值＝13；向调节pH值的微藻液中加入十二烷基磺酸钠；且湿微藻泥中含有的微藻为眼点拟微绿球藻(nannochloropsisoculata)；十二烷基磺酸钠的质量与微藻液中微藻的干重之比为3：100；
冷冻固化造粒步骤为：将调节pH值和加入十二烷基磺酸钠的微藻液进行冷冻固化造粒，得到处在冷冻固化温度下的固化微藻粒；且冷冻固化造粒的温度为-30℃，冷冻固化造粒的时间为4h，处在冷冻固化温度下的固化微藻粒的粒径为50mm～80mm；
机械破壁步骤为：将处在冷冻固化温度下的固化微藻粒采用震动磨震动处理50min，得到破壁微藻溶浆，完成眼点拟微绿球藻细胞壁的破壁。
本实施例提供的从微藻中提取蛋白质的方法包括破壁步骤和蛋白质提取步骤；其中，
破壁步骤采用本实施例提供的微藻细胞壁的破壁方法，得到破壁微藻溶浆；
蛋白质提取步骤为：首先，将破壁微藻溶浆在10000g的离心机中离心5min，得到的固液分离体系，且固液分离体系中底层沉淀为眼点拟微绿球藻的细胞残渣，收集上清液，即得到含有蛋白质的上清液；其次，调节含有蛋白质的上清液的pH值至4.5，达到含有蛋白质的上清液中蛋白质的等电点，使蛋白质析出，接着静置20min使蛋白质沉淀，去除上清液后，得到蛋白质沉淀，将蛋白质沉淀在-55℃真空冷冻干燥，得蛋白质粉末57.6g。
实施例四：
本实施例的微藻细胞壁的破壁方法包括冷冻固化造粒步骤和机械破壁步骤；其中，
冷冻固化造粒步骤前，将200g干微藻溶于4000g蒸馏水中，得到微藻液，然后用NaOH调节微藻液的pH值＝13；向调节pH值的微藻液中加入十二烷基磺酸钠；且干微藻粉中含有的微藻为小球藻(Chlorella)；十二烷基磺酸钠的质量与微藻液中小球藻的干重之比为2:100；
冷冻固化造粒步骤为：将调节pH值和加入十二烷基磺酸钠的微藻液进行冷冻固化造粒，得到处在冷冻固化温度下的固化微藻粒；且冷冻固化造粒的温度为-25℃，冷冻固化造粒的时间为10h，处在冷冻固化温度下的固化微藻粒的粒径为50mm～100mm；
机械破壁步骤为：将处在冷冻固化温度下的固化微藻粒采用震动磨震动处理40min，得到破壁微藻溶浆，完成小球藻细胞壁的破壁。
本实施例提供的从微藻中提取蛋白质的方法包括破壁步骤和蛋白质提取步骤；其中，
破壁步骤采用本实施例提供的微藻细胞壁的破壁方法，得到破壁微藻溶浆；
蛋白质提取步骤为：首先，将破壁微藻溶浆在10000g的离心机中离心5min，得到的固液分离体系，且固液分离体系中底层沉淀为小球藻的细胞残渣，收集上清液，即得到含有蛋白质的上清液；其次，调节含有蛋白质的上清液的pH值至4.5，达到含有蛋白质的上清液中蛋白质的等电点，使蛋白质析出，接着静置20min使蛋白质沉淀，去除上清液后，得到蛋白质沉淀，将蛋白质沉淀在-55℃真空冷冻干燥，得蛋白质粉末76.8g。
实施例五：
本实施例的微藻细胞壁的破壁方法包括冷冻固化造粒步骤和机械破壁步骤；其中，
冷冻固化造粒步骤前，将200g干微藻粉泥溶于4000g蒸馏水中，得到微藻液，然后用NaOH调节微藻液的pH值＝13；且干微藻粉中含有的微藻为小球藻(Chlorella)；
