CN106483208A - 用于使用质谱法检测尿素循环障碍的新方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用液相色谱‑质谱(LC‑MS)法的用于高通量筛查和分析代谢障碍的新生儿筛查试剂盒、方法、稳定同位素标记的内部标准品或内部标准溶液。所述代谢障碍可以是氨基酸、有机酸或脂肪酸氧化障碍，特别是尿素循环障碍或缺乏、高血氨症、高鸟氨酸血症‑高氨血症‑高瓜氨酸尿症(HHH)和/或精氨琥珀酸尿症。所述新生儿筛查试剂盒、方法、稳定同位素标记的内部标准品或内部标准溶液特别适用于代谢障碍的新生儿筛查(NBS)。
Description
技术领域
本申请提供了使用液相色谱-质谱(LC-MS)法的用于高通量筛查和分析代谢障碍的方法、试剂、内部标准溶液和试剂盒。所述代谢障碍可以是氨基酸、有机酸或脂肪酸氧化障碍，特别是尿素循环障碍或缺陷、高血氨症、精氨琥珀酸尿症和/或高鸟氨酸血症-高氨血症-高瓜氨酸尿症(HHH)。所述方法、试剂、内部标准溶液和试剂盒特别适用于在新生儿中进行多个外筛查测试并且以高速检测一组代谢障碍，以确认和/或追踪相同的疾病。
背景技术
目前，根据所筛查的特定的障碍，使用多种方法来进行生物学障碍的筛查，特别是这些障碍的新生儿筛查(NBS)。目前，许多团体(party)使用与串联质谱法偶联的电喷射离子化作用(ESI-MS/MS)来进行NBS的氨基酸和酰基肉碱分析。与质谱法(MS)偶联的液相色谱法(LC)也已用于NBS。
待在新生儿中检测的特定的新生儿代谢缺陷是尿素循环缺陷。尿素循环是在哺乳动物中将有毒的代谢物氨和多余的氮处理为尿素的代谢途径。尿素循环在防止有毒的含氮化合物的积累中发挥重要作用，并且还包含精氨酸的从头生物合成和降解所需的几种生物化学反应。如图1所示，尿素循环由五种酶催化：氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、精氨琥珀酸合成酶(ASS)、精氨琥珀酸裂解酶(ALS)和精氨酸酶(ARG1)。尿素循环的前两种酶位于线粒体基质中，其余三种酶在细胞质中。CPS1在第一步中促使从铵离子和二氧化碳形成氨甲酰磷酸。接下来的反应由OTC催化，其将氨甲酰基从氨甲酰磷酸转移到鸟氨酸以形成瓜氨酸。ASS在第三步中参与从瓜氨酸和天冬氨酸形成精氨琥珀酸，并且ASL在第四步中促使从精氨琥珀酸形成精氨酸和延胡索酸。ARG1在第五步中催化从精氨酸形成鸟氨酸和尿素。此外，N-乙酰谷氨酸合成酶(NAGS)催化N-乙酰谷氨酸的形成，N-乙酰谷氨酸激活CPS1。因此，尿素合成代谢途径的中断可由所述级联中具体步骤中涉及的几种酶的任一种的缺乏或失活而引起。生成尿素的途径中的缺陷具有两个结果：精氨酸成为必需氨基酸(除了在精氨酸酶缺乏症中，在这种情况下所述酶的缺乏引起精氨酸降解障碍)，以及氮原子在多种分子中累积，累积方式随具体的酶的缺乏而，但是在所有未处于代谢控制下的尿素循环障碍中氨和谷氨酰胺的血浆水平增加。
尿素循环障碍(UCD)包括：(a)氨甲酰磷酸转移酶缺乏症(CPSD或CPS1)，(b)N-乙酰谷氨酸合成酶缺乏症(NAGS)，(c)鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症(OTCD)，(d)精氨琥珀酸合成酶缺乏症(ASD)，(e)精氨琥珀酸裂解酶缺乏症或1型瓜氨酸血症(ALD或ASS1)，以及(f)精氨酸酶缺乏症(ARG1)。除了作为伴X染色体的一般障碍的OTCD，尿素循环障碍以常染色体阴性方式遗传。这些疾病中的每一种均代表尿素循环中通常表达的酶之一的生物合成的缺陷，其特征在于由尿素前体(主要是氨，其次为谷氨酰胺)的累积诱导的体征和症状。
这些临床障碍的常见病理后遗症是血浆氨水平的极度升高(高氨血症)。严重尿素循环障碍的特征为，血浆氨水平约为2000至2500mg/dL。高氨血症的检测对于早期诊断和有效治疗最为重要。高氨血症通常与氨累积增加有关，呕吐的急性发作、异常肝酶水平、嗜睡、抽搐和昏迷。即使经过治疗，长期的严重高氨血症也会导致智力和身体迟缓。但是，存在质疑引入通用的UCD新生儿筛查的已有临床状况。在所述疾病范围的轻度阶段(at the mildend of the spectrum)，有患者被描述为疾病迟发，仅有单一或很少的症状，甚至没有症状，以及仅有生物化学表型。这些患者(例如在ASS缺乏症的情况下)被描述为患有1型轻度瓜氨酸血症，这是一种与典型的1型瓜氨酸血症等位的病症，然而程度轻得多并且需要更少(如果需要的话)的医学干预。这样的患者通常在新生儿筛查程序中被识别出，并已经讨论了所述轻度病况是否是由早期检测和启动治疗引起，或由相关的残余的酶或转运蛋白功能引起。已经认为代谢物和/或突变分析可有助于识别症状较轻的患者，以试图避免无疾病的错误描述(stigmatisation)、对患者的可能的不必要的治疗和患者的不必要的焦虑，但是迄今为止尚未提供确定的解决方案。
在ASS缺乏症(瓜氨酸血症)和ARG1缺乏症(高精氨酸血症)的情况下，在血液和尿中都有各自底物(瓜氨酸和精氨酸)的显著累积。在ASL缺乏症中，由于低肾脏阈值，底物精氨琥珀酸不以任何显著的量在血液中累积。但是，一些瓜氨酸确实在血液中累积，并且大量精氨琥珀酸被排到尿中。在这方面，最近的UCD指南总结，目前不推荐近端(proximal)障碍的NBS，但是可考虑将其用于远端(distal)UCD。实际上，开发基于对血液或尿中酶或累积的底物的直接测量的UCD筛查测试的尝试限于循环中的最终步骤，因为对于前面的步骤，酶(例如，NAGS、CPS1和OTC)被限制在线粒体中，因此没有底物累积(图1)。但是，从技术上讲，直接测量干血斑点中的氨几乎是不可能的。
从2001年起，通过使用精氨酸和瓜氨酸作为标记物，在美国的一些州(加利福尼亚州、马萨诸塞州、密歇根州、纽约州、纽瓦克州、威斯康星州)中在扩展的新生儿筛查程序中已包含ASSD和ASLD。从2006年起，通过使用瓜氨酸作为标记物，在整个美国已筛查ASSD和ASLD，其作为“推荐统一筛查组”的一部分。来自6077736名新生儿的公开数据(覆盖从2001年至2012年不同的州)得到所述两种障碍的1/117000新生儿的累积发病率。
尿素循环的一种最常见和严重的缺陷——OTC缺乏症——被考虑包含于所述组中，但是由于缺少已在一般的新生儿群体中被验证的筛查测试，它不符合指定的评估标准。作为伴X染色体的障碍，OTC缺乏症具有较大的临床变异性并且可表现为在出生后前几天中危及生命的严重的新生儿发病形式，或通常更轻度的疾病的迟发形式。女性携带者也可经历与血氨水平增加相关的症状。OTC缺乏症的实验室指征为谷氨酰胺和氨浓度升高、低瓜氨酸，以及尿中乳清酸的排泄升高。因此，NBS实验室已经试图使用低瓜氨酸和若干比值来鉴定处于OTC缺乏症风险的婴儿，但是迄今为止取得的成功有限。
为了强调使用低瓜氨酸作为标记物以检测近端UCD的困难，在2001年至2008年期间，在Tuscany应用LC-MS/MS进行了一项研究。作者得出结论，低瓜氨酸血症并不是OTCD新生儿筛查的可靠标记物，特别是对于可表现出正常瓜氨酸水平的迟发形式而言。在其他代谢障碍中也可发现低瓜氨酸浓度，这进一步质疑了它作为筛查标记物的用途。因此，最近的UCD指南得出结论：目前不能推荐用于近端障碍的NBS，但是可考虑将其用于远端UCD。
尽管在患有OTC缺乏症的患者的尿中乳清酸通常升高，仍无法可靠地将它用作血液中的标记物。尽管所有UCD均影响尿素循环功能并因此导致高氨血症，但它们的生物化学特征(profile)是非常不同的。
关于新生儿尿素循环缺陷筛查的若干其他限制是，目前无法可靠地检测CPS1缺乏症、OTC缺乏症和NAGS缺乏症。此外，尽管已通过这些方法检测高精氨酸血症或ARG1缺乏症，仍无法预期新生儿筛查能够可靠地检测所有的情况。即使在可通过新生儿筛查检测的UCD中，新生儿通常在获得筛查结果之前就表现出症状；因此，医疗保健提供者的高水平的临床怀疑(clinical suspicion)是必要的。使用目前可用的检测UCD的技术时，这类筛查的灵敏性和特异性不是绝对的。
在该途径中全部五种酶缺乏症的共同因子为血浆氨水平的极度升高(高氨血症)。因此高氨血症的检测对于早期诊断和有效治疗是最重要的。因为在NBS中直接测量氨是不可行的，谷氨酰胺是通常在UCD中升高的另一种代谢物。但是，也报告了使用谷氨酰胺作为UCD的标记物的许多困难。实际上，谷氨酰胺在血浆和血清中是高度不稳定的，并自发地转化为谷氨酸盐和焦谷氨酸盐，其形成会导致假的低谷氨酰胺水平，使得谷氨酰胺目前不是使用LC-MS进行的NBS的适合筛查参数。
临床实验室中质谱(MS)的使用随时间大大增加。该发展显然是由于过去十五年中质谱应用的巨大进步。质谱允许使用滤纸斑点(spot)在不同的生物样品中或直接在不同的生物液体中非常快速地测量不同的代谢物。由于它的高灵敏性，这项技术可用于使用适合的内部标准品来定性和定量分析许多分析物或代谢物，例如，氨基酸和酰基肉碱、高半胱氨酸、乳清酸、琥珀酰丙酮等。特别地，MS广泛用于分析来自出生时取的干血斑点(Guthrie卡片)的代谢物，但是因为以上段落中所讨论的缺点，在检测的代谢物中那些由于UCD导致的代谢物未被有效地检测。
尽管将UCD筛查包含在新生儿筛查中是非常合乎需要的，但是其受到以下事实的阻碍：没有针对每一种UCD的特异性标记物；迄今为止，UCD的共同特征(例如高氨血症)不可直接在干血斑点(DBS)中检测；由于所提出的谷氨酰胺在DBS中的不稳定性，检测谷氨酰胺的继发升高(secondary elevation)似乎是不可行的。
因此，本发明的目的是提供分析方法、试剂和内部标准溶液，其允许确定可正确地指示UCD的代谢物(特别是谷氨酰胺)，以及确定通常在代谢物筛查(特别是对出生时取的干血斑点进行的那些筛查)中确定的其他代谢物。本发明因此涉及新生儿筛查试剂盒、方法、试剂和内部标准溶液，其允许使用串联质谱来快速并可靠地确定和检测多种UCD以及其他代谢缺陷(串联-MS NBS)。
本发明因此提供了可靠的方法、试剂盒、试剂和内部标准溶液，用于在多反应监测(MRM)中同时检测来自样品的赖氨酸和谷氨酰胺，以及用于分离和特异性定量谷氨酰胺的二级(second-tier)UPLC方法。因此，本发明使得使用新的标记物或新的标记物的组合来检测UCD可行，这不能通过现有技术中报告的方法来实现。
这样的方法、试剂盒、试剂和内部标准溶液可有利地与全部特异性氨基酸(精氨酸、精氨琥珀酸、瓜氨酸、鸟氨酸和脯氨酸)、n-乙酰谷氨酸和乳清酸的测量相结合。该新的组合、方法、试剂盒(kit)、试剂盒(reagent kit)和内部标准溶液允许使用串联质谱来非常快速和可靠地确定和检测新生儿中的多种UCD(串联-MS NBS)。
本发明特别适用于检测近端标记物如谷氨酰胺，其作为近端尿素循环障碍缺陷的诊断标记物。检测标记物(如谷氨酰胺)允许区分近端和远端尿素循环缺陷，因为这样的标记物可以是近端酶的产物和远端酶的底物。一旦确定所述缺陷是在近端或远端尿素循环障碍中，则可以快速替换谷氨酰胺和其他氨基酸。然后可进行在近端尿素循环障碍中的静脉谷氨酰胺给药，以使受试者快速恢复。
本发明因此提供了可靠和灵敏的方法和试剂盒以通过确定和定量生物样品中多种指示代谢物的组合，在与现在通常实施的方法相比更高的检测和/或精确度水平上评估更多种UCD的易感性、存在和严重性，所述UCD包括OTC缺乏症、精氨琥珀酸合成酶缺乏症(瓜氨酸血症)、精氨琥珀酸裂解酶缺乏症(精氨琥珀酸尿症)、精氨酸酶缺乏症和高氨血症-高鸟氨酸血症-高瓜氨酸尿症综合征(HHH)。
发明内容
本发明因此涉及筛查方法、试剂盒、试剂和内部标准溶液，用于检测和评估从受试者获得的样品(例如从新生儿获得的干血斑点)中谷氨酰胺代谢物谷氨酰胺的水平。所述试剂盒、内部标准溶液和方法适用于新生儿筛查(NBS)，特别适用于检测新生儿中的尿素循环障碍或缺陷(UCD)、OTC缺乏症和/或高氨血症和/或精氨琥珀酸尿。这样的新生儿筛查方法、试剂盒、试剂和内部标准溶液也适用于检测和/或定量所述样品中的其他代谢物，包括氨基酸、有机酸、多种肉碱和/或琥珀酰丙酮。
