CN108732254A - 一种用于氨基酸检测的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种用于氨基酸检测的方法及其应用。本申请用于氨基酸检测的方法，包括利用LC‑MS/MS对经过氨基酸提取分离后由复溶液溶解的待测样品进行检测，液相色谱分离采用的流动相由水相和有机相组成；质谱扫描采用MRM技术；复溶液为浓度0.1％‑5％的甲酸水溶液；流动相中，水相由浓度0.1％的甲酸、浓度0.05％的七氟丁酸和水组成，有机相由浓度0.1％的甲酸、浓度0.01％‑0.1％的七氟丁酸和有机溶剂组成。本申请的方法，不需氨基酸衍生处理，所需样品量少，操作简单、特异性强、灵敏度高、稳定性好，可同时检测43种氨基酸，效率高；并且，可用于动植物组织、细胞、血清、血浆、唾液等样品检测，适用范围广。

Description

一种用于氨基酸检测的方法及其应用

技术领域

本申请涉及氨基酸检测领域，特别是涉及一种用于氨基酸检测的方法及其应用。

背景技术

氨基酸是在生物体内构成蛋白质分子的基本单位，与生物的生命活动有着密切的关系。氨基酸在体内有许多重要的功能，包括调节肌肉和激素的活性，形成和维持身体的每一个组织，如骨、韧带、肌腱、肌肉等。氨基酸几乎在每一个化学过程都发挥着重要作用，影响生理和心理功能。一部分氨基酸被认为是必不可少的，称为必需氨基酸，我们的身体自身不能合成，因此必须从饮食中摄取。当氨基酸供给不足，无法满足组织需求，重要的生理功能也会受到影响。这会导致从免疫系统效应到心血管疾病，甚至情绪障碍以及其它更多的症状和体征。

氨基酸除了作为合成蛋白质的基本单位，它在细胞中还起到调控功能，这对生长、发育及人体健康来说至关重要。检测氨基酸是否充足、氨基酸水平是否平衡以及氨基酸之间的转化能力，这在预防疾病和从根本上防治很多慢性病具有重要意义。

由于氨基酸是一类化学性质相似的生物活性物质，在分析过程中，检测方法的灵敏度对分析的准确性起非常重要的作用。准确灵敏地测定食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要的意义。

现有的氨基酸分析和检测，按分离方法分可分为纸色谱法、反相高效液相色谱法、毛细管电泳法、薄层色谱法、气相色谱法等；按检测方法分可分为化学分析法、电化学方法、分光光度法等；按衍生反应的先后，可分为柱前衍生和柱后衍生法。现有这些方法或检测仪器，通常需要检测氨基酸的紫外可见光谱吸收、荧光或化学发光；多数氨基酸的紫外可见光谱的吸收极弱，自身又无荧光，因此不能直接检测，需要衍生化处理来提高检测的灵敏度和选择性；检测荧光或化学发光同样也需要衍生化处理来实现。因此，现有的检测方法中，毛细管电泳分析氨基酸费时、费力，且重现性差；而气相、液相色谱用于氨基酸检测需要衍生化处理，衍生反应干扰多、专一性差。

现有的氨基酸LC-MS检测的方法能检测的氨基酸数目在20种左右，在生物体内被修饰的氨基酸由于含量低而无法定量，检测更多氨基酸时多会进行繁琐的前处理衍生化反应。

发明内容

本申请的目的是提供一种改进的氨基酸检测的方法及其应用。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请公开了一种用于氨基酸检测的方法，包括利用LC-MS/MS对待测样品进行检测，其中待测样品经过氨基酸提取分离后由复溶液溶解后制成上样液进行检测，液相色谱分离采用的流动相由水相和有机相组成；并且质谱扫描采用MRM技术；复溶液为浓度0.1％-5％的甲酸水溶液；流动相中，水相由浓度0.1％的甲酸、浓度0.05％的七氟丁酸和水组成，有机相由浓度0.1％的甲酸、浓度0.01％-0.1％的七氟丁酸和有机溶剂组成。优选的，七氟丁酸的浓度为0.05％。