冷冻固化造粒步骤为：将调节pH值的微藻液进行冷冻固化造粒，得到处在冷冻固化温度下的固化微藻粒；且冷冻固化造粒的温度为-25℃，冷冻固化造粒的时间为10h，处在冷冻固化温度下的固化微藻粒的粒径为50mm～100mm。
机械破壁步骤为：将处在冷冻固化温度下的固化微藻粒采用震动磨震动处理40min，得到破壁微藻溶浆；
机械破壁步骤后：向破壁微藻溶浆中加入十二烷基磺酸钠，完成小球藻细胞壁的破壁；且十二烷基磺酸钠的质量与微藻液中小球藻的干重之比为2:100。
本实施例提供的从微藻中提取蛋白质的方法包括破壁步骤和蛋白质提取步骤；其中，
破壁步骤采用本实施例提供的微藻细胞壁的破壁方法，得到加入十二烷基磺酸钠的破壁微藻溶浆；
蛋白质提取步骤为：首先，将加入十二烷基磺酸钠的破壁微藻溶浆在10000g的离心机中离心5min，得到的固液分离体系，且固液分离体系中底层沉淀为小球藻的细胞残渣，收集上清液，即得到含有蛋白质的上清液；其次，调节含有蛋白质的上清液的pH值至4.5，达到含有蛋白质的上清液中蛋白质的等电点，使蛋白质析出，接着静置20min使蛋白质沉淀，去除上清液后，得到蛋白质沉淀，将蛋白质沉淀在-55℃真空冷冻干燥，得蛋白质粉末115.9g。
实施例六：
本实施例的微藻细胞壁的破壁方法包括冷冻固化造粒步骤和机械破壁步骤；其中，
冷冻固化造粒步骤前，将200g干微藻粉溶于4000g蒸馏水中，得到微藻液；且干微藻粉中含有的微藻是质量比为1:1的小球藻(Chlorella)和眼点拟微绿球藻(nannochloropsisoculata)的混合物；
冷冻固化造粒步骤为：将微藻液进行冷冻固化造粒，得到处在冷冻固化温度下的固化微藻粒；且冷冻固化造粒的温度为-20℃，冷冻固化造粒的时间为10h，处在冷冻固化温度下的固化微藻粒的粒径为50mm～100mm；
机械破壁步骤为：将处在冷冻固化温度下的固化微藻粒采用珠磨破壁法处理8min，得到破壁微藻溶浆；
机械破壁步骤后：向破壁微藻溶浆中加入十二烷基磺酸钠，完成小球藻细胞壁和眼点拟微绿球藻细胞壁的破壁；且十二烷基磺酸钠的质量与微藻液中小球藻和眼点拟微绿球藻的总干重之比为5:100。
本实施例提供的从微藻中提取蛋白质的方法包括破壁步骤和蛋白质提取步骤；其中，
破壁步骤采用本实施例提供的微藻细胞壁的破壁方法，得到加入十二烷基磺酸钠的破壁微藻溶浆；
蛋白质提取步骤为：首先，将加入十二烷基磺酸钠的破壁微藻溶浆在10000g的离心机中离心5min，得到的固液分离体系，且固液分离体系中底层沉淀为小球藻的细胞残渣，收集上清液，即得到含有蛋白质的上清液；其次，调节含有蛋白质的上清液的pH值至4.5，达到蛋白质溶液中蛋白质的等电点，使蛋白质析出，接着静置20min使蛋白质沉淀，去除上清液后，得到蛋白质沉淀，将蛋白质沉淀在-55℃真空冷冻干燥，得蛋白质粉96.2g。
实施例七：
本实施例的微藻细胞壁的破壁方法包括冷冻固化造粒步骤和机械破壁步骤；其中，
冷冻固化造粒步骤前，将250g干微藻粉溶于2800g蒸馏水中，得到微藻液，然后用NaOH调节微藻液的pH值＝10；接着加入尿素；且干微藻粉中含有的微藻为小球藻(Chlorella)；所加入的尿素的质量与微藻液中小球藻的干重之比为0.1:100；
冷冻固化造粒步骤为：将加入尿素的微藻液进行冷冻固化造粒，得到处在冷冻固化温度下的固化微藻粒；其中，冷冻固化造粒的温度为-20℃，冷冻固化造粒的时间为6h，处在冷冻固化温度下的固化微藻粒为粒径在10mm～25mm的球状；