本发明也涉及用于诊断新生儿中代谢障碍(例如，UCD、高氨血症、HHH和/或精氨琥珀酸尿症)的新生儿筛查方法、试剂盒、试剂和内部标准溶液，包括检测和/或测量样品(例如，从新生儿获得的干血斑点)中代谢物，特别是谷氨酰胺的水平。
本发明还提供了新生儿筛查试剂盒，包括其本身包含多个细胞的测试盘；以及单独贮存的内部标准品，至少包括赖氨酸的稳定同位素标记的内部标准品，其被放置在所述测试盘的多个细胞中；以及任选的溶剂分配器(dispenser)，例如微量移液器，或任何其他分配溶剂的方式。所述单独贮存的标准品可以优选地为干燥的。
本发明最后提供了可用于本发明的新生儿筛选方法试剂盒的新的稳定同位素标记的标准品或内部标准溶液的组，至少包括赖氨酸的稳定同位素标记的内部标准品，还包括对应于待在所述新生儿筛查试剂盒中测试的额外代谢物的一种或多种额外的稳定同位素标记的内部标准品。所述新的稳定同位素标记的标准品或内部标准溶液的组可以以干燥形式存在。
附图说明
图1：示出了尿素循环的示意图。
图2：为示出了尿素循环中主要酶缺乏症的病理值的表格。
图3：为提供了内源氨基酸的一些对照水平的表格。
图4：为示出了使用串联质谱进行的对各分析物的谷氨酰胺、赖氨酸、精氨琥珀酸和乳清酸以及标准溶液的测量的线性度的图表。
图5：为示出了使用串联质谱进行的对各分析物的谷氨酰胺、赖氨酸、精氨琥珀酸和乳清酸以及标准溶液的测量的线性度的图表。
图6：为示出了使用串联质谱进行的对各分析物的谷氨酰胺、赖氨酸、精氨琥珀酸和乳清酸以及标准溶液的测量的线性度的图表。
图7：为示出了使用离子交换色谱进行的对干血斑点(DBS)中赖氨酸和谷氨酰胺总和的测量的线性度的图表。
图8：示出了对甘氨酸和赖氨酸总和的预期测量结果，以及来自健康新生儿的180DBS的测量值，来自被证明患有OTC缺乏症的患者的2个样品的测量值，以及患有尿素循环缺陷(UCD)的患者的预期范围。在图8中，图注如下：赖氨酸＝来自文献的参考范围，谷氨酰胺＝来自文献的参考范围，Sum(Gln+Lys)＝结合的参考范围，正常＝180个正常的NBS样品，OTC＝来自被证明患有OTC缺乏症的患者的2个DBS，UCD＝患有UCD的新生儿的预期范围。
图9：为示出了男性、女性、青少年和儿童的血浆中氨基酸的生理水平(μmol/L)的表格。
图10：为示出了决策树流程图，其从检测作为早期标记物的谷氨酰胺和赖氨酸的升高的总和开始，到随后更精确地检测受试者中UCD的类型的诊断步骤。
图11：为本发明的新生儿筛查试剂盒的照片再现。
具体实施方式
尽管结合了多个实施方案来描述本发明，本发明并不意欲受限于这样的实施方案。相反，本发明包含多种替代方案、修改和等价物，如本领域技术人员所理解的。
本发明涉及新生儿筛查试剂盒、方法以及新的内部标准品或内部标准溶液的组，用于通过串联质谱法检测从受试者获得的样品中代谢物的存在和/或测量代谢物的水平，所述代谢物包括具有类似质量结构的代谢物，其中一种代谢物是不稳定的，包括以下步骤：
(i)使用提取液从所述样品中提取所述代谢物；
(ii)在步骤(i)之前或之后，提供包含已知量的一种或多种稳定同位素标记的内部标准品的溶液，所述内部标准品对应于样品中待检测的所述代谢物；
(iii)使所述代谢物和所述一种或多种稳定同位素标记的内部标准品离子化以产生离子；
(iv)在多反应监测(MRM)模式下在质谱图中获得所述一种或多种离子的质荷比(m/z)；
(v)在MRM模式下确定所述具有类似质量结构的代谢物的总和，以及
(vi)使用对应于一种稳定代谢物的稳定同位素标记的内部标准品来检测和定量所述代谢物的量，以及推导出其他稳定代谢物的量。
本发明的体外方法、新生儿筛查试剂盒以及新的内部标准品或内部标准溶液的组，允许对具有相同等重特性的靶代谢物进行定量，并且可通过使用总和或比值来确定样品中一种或多种等重物(isobar)的定量浓度。
在本发明的第一实施方案中，所述新生儿筛查方法、试剂、试剂盒和内部标准品允许定量谷氨酰胺和赖氨酸，更特别为谷氨酰胺。
根据该实施方案，本发明也涉及新生儿筛查试剂盒、方法和新的内部标准品或内部标准溶液的组，用于通过串联质谱法在从受试者获得的样品中检测代谢物的存在和/或测量代谢物的水平，所述代谢物至少包括谷氨酰胺并且/或者赖氨酸和谷氨酰胺的总和，包括以下步骤：
(i)使用提取液从所述样品中提取所述代谢物；
(ii)在步骤(i)之前或之后，提供包含已知量的一种或多种稳定同位素标记的内部标准品的溶液，所述内部标准品对应于样品中待检测的所述代谢物；
(iii)使所述代谢物和所述一种或多种稳定同位素标记的内部标准品离子化以产生离子；
(iv)在多反应监测(MRM)模式下在质谱图中获得所述一种或多种离子的质荷比(m/z)；
(v)在MRM模式下确定谷氨酰胺和赖氨酸的总和，以及
(vi)使用对应于赖氨酸的稳定同位素标记的内部标准品，检测和定量谷氨酰胺的量并且/或者谷氨酰胺和赖氨酸的量。
所述方法因此提供了在复杂混合物中对未分辨的色谱峰和/或不稳定的代谢物进行高通量代谢物分析。这样的方法允许从质谱仪信号(优选从串联质谱仪信号)去卷积(deconvolute)样品中多个代谢物的贡献。可获得代谢物(例如，等重物或结构异构体)的定量浓度。由于谷氨酰胺和赖氨酸的等重性质，可从色谱信号评估所述等重物的总和和/或比值，随后可通过与对应于赖氨酸或以上提及的赖氨酸替代物的稳定同位素标记的内部标准品进行比较来推导谷氨酰胺的水平。
因此，根据本发明，赖氨酸可用于定量谷氨酰胺的量。但是应理解，本发明的方法、试剂盒和内部标准品并不限于赖氨酸。任何与赖氨酸具有类似质量结构并且与谷氨酰胺等重的代谢物也可在本发明的方法和试剂盒中被用作赖氨酸替代物。可通过使用总和或比值来确定样品中一种或多种等重物的定量浓度，以及定量受试者样品中谷氨酰胺的量。以赖氨酸替代物为例，我们能够引用谷氨酸、甲硫氨酸、甲基赖氨酸、二甲基赖氨酸、三甲基赖氨酸、羟基赖氨酸、乙酰基赖氨酸、sumoyl-赖氨酸、糖基化-赖氨酸(glocosilated-lysine)，以及赖氨酸合成的前体，例如天冬氨酸等。
本发明的方法因此涉及新生儿筛查试剂盒、体外诊断方法以及新的稳定同位素标记的内部标准品或新的内部标准溶液的组，用于诊断和/或检测代谢障碍，例如UCD、高氨血症、精氨琥珀酸尿和/或高鸟氨酸血症-高氨血症-高瓜氨酸尿症(HHH)综合征，包括通过串联质谱法在从新生儿获得的样品中检测代谢物的存在和/或测量代谢物水平，所述代谢物至少包括谷氨酰胺，包括以下步骤：
(i)使用提取液从所述样品中提取所述代谢物；
(ii)在步骤(i)之前或之后，提供包含已知量的一种或多种稳定同位素标记的内部标准品的溶液，所述内部标准品对应于样品中待检测的所述代谢物；
(iii)使所述代谢物和所述一种或多种稳定同位素标记的内部标准品离子化以产生离子；
(iv)在多反应监测(MRM)模式下在质谱图中获得所述一种或多种离子的质荷比(m/z)；
(v)在MRM模式下确定谷氨酰胺和赖氨酸的总和，以及
(vi)使用对应于赖氨酸的稳定同位素标记的内部标准品来检测和定量谷氨酰胺的量，以及任选地
(vii)确定与谷氨酰胺的生理水平相比，步骤(vi)中获得的谷氨酰胺的水平是否升高。
具有所述缺乏症的患者的谷氨酰胺的预期血浆生理水平是本领域中公知的(参见，例如，Physician’s Guide to the Laboratory Diagnosis of Metabolic Diseases,Editors:NenadBlau,Marinus Duran,Milan E.Blaskovics,K.Michael Gibson,Springer-Verlag Berlin Heidelberg，第二版，2003，其以引用的形式纳入本文)。图2和3中提供了健康受试者的血浆中谷氨酰胺的水平。例如，儿童中谷氨酰胺的生理水平可以为200或900μmol/L，或250至850μmol/L，或330至809μmol/L。
如图1所示，尿素循环障碍(UCD)包括多种遗传缺陷，其导致无效的尿素合成。UCD可包括尿素循环中的一种或多种酶缺乏症：(a)氨甲酰磷酸转移酶缺乏症(CPSD或CPS1)，(b)N-乙酰谷氨酸合成酶缺乏症(NAGS)，(c)鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症(OTCD)，(d)精氨琥珀酸合成酶缺乏症(ASD)，(e)精氨琥珀酸裂解酶缺乏症或1型瓜氨酸血症(ALD或ASS1)，以及(f)精氨酸酶缺乏症(ARG1)。除了作为伴X染色体遗传障碍的OTCD，尿素循环障碍以常染色体阴性方式遗传。这些疾病中的每一种均代表尿素循环通常表达的酶之一的生物合成缺陷，其特征在于由尿素前体(主要是氨和谷氨酰胺)的累积诱导的体征和症状。
本发明因此特别适用于检测近端标记物如谷氨酰胺，其作为近端尿素循环障碍缺陷的诊断标记物。本发明允许检测额外的标记物如谷氨酰胺，从而区分近端和远端尿素循环缺陷，因为这样的标记物可以是近端酶的产物和远端酶的底物。一旦确定所述缺陷是在近端或远端尿素循环障碍中，则可以快速替换谷氨酰胺和其他氨基酸。
确定谷氨酰胺的存在和定量谷氨酰胺的量，与尿素循环障碍和/或高氨血症和/或精氨琥珀酸尿症和/或高鸟氨酸血症-高氨血症-高瓜氨酸尿症(HHH)综合征的存在或不存在有关。
高氨血症指与氨水平升高相关的临床病症，其表现为多种症状和体征，包括明显的中枢神经系统(CNS)异常。
高鸟氨酸血症-高氨血症-高瓜氨酸尿症(HHH)综合征的特征在于，谷氨酰胺和氨的血浆浓度高。
包括诊断方法是至关重要的，所述诊断方法用于在生理症状和行为症状变得明显之前，在人类新生儿患者中早期评估对UCD、高氨血症和/或精氨琥珀酸尿症的新生儿易感性(predisposition)。
实际上，这些情况中的典型临床生物化学异常是血浆谷氨酰胺和氨浓度的显著升高。但是，随着血浆氨浓度恢复正常，血浆谷氨酰胺浓度仍保持适度升高(对照值上限的1.5倍至2倍)。通常，所形成的氨被谷氨酸捕获以通过谷氨酰胺合成酶形成谷氨酰胺。因此，谷氨酰胺的任何升高均将导致更高的氨捕获。因此，通过给予(具体而言)可捕获谷氨酰胺并且(一般而言)可捕获氨基酸的药剂，谷氨酰胺作为适用于HHH检测和计划进一步的HHH治疗的标记物，因此将来自尿素合成的氮转移到替代的排泄途径。
根据第二实施方案，新生儿筛查试剂盒、体外诊断方法以及新的稳定同位素标记的内部标准品或新的内部标准溶液的组适用于通过串联质谱法来进一步检测从新生儿获得的血液样品中与谷氨酰胺一起的额外代谢物的存在和/或测量其水平，因此特别适用于检测所有的UCD，包括近端异常以及典型的远端缺陷。
所述额外代谢物可包括精氨酸、瓜氨酸、精氨琥珀酸、鸟氨酸、赖氨酸和/或乳清酸。实际上，如图10的诊断决策树中所示，一旦已经根据本发明检测到升高的谷氨酰胺水平，可进一步诊断对UCD类型的精确确定，例如特别是新的近端尿素循环缺陷，包括N-乙酰谷氨酸合成酶(NAGS)缺乏症、氨甲酰磷酸合成酶(CPS)缺乏症、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症，和/或鸟氨酸移位酶缺乏症(HHH)。
根据该实施方案，新生儿筛查试剂盒、体外诊断方法以及新的稳定同位素标记的标准品或新的内部标准溶液的组，适用于通过串联质谱法在从新生儿获得的血液样品中进一步检测与谷氨酰胺一起的额外代谢物(其选自精氨酸、瓜氨酸、精氨琥珀酸、鸟氨酸、赖氨酸和/或乳清酸)的存在和/或测量其水平，因此特别适用于进行多个体外测试以测定所述血液样品中的其他代谢物，包括以下步骤：
(i)使用提取液从所述样品中提取所述代谢物；
(ii)在步骤(i)之前或之后，提供包含已知量的一种或多种稳定同位素标记的内部标准品的溶液，所述内部标准品对应于样品中待检测的所述代谢物；
(iii)使所述代谢物和所述一种或多种稳定同位素标记的内部标准品离子化以产生离子；
(iv)在多反应监测(MRM)模式下在质谱图中获得所述一种或多种离子的质荷比(m/z)；