需要说明的是，LC-MS/MS是指液相二级质谱，即液相色谱与二级质谱联用，MRM技术是指质谱多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)。本申请关键在于，采用LC-MS/MS对待测样品进行检测，并特别研制了复溶液和流动相。其中，本申请特定浓度的七氟丁酸流动相，能够有效的对多种氨基酸进行分离，改变色谱行为，使得本申请的检测方法能够检测出更多的氨基酸，本申请的一种实现方式中一次可以同时检出43种氨基酸，提高了氨基酸的检测效率；在研究过程中发现，七氟丁酸浓度会影响色谱强度和分离度，因此，必须在合适的范围内，才能达到氨基酸的有效检测和分离。

此外，还需要说明的是，小分子物质由于分子量小，在esi或者apci的离子源模式下，习惯产生1电荷的离子，而2电荷的离子相对较少，但是在本申请的研究过程中发现，在现有的色谱条件下，Hcy内标对带1个电荷的离子响应较差，带2个电荷的离子恰好有良好的响应；除了Hcy内标以外的氨基酸，包括Hcy都是带1个电荷的离子有高的响应。因此，本申请的优选方案中，对Hcy内标进行二级质谱检测时，采用的母离子选择带两个电荷的离子。

优选的，有机溶剂为甲醇或乙腈。

优选的，氨基酸提取分离，包括沉淀蛋白提取氨基酸的处理，所采用的试剂为酸和/或有机溶剂，沉淀蛋白后，采用过滤或者离心，提取含有氨基酸的滤液或上清液。

优选的，本申请的方法还包括对滤液或上清液进行浓缩干燥获得氨基酸，然后再采用复溶液溶解。

优选的，在对待测样品进行氨基酸提取分离之前，还包括对待测样品进行碾碎、研磨，然后再进行氨基酸提取分离。

本申请的再一面公开了本申请的方法在氨基酸检测系统、平台、检测装置或试剂盒中的应用。

本申请的再一面公开了一种氨基酸检测系统，该氨基酸检测系统中采用了本申请的方法。

本申请的再一面公开了一种氨基酸检测平台，该氨基酸检测平台中采用了本申请的方法。

本申请的再一面公开了一种氨基酸检测装置，该氨基酸检测装置中采用了本申请的方法。

本申请的再一面公开了一种氨基酸检测试剂盒，该氨基酸检测试剂盒中采用了本申请的方法。

需要说明的是，本申请的氨基酸检测方法，第一，能够同时对43种氨基酸进行检测，检测效率高；第二，不需要进行衍生处理，检测方便，耗时短，本申请的一种实现方式中，上机时间14min，就可以同时检测43种氨基酸；第三，需要的样本量少，操作简单，并且特异性强、灵敏度高、稳定性好。因此，本申请的检测方法完全可以用于现有的氨基酸检测系统、平台、检测装置或试剂盒中，替换现有的检测方法。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

本申请的氨基酸检测方法，不需要对氨基酸进行衍生处理，所需样品量少，并且，操作简单、特异性强、灵敏度高、稳定性好，在较短时间内就可以对43种氨基酸进行同时检测，检测效率高。此外，本申请的方法可以用于动植物组织、细胞、血清、血浆、唾液等样品的检测，适用范围广。本申请为氨基酸检测提供了一种快速、高效、灵敏、特异、简单且稳定的新方法和途径。

附图说明

图1是本申请实施例中采用本申请的方法检测43种氨基酸组成的标准品的检测结果；

图2是本申请实施例中采用传统方法检测43种氨基酸组成的标准品的检测结果；

图3是本申请实施例中采用本申请的方法检测磷酸丝氨酸的检测结果；

图4是本申请实施例中采用传统方法检测磷酸丝氨酸的检测结果。

具体实施方式

LC-MS/MS是近年发展起来的联用技术，在药物及体内药物分析、兴奋剂和毒品检测、农药或兽药残留量分析等领域都有应用。本申请将其用于氨基酸检测，并且特别研制了适用于氨基酸样品的复溶液和流动相。