机械破壁步骤为：将处在冷冻固化温度下的固化微藻粒采用震动磨震动处理60min，得到破壁微藻溶浆；
机械破壁步骤后：向破壁微藻溶浆中加入十二烷基磺酸钠，完成小球藻细胞壁的破壁；且十二烷基磺酸钠的质量与微藻液中小球藻的干重之比为4:100。
本实施例提供的从微藻中提取蛋白质的方法包括破壁步骤和蛋白质提取步骤；其中，
破壁步骤采用本实施例提供的微藻细胞壁的破壁方法，得到加入十二烷基磺酸钠的破壁微藻溶浆；
蛋白质提取步骤为：首先，将加入十二烷基磺酸钠的破壁微藻溶浆在10000g的离心机中离心5min，得到的固液分离体系，且固液分离体系中底层沉淀为小球藻的细胞残渣，收集上清液，即得到含有蛋白质的上清液；其次，调节含有蛋白质的上清液的pH值至4.5，达到含有蛋白质的上清液中蛋白质的等电点，使蛋白质析出，接着静置20min使蛋白质沉淀，去除上清液后，得到蛋白质沉淀，将蛋白质沉淀在-55℃真空冷冻干燥，得蛋白质粉末147.2g。
实施例八：
本实施例的微藻细胞壁的破壁方法包括冷冻固化造粒步骤和机械破壁步骤；其中，
冷冻固化造粒步骤前，将250g干微藻粉溶于2800g蒸馏水中，得到微藻液；且干微藻粉中含有的微藻为小球藻(Chlorella)；
冷冻固化造粒步骤为：将微藻液进行冷冻固化造粒，得到处在冷冻固化温度下的固化微藻粒；其中，冷冻固化造粒的温度为-20℃，冷冻固化造粒的时间为6h，处在冷冻固化温度下的固化微藻粒为粒径在10mm～25mm的球状；
机械破壁步骤为：将处在冷冻固化温度下的固化微藻粒采用震动磨震动处理60min，得到破壁微藻溶浆；
机械破壁步骤后：用NaOH调节破壁微藻溶浆的pH值＝10，接着加入尿素和十二烷基磺酸钠，完成小球藻细胞壁的破壁；且NaOH和尿素的混合物中尿素的质量与微藻液中小球藻的干重之比为0.1:100；十二烷基磺酸钠的质量与微藻液中小球藻的干重之比为4:100。
本实施例提供的从微藻中提取蛋白质的方法包括破壁步骤和蛋白质提取步骤；其中，
破壁步骤采用本实施例提供的微藻细胞壁的破壁方法，得到加入尿素和十二烷基磺酸钠的破壁微藻溶浆；
蛋白质提取步骤为：首先，将加入尿素和十二烷基磺酸钠的破壁微藻溶浆在10000g的离心机中离心5min，得到的固液分离体系，且固液分离体系中底层沉淀为小球藻的细胞残渣，收集上清液，即得到含有蛋白质的上清液；其次，调节含有蛋白质的上清液的pH值至4.5，达到含有蛋白质的上清液液中蛋白质的等电点，使蛋白质析出，接着静置20min使蛋白质沉淀，去除上清液后，得到蛋白质沉淀，将蛋白质沉淀在-55℃真空冷冻干燥，得蛋白质粉末117.2g。
实施例九：
本实施例的微藻细胞壁的破壁方法包括冷冻固化造粒步骤和机械破壁步骤；其中，
冷冻固化造粒步骤前，将200g干微藻粉溶于4000g蒸馏水中，得到微藻液，向微藻液中加入十二烷基磺酸钠；且干微藻粉中含有的微藻是质量比为1:1的小球藻(Chlorella)和眼点拟微绿球藻(nannochloropsisoculata)的混合物；十二烷基磺酸钠的质量与微藻液中小球藻和眼点拟微绿球藻的总干重之比为3:100；