(v)在MRM模式下确定谷氨酰胺和赖氨酸的总和，以及
(vi)使用对应于赖氨酸的稳定同位素标记的内部标准品，检测和定量谷氨酰胺的量，以及
(vii)通过分析步骤(iv)中所获得的MRM质谱图确定所述一种或多种代谢物的存在和/或水平。
本发明因此提供了可靠且灵敏的新生儿筛查试剂盒和方法以通过确定和定量生物样品中多种指示代谢物的组合，在与现在通常实施的方法相比更高的检测和/或精确度水平上评估更多种UCD的易感性、存在和严重性，所述UCD包括OTC缺乏症、精氨琥珀酸合成酶缺乏症(瓜氨酸血症)、精氨琥珀酸裂解酶缺乏症(精氨琥珀酸尿症)、精氨酸酶缺乏症和高氨血症-高鸟氨酸血症-高瓜氨酸尿综合征(HHH)。
根据该实施方案的第一方面，本发明涉及新生儿筛查试剂盒、新生儿筛查体外方法以及新的稳定同位素标记的内部标准品或内部标准溶液的组，用于在新生儿中检测或诊断对精氨酸酶缺乏症(ARG1)的怀疑，包括通过串联质谱法在从新生儿获得的样品中检测代谢物的存在和/或测量代谢物的水平，所述代谢物至少包括谷氨酰胺和精氨酸，并且所述试剂盒和方法包括以下步骤：
(i)使用提取液从所述样品中提取所述代谢物；
(ii)在步骤(i)之前或之后，提供包含已知量的一种或多种稳定同位素标记的内部标准品的溶液，所述内部标准品对应于样品中待检测的所述代谢物；
(iii)使所述代谢物和所述一种或多种稳定同位素标记的内部标准品离子化以产生离子；
(iv)在多反应监测(MRM)模式下在质谱图中获得所述一种或多种离子的质荷比(m/z)；
(v)在MRM模式下确定谷氨酰胺和赖氨酸的总和，以及
(vi)使用对应于赖氨酸的稳定同位素标记的内部标准品，检测和定量谷氨酰胺的量，
(vii)确定与谷氨酰胺的生理水平相比，步骤(vi)中获得的谷氨酰胺的量是否升高，以及
(viii)如果步骤(vii)中获得的谷氨酰胺的水平升高，则进一步确定精氨酸的水平以及所述精氨酸水平与精氨酸的生理水平相比是否升高，从而允许诊断对精氨酸酶缺乏症的怀疑。
根据该实施方案的第二方面，本发明涉及新生儿筛查试剂盒、新生儿筛查体外方法以及新的稳定同位素标记的内部标准品或内部标准溶液的组，用于在新生儿中检测或诊断对N-乙酰谷氨酸合成酶(NAGS)缺乏症的怀疑，包括通过串联质谱法在从新生儿获得的样品中检测代谢物的存在和/或测量代谢物的水平，所述代谢物至少包括谷氨酰胺、精氨酸、瓜氨酸，所述试剂盒和方法包括以下步骤：
(i)使用提取液从所述样品中提取所述代谢物；
(ii)在步骤(i)之前或之后，提供包含已知量的一种或多种稳定同位素标记的内部标准品的溶液，所述内部标准品对应于样品中待检测的所述代谢物；
(iii)使所述代谢物和所述一种或多种稳定同位素标记的内部标准品离子化以产生离子；
(iv)在多反应监测(MRM)模式下在质谱图中获得所述一种或多种离子的质荷比(m/z)；
(v)在MRM模式下确定谷氨酰胺和赖氨酸的总和，以及
(vi)使用对应于赖氨酸的稳定同位素标记的内部标准品，检测和定量升高的谷氨酰胺水平；
(vii)分别使用对应于精氨酸和瓜氨酸的稳定同位素标记的内部标准品，检测精氨酸和瓜氨酸的水平，以及
(viii)如果步骤(vi)中获得的谷氨酰胺的水平升高，并且精氨酸水平与精氨酸的生理水平相比降低，则进一步确定与瓜氨酸的生理水平相比瓜氨酸水平是否降低，从而推测N-乙酰谷氨酸合成酶(NAGS)缺乏症。
根据该实施方案的第三方面，本发明涉及新生儿筛查试剂盒、新生儿筛查体外方法以及新的稳定同位素标记的内部标准品或内部标准溶液的组，用于在新生儿中检测或诊断精氨琥珀酸合成酶(ASS)缺乏症、精氨琥珀酸尿症(ASA)和/或瓜氨酸血症，包括通过串联质谱法在从新生儿获得的样品中检测代谢物的存在和/或测量代谢物的水平，所述代谢物至少包括谷氨酰胺、精氨酸、瓜氨酸、精氨琥珀酸，所述试剂盒和方法包括以下步骤：
(i)使用提取液从所述样品中提取所述代谢物；
(ii)在步骤(i)之前或之后，提供包含已知量的一种或多种稳定同位素标记的内部标准品的溶液，所述内部标准品对应于样品中待检测的所述代谢物；
(iii)使所述代谢物和所述一种或多种稳定同位素标记的内部标准品离子化以产生离子；
(iv)在多反应监测(MRM)模式下在质谱图中获得所述一种或多种离子的质荷比(m/z)；
(v)在MRM模式下确定谷氨酰胺和赖氨酸的总和，以及
(vi)使用对应于赖氨酸的稳定同位素标记的内部标准品，检测和定量升高的谷氨酰胺水平；
(vii)分别使用对应于精氨酸、瓜氨酸和精氨琥珀酸的稳定同位素标记的内部标准品，检测精氨酸、瓜氨酸和精氨琥珀酸的水平，以及
(viii)如果步骤(vi)中获得的谷氨酰胺的水平升高，并且精氨酸水平与精氨酸的生理水平相比降低，则进一步确定与瓜氨酸的生理水平相比瓜氨酸水平是否增加，从而诊断对瓜氨酸血症的怀疑，以及进一步确定与精氨琥珀酸的生理水平相比精氨琥珀酸水平是否升高，从而推测精氨琥珀酸尿症(ASA)。
根据该实施方案的第四方面，本发明涉及新生儿筛查试剂盒、新生儿筛查体外方法以及新的稳定同位素标记的内部标准品或内部标准溶液的组，用于在新生儿中检测或诊断鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症(OTCD)和/或氨甲酰磷酸合成酶(CPS)缺乏症，包括通过串联质谱法在从新生儿获得的样品中检测代谢物的存在和/或测量代谢物的水平，所述代谢物至少包括谷氨酰胺、精氨酸、瓜氨酸和乳清酸，所述试剂盒和方法包括以下步骤：
(i)使用提取液从所述样品中提取所述代谢物；
(ii)在步骤(i)之前或之后，提供包含已知量的一种或多种稳定同位素标记的内部标准品的溶液，所述内部标准品对应于样品中待检测的所述代谢物；
(iii)使所述代谢物和所述一种或多种稳定同位素标记的内部标准品离子化以产生离子；
(iv)在多反应监测(MRM)模式下在质谱图中获得所述一种或多种离子的质荷比(m/z)；
(v)在MRM模式下确定谷氨酰胺和赖氨酸的总和，以及
(vi)使用对应于赖氨酸的稳定同位素标记的内部标准品，检测和定量升高的谷氨酰胺水平；
(vii)使用包含对应于精氨酸、瓜氨酸和乳清酸的稳定同位素标记的内部标准品的内部标准溶液，检测精氨酸、瓜氨酸和乳清酸的水平，以及
(viii)如果步骤(vi)中获得的谷氨酰胺水平升高，并且与精氨酸和瓜氨酸的生理水平相比精氨酸和瓜氨酸水平降低，则进一步确定与乳清酸的生理水平相比乳清酸水平是否升高，从而诊断对鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症(OTCD)的怀疑，或进一步确定乳清酸水平是否正常，从而诊断对氨甲酰磷酸合成酶(CPS)缺乏症的怀疑。
根据该实施方案的第五方面，本发明涉及新生儿筛查试剂盒、新生儿筛查体外方法以及新的稳定同位素标记的内部标准品或内部标准溶液的组，用于在新生儿中筛查或诊断对赖氨酸尿性蛋白耐受不良(LPI)或高鸟氨酸血症-高氨血症-高瓜氨酸尿症(HHH)的怀疑，包括通过串联质谱法在从新生儿获得的样品中检测代谢物的存在和/或测量代谢物的水平，所述代谢物至少包括谷氨酰胺、赖氨酸和鸟氨酸，所述试剂盒和方法包括以下步骤：
(i)使用提取液从所述样品中提取所述代谢物；
(ii)在步骤(i)之前或之后，提供包含已知量的一种或多种稳定同位素标记的内部标准品的溶液，所述内部标准品对应于样品中待检测的所述代谢物；
(iii)使所述代谢物和所述一种或多种稳定同位素标记的内部标准品离子化以产生离子；
(iv)在多反应监测(MRM)模式下在质谱图中获得所述一种或多种离子的质荷比(m/z)；
(v)在MRM模式下确定谷氨酰胺和赖氨酸的总和，以及
(vi)使用对应于赖氨酸的稳定同位素标记的内部标准品，检测和定量谷氨酰胺和赖氨酸的量；
(vii)确定与谷氨酰胺和赖氨酸的生理水平相比，步骤(vi)中获得的谷氨酰胺的量是否升高，以及赖氨酸水平是否降低；
(viii)如果与生理水平相比，步骤(vii)中获得的谷氨酰胺水平升高并且赖氨酸水平降低，则进一步确定与鸟氨酸的生理水平相比鸟氨酸水平是否升高，从而允许诊断对高鸟氨酸血症-高氨血症-高瓜氨酸尿症(HHH)的怀疑，或进一步确定鸟氨酸水平是否正常，从而允许诊断对赖氨酸尿性蛋白耐受不良(LPI)的怀疑。
精氨酸、瓜氨酸、精氨琥珀酸、乳清酸和鸟氨酸的生理水平是本领域中公知的。那些尤其记载于Physician’s Guide to the Laboratory Diagnosis of MetabolicDiseases,Editors:NenadBlau,Marinus Duran,Milan E.Blaskovics,K.Michael Gibson,Springer-Verlag Berlin Heidelberg,第二版，2003,ISBN978-3-642-62709-5，其以引用的方式纳入本文。图9提供了健康受试者的血浆中的氨基酸水平。
可使用本发明的新生儿筛查试剂盒、方法和内部标准溶液来检测的额外代谢物包括，例如，N-乙酰谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸、天冬氨酸和/或高瓜氨酸，从而允许更精确地诊断UCD。实际上，迄今为止已经报告了，低的N-乙酰谷氨酸水平与NAGS酶缺乏症相关，或低的脯氨酸水平与吡咯啉-5-羧化酶合酶(P5CS)缺乏症相关，又或者血液中的高瓜氨酸检测与高鸟氨酸血症-高氨血症-高瓜氨酸尿症(HHH)综合征相关。
因此，根据该第二实施方案，新生儿筛查试剂盒和方法以及新的稳定同位素标记的内部标准品或内部标准溶液的组，有利地提供了更完备的代谢特征(profile)，允许更可靠和高效地体外诊断或预测受试者中的UCD、高氨血症、HHH和/或精氨琥珀酸尿症，因为现在在新生儿受试者的生物样品中检测尿素循环的早期标记物谷氨酰胺的累积，以及指示UCD、高氨血症、HHH和/或精氨琥珀酸尿症的其他代谢物。如图2的表格中所示，谷氨酰胺是最重要的标记物之一，因为它指示了多种UCD。因此，检测并测量谷氨酰胺以及其他标记代谢物对筛查和检测UCD是至关重要的。
本文所述的代谢特征可适用于监测受试者(例如，哺乳动物，如人类)如新生儿的代谢。作为非限制性实例，所述方法可用于确定特定治疗的治疗效果。基于这种确定，可提供受试者额外的或替代性的治疗选择。所述代谢特征也适用于评估特定治疗方式(例如饮食限制)的患者依从性。因此，本文所述的技术适用于筛查、诊断、预后、监测疗法和依从性，以及其中确定两种或多种生物分子组的存在和量所适用的任何其他应用。
根据第三实施方案，新生儿筛查试剂盒和体外方法以及新的稳定同位素标记的内部标准品或内部标准溶液的组，特别是在新生儿中用于确定通常用作代谢疾病的标记物的其他额外代谢物的存在和/或水平，从而通过单一筛查确保对新生儿中疾病病症的更广泛的检测。
所述其他额外的代谢物可包括但不限于氨基酸、有机酸、肉碱或多种肉碱，以及琥珀酰丙酮(SUAC)。升高的氨基酸、游离肉碱和酰基肉碱的水平是可指示若干代谢障碍中的一种或多种的代谢物的实例。游离肉碱和酰基肉碱是被归类为脂肪酸氧化(FAO)障碍和有机酸尿症(OA)的障碍的标记物。同样地，氨基酸可用作被共同地称为氨基酸代谢病的若干代谢障碍的标记物。
因此，根据该第三实施方案，新生儿筛查试剂盒、体外方法以及新的稳定同位素标记的内部标准品或内部标准溶液的组可用于在新生儿中鉴定、检测和/或定量通常被用作代谢疾病标记物的临床上相关的氨基酸。
由于许多原因，患者体液中氨基酸的种类(identity)和数量对患者的健康是重要的。异常的氨基酸水平可用于诊断疾病或病症。在评估受试者的代谢状态中，内源氨基酸的存在、缺失、种类、数量或修饰，以及其与其他氨基酸相比的存在和数量(即游离氨基酸的全部特征)是重要的参数。图3提供了内源氨基酸的一些对照水平。异常的氨基酸水平或者与其他氨基酸相比某些氨基酸水平的升高/降低可表明代谢障碍。血液中游离氨基酸的定性和定量分析对于诊断和管理多种代谢紊乱(包括主要氨基酸酶病(例如，苯丙酮尿症、枫糖尿病)和氨基酸转运障碍(例如，胱氨酸尿症))是重要的。