现有的氨基酸检测方法，由于部分氨基酸的检测灵敏度较低，或者需要进行衍生化，或者由于不能实现色谱的良好分离，不能进行检测；因此，现有的氨基酸检测方法只能检出20种左右的氨基酸。而本申请的检测方法，通过特别研制的复溶液和流动相，能够让氨基酸有良好的基线分离，能够检出更多的氨基酸。此外，MRM选择1个或者2个离子对是结合液相方法下选择最优的，通常大部分的氨基酸检测都是采用1个电荷的离子；但是，例如Hcy内标对带1个电荷的离子响应较差，带2个电荷的离子恰好有良好的响应。因此，本申请的氨基酸检测方法能够检出43种氨基酸。

本申请的氨基酸检测方法，不需要进行衍生化处理，需要的样本量少，操作简单，本发明特异性强，灵敏度高，稳定性好，上机时间14min，就可以同时检测43种氨基酸。

本申请的检测方法，适合于植物动物组织、细胞、血清、血浆等常见的生物样本类型，适用范围广泛，甚至适用于唾液，实现真正的无创。由于对于含量低的氨基酸也不需经过衍生化处理，操作更简单，成本更低廉。而本申请研发的复溶液，能够改善氨基酸的色谱行为。流动相使氨基酸在色谱行为上能够有更好的分离和峰型，使某些难以检测的氨基酸能够进行准确定量检测，例如磷酸丝氨酸，采用传统的检测方法，如图4所示，不能得到有效的检测结果；而采用本申请的检测方法，则能够得到明显的磷酸丝氨酸峰值，结果如图3所示。本申请的检测方法，能一针同时对43种氨基酸进行定量检测，简便、省时、节省成本。

下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

本例首先采用43种氨基酸的混合样品作为标准品，用于本申请的氨基酸检测方法的验证检测。作为对比，采用传统的检测方法对标准品进行检测。构成标准品的43种氨基酸如表1所示。

本例的氨基酸检测方法如下：

利用LC-MS/MS对标准品进行检测，43种氨基酸溶解于浓度为1％的甲酸水溶液中作为上样液，色谱柱采用PHENOMENEXluna c18(2)150×4.6mm 5μm，液相色谱分离采用的流动相中，水相由浓度0.1％的甲酸、浓度0.05％的七氟丁酸和水组成，有机相由浓度0.1％的甲酸、浓度0.05％的七氟丁酸和有机溶剂组成，本例的有机溶剂为乙腈。质谱扫描采用MRM技术，二级质谱的母离子选择带两个电荷的离子。

液相色谱的洗脱过程如下：

Time/min	0.3	6	9	9.5	10.5	11	14
								％B	2	40	40	90	90	2	2

二级质谱的离子源为ESI。扫描方式为MRM，以带两个电荷的离子为母离子，43种氨基酸的化合物参数如表2所示，进行定量检测。

质谱参数如下：

Source gas parameters
		Curtain gas	35
Collision Gas(CAD)	Medium
		IonSpray Voltage(IS)	5500
Temperature(TEM)	600℃
		Ion SourceGas 1(GS 1)	60
Ion Source Gas 2(GS2)	60

作为对比，传统检测方法同样采用LC-MS/MS对标准品进行检测，所不同的是，液相色谱分离采用的流动相中，水相由浓度0.1％的甲酸和水组成，有机相由浓度0.1％的甲酸和有机溶剂组成，有机溶剂为乙腈。质谱扫描采用MRM技术，二级质谱的母离子选择带一个电荷的离子。其余与本例的氨基酸检测方法相同。

表1 标准品组成

表2 43种氨基酸的质谱检测化合物参数

检测结果如图1和图2所示，图1为标准品用本例的氨基酸检测方法上机的液相质谱图，横坐标为出峰时间，单位为min，纵坐标为响应强度，单位为cps；图2为标准品用传统检测方法上机的液相质谱图，横坐标为出峰时间，单位为min，纵坐标为响应强度，单位为cps。比较图1和图2可见，本例的氨基酸检测方法与传统检测方法相比，本例的氨基酸检测方法获得的色谱峰型平滑，分离度好，能检测的色谱峰比传统检测方法要多；即本例的氨基酸检测方法能够检测出更多的氨基酸。从检测数据来看，本例的氨基酸检测方法一次性可以同时检出标准品中的43种氨基酸；而传统检测方法只能检出标准品中的27种氨基酸。本例具体对比统计了传统检测方法能够检出的27个氨基酸的四个重复试验检出的氨基酸浓度结果，并统计了这27个氨基酸采用本例的氨基酸检测方法的检测结果，如表3所示。