冷冻固化造粒步骤为：将加入十二烷基磺酸钠的微藻液进行冷冻固化造粒，得到处在冷冻固化温度下的固化微藻粒；其中，冷冻固化造粒的温度为-20℃，冷冻固化造粒的时间为10h，处在冷冻固化温度下的固化微藻粒的粒径为50mm～100mm；
机械破壁步骤为：将处在冷冻固化温度的固化微藻粒采用珠磨破壁法处理8min，得到破壁微藻溶浆，完成小球藻细胞壁和眼点拟微绿球藻细胞壁的破壁。
本实施例提供的从微藻中提取蛋白质的方法包括破壁步骤和蛋白质提取步骤；其中，
破壁步骤采用本实施例提供的微藻细胞壁的破壁方法，得到加入破壁微藻溶浆；
蛋白质提取步骤为：首先，将破壁微藻溶浆在10000g的离心机中离心5min，得到的固液分离体系，且固液分离体系中底层沉淀为小球藻的细胞残渣，收集上清液，即得到含有蛋白质的上清液；其次，调节含有蛋白质的上清液的pH值至4.5，达到含有蛋白质的上清液中蛋白质的等电点，使蛋白质析出，接着静置20min使蛋白质沉淀，去除上清液后，得到蛋白质沉淀，将蛋白质沉淀在-55℃真空冷冻干燥，得蛋白质粉40.2g。
实施例十：
本实施例的微藻细胞壁的破壁方法包括冷冻固化造粒步骤和机械破壁步骤；其中，
冷冻固化造粒步骤前，将200g干微藻粉溶于3000g蒸馏水中，得到微藻液，然后向微藻液中加入十二烷基磺酸钠和尿素，并用NaOH调节pH值＝9；且干微藻粉中含有的微藻为小球藻(Chlorella)；所加入的尿素的质量与微藻液中小球藻的干重之比为0.05:100；十二烷基磺酸钠的质量与微藻液中小球藻的干重之比为3:100；
冷冻固化造粒步骤为：将加入尿素和十二烷基磺酸钠并调节pH值的微藻液进行冷冻固化造粒，得到处在冷冻固化温度下的固化微藻粒；其中，冷冻固化造粒的温度为-28℃，冷冻固化造粒的时间为5h，处在冷冻固化温度下的固化微藻粒为粒径在10mm～25mm的球状；
机械破壁步骤为：将处在冷冻固化温度下的固化微藻粒采用震动磨震动处理60min，得到破壁微藻溶浆，完成小球藻细胞壁的破壁。
本实施例提供的从微藻中提取蛋白质的方法包括破壁步骤和蛋白质提取步骤；其中，
破壁步骤采用本实施例提供的微藻细胞壁的破壁方法，得到破壁微藻溶浆；
蛋白质提取步骤为：首先，将破壁微藻溶浆在10000g的离心机中离心5min，得到的固液分离体系，且固液分离体系中底层沉淀为小球藻的细胞残渣，收集上清液，即得到含有蛋白质的上清液；其次，调节含有蛋白质的上清液的pH值至4.5，达到含有蛋白质的上清液中蛋白质的等电点，使蛋白质析出，接着静置20min使蛋白质沉淀，去除上清液后，得到蛋白质沉淀，将蛋白质沉淀在-55℃真空冷冻干燥，得蛋白质粉末101.2g。
实施例十一：
本实施例的微藻细胞壁的破壁方法包括冷冻固化造粒步骤和机械破壁步骤；其中，
冷冻固化造粒步骤前，将800g湿薇藻泥溶于2150g蒸馏水中，得到微藻液；且湿薇藻泥中含有的微藻为小球藻(Chlorella)；
冷冻固化造粒步骤为：将微藻液进行冷冻固化造粒，得到处在冷冻固化温度下的固化微藻粒；且冷冻固化造粒的温度为-28℃，冷冻固化造粒的时间为5h，处在冷冻固化温度下的固化微藻粒为粒径在10mm～25mm的球状；
机械破壁步骤为：将处在冷冻固化温度下的固化微藻粒采用震动磨震动处理60min，得到破壁微藻溶浆；