例如，这些代谢物可选自组成蛋白质(proteinogenic)的氨基酸和非组成蛋白质的氨基酸。更精确而言，它们可选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、左旋多巴(L-Dopa)、羟脯氨酸、硒代甲硫氨酸、磷酸丝氨酸、α-氨基己二酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、β-丙氨酸、牛磺酸、β-氨基异丁酸、肌肽、甲基组氨酸、α-氨基丁酸、鹅肌肽、乙醇胺、胱硫醚、羟赖氨酸、鸟氨酸、精氨琥珀酸、s-磺酸半胱氨酸(s-sulfocysteine)、高瓜氨酸、霍金素(hawkinsin)。氨基酸代谢物优选地选自缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、瓜氨酸、精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、高瓜氨酸、天冬酰胺和/或5-氧代脯氨酸(焦谷氨酸)。
其他额外的代谢物也可包括肉碱，例如游离肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、丁酰肉碱、异戊酰肉碱、戊二酰肉碱、己酰肉碱、辛酰肉碱、癸酰肉碱、十二酰肉碱、十四酰肉碱、十六酰肉碱和/或硬脂酰肉碱。
进行酰基肉碱特征(ACP)分析，以对脂肪酸氧化(FAO)障碍和有机酸代谢障碍进行生物化学筛查。遗传的FAO障碍是最近发现的先天性代谢缺陷(IEM)。它们可在从出生到成年的任何年龄出现，通常导致危及生命的代谢失代偿发作期。典型的表现为低酮低血糖症(hypoketotic hypoglycemia)、肝病、骨骼和心肌病，以及意外猝死。有机酸血症是IEM的更异源的组。它们通常表现为反复发作的危及生命的急性疾病、张力过低或张力过高、发育停滞和发育迟滞。通常的急性表现包括呕吐、嗜睡、昏迷和癫痫。
在有机酸尿症(OA)中，有机酸的代谢途径被破坏，因此血液和尿中酸的积累改变了身体的酸碱平衡。所获得的对中间代谢途径的改变或适应可导致多种临床症状，包括代谢性酸中毒、酮病、高氨血症、发育停滞、败血症或昏迷。特别地，确定样品的琥珀酰丙酮(SUAC)也是特别有用的。I型酪氨酸血症(Tyr-I)的新生儿筛查是强制性的，以在危及生命的症状出现之前识别出处于风险中的婴儿。单独的酪氨酸分析是受限的，并可能导致假阴性结果。因此，需要进行SUAC分析。根据本发明，不需要用于SUAC的单独的衍生化步骤。
因此，优选地根据本发明的第三实施方案检测并定量的其他额外的代谢物选自精氨琥珀酸、琥珀酰丙酮、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、瓜氨酸、精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、游离肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、丁酰肉碱、异戊酰肉碱、戊二酰肉碱、己酰肉碱、辛酰肉碱、癸酰肉碱、十二酰肉碱、十四酰肉碱、十六酰肉碱和/或硬脂酰肉碱。
因此，本发明的新生儿筛查试剂盒、体外方法以及新的稳定同位素标记的内部标准品或内部标准溶液的组，适用于诊断所有的UCD，以及在新生儿早期生命中通常在实验室中进行的代谢障碍的新生儿常规代谢筛查，从而提供扩展但单一的新生儿筛查。代谢障碍通常为新生儿中的先天性代谢缺陷。
特别地，本发明的新生儿筛查试剂盒、体外方法以及新的内部标准品或内部标准溶液的组允许早期评估新生儿对以下的易感性：UCD、高氨血症、HHH和/或精氨琥珀酸尿症，以及通常在人类新生儿中测试的额外的代谢缺陷，例如但不限于氨基酸障碍、脂肪酸氧化(FAO)障碍和有机酸尿症(OA)。
氨基酸障碍可包括，例如但不限于，苯丙酮尿症(PKU)和其他高苯丙氨酸血症、枫糖尿病(MSUD)、高半胱氨酸血症、瓜氨酸血症(I型和II型)、精氨酸血症、酪氨酸血症(I型和II型)、甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)缺乏症、生物蝶呤缺乏症、高脯氨酸血症、高甲硫氨酸血症，以及脉络膜和视网膜回旋形萎缩。通过MS/MS进行的氨基酸障碍筛查通常包括进行氨基酸的定量或半定量测量。
FAO障碍可包括，例如但不限于，中链酰基-CoA脱氢酶(MCAD)缺乏症、超长链酰基-CoA脱氢酶(VLCAD)缺乏症、短链酰基-CoA脱氢酶(SCAD)缺乏症、多酰基-CoA脱氢酶(MAD)缺乏症或II型戊二酸血症(GA-II)、长链3-羟基酰基-CoA脱氢酶(LCHAD)缺乏症、中/短链L-3-羟基酰基-CoA脱氢酶(M/SCHAD)缺乏症、三功能性蛋白缺乏症(TFP)、I型和II型肉碱棕榈酰转移酶缺乏症(CPT-I,CPT-II)、肉碱-酰基肉碱移位酶(CACT)缺乏症、肉碱转运蛋白缺乏症/肉碱吸收缺陷、短链3-酮酰基-CoA硫解酶(SKAT)缺乏症、中链3-酮酰基-CoA硫解酶(MCKAT)缺乏症，以及2,4-二烯酰-CoA还原酶缺乏症。通过MS/MS进行的脂肪酸障碍筛查通常包括对酰基肉碱进行定量或半定量测量。游离肉碱不是酰基肉碱，但是如本领域技术人员所理解的，在为NBS目的而进行测量的情况下，术语“酰基肉碱”的使用通常包括游离肉碱以及真正的酰基肉碱。
此外，有机酸障碍可包括，例如但不限于，3-甲基巴豆酰-CoA羧化酶(3-MCC)缺乏症、I型戊二酸血症(GA-I)、甲基丙二酸血症(MMA)、丙酸血症(PA)、异戊酸血症(IVA)、丙二酸尿症(MA)、多羧化酶缺乏症(MCD)、2-甲基-3-羟基丁酰-CoA脱氢酶(MHBD)缺乏症、3-羟基-3-甲戊二酰-CoA裂解酶(HMG)缺乏症、2-甲丁酰-CoA脱氢酶(2MBCD)缺乏症、3-甲基戊烯二酸尿症(MGA)、异丁酰-CoA脱氢酶(IBD)缺乏症、β-酮硫解酶缺乏症(BKT)和乙基丙二酸脑病(EE)。
本发明因此提供了使用串联质谱法的改善的体外方法，以分析生物样品，确保更广泛地检测受试者(特别是受试者)的疾病病症。疑似患有代谢障碍的受试者可以是人、儿童、新生儿(neonate)、新生儿(newborn)或儿童，但是优选地为新生儿，并且所述被诊断的代谢障碍是先天性代谢缺陷。优选地，所述诊断是在生命的第1至5天在新生儿中进行。
生物样品，例如体液样品、血液样品，可以是新生儿的血液样品，最优选干血斑点(DBS)的形式。所述干血样品可通过任何方式获得自受试者或患者。例如，可通过刺破患者皮肤(例如足跟穿刺)并将全血滴在滤纸或滤卡(或Guthrie卡片)上，作为一个或多个斑点，从而从新生儿获得样品。取样卡的设计不同，但是通常取样卡包含2至10个斑点/卡。然后可将所述斑点穿孔(例如，直径范围为约3/16英寸至2/16英寸)并将其放置在容器中。例如，可将不同的斑点放置在微量滴定板的不同的孔中。或者，可以以适合于所需测试和/或应用的任何其他形式提供血液样品，例如以血溶物(hemosylate)、贮存的液体血液或血液产物或冻干样品等形式。
对优选地含有干血的生物样品进行质谱分析以产生许多质谱峰，对其中的至少一个峰进行分析。任选地，在进行质谱分析之前，迅速对样品进行预处理，例如通过色谱、超滤、电泳或透析进行预处理。色谱的实例包括离子交换色谱、亲和色谱、疏水色谱、亲水色谱和反相色谱。
上述实施方案的新生儿筛查试剂盒可包括至少一个板或微量滴定板、干血斑点对照、具有已知浓度的储存的稳定同位素标记的内部标准品、提取液、洗脱液和盖(cover)。
优选地，新生儿筛查试剂盒包括以下元素中的一种或多种：
-提取板，例如U形底的微量滴定板、或用于提取的任何合适的微量滴定板；
-分析板，例如V形底的微量滴定板、或用于分析的任何合适的微量滴定板；
-干血斑点对照(A-B-C级)；
-具有已知浓度的储存的稳定同位素标记的内部标准品，其包含标记的氨基酸、和/或标记的酰基肉碱、和/或标记的琥珀酰丙酮、和/或标记的精氨琥珀酸；
-提取液；
-洗脱液；
-粘性的塑料盖；
-任选的铝箔盖。
最优选地，新生儿筛查试剂盒包括以下元素：
(a)提取板(U形底的微量滴定板)，
(b)分析板(V形底的微量滴定板)，
(c)干血斑点对照(A-B-C级)，
(d)具有已知浓度的单独地储存的稳定同位素标记的内部标准品(标记的氨基酸)；
(e)具有已知浓度的单独地储存的稳定同位素标记的内部标准品(标记的酰基肉碱)；
(f)具有已知浓度的单独地储存的稳定同位素标记的内部标准品(标记的琥珀酰丙酮)；
(g)具有已知浓度的单独地储存的稳定同位素标记的内部标准品(标记的精氨琥珀酸)；
(h)提取液；
(i)洗脱液；
(j)粘性的塑料盖；和
(k)铝箔盖。
试剂盒的多种元素示于表11中。
所述内部标准溶液包含稳定同位素标记的内部标准品，其单独地在分隔的小瓶中储存或在共同的小瓶中储存。稳定同位素标记的内部标准品为如上文的本发明的多个实施方案和方面中所述。它们优选地以干燥形式储存。
提取微量滴定板和分析微量滴定板可由任何合适的材料(例如塑料或金属或组合)制成，并可含有具有多种尺寸和数目的孔。并且，测试试剂盒盖片可以是无菌的。试剂盒中所含的提取液和洗脱液可储存在例如硅烷化的玻璃小瓶中，或任何合适的容器、小瓶或烧瓶中。
新生儿筛查试剂盒可任选地包括溶剂或提取液以及分配器，例如微量移液器、多通道微量移液器和机器分配器，或任何其他分配提取液和洗脱液的工具。试剂盒的一种或多种组分可储存在容器中，所述容器可避免或最大程度地减少物质损失或溶剂蒸发。
所述诊断性的新生儿筛查试剂盒和体外方法可包括描述诊断步骤的技术信息表和/或指导方案，所述诊断步骤可包括：i)立即(具体地，在出生后1分钟至6小时)获得所述新生儿患者的血液样品，ii)通过串联质谱，测量从新生儿获得的干血样品中内源性代谢物的水平，以得到新生儿内源性代谢物的代谢特征，所述代谢物至少包含谷氨酰胺，以及任选的任何其他目的内源性代谢物，所述内源性代谢物可用于检测上文所述的新生儿的氨基酸、酰基肉碱和/或有机酸代谢通路中的多种额外代谢缺陷，iii)将所测得的内源性代谢物的水平与从对照获得的生物样品中的内源性代谢物的相应水平进行对比，以评估UCD、高血氨症、HHH和/或精氨琥珀酸尿的易感性和/或存在与否，以及任选地评估通常在新生儿中测试的多种额外代谢缺陷的存在。
然后可将一定体积的提取液加入含有干血样品的每种容器中。这可手动完成，或优选地使用自动的样品操作设备进行。一旦将提取液加入每个样品孔，就对所述样品进行洗脱，例如在振动台上使用温和振动操作进行洗脱。从每个容器中移出上清液并丢弃血液样品的残余物。最终将上清液中的溶剂去除，例如使用加热的氮气流通过蒸发去除。
优选地，所述技术信息表和/或指导方案可详细描述使用筛查试剂盒的步骤，其中所述步骤包括用提取液制备工作液(所述工作液包含所述一种或多种复原的(reconstituted)经标记的内部标准品)的步骤和样品提取的步骤，其中所述步骤可以任意顺序进行。
优选地，本发明的新生儿筛查试剂盒包括以下步骤：
-制备内部标准品的步骤(稳定同位素标记的氨基酸、标记的酰基肉碱标准品等)的步骤，
-用提取液制备工作液(所述工作液包含复原的稳定同位素标记的内部标准品)的步骤，和/或
-样品提取的步骤。
新生儿筛查试剂盒还可包括根据设备制造商所述进行设备设置的步骤，和/或根据设备制造商所述进行结果计算的步骤。
最优选地，新生儿筛查试剂盒包括以下步骤：
步骤1：制备内部标准溶液，其包括：将稳定同位素标记的标准品(例如稳定同位素标记的氨基酸、稳定同位素标记的酰基肉碱等)溶于1ml提取液中。
步骤2：制备“工作液”
可在任何合适的容器中制备工作液，例如在10ml的容量瓶中制备。
通过以下方式制备工作液：
a.加入100μl复原的经标记的氨基酸、100μl复原的经标记的酰基肉碱等，
b.用提取液补足至10ml，以及
c.充分混合。
步骤3：样品提取
获得新生儿的血液样品并将其置于干血斑点(Dried Blood Spot，例如Guthrie卡片等)上。对血斑点打孔(punch)，每个血斑点负载新生儿干血样品的等分试样。
可按以下方式进行样品提取：
i.将干血对照(A-B-C级)的3mm圆片打孔到U形底的微量滴定板(a)中，
ii.对患者样品的3mm圆片打孔到U形底的微量滴定板(a)中，
iii.加入100μl如步骤2所制备的“工作液”，
iv.确保将圆片适当地浸湿，
v.用粘性的塑料盖(j)盖板，
vi.在室温(RT)下以650rpm振动20min(+/-4min)
vii.移除塑料盖(j)，
viii.将每孔的70μl内容物转入V形底的微量滴定板(b)中，
ix.用铝箔盖(k)盖板，
x.将带盖的微量滴定板置于串联质谱仪的自动进样器中并注射所述样品。
筛查试剂盒还可包含关于以下的指导：
-根据设备制造商所述进行设备设置，以及任选地
-根据设备制造商所述进行结果计算。
然后，在提取步骤之前或之后，将单独标准品的组(其包含与待检测代谢物相对应的已知量的一种或多种稳定同位素标记的内部标准品)加入样品中，使得最终通过质谱分析的测试样品包含稳定同位素标记的内部标准品。因此，在加入稳定同位素标记的内部标准品之前或之后，可以用提取液和洗脱液处理干血样品。
因此，本发明的新生儿筛查试剂盒可包括用于加入孔(所述孔已经含有干燥的稳定同位素标记的内部标准品)中的溶剂。因此，可用同样含有具有已知浓度的稳定同位素标记的标准品的溶剂或提取液从经打孔而来的血斑点中提取新生儿的血液样品。如上文所述，这样的溶剂包括赖氨酸的稳定同位素标记的内部标准品，以及任何合适的额外稳定同位素标记的内部标准品(其也可加入试剂盒中以进行想要的和/或需要的其他额外的多种对新生儿血液样品的测试)。
可对血斑点提取物(其含有同位素标记的标准品)进行化学修饰或直接进行分析。对样品所暴露的所有条件也被应用于内部标准品。试剂盒和方法可需要或不需要对代谢物进行衍生化。通过对样品的一种或多种代谢物的共价修饰(即甲基化或酯形成)而进行衍生化步骤，以检测和测量所述代谢物。通常，衍生化试剂例如盐酸-正丁醇被用于此目的，或使用其他合适的衍生化试剂。随后必须再次干燥样品，以去除过量的衍生化试剂。优选地，本发明的方法和试剂盒不需要进行任何衍生化。
或者，带有孔的测试盘可已经提供一种或多种干燥的稳定同位素标记的内部标准品。在两种情况中，所述稳定同位素标记的内部标准品都包括至少一种赖氨酸的稳定同位素标记的内部标准品，并还可包括一种或多种稳定同位素标记的内部标准品(其适于确定任何其他也可用本发明的新生儿筛查试剂盒测试的目标代谢物的量)。通过观察已知标准品与被分析的未知物的设备响应的比率，推知串联质谱测量的血斑提取物中物质的量。
优选的本发明的新生儿筛查试剂盒和方法利用用于新生儿筛查的干燥的稳定同位素标记的标准品，其被溶解并根据不同的样品(sample-by-sample)来加以使用。可通过已知的方法(包括加热干燥和冷冻干燥(冻干法))将标准品干燥。
根据第四个实施方案，本发明包括内部标准溶液，其含有新的一组用于检测UCD、高血氨症、HHH、和/或精氨琥珀酸尿症的稳定同位素标记的内部标准品，其包含至少一种赖氨酸的稳定同位素标记的内部标准品，本发明还可包括与受试者生物样品中的一种或多种待进一步检测的代谢物相对应的一种或多种稳定同位素标记的内部标准品。
优选地，所述稳定同位素标记的内部标准品的组允许检测所有UCD以及上述的额外常规新生儿筛查，并因此包括赖氨酸的干燥的稳定同位素标记的内部标准品，以及额外的与新生儿筛查试剂盒中待进一步检测的一种或多种代谢物相对应的干燥的稳定同位素标记的内部标准品。
根据该实施方案的一个方面，所述与一种或多种代谢物相对应的一种或多种稳定同位素标记的内部标准品选自精氨酸、瓜氨酸、精氨琥珀酸、乳清酸和/或鸟氨酸。
根据该实施方案的第二个方面，所述内部标准溶液可因此至少包含赖氨酸的稳定同位素标记的内部标准品，任选地包含谷氨酰胺的稳定同位素标记的内部标准品，以及与一种或多种选自以下的代谢物相对应的一种或多种稳定同位素标记的内部标准品：精氨琥珀酸、琥珀酰丙酮、乳清酸、鸟氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、瓜氨酸、精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、游离肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、丁酰肉碱、异戊酰肉碱、戊二酰肉碱、己酰肉碱、辛酰肉碱、癸酰肉碱、十二酰肉碱、十四酰肉碱、十六酰肉碱和/或硬脂酰肉碱。
所述稳定同位素标记的内部标准品优选地以干燥的形式存在。
优选地，内部标准溶液可包含赖氨酸的干燥的稳定同位素标记的内部标准品，以及与对应于瓜氨酸、精氨琥珀酸、乳清酸和鸟氨酸的稳定同位素标记的内部标准品，从而允许检测所有UCD以及NAGS缺乏症、CPS缺乏症、OTC缺乏症、HHH、瓜氨酸血症，如上文所述。
所述赖氨酸的干燥的稳定同位素标记的内部标准品可与对应于亮氨酸和/或缬氨酸的稳定同位素标记的内部标准品结合使用，用于检测所有UCD并同时检测MSUD障碍，和/或与对应于苯丙氨酸的内部标准品结合使用，用于检测PKU和高苯丙氨酸血症。
本发明第四个实施方案的其他组合是，赖氨酸的稳定同位素标记的内部标准品与对应于酪氨酸的稳定同位素标记的内部标准品用于检测所有UCD和酪氨酸血症，和/或加上对应于精氨琥珀酸的稳定同位素标记的内部标准品用于进一步检测精氨琥珀酰-CoA-裂解酶(ASAL)缺乏症。
所述内部标准溶液还可包含赖氨酸的干燥的稳定同位素标记的内部标准品与对应于瓜氨酸、精氨琥珀酸、乳清酸、鸟氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和/或丙氨酸的稳定同位素标记的内部标准品。
可向任何上述组合中加入与以下物质对应的稳定同位素标记的内部标准品以用于进一步检测脂肪酸氧化病症：游离肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、丁酰肉碱、异戊酰肉碱、戊二酰肉碱、己酰肉碱、辛酰肉碱、癸酰肉碱、十二酰肉碱、十四酰肉碱、十六酰肉碱和/或硬脂酰肉碱。
基于独特的物理性质(例如独特的质量或质荷比)，可从分子中单独地检测出稳定同位素标记的内部标准品。目标代谢物的稳定同位素标记形式代表常用的内部标准品。例如，如果分析物是MPP，内部标准品可以是同位素标记的MPP。稳定同位素标记的类似物可用于通过使用称为同位素稀释质谱法的技术来定量相应的目标代谢物，其中将代谢物和内部标准品在相同的样品中处理。
如本文所使用，同位素标记的、同位素-标记的及其他类似术语以本领域中理解的方式使用。特别地，同位素标记的化合物是这样的化合物：其已知位置的至少一个原子所富集的同位素与该元素天然存在的最丰富的同位素不同。例如，甲烷可以是13C同位素标记的并具有结构13CH4，或是氘标记的。氘标记的甲烷可以指化合物中与甲烷相关的四个氢原子位置中的一个或多个富集2H(D)。常见的氘标记的甲烷结构包括CDH3和CD4。同位素标记是指超过天然丰度的同位素富集。优选地，所述富集位置的同位素纯度大于50％、或大于80％、大于90％、大于95％、大于97％、大于98％、或大于99％。
可设计内部标准品以使得(1)所述标记引起至少1个质量单位的质量转移，以及(2)稳定同位素标记均不位于不稳定位点以避免交换。在满足上述先决条件(2)的前提下，可以改变分子上标记的实际位置。此外，标记的位置和碎片离子质量可能的改变也可用于确认内部标准品和代谢物的分离。
根据本发明，对于内部标准品，可使用一种或多种同位素标记，当使用多于一种的同位素标记时，可存在多个相同标记(例如氘)或不同标记(例如氘和13C)。示例性的同位素标记的内部标准品是可明显地与目标代谢物的同位素峰区分开的那些衍生物。
可使用任何合适的同位素标记，例如2H、13C、15N、和18O或其组合。不受任何理论的束缚，预期所述稳定同位素标记的衍生物在样品制备和信号产生方面的物理化学行为与未标记的分析物相同，但在质谱上可明显地区分。
标记有一种或多种稳定同位素的氨基酸标准品优选地相对于未标记的氨基酸具有三个或更大的质量差。通过用稳定同位素来标记未标记的氨基酸以带来3个或更大的质量差，可降低未标记物体中天然存在的同位素比率造成的影响，并可进行高精度分析。例如，丙氨酸(分子式；C3H7NO2，分子量88)中天然同位素的分布是分子量88(95.8％)、89(3.74％)、90(0.34％)和91(0.02％)，通过制造3个或更大的质量差，可避免天然同位素的影响。
因此，根据所述第四个实施方案，可用于新生儿筛查试剂盒和方法的内部标准溶液可至少包含赖氨酸-13C6-15N2，以及一种或多种选自2H4-丙氨酸、2H4-13C-精氨酸、2H2-瓜氨酸、15N-13C-甘氨酸、2H3-亮氨酸、2H3-甲硫氨酸、2H6-鸟氨酸、13C6-苯丙氨酸、2H8-缬氨酸、2H3-天冬氨酸、2H3-谷氨酸、13C3-丝氨酸、13C6-酪氨酸、2H5-脯氨酸、13C5-琥珀酰丙酮和/或15N4-13C6-精氨琥珀酸的稳定同位素标记的氨基酸标准品，和/或一种或多种选自2H9-肉碱、2H3-乙酰肉碱、2H3-丙酰肉碱、2H3-丁酰肉碱、2H9-异戊酰肉碱、2H3-戊二酰肉碱、2H3-己酰肉碱、2H3-辛酰肉碱、2H3-癸酰肉碱、2H3-十二酰肉碱、2H9-十四酰肉碱、2H3-十六酰肉碱、2H3-硬脂酰肉碱的经标记的肉碱标准品。优选的氨基酸浓度范围是0.2至50μmol/L。本发明试剂盒试剂中(酰基)肉碱的优选浓度是0.001至1μmol/L。所述内部标准品优选地以干燥的形式存在。
优选地，可根据本发明使用的内部标准溶液包含至少一种选自组分A至D的试剂，其中组分A包含缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸和谷氨酸，组分B包含丝氨酸、脯氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、鸟氨酸和瓜氨酸，组分C包含肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、丁酰肉碱、异戊酰肉碱、戊二酰肉碱、己酰肉碱、辛酰肉碱、癸酰肉碱、十二酰肉碱、十四酰肉碱、十六酰肉碱、硬脂酰肉碱，组分D包含琥珀酰丙酮、乳清酸和精氨琥珀酸，其中每种化合物的一个或多个原子标记有稳定同位素。
另一种优选的内部标准溶液包含甘氨酸、缬氨酸、琥珀酰丙酮、精氨琥珀酸，以及亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和瓜氨酸中的至少一种。
本文所述的方法和试剂盒涉及检测两种或更多种氨基酸的比率或总和或加权总和，所述氨基酸例如是赖氨酸和谷氨酰胺以及一种或多种其他生物代谢物(例如，氨基酸、游离肉碱或酰基肉碱、SUAC、有机酸)，每种生物分子的存在或量与代谢疾病的存在与否相关。本文所述的方法可用于定量，如果需要的话，可允许将测试样品的结果与已知的或预先确定的具体代谢物的标准量作对比(例如，通过使用内部标准品，如上文所述)。所述方法和试剂盒也可用于定性，将测试样品与参考样品进行对比，参考样品可以是正常参考或代谢障碍参考。在这方面，生物分子的相对量可指示代谢疾病。例如，参考样品可来自患有病症、未疑似患有病症、或没有发生病症的风险的受试者，所述病症例如是代谢障碍，例如尿素循环障碍。
一般地，对于通常测试的代谢物和酶，给定生物分子的临界值(cut-off value)可以改变且是本领域中已知的。本领域中已知方法的常规的且明显的改变可用于为不常测试的代谢物建立临界值。临界值通常为生物分子的量，或与另一生物分子的比率，大于或小于临界值可认为指示代谢病症或再测试的原因。因此，根据本文所述的发明，将特定样品类型中的至少一种生物分子的参考水平视为临界值，所述至少一种生物分子的存在(或缺失)和代谢病症的存在(或缺失)之间有显著关联。应当理解，可将生物分子组作为整体看待，作为部分看待，或者根据不同的分析物(analyte-by-analyte)来加以看待。
本领域的技术人员会认识到，某些临界值不是绝对的，因为在临界值两边的值的范围上仍然是显著的。然而，可以为特定样品类型选择出生物分子的最佳临界值(例如，不同的H-分数等)。通常将所确定的用于本文所述方法中的临界值与已公开的范围作对比，但可针对所使用的方法学和患者群体将其个体化。应当理解，根据所使用的统计方法的复杂性以及根据用于为不同生物分子和样品类型确定参考水平值的样品的数量和来源，可决定提高最佳临界值。因此，根据定期的再评价或方法学或群体分布的改变，可上下调整所建立的临界值。此外，如果需要，例如当设备之间的性能相似性>10％时，可使用设备特异性的临界值。
可通过各种方法决定参考水平，条件是所得到的参考水平精确地提供每种生物分子的量：存在大于该量的第一组受试者(例如人类)，其患有代谢障碍的概率不同于第二组受试者(其具有的代谢物或酶活性的量低于参考水平)。可通过对比生物分子量(例如患有相同代谢障碍的受试者群体(例如患者)中的生物分子量)来决定参考水平。这可通过例如直方图(histogram)分析完成，其中全部患者组(cohort)均在图中表示，其中第一轴线表示生物分子的量，第二轴线表示群体中受试者的数量，其样品含有一种或多种给定量的生物分子。
因此，用于进行新生儿筛查的试剂盒和体外方法是通过利用串联质谱信号分析多种代谢物的贡献来进行，所述方法包括：获得包含多个峰值强度的样品的串联质谱信号，其中所述样品中多于一个的所述代谢物贡献至少一个所述峰值强度；为每种所述代谢物提供将所述峰值强度与贡献强度关联的模型；其中所述模型包括将所述信号表示为参考信号(其包括测量赖氨酸和谷氨酰胺的和)的加权总和，其中每个参考信号对应于一个所述代谢物；使用所述模型计算每种所述代谢物的所述贡献强度；为至少一个所述代谢物提供校正曲线以将贡献强度与浓度关联起来；基于所述校正曲线，确定至少一种代谢物的浓度并使用该结果解释尿素循环障碍以及上文所述的其他代谢障碍。
根据本发明的方法和试剂盒，离子化步骤(iii)是通过以下方式进行：将从DBS样品提取的代谢物与干燥的稳定同位素内部标准品递送至质谱仪的离子源。将所提取的代谢物与用作对照的干燥的稳定同位素标记的内部标准品在热氮气流的存在下通过小管喷射入强电场，以帮助去除溶剂并形成离子。离子化过程通常涉及转移电荷至溶剂液滴、蒸发溶剂以及最终产生带正电荷或带负电荷的离子。所述离子形成过程是质谱分析的出发点。
有多种离子化方法可供使用，离子化方法的选择取决于待分析的样品。例如，对于多肽的分析，可使用相对温和的离子化过程，例如电喷射离子化(ESI)。对于ESI，使含有样品的溶液在高电势下(这产生强电场)穿过细针，获得高度带电的液滴的细喷雾，其被导入质谱仪。其他离子化过程包括，例如，快原子轰击(FAB)，其使用中性原子的高能量射束轰击固体样品，导致解吸并离子化。基质辅助激光解吸电离(MALDI)是这样的方法：将激光脉冲用于轰击已经在UV吸收的化合物基质中结晶的样品。本领域中已知的其他离子化过程包括，例如，等离子体辉光放电、等离子体解吸电离、共振电离和次级电离。
在本发明的优选实施方案中，将溶剂化的测试样品/标准品直接引入串联质谱仪中，串联质谱仪被改造为适于使用电喷射处理所述测试样品/标准品。
串联质谱仪可以是任何合适的市售可得的谱仪。
电喷射离子化(ESI)具有多个对本文所述的发明有用的特性。例如，ESI可用于难于离子化或汽化的生物分子，例如多肽。而且，ESI的效率可以非常高，这为高灵敏度的测量提供了基础。此外，ESI从溶液中产生带电荷的分子，这便于分析溶液中的报告分子(reporter)。与之相反，离子化过程，例如MALDI，需要在离子化之前使样品结晶。由于ESI可直接从溶液中产生带电荷的分子，这适合于液相色谱系统的样品。例如，质谱仪可具有液相色谱系统(例如HPLC)的入口，而使级分从色谱柱流入质谱仪。这种液相色谱系统与质谱仪的联机排列(in-line arrangement)有时称为LC-MS。例如，LC-MS可用于在质谱分析之前从已裂解的标签报告分子中分离出未裂解的或部分裂解的标签报告分子。此外，色谱可用于在质谱分析之前从标签报告分子样品中去除盐或其他缓冲液成分。例如，在联机或脱机(off-line)下，使用反相HPLC柱进行样品脱盐，可用于提高离子化过程的效率，并因而提高质谱的检测灵敏度。优选地，离子化步骤(iii)可按以下方式进行：将所述提取的代谢物和标准品通过液相色谱系统递送至质谱仪的离子源。
所述汽化和离子化的混合物进入第一MS，其用作分离设备且仅允许目标离子通过。通过第一MS的离子称为前体或母离子，其进入碰撞室，在那里发生破碎。通过向碰撞室通入惰性碰撞气体(例如氮气或氩气)来实现破碎。碰撞室中产生的碎片称为产物或子离子。在第二MS中测量这些碎片的质量。第二MS中的碎片与第一MS中产生的完整分子相关。这个过程使得能够进行独特的MS例如前体离子扫描和中性丢失扫描成为可能。
根据本发明，质荷比(m/z)的获得步骤(iv)是以多反应监测(MRM)模式进行，并且涉及串联光谱(MS-MS)实验，在所述实验中监测所选择的前体离子(即母离子、分子离子或子离子)的一种或多种特定产物。
质谱仪的多种结构(configuration)可用于本发明的方法中。通常，质谱仪具有以下主要组件：样品入口、离子源、质量分析器、检测器、真空系统、设备控制系统和数据系统。样品入口、离子源和质量分析器中的差异通常定义了设备的类型及其性能。例如，入口可以是毛细管柱液相色谱源或可以是直接的探针或平台(例如用于基质辅助激光解吸中)。常见离子源是例如电喷射，包括纳喷射和微喷射或基质辅助激光解吸。常见质量分析器包括四极质量过滤器、离子阱质量分析器和飞行时间质量分析器。优选地，所述数据获得步骤(iv)可以用三重四极质谱仪或高分辨质谱仪进行。
使用质谱仪扫描测试样品以产生一个或多个质谱。任何可检测所提取的代谢物和标准品中信号的质谱仪均可用于本发明方法。根据本发明，优选地使用串联质谱仪，因为它能鉴定不同的分子实体，所述分子实体在经受碰撞诱导解离(CID)时产生常见碎片。在串联质谱中，两台质量分析器由碰撞室串联连接。第一质量分析器(第一四极)用于选择目标离子(例如，具有特定质荷比(m/z)的离子)。然后，所选择的离子被转入碰撞室，在那里通过惰性气体(例如氮气或氦气或氩气)碰撞将它们破碎。这个过程称为碰撞活化解离(CAD)，在质谱仪的碰撞室中进行。一旦前体离子已被破碎，第二质量分析器(第三四极)就被用于扫描或检测所有产生的产物离子、或选择和检测特定碎片离子。
串联质谱被用于离子化赖氨酸和/或谷氨酰胺以及本发明的新生儿筛查试剂盒和方法中待检测的任何额外代谢物。所述串联质谱允许离子破碎并检测特定峰，所述特定峰指示样品中这些分子的存在。
可以许多方式完成串联质谱检测。在一种类型(通常在三重四极串联质谱上进行)的串联质谱中，破碎以产生常见产物(碎片)离子的离子可作为一类通过进行“前体离子扫描”来检测，通过在碰撞室中为常见破碎选择合适的质量来进行，检测所有产生常见碎片离子的离子。在一种不同形式的串联质谱中，破碎以产生常见中性丢失的离子可作为一类通过进行所谓的中性丢失扫描来检测，其中通过在第一和第三四极之间设置等于常见中性丢失的合适的质量补偿来进行，检测所有破碎以产生特定中性丢失的离子。在称为多反应监测(MRM)的另一种类型的串联质谱中，在第一四极中选择目标前体离子、在碰撞室中破碎并在第三四极中选择从碰撞活化中得到的特定碎片离子并最终检测。
将第一和第三四极固定以在预先确定的时间(几毫秒)内分别选择相应的前体和目标碎片离子对。如果需要检测额外的分析物或代谢物，可在实验中引入额外的检测转换。可连续获得所有选择的质量转换中的数据，以获得想要的信息。
可对四极质量分析器以及本文所述的其他质量分析器进行编程以分析所定义的m/z或质量范围。由于在测定前会知道裂解的标签报告分子的质量范围，可对质谱仪进行编程以传送具有设计的正确质量范围的离子，而排除具有更高或更低质量范围的离子。选择质量范围的能力能够降低测定中的背景噪声，并因此提高信噪比。此外，所定义的质量范围可用于排除对分子的分析。因此，质谱仪能够完成内在的分离步骤并完成代谢物的检测和鉴定。
离子阱质谱利用离子阱质量分析器。在这些质量分析器中，应用场以使所有m/z的离子都在最初被捕获并在质量分析器中振荡。离子通过聚焦装置(例如八极透镜系统)从离子源进入离子阱。在激发和从电极喷射至检测器之前，在捕获区域中进行离子捕获。通过连续施加电压完成质量分析，所述电压会增加振荡的振幅，使m/z增加的离子从阱中喷射出并进入检测器。与四极质谱相比，除具有所选择的m/z的离子外，所有离子都保留在质量分析器的场中。离子阱的一个优势在于，只要小心地限制在一次被捕获的离子数目，其就具有非常高的灵敏度。对离子数目的控制可通过改变离子注入阱中所用的时间来实现。离子阱的质量分辨率与四极质量过滤器的分辨率接近，但是离子阱的确具有低的m/z限制。
飞行时间质谱利用飞行时间质量分析器。对于这种m/z分析的方法，通过在电场中加速(通过高电压产生)首先给予离子固定量的动能。加速后，离子进入无场或“漂流”区域，在那里离子在与其m/z成反比的速度下穿行。因此，具有低m/z的离子比具有高m/z的离子穿行得更快。测量离子穿行无场区域的长度所需的时间，并将其用于计算离子的m/z。
这种类型的质量分析的一个考虑因素是将所研究的离子组在同一时间引入分析器。例如，这种类型的质量分析非常适于离子化技术例如MALDI，其以短的明确的脉冲来产生离子。另一个考虑因素是控制动能量变化的离子所产生的速度零散(velocity spread)。使用更长的飞行管、离子反射体、或更高的加速电压可帮助将速度零散的影响减至最小。飞行时间质量分析器比四极或离子阱质量分析器具有更高水平的灵敏度和更宽的m/z范围。同样地，用这类质量分析器可快速获得数据，因为不必进行质量分析器的扫描。
串联质谱可利用上述质量分析器的组合。串联质谱仪可使用第一质量分析器以根据离子的m/z分离离子，以分离出目标离子用于进一步分析。然后使分离出的目标离子破碎成碎片离子(称为碰撞活化解离或碰撞诱导解离)并通过第二质量分析器分析碎片离子。这些类型的串联质谱仪系统称为空间系统上串联，因为两台质量分析器在空间上是分开的，通常通过碰撞室隔开。串联质谱仪系统还包括时间系统上串联，其使用一台质量分析器，但质量分析器被连续用于分离离子、诱导破碎、然后进行质量分析。
在空间范畴上串联的质谱仪具有一台质量分析器。例如，串联四极质谱仪系统可具有第一四极质量过滤器、然后是碰撞室、然后是第二四极质量过滤器、然后是检测器。另一种排列是使用四极质量过滤器用于第一质量分析器、飞行时间质量分析器用于第二质量分析器，用碰撞室将两台质量分析器间隔开。其他串联系统是本领域中已知的，包括反射式飞行时间、串联扇形和扇形-四极质谱。
在时间范畴串联的质谱仪具有一台质量分析器，其在不同时间发挥不同功能。例如，离子阱质谱仪可用于捕获所有m/z的离子。应用一系列的rf扫描功能，将除目标m/z离子外的所有m/z的离子从阱中喷射出。在已经分离出目标m/z后，应用rf脉冲以在阱中用气体分子产生碰撞，以诱导离子的破碎。然后通过质量分析器测量破碎离子的m/z值。离子回旋加速共振设备(也称为傅里叶变换质谱仪)是时间系统上串联的实例。
多种类型的串联质谱实验可通过控制在实验的每个阶段中选择出的离子来进行。不同类型的实验利用质谱分析器的不同操作模式，有时称为“扫描”。在第一实例中，称为质谱扫描，第一质量分析器和碰撞室将所有用于质量分析的离子传送至第二质量分析器。在第二实例中，称为产物离子扫描，在第一质量分析器中对目标离子进行质量选择，然后在碰撞室中破碎。然后，通过扫描第二质量分析器对所形成的离子进行质量分析。在第三实例中，称为前体离子扫描，扫描第一质量分析器以将经过质量分析的离子连续传送至碰撞室用于破碎。第二质量分析器对目标产物离子进行质量选择以用于传送至检测器。因此，检测信号是能被破碎为常见产物离子的所有前体离子的结果。其他实验模式包括中性丢失扫描，其中在质量扫描中获得恒定的质量差异。当在单次实验中测量大的代谢物组时(如进行多通道实验时)，使用这些不同的串联质谱扫描过程是有利的。
这些技术是本领域技术人员熟知的，他们容易认识到，不同质谱法(例如四极质谱、离子阱质谱、飞行时间质谱和串联质谱)可使用离子源和质量分析器的各种组合，其允许在设计自定义的检测方案中具有灵活性。而且，可对质谱仪进行编程以连续或同时从离子源将所有离子传送至质谱仪。此外，可对质谱仪进行编程以选择具有特定质量的离子用于传送至质谱仪同时阻断其他离子。在质谱仪中精确控制离子运动的能力允许检测方案具有更多的选选择，这在分析大量代谢物(例如来自多通道实验)时是有利的。
不同质谱仪具有不同水平的分辨率，即，分辨离子之间的峰的能力与质量密切相关。分辨率定义为R＝m/Δm，其中，m是离子质量，Δm是质谱中两个峰之间的质量差。例如，分辨率为1000的质谱仪可将m/z为100.0的离子从m/z为100.1的离子中分辨出。因此，本领域技术人员会选择分辨率适于待检测的代谢物的质谱仪。
质谱仪可分辨具有较小质量差的离子并能以高度的精确度测量离子的质量。因此，由于质谱仪可区分甚至密切相关的分子的质量，可在同一实验中一起使用质量接近的代谢物。使用质谱法实现的高度的分辨力和质量精确度允许使用大的代谢物组，因为它们可被彼此区分开。
然后通过将对应于代谢物的一个或多个质谱中的峰与对应于同位素富集的标准品的一个或多个质谱中的峰进行比较，以确定测试样品中代谢物的水平。在一个实施方案中，使用相对峰高。在另一个实施方案中，将峰下的面积积分并比较。
一旦已确定测试样品或干血样品中的代谢物水平，就可将其与正常水平的范围作对比。如果所述水平在此正常范围之外，则将干血样品或从其获得干血样品的患者送交进一步分析。例如，可用一个或多个额外的血斑点重复四十测试以获得平均水平。额外地或替代地，可使用本领域中已知的替代方法(例如使用血清样品的免疫化学法或质谱法)测量代谢物水平。
在一个优选的实施方案中，所述系统包括三重四极(串联)质量分析器的MRM操作模式。在MRM操作模式中，设置第一质量分析四极以从穿过第一质量分析四极的离子中选择出特定“前体”离子，第二非质量分析四极用于引起前体离子的受控制的解离，设置第三四极(第二质量分析四极)以仅选择前体离子的特定碎片离子或“产物”离子。前体和产物的组合称为MRM离子对。
根据本发明的一些实施方案，MRM数据可以多种不同方式获得，不同之处在于如何使激光与目标板上的样品相互作用，例如，取决于所使用的消融模式。“光栅”消融模式涉及激光束在一个或多个样品上切割直线痕。为完成这种“光栅化”，在目标样品斑点之前在非样品位置发射激光束，然后可连续移动目标板以将新样品置于激光冲击点。这意味着激光解吸点将遇到一系列交替的目标板的样品/非样品部分。所得到的MRM数据包含一系列离子信号“峰”，其根据质谱仪分析时间由每秒钟离子计数指示，遇到样品时具有非零信号，样品斑点之间散布着零信号基线区域。根据激光功率、激光束下目标板的移动速度、被监测的代谢物数目以及样品组成，对于此消融模式，通常可在约0.25至5秒中获得单一样品(检测一种或若干MRM离子对)的数据。
在“离散”操作模式中，在激光处于非发射状态下时，可将目标板置于激光冲击点下，然后打开激光维持一些特定的时间段。在激光没有发射时，质谱仪记录零信号(因为没有离子产生)。当激光开始发射，激光束将材料从该特定位置解吸附，产生MRM信号“峰”。MRM信号强度从零迅速升至最大，然后由于样品在目标板特定位置上被消耗而降低。通过关闭激光、或通过允许激光发射直至特定位置的样品被完全消耗且不再有产生离子的样品，使MRM信号水平回到零基线水平。激光发射停止后，随后移动样品板以为下次消融呈现新的样品位置。根据激光功率、样品组成和激光发射的时间长度，对于此消融模式，通常可在一秒内获得孔内单一样品的数据。
其他消融模式涉及根据一些图案移动样品斑点，使得持续发射的激光在样品斑点上产生图案。这种“图案光栅”模式在几秒钟至几分钟(取决于样品斑点内图案的形式和速度)内产生稳定的离子流。所述模式中可包括一个或多个样品斑点，当从一个样品斑点移动至另一个时具有合适的适应性。可构建质谱仪方法以进行大量不同测量，甚至包括质谱仪扫描类型的混合。对于与用此技术(例如，前体或中性丢失扫描)的MRM分析通常需要的消融时间相比，需要更长消融时间的测量，图案光栅是有用的。
在本发明的优选的试剂盒和方法中，提取步骤(ii)是通过使用包含一种或多种有机溶剂的提取缓冲液来进行，离子化步骤(iii)是通过将所述提取的代谢物和内部标准溶液经液相色谱系统递送至质谱仪的离子源来进行，数据获得步骤(iv)是用三重四极质谱仪或高分辨质谱仪进行，步骤(v)是通过选择至少一种精确的质荷比(m/z)离子(其对应于所述样品中存在的所述代谢物的至少一种计算的质荷比(m/z))来进行。并且，实施对干血斑点中代谢物的直接串联质谱分析以用于新生儿筛查，而不需要化学衍生化。最优选地，对串联质谱测量应用多反应监测(MRM)技术，使得每种代谢物具有其各自的前体和产物离子设置。
在本发明的最优选的试剂盒和方法中，包括在进行质谱(MS)分析之前通过液相色谱(LC)分离一种或多种代谢物的步骤，如上所述。因此，最优选的试剂盒和方法是液相色谱-质谱方法和试剂盒。
高压液相色谱(HPLC)是基于柱的色谱形式，其通常被用于分析化学以分离、鉴定或检测及定量分子。HPLC利用装有色谱填充物质(固定相)的柱、使流动相流过柱的泵，和检测分子的丰度并显示其相对于消逝时间在色谱柱上的保留(保留时间)的检测器。保留时间随固定相、被分析的分子及使用的溶剂的相互作用而变化。将含有代谢物的样品手动地或通过自动的自动进样器注入流动相。代谢物的极性、所使用的柱的固定相及流动相决定了代谢物的保留时间及其从干扰中的分离和可定量的程度。使用HPLC进行的氨基酸分离可用任何市售可得的LC设备进行，其使用自动或手动的进样注射以及可调节的、持续的且可重复的溶剂流速。
适于液相色谱的柱含有这样的填充物质：其包含非常小的通常为球形的颗粒(例如二氧化硅颗粒)，具有3-50微米的直径和100-1000埃的孔径。通常，HPLC用附着于所述小颗粒外表面的固定相进行；所述固定相可提供表面疏水性或使得能够实现离子改变或离子配对。色谱柱通常包括两个口，一个入口用于接收样品，一个出口用于排出可能包括或不包括样品的流出物。
在本发明的一些实施方案中，样品中的一种或多种氨基酸从入口进入柱，然后由溶剂或溶剂混合物洗脱，并最终在出口排出。在优选的实施方案中，样品中的一种或多种氨基酸从入口进入柱，其中在穿过所述柱的流被反转后，然后由溶剂或溶剂混合物洗脱，并最终在入口向回排出(反向流动)。使用色谱柱反向流动时，特别是使用两个连续色谱柱反向流动的第一色谱柱时，证明了有益于延迟亲水氨基酸的洗脱并提高它们在质量检测器中的离子化，使得分析的灵敏度提高。
可选择不同的溶剂或溶剂混合物用于洗脱氨基酸。例如，液相色谱可用在混合物中具有不同的溶剂量的梯度模式、在混合物中具有连续固定的溶剂量的恒定(isocratic)模式，或部分恒定部分梯度的混合模式进行。合适的溶剂和溶剂混合物包括钠或锂缓冲液(例如阳离子交换HPLC)或乙腈(用于反相HPLC)。
HPLC柱的内径是影响检测灵敏度和分离选择性的重要参数。在本发明的优选实施方案中，柱尺寸包括柱内径为2.1-3.0mm及柱长度为3-10cm。
液相色谱基于的原理是：将代谢物吸附于固定相并最终用流动相解吸附并洗脱至检测单元，用于合适的检测和/或定量。固定相和流动相的选择都极大地影响色谱分离的成功。
反相HPLC(RP-HPLC或RPC)具有非极性的固定相以及水性的中度极性的流动相。一种常见的固定相是经处理的二氧化硅。在这些固定相中，更加非极性的分子的保留时间更长，而极性分子洗脱的更快。流动相通常是水和易混合的极性有机溶剂(如甲醇、乙腈、四氢呋喃(THF))的二元混合物。反相色谱是基于分配(partition)并通常用于通过非极性差异来分离。
与反相HPLC相反，正相HPLC(NP-HPLC)使用极性固定相和非水性的非极性的流动相，并有效地用于分离易溶于非极性溶剂的代谢物。代谢物与极性固定相相联并由其保留，直至最后洗脱。通常用于正相色谱的固定相是二氧化硅或具有氰基和/或氨基官能团的有机部分。在NP-HPLC中，最非极性的分子先洗脱，最极性的分子最后洗脱。流动相由非常非极性的溶剂组成，例如己烷或混有略微更极性的溶剂(如异丙醇、乙酸乙酯或氯仿)的己烷。随着流动相中非极性溶剂的量的增加，保留会增加。NP-HPLC是基于吸附并通常被用于分析易溶于有机溶剂中的溶质，基于其极性差异例如胺类、酸类、金属络合物等。
离子交换色谱的使用也可在本发明的范围内，因为氨基酸(根据定义)含有至少一个氨基基团和一个羧酸基团，当流动相的pH与氨基酸的pKa不同时，它们可离子化并因而携带正电荷或负电荷。在7.0的中性pH以下，主要具有碱性基团(例如氨基基团)的氨基酸带正电荷，而在7.0的中性pH以上，主要具有酸性基团(例如羧酸基团)的氨基酸带负电荷。代表蛋白质构建块的20种蛋白氨基酸的侧链基团不同，这影响氨基酸的化学反应性、离子电荷、相对亲水性或疏水性以及极性。离子交换色谱是这样的方法：其基于代谢物的电荷性质允许对离子和极性分子的分离。带电荷的氨基酸可以是酸性或碱性的。固定相表面陈列与具有相反电荷的分析物离子相互作用的离子官能团(R--X)。这类型的色谱进一步细分为阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。目标代谢物(阴离子或阳离子)保留在固定相上，但可通过增加带有相似电荷的物质的浓度(将从固定相上置换分析物离子)来洗脱。例如，在阳离子交换色谱中，带正电荷的分析物可通过添加带正电荷的钠离子而被置换。
也考虑了将离子配对色谱用于本发明的范围内。与离子交换色谱类似，离子配对色谱利用代谢物的可离子化性和电荷性质用于色谱分离。然而，不同于交换离子，离子配对系统是使用全氟化的羧酸(例如十三氟庚酸(TDFHA)或三氟乙酸(TFA))作为流动相成分以及可接受电子或贡献电子或两者皆可的固定相来构建。特别地，离子配对色谱可用于在反相柱上分离离子代谢物以抑制带电荷的有机化合物的离子特性。离子配对试剂带有与代谢物相反的电荷并疏水区以与固定相相互作用。被吸收的离子配对试剂的电荷与代谢物的电荷具有静电相互作用。作为实例，胺类在反相柱上会产生严重的拖尾色谱峰，而添加离子配对试剂(例如三氟乙酸)减少拖尾。随着柱相的改进和选择更好的离子配对试剂，离子配对色谱不仅使色谱峰更尖锐，而且还调节反相柱上离子代谢物的保留。通常离子配对试剂包括四烷基铵离子和全氟化的有机酸。离子配对试剂的类型、离子配对试剂的浓度、流动相中有机改性剂的类型、有机改性剂的浓度(梯度)以及合适的柱选择都对成功的离子配对色谱实验至关重要。在优选的实施方案中，使用离子配对色谱。
根据第五个实施方案，本发明的新生儿筛查试剂盒和方法还可扩展至包括对与严重疾病相关的变体蛋白质和多肽的检测。例如，已知血红蛋白的多肽亚基的许多变体或突变体形式会导致多种形式的贫血，而且许多这样的突变只涉及一个氨基酸。
优选的试剂盒和方法会以经特定选择的电离物质为目标。试剂盒和方法不仅可有利地用于检测包含与标准不同的氨基酸的变体(如在下文所述的许多可能的已知的血红蛋白病中)，还可有利地用于检测多肽的糖基化形式中的变异、以及所预期的多肽序列中的一个或多个氨基酸残基的缺失和/或增加。
根据所述第五个实施方案，试剂盒和方法特别可用于通过质谱测试样品，其中电离技术产生多重荷电光谱，以进一步检测(a)已知多肽或多肽衍生物的存在与否，或(b)已知多肽或多肽衍生物的变体的存在与否，其中对样品的扫描靶向于具有已知质荷比的所选择的电离物质，质荷比的预期值的缺失指示已知多肽或其衍生物的缺失，或变体多肽或其衍生物的存在是由质荷比相对预期值的改变来指示。因此，所述方法允许在限制的质荷范围(质量窗)上集中采集数据，以包括正常多肽和一种或多种目标变体多肽。以这种方式靶向是更加可重复的，并显示对应于正常质荷比的峰，以及从患者(在这方面为纯合子或杂合子)获得的样品中存在的因变异导致的相对于正常的改变。因此，所述方法可通常仅需要一个待靶向的限制的质量窗。也可能将单独的窗用于正常多肽和用于变体多肽。可使用额外的质量窗用于靶向其他变体或其他多肽。
根据本发明的方法，电离技术用于产生多重荷电光谱，以检测(a)已知多肽或多肽衍生物的存在与否，或(b)已知多肽或多肽衍生物的变体的存在与否，其中对样品的扫描靶向于具有已知质荷比的所选择的电离物质，质荷比的预期值的缺失指示已知多肽或其衍生物的缺失，或变体多肽或其衍生物的存在是由质荷比相对预期值的改变来指示。
因此，本发明的本实施方案的试剂盒和方法可用于检测任何蛋白质变异，例如蛋白质突变或野生型蛋白质的异常浓度。因此，任何导致产生变体蛋白质的遗传性疾病都可用本实施方案的试剂盒和方法来检测。优选地，检测血红蛋白变异、白蛋白、肌红蛋白(myoblobin)、细胞色素以及多种先天性疾病(例如糖基化障碍)有关的变体蛋白。
本发明的优选试剂盒和方法用于检测临床上重要的血红蛋白变体，例如Hb S、HbC、HbDPunjab、HbOArab、HbLepore、Hb E、δβ地中海贫血、遗传性持续性胎儿血红蛋白症(HPFH)和阿尔法零型地中海贫血症。进一步优选的是，本发明的方法用于检测以下临床上重要的血红蛋白变体：S、C、E、DPunjab和Oarab。待检测的蛋白质变体可以是任何蛋白质，包括糖蛋白。特别地，指示代谢障碍的特定糖蛋白可使用本发明的方法来检测。
血红蛋白变体分析可与对上述代谢物(即来自如干血斑点的相同样品或来自如大量不同干血斑点的不同样品的谷氨酰胺以其他氨基酸、肉碱、酰基肉碱、SUAC、ASA)的分析同时或相继进行。
本发明另一实施方案的方法或试剂盒可进一步包括步骤(v)测定样品中多肽的酶活性、和/或步骤(vi)测定所述多肽的氨基酸组成。测定酶活性的步骤可包括(a)将用于所述酶活性的底物加入所述样品中，及(b)分析样品中所述底物的存在与否和/或所述酶活性在所述底物上导致的产物的存在与否。测定氨基酸组成的步骤可包括(i)加入肽链内切酶如胰蛋白酶(ii)在肽链内切酶处理后分析所述样品中的多肽，及(iii)推知所述多肽的氨基酸组成。
实施例
实施例1：谷氨酰胺、赖氨酸、精氨琥珀酸和乳清酸水平的确定
为确定对谷氨酰胺、赖氨酸、精氨琥珀酸和乳清酸的测量的线性度，制备最多20mM的各分析物的标准溶液，并将10μL注入串联质谱仪中，测量各离子/转换(图6-8)。
实施例2：干血样品中谷氨酰胺和赖氨酸水平的确定
为确定对干血斑点(DBS)中赖氨酸和谷氨酰胺的总和的测量的线性度，在健康供体的血液中加入赖氨酸。使用离子交换色谱通过标准氨基酸确定等份试样中确定赖氨酸和谷氨酰胺的内源性浓度(图9)。
实施例3：干血样品中谷氨酰胺和赖氨酸的总和的确定
图10显示对谷氨酰胺和赖氨酸的总和的测量的推荐结果。对于赖氨酸和谷氨酰胺，将赖氨酸和甘氨酸的参考范围绘图，联通所计算的这2种参考范围(较低参考之和-较高参考范围之和)，180份健康新生儿的DBS的测量值，患有经证明的OTC缺乏症的患者的2份样品的测量值，患有尿素循环缺陷(UCD)的患者的预期范围。
Claims (16)
1.一种通过串联质谱法在从受试者获得的样品中检测一种或多种代谢物的存在和/或测量其水平的方法，所述代谢物至少包括谷氨酰胺，并且所述方法包括以下步骤：
(i)使用提取液从所述样品中提取所述代谢物；
(ii)在步骤(i)之前或之后，提供包含已知量的一种或多种稳定同位素标记的内部标准品的溶液，所述内部标准品对应于样品中待检测的所述代谢物；
(iii)使所述代谢物和所述一种或多种稳定同位素标记的内部标准品离子化以产生离子；
(iv)在多反应监测(MRM)模式下在质谱图中获得所述一种或多种离子的质荷比(m/z)；以及
(v)在MRM模式下确定谷氨酰胺和赖氨酸的总和，
(vi)使用对应于赖氨酸的稳定同位素标记的内部标准品，检测和定量谷氨酰胺的量。
2.根据权利要求1的方法，所述方法用于体外诊断选自尿素循环障碍和/或高氨血症、高鸟氨酸血症-高氨血症-高瓜氨酸尿症(HHH)和/或精氨琥珀酸尿症的一种或多种代谢缺陷，所述方法还包括步骤(vii)，其中与谷氨酰胺的生理水平相比检测到步骤(vi)中获得的谷氨酰胺水平升高。
3.根据权利要求1或2的方法，其中在所述样品中进一步检测和定量选自氨基酸、有机酸、酰基肉碱、多种肉碱和/或琥珀酰丙酮的一种或多种代谢物，其中所述方法还包括步骤(v)以通过分析步骤(iv)中获得的MRM质谱图确定所述一种或多种代谢物的存在和/或量。
4.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述氨基酸包括天冬氨酸、丝氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、亮氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、鸟氨酸、精氨酸、丙氨酸、N-乙酰谷氨酸、甘氨酸、精氨琥珀酸和/或氧代脯氨酸，并且/或者其中所述有机酸包括乳清酸，或所述酰基肉碱或多种肉碱包括游离肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、丁酰肉碱、异戊酰肉碱、戊二酰肉碱、己酰肉碱、辛酰肉碱、癸酰肉碱、十二酰肉碱、十四酰肉碱、十六酰肉碱和/或硬脂酰肉碱。
5.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述一种或多种稳定同位素标记的内部标准品是干燥的和/或至少包括赖氨酸的稳定同位素标记的内部标准品，并且还包括对应于以下的一种或多种稳定同位素标记的内部标准品：丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、丝氨酸、氧代脯氨酸、脯氨酸、精氨琥珀酸、琥珀酰丙酮、乳清酸、游离肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、丁酰肉碱、异戊酰肉碱、戊二酰肉碱、己酰肉碱、辛酰肉碱、癸酰肉碱、十二酰肉碱、十四酰肉碱、十六酰肉碱和/或硬脂酰肉碱。
6.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述样品是体液样品，优选血液样品，更优选干燥的血液样品，和/或其中所述受试者是疑似患有代谢障碍的受试者，例如新生儿、婴儿或儿童，优选新生儿。
7.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述离子化步骤(iii)是通过将所述提取的代谢物和标准品通过液相色谱系统输送至质谱仪的离子源而进行，和/或其中所述数据获得步骤(iv)是使用三级四极质谱仪或高分辨率质谱仪进行，和/或其中所述步骤(v)是通过选择至少一种精确的质荷比(m/z)离子而进行，所述精确的质荷比离子对应于所述样品中存在的所述一种或多种代谢物的至少一种计算的质荷比(m/z)。
8.根据前述权利要求任一项的方法，还包括同时或依次进行多肽分析，所述多肽包括选自以下的多肽：血红蛋白、血红蛋白变体、白蛋白、肌红蛋白、细胞色素、细菌酶、抗原性的肽决定簇、糖蛋白和与多种先天性障碍相关的变体蛋白，其中所述方法还包括步骤(v)测定所述样品中所述多肽的酶活性，和/或(vi)测定所述多肽的氨基酸组成。
9.一种新生儿筛查试剂盒，其用于根据权利要求1-11任一项的方法通过串联质谱法在新生儿的血液样品中检测谷氨酰胺的存在和/或测量谷氨酰胺的水平，所述试剂盒包括内部标准溶液，其包含至少一种对应于赖氨酸的稳定同位素标记的内部标准品。
10.权利要求12的新生儿筛查试剂盒，其用于体外诊断选自尿素循环障碍和/或高氨血症、高鸟氨酸血症-高氨血症-高瓜氨酸尿症(HHH)和/或精氨琥珀酸尿症的一种或多种代谢缺陷。
11.权利要求12或13的新生儿筛查试剂盒，其中所述内部标准溶液还包括对应于一种或多种代谢物的一种或多种稳定同位素标记的内部标准品，所述一种或多种代谢物选自氨基酸、有机酸、酰基肉碱、多种肉碱和/或琥珀酰丙酮，并且其中所述标准品任选地为干燥的。
12.根据权利要求12至14任一项的新生儿筛查试剂盒，其中所述内部标准溶液还包括对应于以下的一种或多种稳定同位素标记的内部标准品：丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、甘氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、丝氨酸、氧代脯氨酸、脯氨酸、谷氨酸、精氨琥珀酸、琥珀酰丙酮、乳清酸、游离肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、丁酰肉碱、异戊酰肉碱、戊二酰肉碱、己酰肉碱、辛酰肉碱、癸酰肉碱、十二酰肉碱、十四酰肉碱、十六酰肉碱和/或硬脂酰肉碱，其中所述试剂盒允许在所述新生儿中诊断选自尿素循环障碍和/或高氨血症、高鸟氨酸血症-高氨血症-高瓜氨酸尿症(HHH)和/或精氨琥珀酸尿症的一种或多种代谢缺陷，以及选自氨基酸障碍、脂肪酸氧化(FAO)障碍和有机酸尿症(OA)的其他新生儿代谢障碍。
13.根据权利要求12至15任一项的新生儿筛查试剂盒，其中所述内部标准溶液至少包括13C6-15N2-赖氨酸，还包括选自以下的一种或多种标准品：2H4-丙氨酸、2H2-瓜氨酸、15N-13C-甘氨酸、2H3-亮氨酸、2H3-甲硫氨酸、2H6-鸟氨酸、13C6-苯丙氨酸、2H8-缬氨酸、2H3-天冬氨酸、2H3-谷氨酸、13C3-丝氨酸、13C6-酪氨酸、2H5-脯氨酸、13C5-琥珀酰丙酮、15N4-13C6–精氨琥珀酸、2H9-肉碱、2H3-乙酰肉碱、2H3-丙酰肉碱、2H3-丁酰肉碱、2H9-异戊酰肉碱、2H3-戊二酰肉碱、2H3-己酰肉碱、2H3-辛酰肉碱、2H3-癸酰肉碱、2H3-十二酰肉碱、2H9-十四酰肉碱、2H3-十六酰肉碱和/或2H3-硬脂酰肉碱，其中所述标准品任选地为干燥的。
14.根据权利要求12至16任一项的新生儿筛查试剂盒，其中所述样品是体液样品，优选地为血液样品，更优选地为干燥的血液样品，和/或其中所述新生儿疑似患有代谢障碍。
15.一种内部标准溶液，其至少包括赖氨酸的稳定同位素标记的内部标准品，还包括对应于以下的一种或多种稳定同位素标记的内部标准品：丙氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、甘氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、鸟氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、丝氨酸、氧代脯氨酸、脯氨酸、精氨琥珀酸、琥珀酰丙酮、乳清酸、游离肉碱、乙酰肉碱、丙酰肉碱、丁酰肉碱、异戊酰肉碱、戊二酰肉碱、己酰肉碱、辛酰肉碱、癸酰肉碱、十二酰肉碱、十四酰肉碱、十六酰肉碱和/或硬脂酰肉碱，其中所述标准品任选地为干燥的。
16.权利要求26的内部标准溶液，其至少包括13C6-15N2-赖氨酸，还包括选自以下的一种或多种标准品：2H4-丙氨酸、2H2-瓜氨酸、15N-13C-甘氨酸、2H3-亮氨酸、2H3-甲硫氨酸、2H6-鸟氨酸、13C6-苯丙氨酸、2H8-缬氨酸、2H3-天冬氨酸、2H3-谷氨酸、13C3-丝氨酸、13C6-酪氨酸、2H5-脯氨酸、13C5-琥珀酰丙酮、15N4-13C6-精氨琥珀酸、2H9-肉碱、2H3-乙酰肉碱、2H3-丙酰肉碱、2H3-丁酰肉碱、2H9-异戊酰肉碱、2H3-戊二酰肉碱、2H3-己酰肉碱、2H3-辛酰肉碱、2H3-癸酰肉碱、2H3-十二酰肉碱、2H9-十四酰肉碱、2H3-十六酰肉碱和/或2H3-硬脂酰肉碱，其中所述标准品任选地为干燥的。
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