表3 本例检测方法与传统检测方法检出的27种氨基酸浓度对比列表

表3的结果显示，在峰型正常的前提下，对于27种氨基酸，本例的氨基酸检测方法与传统检测方法的定量结果相当，定量结果出现差异的氨基酸出现在传统检测方法的氨基酸峰型不平滑的前提下，本例的氨基酸检测方法的定量结果更加稳定、可信。

在以上基础上，本例进一步采用本例的氨基酸检测方法和传统检测方法，分别对磷酸丝氨酸(Pser)进行检测，结果如图3和图4所示，图3为磷酸丝氨酸用本例的氨基酸检测方法上机的液相质谱图，横坐标为出峰时间，单位为min，纵坐标为响应强度，单位为cps；图4为磷酸丝氨酸用传统检测方法上机的液相质谱图，横坐标为出峰时间，单位为min，纵坐标为响应强度，单位为cps。由图3和图4可见，Pser在本例的氨基酸检测方法有高的响应，而在传统检测方法无有效的色谱峰图；可见，本例的氨基酸检测方法能够检测出传统检测方法不能检出的氨基酸。这与本例的氨基酸检测方法能够检出43种氨基酸，而传统检测方法只能检出27种氨基酸的结论是相符的。

此外，本例对本例的氨基酸检测方法的稳定性进行了试验，具体的，采用相同的血浆样本，每天做3个平行试验，重复进行3天试验，统计其检测数值，分析数值的平均值(average，缩写AV)和变异系数(Coefficient of variation，缩写CV)，结果如表4所示，血浆样本的处理方法在后面的试验中详细介绍。

表4 采用血浆样本进行的稳定性试验结果

表4的结果显示，本例的氨基酸检测方法，能够对血浆样本中的41种氨基酸进行检测，并且检测结果稳定性好。

在以上试验的基础上，采用本例的氨基酸检测方法，分别对小米、血清、唾液三种样品的氨基酸进行了提取和检测。三种样品的氨基酸提取方法如下。

一、小米氨基酸提取和检测

本例采用的小米样品为山西长治小米，具体如下：

1)用四分法分取20g山西长治小米，拣去杂质；

2)将样品干燥后，碾碎，通过孔径为120目的筛子，充分混匀，备用；

3)称取碾碎的小米样品20mg，准确至0.1mg，置于水解管中；

4)在水解管内加入6mol/L盐酸10mL，封口；

5)于100±01℃的恒温干燥箱内，水解20-22h后，取出冷却

6)在步骤五溶液中加去离子水，定容至20mL，混匀后经2μm滤膜过滤，吸取滤液1mL；

7)把步骤6)所得1mL滤液置于低温真空干燥器内，干燥至粉末，残留物用1mL去离子水溶解重悬；

8)反复进行步骤7)1-2次；

9)最后一次蒸干后，加30μL去离子水溶解，取1μL样品上质谱仪测量各种氨基酸在每毫升水解液中的含量，单位为mg。

根据所得来的结果，计算氨基酸在原小米样品中的含量，公式如下：

某种氨基酸，％(干基)＝[A/(m×(1-H))]×10^-3×20×30×100

其中，A为上机测量的氨基酸在每毫升水解液中的含量，单位mg；

公式中，m为称取的碾碎小米样品的质量，单位mg，本例具体的m为20mg；H为小米样品的水分百分率，本例经过烘干处理后，小米样品的水分百分率接近0；20为步骤6)中样品总量占所取样品的倍数，具体的，步骤6)定容至20mL后取1mL，其倍数即20÷1；30为步骤9)中样品总量占上样量的倍数，具体的，步骤9)加30μL去离子水溶解，取1μL上样，其倍数即30÷1。乘以10^-3是毫克与克的换算；乘以100是通常以每100克原样品中含氨基酸的量来计算，因此需要再乘以100。

根据以上计算可以得到每100克小米样品中含氨基酸的量，单位毫克。

采用本例的氨基酸检测方法对山西长治小米进行检测，最终检出了20中氨基酸，结果如表5所示，而根据现有的检测方法通常只能检出17或18种氨基酸。

表5 山西长治小米氨基酸检测结果

Asn	Ser	Gly	Gln	Asp	Thr	Ala	Glu	His	Arg
										0.27	381.61	233.63	483.83	701.25	341.11	765.22	1697.51	188.76	317.10
Pro	Cys	Lys	Met	Val	Tyr	Ile	Leu	Phe	Trp
										649.66	149.22	150.12	312.18	491.54	198.70	355.18	941.12	363.00	244.01

二、血清/血浆氨基酸的提取和检测

1)取待检血清或血浆样品40μL，加入10μL的10％磺基水杨酸进行蛋白沉淀；也可以加入120μL乙腈进行蛋白沉淀；

2)将血清样品和磺基水杨酸充分混匀后，高速离心，取10μL上清

3)冷冻抽干，加40μL含1％甲酸的去离子水溶解，作为上样液上机检测。上机测量各种氨基酸在待检血清样品中的含量，单位mg。

检测结果如表6所示，可见，本例的氨基酸检测方法，能够有效的检测出血浆样品中的41中氨基酸，而现有的检测方法通常只能检出20种左右的氨基酸。

表6 血清中氨基酸的检测结果

三、唾液氨基酸的提取和检测

1)对唾液进行25000离心20min，取出100μL唾液样品进行检测；

2)唾液亲水内标工作液与10％磺基水杨酸1:1混合，简单离心，命名为b液；

3)向100μL唾液样品中加入25μL的b液，或者不用b液，直接加入25μL的10％磺基水杨酸；对蛋白进行沉淀；加入b液或磺基水杨酸后，涡旋离心30s，使其混匀；

4)冷冻离心25000g离心10min，取上清10μL；

5)冷冻抽干，加10μL含1％甲酸的去离子水溶解，作为上样液上机检测。上机测量各种氨基酸在唾液样品中的含量，单位mg。

检测结果如表7所示，可见，本例的氨基酸检测方法，能够有效的检测出血浆样品中的25中氨基酸，而现有的检测方法通常只能检出17种氨基酸。

表7 唾液中氨基酸检测结果

可见，本例的氨基酸检测方法，能够对各自类型的样本进行氨基酸检测，并且，本例的氨基酸检测方法，能检出的氨基酸种类更多，更全面。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

Claims (7)

1.一种用于氨基酸检测的方法，其特征在于：包括利用LC-MS/MS对待测样品进行检测，其中待测样品经过氨基酸提取分离后由复溶液溶解后制成上样液进行检测，液相色谱分离采用的流动相由水相和有机相组成；并且质谱扫描采用MRM技术；

所述复溶液为浓度0.1％-5％的甲酸水溶液；

所述流动相中，水相由浓度0.1％的甲酸、浓度0.05％的七氟丁酸和水组成，有机相由浓度0.1％的甲酸、浓度0.01％-0.1％的七氟丁酸和有机溶剂组成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂为甲醇或乙腈。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述氨基酸提取分离，包括沉淀蛋白提取氨基酸的处理，所采用的试剂为酸和/或有机溶剂，沉淀蛋白后，采用过滤或者离心，提取含有氨基酸的滤液或上清液。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：还包括对滤液或上清液进行浓缩干燥获得氨基酸，然后再采用复溶液溶解。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在对待测样品进行氨基酸提取分离之前，还包括对待测样品进行碾碎、研磨，然后再进行氨基酸提取分离。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法在氨基酸检测系统、平台、检测装置或试剂盒中的应用。

7.一种氨基酸检测系统、平台、检测装置或试剂盒，其特征在于：所述氨基酸检测系统、平台、检测装置或试剂盒中采用了权利要求1-5任一项所述的方法。