机械破壁步骤后：向破壁微藻溶浆中加入十二烷基磺酸钠和尿素，接着用NaOH调节pH值＝9，完成小球藻细胞壁的破壁；其中，尿素的质量与微藻液中小球藻的干重之比为0.5:100；十二烷基磺酸钠的质量与微藻液中小球藻的干重之比为2:100。
本实施例提供的从微藻中提取蛋白质的方法包括破壁步骤和蛋白质提取步骤；其中，
破壁步骤采用本实施例提供的微藻细胞壁的破壁方法，得到调节pH值的破壁微藻溶浆；
蛋白质提取步骤为：首先，将调节pH值的破壁微藻溶浆在10000g的离心机中离心5min，得到的固液分离体系，且固液分离体系中底层沉淀为小球藻的细胞残渣，收集上清液，即得到含有蛋白质的上清液液；其次，调含有蛋白质的上清液的pH值至4.5，达到含有蛋白质的上清液中蛋白质的等电点，使蛋白质析出，接着静置20min使蛋白质沉淀，去除上清液后，得到蛋白质沉淀，将蛋白质沉淀在-55℃真空冷冻干燥，得蛋白质粉末116.4g。
需要说明的是，上述实施例中使用的湿微藻泥是按照1000g湿微藻泥含165.8g干微藻计算的。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种微藻细胞壁的破壁方法，其特征在于，包括冷冻固化造粒步骤和机械破壁步骤；其中，
所述冷冻固化造粒步骤为：将微藻液进行冷冻固化造粒，得到处在冷冻固化温度下的固化微藻粒；
所述机械破壁步骤为：将处在冷冻固化温度下的固化微藻粒进行机械破壁处理，得到破壁微藻溶浆，完成微藻细胞壁的破壁。
2.根据权利要求1所述的微藻细胞壁的破壁方法，其特征在于，所述冷冻固化造粒步骤中，所述微藻液中的微藻为眼点拟微绿球藻和/或小球藻。
3.根据权利要求1所述的微藻细胞壁的破壁方法，其特征在于，所述冷冻固化造粒步骤前，还包括将微藻液的pH值调至碱性；
或，所述机械破壁步骤后，将破壁微藻溶浆的pH值调至碱性。
4.根据权利要求3所述的微藻细胞壁的破壁方法，其特征在于，所述微藻液的pH值或所述破壁微藻溶浆的pH值是通过NaOH或三羟甲基氨基甲烷调节的。
5.根据权利要求3所述的微藻细胞壁的破壁方法，其特征在于，所述微藻液的pH值或所述破壁微藻溶浆的pH值均调节至9-13。
6.根据权利要求1或3所述的微藻细胞壁的破壁方法，其特征在于，所述冷冻固化造粒步骤前，还包括向微藻液中加入助溶剂；
或，所述机械破壁步骤后，还包括向破壁微藻溶浆中加入助溶剂。
7.根据权利要求6所述的微藻细胞壁的破壁方法，其特征在于，所述助溶剂为尿素、表面活性剂中的一种或两种。
8.根据权利要求6所述的微藻细胞壁的破壁方法，其特征在于，所述助溶剂为十二烷基磺酸钠时，所述助溶剂的质量与所述微藻液中微藻的干重之比为(2～5)：100；所述助溶剂为尿素时，所述助溶剂的质量与所述微藻液中微藻的干重之比为(0.05～0.5):100。
9.根据权利要求1所述的微藻细胞壁的破壁方法，其特征在于，所述冷冻固化造粒的温度小于-10℃，冷冻固化造粒的时间为4h～10h。
10.一种从微藻中提取蛋白质的方法，其特征在于，包括权利要求1-9中任一项所述的微藻细胞壁的破壁方法。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |