PT1587406E - Quantificação dos níveis de carnitina em pacientes submetidos a diálise - Google Patents

Description

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Descrição "Quantificação dos níveis de carnitina em pacientes submetidos a diálise"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a métodos de quantificação do nível de deficiência de carnitina em pacientes, de forma que as concentrações de carnitina possam ser fácil e rigorosamente detectadas num determinado paciente ao longo do tempo. Especificamente, a presente invenção descreve métodos de quantificação das concentrações de carnitina e do nível de deficiência de carnitina em pacientes que estão a ser submetidos a procedimentos de diálise.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A carnitina é uma substância que ocorre de forma natural no corpo humano, necessária para o metabolismo a nível celular. Foi demonstrado que a carnitina desempenha um papel no transporte de ácidos gordos para a mitocôndria, para ajudar na produção da energia e na remoção de resíduos tóxicos das células. Estudos indicam que mais de 70% da carnitina presente no plasma de um paciente de hemodiálise -Ι ό. removida durante uma só sessão de diálise. Pensa-se que esta elevada percentagem de perda de carnitina por parte de um paciente durante uma sessão de hemodiálise se deve ao peso molecular relativamente reduzido do composto, elevada solubilidade em água e fraca ligação a proteínas. Crê-se que os níveis de carnitina são ainda mais diminuídos nos pacientes com doença renal em fase terminal ("ESRD") devido à reduzida síntese renal e à reduzida ingestão de carne e lacticínios. Assim, os níveis de carnitina dos pacientes de diálise e em especial dos pacientes com doença renal em fase terminal submetidos a diálise, geralmente diminuem gradualmente ao longo do tempo. A depleção dos níveis de carnitina nos tecidos é uma consequência visível a longo prazo das perdas repetidas de carnitina do plasma. Assim, a depleção da carnitina nos tecidos é observada nos tecidos dos pacientes submetidos a sucessivas sessões de diálise por um período de tempo prolongado. A depleção da carnitina nos tecidos é indesejável porque é assumida como possível factor causal de várias complicações de saúde associadas à diálise, incluindo a cardiomiopatia, arritmias, fraqueza muscular e fadiga generalizada.

Conforme descrito nas patentes de invenção norte-americanas n.os 6335369 e 6429230 de Cavazza (adiante designadas por "patentes de invenção de Cavazza"), a administração de levocarnitina (ou L-carnitina) pode ser beneficamente -3- utilizada para tratar a deficiência de carnitina em pacientes com doença renal em fase terminal (também conhecidos por "pacientes urémicos crónicos") submetidos a diálise frequente. De acordo com as patentes de invenção de Cavazza, os pacientes submetidos a diálise periódica podem receber levocarnitina ou um dos seus sais para prevenir ou tratar a deficiência da carnitina. Crê-se que tal é alcançável, entre outras coisas, através da administração intravenosa de uma dose eficaz de L-carnitina por retorno venoso após cada uma das sessões de diálise a que se submeta o paciente com ESRD. As patentes de invenção de Cavazza descrevem que tal terapia de injecções de L-carnitina para tratar a deficiência de carnitina pode ser iniciada por pacientes que apresentem concentrações pré-diálise de carnitina no plasma abaixo do normal (os níveis normais de concentração de carnitina situam-se entre os 40-50 pmol/l). Crê-se que tal administração intravenosa de L-carnitina a pacientes com ESRD submetidos a tratamentos de diálise resulta em concentrações mais elevadas de carnitina no plasma. Além disso, a deficiência de carnitina em pacientes com ESRD submetidos a diálise pode ser prevenida através da administração intravenosa de levocarnitina incitada por níveis de concentração de carnitina no plasma que se encaminham para a deficiência de carnitina. Os métodos para a prevenção do tratamento da deficiência de carnitina, conforme descritos nas patentes de invenção de -4-

Cavazza, possibilitam a correcção da perda de carnitina no plasma que, caso contrário, ocorreria durante as sessões de diálise.

Para gerir a libertação terapêutica de L-carnitina em pacientes submetidos a diálise, seria benéfico aos médicos especialistas disporem de um método rigoroso e fiável, e ao mesmo tempo rápido e rentável, para monitorizar o nivel de carnitina no plasma em pacientes antes de uma sessão de diálise, após uma sessão de diálise e/ou durante uma sessão de diálise. As técnicas actuais disponíveis para a medição dos níveis de carnitina no plasma de um paciente incluem os ensaios enzimáticos, cromatografia líquida de alta resolução ("HPLC") e espectrometria de massa tandem ("MS/MS"). No entanto, estas técnicas para a quantificação dos níveis de carnitina no plasma geralmente não proporcionam uma elevada produtividade e rentabilidade, e uma análise rigorosa e de elevada sensibilidade necessária para a implementação num regime a larga escala, para gerir as terapias de substituição de levocarnitina para pacientes submetidos a diálise.

Cada uma das técnicas actuais para a medição dos níveis de carnitina no plasma de um paciente apresenta diferentes desvantagens. Os ensaios enzimáticos são altamente sensíveis, mas também são extremamente morosos e, por isso, não são prontamente adaptáveis a uma utilização em larga escala por clínicas de diálise. Além disso, os ensaios -5- enzimáticos apenas podem proporcionar uma quantificação dos níveis de carnitina livre (L-carnitina) e de carnitina total numa amostra de plasma e não proporcionam resultados relativos às acilcarnitinas individuais, como as carnitinas de cadeia longa, que são marcadores úteis do estatuto metabólico dos pacientes com ESRD submetidos a diálise para posterior selecção das terapias adequadas. Além disso, a determinação dos níveis de carnitina total através de ensaios enzimáticos tem de ser realizada separadamente da determinação dos níveis de carnitina livre devido ao recurso obrigatório à hidrólise química antes da quantificação.

Comprovou-se que os métodos de HPLC que envolvem determinada derivatização pré-coluna e detecção de fluorescência podem ser suficientemente sensíveis para permitir a determinação dos níveis de várias acilcarnitinas individuais. No entanto, os métodos de HPLC mantêm-se dispendiosos e morosos, em grande parte devido à preparação da amostra, que exige inúmeros e elaborados procedimentos. Além disso, a determinação dos níveis de acilcarnitina de cadeia longa e muito longa não pode ser realizada por HPLC. Este método é prejudicado pelo facto de a quantificação dos níveis de carnitina total exigir uma análise separada, incluindo a hidrólise química da amostra.

Em especial, o ensaio por HPLC e os ensaios enzimáticos que podem ser usados na determinação rigorosa e fiável dos -6- níveis de carnitina exigem amostras biológicas previamente congeladas durante o armazenamento e envio para recolha. Compreensivelmente, este factor inviabiliza a utilização laboratorial remota destes procedimentos.

No que respeita à quantificação dos níveis de carnitina por MS/MS, o método de MS/MS de ionização por electrospray tem sido usado para identificar perfis anómalos de carnitina em amostras de sangue de crianças. Em particular, a patente de invenção norte-americana n.° 6268605 (correspondendo à patente de invenção WO 02/04945) de Chace ("a patente de invenção '605") descreve um método de despistagem genética de crianças usando a espectrometria de massa tandem ("MS/MS") . De acordo com a patente de invenção '605, o sangue é recolhido de um paciente em idade infantil e colocado em pequenas quantidade num pedaço de papel de filtro, onde é seco, e posteriormente é enviado para o laboratório. 0 sangue é, depois, reconstituído no laboratório e analisado por um espectrómetro de massa de ionização por electrospray com um padrão interno, para identificar perfis metabólicos potencialmente anormais de aminoácidos e acilcarnitinas. Ao recolher amostras de sangue secas em filtra de papel, o método descrito na patente de invenção '605 permite uma transferência económica e não refrigerada das amostras de sangue do médico para um laboratório remoto para posterior análise. Por sua vez, este facto permite a utilização de um -7- espectrómetro de massa situado num local distante na análise de um grande volume de amostras, o que constitui uma vantagem em termos de economia a larga escala.

Embora o método de MS/MS de ionização por electrospray de amostras de sangue secas, conforme descrito na patente de invenção '605, seja um mecanismo fiável, económico e de elevado rendimento para a identificação de perfis metabólicos anómalos de acilcarnitinas em crianças, não é uma solução adequada para a obtenção de uma quantificação rigorosa dos níveis de carnitina no plasma de pacientes com deficiência de carnitina derivada de vários motivos. Em primeiro lugar, o sangue pode ser um fraco indicador dos níveis de carnitina nos tecidos, pois a concentração intracelular de L-carnitina nos glóbulos vermelhos não se equilibra com a concentração no plasma (já que as membranas dos eritrócitos são impermeáveis à L-carnitina). Apenas a carnitina presente no plasma de um paciente pode ser dialisado durante uma determinada sessão de diálise, enquanto que a concentração de carnitina no interior dos glóbulos vermelhos não é directamente afectada pela diálise. Além disso, já que os glóbulos vermelhos não possuem mitocôndria, a carnitina não pode ser utilizada para a oxidação dos ácidos gordos de cadeia longa. Assim, a concentração intracelular da carnitina presente nos glóbulos vermelhos pode, na verdade, alterar quaisquer análises relativas à deficiência de carnitina. A preparação -8- de amostras de sangue secas para introdução no espectrómetro de massa conforme descrita na patente de invenção '606 necessariamente libertaria uma grande quantidade de carnitina dos glóbulos vermelhos e, consequentemente, amplificaria os níveis de carnitina livre e total.

Além disso, os passos de derivação utilizados durante a preparação da amostra em muitos métodos de análise MS/MS são conhecidos por provocarem a hidrólise de acilcarnitinas em carnitina livre, conforme descrito por D. W. Johnson in J. Inher. Metab. Dis. 22 (1999), 201-202. Esta hidrólise das acilcarnitinas é clinicamente significativa se o método for utilizado para gerir a terapia de substituição de carnitina em pacientes submetidos a diálise. Soluções anteriores para este problema envolvem a realização de dois ensaios MS/MS numa determinada amostra, uma vez sem derivatizaçâo para medir os níveis de carnitina livre e uma segunda vez com derivatizaçâo para medir os níveis de carnitina total. No entanto, isto aumenta os custos da análise da amostra e, por isso, perde-se uma das vantagens significativas dos métodos de MS/MS. Além disso, enquanto que a MS/MS pode ser utilizada sem o passo de derivatizaçâo, a remoção deste passo faz com que a sensibilidade do ensaio diminua cerca de dez vezes. Esta visível redução da sensibilidade é problemática na pois é quantificação da deficiência de carnitina, -9- expectável que as amostras analisadas obtidas de pacientes com deficiência de carnitina submetidos a diálise apresentem baixos níveis de carnitina.

Uma outra complicação da adaptação da MS/MS para a quantificação dos níveis de carnitina reside no facto de, aparentemente, o ácido glutâmico interferir na análise das concentrações da acetilcarnitina. A espectrometria de massa tandem é capaz de distinguir iões moleculares com a mesma massa que também possuem diferentes iões produto. No entanto, a espectrometria de massa tandem não consegue distinguir entre massas moleculares com os mesmos iões produto e iões moleculares. 0 éster dibutilo da forma protonada do ácido glutâmico partilha a mesma massa molecular do ião molecular (260 m/z) e a mesma massa molecular do ião produto (86 m/z) que o éster butilo da acetilcarnitina. Já que o ácido glutâmico em concentrações fisiológicas é muito mais abundante do que a acetilcarnitina, a forma protonada do ácido glutâmico pode estar presente em quantidades suficientes para interferirem no sinal da MS/MS a 260 m/z, associado à detecção da acetilcarnitina. Assim sendo, qualquer utilização de MS/MS para análise das concentrações de carnitina deverá ser tida em conta no que diz respeito a este problema.

Assim, mantém-se uma necessidade no que respeita a um método optimizado de diagnóstico da deficiência de carnitina em pacientes e de quantificação do nivel desta -10- mesma deficiência, de forma que as concentrações de carnitina possam ser fácil e rigorosamente detectados num determinado paciente ao longo de um determinado período de tempo. Também se mantém uma necessidade relativamente a um método de elevada produtividade, rentabilidade e precisão para a quantificação do nível de deficiência de carnitina num paciente, de forma a que tal método possa ser usado de forma regular para monitorizar o nível de deficiência de carnitina e gerir as terapias adequadas para a tratar. D. Constantin-Teodosiu et al., in Kidney International, vol. 49 (1996), pp. 158-162, relatam um estudo direccionado à avaliação do estatuto da carnitina plasmática em pacientes submetidos a diálise peritoneal contínua ambulatória (CAPD) e à quantificação da perda diária de carnitina neste grupo de pacientes comparativamente a indivíduos de controlo saudáveis com as mesmas idades e o mesmo sexo.

Neste estudo, obteve-se sangue venoso do paciente e misturou-se com heparina de lítio. Após centrifugação, congelou-se instantaneamente o plasma em azoto líquido e armazenou-se a -80°C. Extraíram-se alíquotas das amostras de plasma com clorofórmio/metanol e o resíduo obtido após evaporação foi adicionalmente tratado antes da sua utilização num ensaio enzimático com substrato radioisotópico. Desta forma, determinaram-se os níveis de carnitina total, carnitina livre e acetilcarnitina. Além -11- disso, foram calculadas as concentrações de acilcarnitina de cadeia média e longa a partir destes resultados.

RESUMO DA INVENÇÃO À luz das deficiências supra descritas e presentes nas actuais técnicas de diagnóstico e quantificação da deficiência de carnitina em pacientes submetidos a diálise, constitui um objectivo da presente invenção proporcionar um método fiável e rigoroso para a quantificação dos níveis de carnitina em pacientes submetidos a diálise.

Além disso, constitui um objectivo da presente invenção proporcionar um método para uma quantificação de elevada produtividade, rentabilidade e precisão do nível de deficiência de carnitina em pacientes, de forma a ajudar na gestão das terapias de tratamento dos pacientes de diálise. Adicionalmente, constitui um objectivo da presente invenção proporcionar um método de elevada sensibilidade para a determinação dos níveis de carnitina livre, acilcarnitina e carnitina total em pacientes submetidos a diálise. Tais níveis podem ser utilizados na avaliação da saúde do paciente e para auxiliar no diagnóstico da deficiência de carnitina e na definição de terapias preventivas e/ou terapêuticas.

Estes e outros objectivos são alcançados através dos métodos descritos na presente invenção, que incluem a -12- análise quantitativa da L-carnitina livre, acilcarnitinas e carnitina total de amostras de plasma secas sob papel de filtro através de métodos adequados, como sendo os ensaios enzimáticos, HPLC e MS/MS de ionização por electrospray. Os métodos da presente invenção incluem a recolha, preparação e análise de amostras através de cálculos e comparações quantitativos das mesmas amostras com amostras de calibração e controlo de qualidade preparadas com plasma dialisado.

As amostras de plasma são recolhidas de um paciente submetido a diálise antes, durante e/ou depois de cada uma das sessões de diálise, são colocadas em papel de filtro e secas. As amostras secas são depois enviadas (por exemplo, por correio nocturno) para um laboratório para posterior análise. As amostras secas são, de seguida, preparadas para análise no laboratório através de reconstituição com um padrão interno contendo álcool e, preferivelmente, derivatizaçâo. As amostras preparadas são analisadas para quantificar a carnitina livre e a acilcarnitina e os seus padrões internos nas amostras dos pacientes, nas amostras para obtenção da curva de calibração e nas amostras de controlo de qualidade. Os resultados dos ensaios de quantificação das várias amostras são, depois, analisados informaticamente para quantificar a carnitina livre, a acilcarnitina e a carnitina total nas amostras secas, tendo em conta, entre outros factores, a recolha de várias -13- amostras e possíveis problemas relacionados com a preparação, a hidrólise de acilcarnitinas, a interferência por parte do glutamato e o desempenho do equipamento.

As variantes preferidas da invenção analisam as amostras por MS/MS de electrospray por injecção de fluxo usando uma série de scans SRM e do ião percursor. Preferivelmente, as soluções de metanol que contêm padrões internos de deuterizados carnitina são usadas para extrair as amostras secas de plasma do papel de filtro, sendo o plasma obtido a partir de amostras de pacientes, de amostras para obtenção de curva de calibração ou de amostras de controlo de qualidade. Nas variantes mais preferidas, as amostras de plasma extraídas são, depois, tratadas com secagem por gás e de seguida por esterificação com butanol acidificado, e qualquer hidrólise de acilcarnitinas em carnitina livre é tida em conta nos resultados da MS/MS usando os cálculos adequados descritos.

Outras características e vantagens da invenção serão mencionadas na descrição que se segue, e em parte, serão evidentes a partir da mesma, ou poderão ser compreendidas através da prática da invenção. A invenção será descrita minuciosamente no que diz respeito a determinadas variantes com referência às figuras apresentadas. Estes e outros objectivos e vantagens da invenção serão evidentes a partir das variantes referidas na descrição e nas reivindicações, bem como nas figuras anexas. A descrição minuciosa e as -14- figuras que se seguem deverão ser entendidas como meramente ilustrativas de determinadas aplicações dos conceitos inventivos e não deverão ser vistos como limitativos da mesma invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIG. 1 é um diagrama de blocos simplificado que apresenta o método geral de acordo com as variantes preferidas da presente invenção. A FIG. 2 é um diagrama de blocos que apresenta de forma mais minuciosa os passos envolvidos na preparação da amostra.

DESCRIÇÃO DAS VARIANTES PREFERIDAS

Os métodos infra descritos dizem respeito a uma variante preferida e à respectiva implementação, de natureza exemplificativa e especifica. Tal como usual, será óbvio que não existe qualquer limitação ao campo de aplicação da presente invenção. A invenção engloba alterações e modificações às implementações ilustradas dos métodos e demais aplicações dos princípios da invenção em questão, tal como normalmente acontece com os conhecedores da arte. Os métodos da presente invenção envolvem a recolha de amostras de plasma de pacientes, sendo tais amostras - 15- vertidas e secas sob papel de filtro. A invenção utiliza os adequados passos de preparação e análise para produzir dados quantitativos para comparação com dados produzidos de forma semelhante a partir de amostras de calibração e de amostras de controlo de qualidade preparadas a partir de plasma dialisado. A quantificação rigorosa da concentração de carnitina livre, de acilcarnitinas e carnitina total é depois obtida por comparação com uma curva de calibração produzida a partir de dados relativos às amostras para obtenção da curva de calibração.

De acordo com variantes da presente invenção, as amostras de plasma podem ser colhidas de um paciente submetido a diálise antes, durante e/ou após cada sessão de diálise para posterior marcação em papel de filtro para produzir uma amostra seca. 0 papel de filtro usado para conter e transportar as amostras de plasma secas de acordo com a presente invenção pode ser de qualquer tipo, incluindo papel de filtro 903 disponível na Schleicher and Schuell, e preferivelmente em forma rectangular e marcado de forma a poder ser dividido em quatro quadrantes. Desta forma, um só papel de filtro pode ser vantajosamente usado de acordo com a invenção para proporcionar múltiplas amostras de um só paciente, incluindo duas ou mais manchas idênticas de plasma (de forma a reduzir as hipóteses de contaminação ou destruição) ou até quatro amostras diferentes obtidas em diferentes momentos (como antes, durante e depois da -16- diálise) do mesmo paciente. Preferivelmente, o papel de filtro também possui um ou mais círculos impressos no mesmo que servem de alvos para as manchas de plasma, de forma a ajudar o responsável pela recolha no local da diálise na colocação de gotas do plasma no papel de filtro e para ajudar o técnico laboratorial na identificação e recuperação do plasma para posterior análise. As amostras de plasma dos pacientes, logo que suficientemente secas sob a forma de manchas no papel de filtro, podem ser enviadas em envelopes selados (por exemplo, através de correio nocturno) para as instalações distantes de um laboratório para análise, já que se concluiu que as amostras se mantêm estáveis à temperatura ambiente durante cerca de uma semana.

De acordo com a invenção, tais amostras secas de plasma obtidas de pacientes submetidos a diálise podem ser analisadas de acordo com qualquer método de ensaio adequado, incluindo os ensaios enzimáticos, a HPLC e a MS/MS. No entanto, de acordo com variantes preferidas da presente invenção, a análise das amostras de plasma é realizada por MS/MS de ionização por electrospray. Esta técnica é preferível em parte porque permite uma determinação simultânea das concentrações de carnitina livre, das acilcarnitinas e da carnitina total numa só análise. -17-

De acordo com tais variantes preferidas da invenção, uma vez recebidas no laboratório, as amostras secas de plasma são preparadas através da reconstituição com um álcool com padrões internos e posterior derivatização. As amostras preparadas são analisadas de forma a quantificar as concentrações de carnitina livre, das acilcarnitinas e da carnitina total (comparativamente àquelas dos padrões internos) nas amostras dos pacientes, nas amostras para obtenção de curva de calibração e nas amostras de controlo de qualidade em que as amostras para obtenção de curva de calibração e as amostras de controlo de qualidade são preparadas pelo laboratório a partir de plasma dialisado. Os resultados dos ensaios de quantificação das várias amostras são, depois, analisadas por computador para quantificar a carnitina livre, acilcarnitinas e carnitina total nas amostras secas de plasma tendo em conta, entre outros factores, a recolha de várias amostras e possíveis problemas relacionados com a preparação, a hidrólise de acilcarnitinas, a interferência por parte do glutamato e o desempenho do espectrómetro de massa.

Nestas variantes da presente invenção, são preparadas amostras secas para obtenção da curva de calibração com várias composições a partir de plasma dialisado e sal purificado de L-carnitina livre. Cinco amostras para obtenção de curva de calibração adequadas, incluindo L-carnitina livre enriquecida em plasma dialisado a partir de -18- uma solução de metanol:água são enumerados no Quadro 1. Conforme referido no quadro, as amostras para obtenção de curva de calibração apresentam uma concentração de carnitina livre conhecida que corresponde à solução-mãe para obtenção de curva de calibração da carnitina livre usada para preparar a marcação de plasma.

Quadro 1

Solução usada para a obtenção Concentração de carnitina de curva de calibração da livre em amostras de marcação carnitina livre em plasma (FCxxxx) de plasma (μΜ) FC4000 40 FC2000 20 FC1000 10 FC500 5 FC0000 0 Para preparar as soluções para obtenção da curva de calibração ("FCxxxx") supra indicadas, pode usar-se o seguinte procedimento. Dilui-se uma quantidade adequada de sal interno de L-carnitina livre numa solução de metanol-água para HPLC, para produzir uma solução concentrada para obtenção de curva de calibração de carnitina livre reconstituída. A concentração desta solução concentrada para obtenção da curva de calibração deverá ser de 6,203

Mm. De seguida, prepara-se uma primeira solução-mãe da -19- curva de calibração, FC4000, diluindo 1074 μΐ da solução concentrada para obtenção de curva de calibração com S926 μΐ da solução para HPLC de 50:50 metanol-água. A concentração da L-carnitina livre na solução FC4000 deverá ser de 1933 nmol/μΐ. De seguida, prepara-se a solução-mãe para obtenção da curva de calibração F2000, diluindo 2 ml de FC4000 com 2 ml da solução para HPLC de metanol-água. De seguida, são usadas diluições subsequentes sequenciais 1:1 em solução 50:50 para HPLC de metanol-água, para preparar as soluções-mãe FC1000 e FC0500 para obtenção da curva de calibração. A solução 60:50 para HPLC de metanol-água é usada como solução-padrão FC0000 para obtenção de curva de calibração.

Para preparar as amostras de plasma para obtenção da curva de calibração, conforme descrito no Quadro 1, combinou-se 1 ml de plasma dialisado com 30 μΐ de cada solução-mãe FCxxxx para produzir as concentrações de carnitina livre indicadas. Para preparar as amostras secas, colocou-se 25 μΐ destas soluções de plasma no mesmo tipo de papel de filtro usado para recolher as amostras de plasma dos pacientes e permitiu-se que secassem à temperatura ambiente (geralmente pelo menos 2 horas e meia). Estas amostras secas para obtenção da curva de calibração apresentam aproximadamente a mesma estabilidade que as amostras de plasma dos pacientes, e podem ser preservadas para -20- posterior utilização (até cerca de 3 meses), armazenando-se as amostras secas a -20°C.

Além disso, nestas variantes da presente invenção, são preparadas amostras secas de controlo de qualidade com várias composições conhecidas a partir de plasma dialisado e sal interno purificado de L-carnitina livre e cloridrato de acetilcarnitina. Tal como acontece com a preparação das amostras de plasma para obtenção da curva de calibração supra descrita, a preparação das amostras de plasma para controlo de qualidade, de acordo com as variantes da presente invenção, inclui a preparação de várias soluções para controlo de qualidade contendo carnitina para mistura com plasma dializado. Em variantes preferidas, estas soluções para controlo de qualidade, com uma solução a 50:50 de metanol-água como solvente, incluem uma solução-mãe de carnitina livre ("FC-S"), uma solução de trabalho de carnitina livre ("FC-W"), uma solução-mãe de acetilcarnitina ("C2-S") e uma solução de trabalho de acetilcarnitina ("C2-W"). A solução FC-S é preparada de forma a apresentar uma concentração de carnitina de 2 nmol/μΐ, e a solução FC-W é preparada a partir desta através de diluição, apresentando uma concentração de carnitina de 0,5 nmol/μΐ. Da mesma forma, a solução C2-S é preparada de forma a apresentar uma concentração de carnitina de 4 nmol/μΐ e a solução C2-W é preparada a -21- partir da mesma através de diluição, para apresentar uma concentração de 1 nmol/μΐ.

Logo que forem preparadas as necessárias soluções para controlo de qualidade, podem preparar-se várias soluções de plasma para controlo de qualidade (QCyyyy), combinando 5 ml de plasma dialisado com combinações das soluções para controlo de qualidade e uma solução pura para HPLC de metanol:água, conforme indicado no Quadro 2.

Quadro 2

Amostra de plasma (QCyyyy) Volume de FC-S adicionado (ml) Volume de FC-W adicionado (ml) Volume de C2-S adicionado (ml) Volume de C2-W adicionado (ml) Volume de 50:50 água:MeOH adicionado (ml) QC0000 0 0 0 0 2 QC0010 0 0 0 1 1 QC0040 0 0 1 0 1 QC0600 0 1 0 0 1 QC0610 0 1 0 1 0 QC0540 0 1 1 0 0 QC2000 1 0 0 0 1 QC2010 1 0 0 1 0 QC2040 1 0 1 0 0 A titulo explicativo, pode concluir-se a partir do Quadro 2 que a solução de plasma para controlo de qualidade QC0510 é -22- preparada através da mistura de 1 ml de FC-W com 5 ml de plasma dialisado, e que a solução de plasma para controlo de qualidade QC0040 é preparada da mesma forma, misturando 1 ml de C2-S e 1 ml de solução a 50:50 para HPLC de metanol:água com 5 ml de plasma dialisado Seguindo o procedimento indicado no Quadro 2, podem produzir-se nove amostras para controlo de qualidade QCyyyy distintas, com as concentrações ("[FC]") de carnitina livre e as concentrações de acetilcarnitina (" [C2]") indicadas no Quadro 3.

Quadro 3

Plasma (QCyyyy) Plasma [FC] (μΜ) Plasma [C2] (μΜ) QC0000 0 0 QC0010 0 10 QC0040 0 40 QC0600 5 0 QC0610 5 10 QC0540 5 40 QC2000 20 0 QC2010 20 10 QC2040 20 40

Tal como acontece com as amostras de plasma para obtenção da curva de calibração, as amostras secas para controlo de qualidade são preparadas por marcação de 26 μΐ das soluções de plasma para controlo de qualidade no mesmo tipo de papel -23- de filtro usado para recolher as amostras de plasma do paciente e permitiu-se que sequem (novamente, durante pelo menos 2 horas e meia à temperatura ambiente). Estas amostras secas de plasma para controlo de qualidade também apresentam aproximadamente a mesma estabilidade que as amostras de plasma dos pacientes, e podem ser preservadas para posterior utilização (até cerca de 3 meses) através de armazenamento a -20"C.

No que respeita à FIG. 1, apresenta-se uma perspectiva geral de um método de acordo com variantes preferidas da presente invenção para quantificação dos níveis de concentração de carnitina que pode ser utilizado num cenário de diagnóstico clínico, para o diagnóstico do nível de deficiência da carnitina em pacientes submetidos a diálise. O método envolve quatro passos essenciais que, juntos, proporcionam uma análise rápida, automática e rigorosa das amostras. A preparação eficaz de amostras 10 das amostras secas de plasma (as amostras de plasma dos pacientes, amostras para obtenção da curva de calibraçâo e amostras para controlo de qualidade são preparadas para análise de forma idêntica) é necessária para assegurar uma derivatização rigorosa da carnitina das amostras e uma hidrólise regular e quantificável das acetilcarnitinas em carnitina livre. Os padrões internos marcados são combinados com as amostras dos pacientes durante a sua preparação para proporcionar uma referência para a -24- quantificação. Após a preparação (10) das amostras, estas são injectadas (12) no espectrómetro de massa tandem com ionização por electrospray. Como é conhecido na arte, um espectrómetro de massa tandem com ionização por electrospray pode ser vantajosamente adaptado de forma a implementar vários procedimentos automáticos de tratamento das amostras, para assegurar a velocidade e consistência da análise das amostras. De seguida, são obtidos dados na MS/MS das amostras dos pacientes e das amostras para obtenção da curva de calibração, posteriormente processados de forma a quantificar os niveis de carnitina em todas as amostras de plasma dos pacientes constantes no passo 14. Neste passo, os valores produzidos na análise do espectrómetro de massa são, preferivelmente, processados e impressos numa folha de cálculo para permitir a verificação dos cálculos, uma forma de assegurar uma obtenção de valores rigorosos e de qualidade. Além disso, todos os dados relativos aos espectros são rigorosos, graças ao recurso a verificações de diagnóstico e às amostras para controlo de qualidade, conforme descrito no passo 16. Para assegurar um grau de rigor e qualidade das amostras, utilizam-se verificações periódicas à integridade do sistema e amostras para controlo de qualidade que incluem determinados aditivos. Combinados, os passos supra referidos maximizam a velocidade e qualidade da análise das amostras de plasma quanto aos niveis de carnitina, -25- resultando num método que é adequado para uma utilização em cenários clínicos. A FIG. 2 apresenta uma perspectiva geral do procedimento de preparação das amostras (passo 10 da FIG. 1) usado nas variantes preferidas da presente invenção. É realizado um registo inicial da amostra, codificando cada uma das amostras e, consequentemente, associando a amostra a uma determinada localização num poço de microtitulação numa placa de microtitulação. As amostras consistem de marcações de plasma colocadas nas áreas designadas do papel de filtro. Após a punção (22) de cada marcação, como sendo em forma de discos com uma punção automática (tais discos apresentam tipicamente um diâmetro entre 0,5 cm e 0,3 cm, e preferivelmente de 0,5 cm), esta é colocada no poço de microtitulação designado de uma placa de microtitulação de fundo plano. Os preparados de padrões internos, preparados com metanol e um outro álcool adequado que serve como solvente de extracçâo, são adicionados (24) à marcação seca de plasma recortada por punção a cada um dos poços. Tais adições (24) são preferivelmente realizadas usando um equipamento de tratamento automático de amostras. O metanol, ou outro álcool adequado utilizado nos preparados dos padrões internos serve como solvente de extracçâo, enquanto que os padrões internos servem para quantificar a carnitina livre e as acilcarnitinas na matriz de plasma seco de cada uma das amostras. Em variantes da -26- invenção, os preparados dos padrões internos são adaptados de forma a incluir uma mistura ideal de padrões de acilcarnitina/carnitina marcada com deutério diluídos num solvente de extracção. Será evidente para os conhecedores da arte que os padrões internos são proporcionados no meio de extracção para que as funções óptimas de análise em modo misto possam maximizar a detecção da carnitina. 0 Quadro 4 apresenta uma lista dos padrões internos de carnitina livre e acilcarnitina usados nas variantes preferidas da invenção. Um solvente de extracção adequado contendo padrões internos pode ser preparado de acordo com o seguinte procedimento. Um conjunto de padrões de L- carnitina e L-acilcarnitina marcados isotopicamente, tais como sendo em forma sólida, podem ser obtidos comercialmente de forma a facilitar a preparação das misturas nas quais as razões estequiométricas da carnitina são conhecidas. De acordo com as variantes preferidas da presente invenção, a L-carnitina e L-acilcarnitinas marcadas incluem a [D9]carnitina, [D3]acetilcarnitina, [D3] propionilcarnitina, [D3]butirilcarnitina, [D9] isovalerilcarnitina, [D3] octanoilcarnitina, [Dg]miristoilcarnitina e [D3]palmitoilcarnitina e estão presentes no padrão interno numa razão molar de 20:5:1:1:1:1:1:2, conforme descrito no Quadro 4. -27-

Quadro 4

Padrões internos marcados de L-carnitina Solução reconstituída por P.I. (pmol/l) Solução-mãe P.I. (pmol/l) Solução de trabalho P.I. (pmol/l) [Dg] carnitina 152,00 19,00 0,127 [D3]acetilcarnitina 38,00 4,75 0,031 [D3]propionilcarnitina 7, 60 0, 96 0,006 [D3]butirilcarnitina 7, 60 0, 95 0,006 [Dg]isovalerilcarnitina 7, 60 0, 95 0,006 [D3]octanoilcarnitina 7, 60 0, 95 0,006 [Dg]miristoilcarnitina 7, 60 0, 96 0,006 [D3]palmitoilcarnitina 15,20 1, 96 0,018

Uma solução de trabalho de padrões internos adequada para analisar os discos individuais de plasma recortados por punção com 0,5 cm, como a solução "Solução de trabalho P.I." do Quadro 4, pode ser preparada de acordo com o seguinte procedimento. As várias L-carnitina e L-acilcarnitinas são reconstituídas em metanol para HPLC (ou outro álcool solvente de extracção adequado) para formar uma solução concentrada reconstituída de padrões internos com as concentrações padrão da solução reconstituída por P. I. do Quadro 4. É, de seguida, preparada uma solução-mãe -28- concentrada com padrão interno ("Solução-mãe P.I." no Quadro 4) diluindo 500 μΐ de solução reconstituída com padrão interno em 3500 μΐ de uma solução para HPLC de 50:50 metanol-água, obtendo-se uma diluição de 1:8 dos padrões internos. Por fim, é preparada uma solução de trabalho de solvente de extracção ("Solução de trabalho P.I.") contendo os padrões internos marcados para utilização na recuperação do plasma das amostras secas, fazendo uma diluição de 1:150 de solução-mãe P.I. em metanol para HPLC. A solução de trabalho P.I. é usada na preparação das amostras de plasma para a espectrometria de massa tandem da forma infra descrita.

As concentrações dos padrões internos na solução de trabalho P.I. podem, obviamente, ser rapidamente ajustadas para analisar duas marcações de plasma seco de 0,5 cm ou de 0,3 cm, uma só marcação de plasma seco de 0,5 cm ou 0,3 cm, etc., ajustando o volume das adições de solvente de extracção às amostras analisadas ou à concentração da solução-mãe P.I. de forma que será óbvia aos especialistas da arte. Assim sendo, a solução de trabalho P.I. serve como solvente de extracção e como meio para padronização interna da análise.

Nestas variantes preferidas da invenção, cada análise de MS/MS inclui uma combinação de amostras de plasma secas para obtenção de curva de calibração e de amostras de plasma secas para controlo de qualidade, juntamente com as -29- amostras dos pacientes cujas concentrações de carnitina se desejem analisar. Por exemplo, as cinco amostras de plasma para obtenção de curvas de calibração (FC400D, FC2000, FC1000, FC0500, FC0000) e duas amostras para controlo de qualidade escolhidas aleatoriamente (tais como QC0000 e QC2040, ou QC2010 e QC0040) podem ser intercaladas com amostras de plasma dos pacientes em cada placa de microtitulação introduzida para análise no espectrómetro de massa com ionização por electrospray. Este procedimento ajuda a estabelecer uma curva de calibração para analisar as amostras de plasma dos pacientes, bem como métodos para ultrapassar as várias inconsistências e erros produzidos pela preparação e análise da MS/MS. Os três tipos de amostras de plasma secas são preparados para análise de acordo o mesmo procedimento indicado na FIG. 2.

De novo fazendo referência à FIG. 2, em variantes preferidas da invenção, as amostras de plasma secas para obtenção da curva de calibração, as amostras de plasma secas para controlo de qualidade e as amostras de plasma secas dos pacientes são puncionados em poços registados de placas de microtitulação com fundo plano, como sendo uma punção DBS Wallac equipada com uma cabeça de 0,5 cm, nos passos 20 e 22. De seguida, no passo 24, uma quantidade adequada, por exemplo 300 μΐ, de uma solução de trabalho contendo padrão interno (por exemplo, Solução de trabalho P.I.) é adicionada a cada amostra da placa. A placa de -30- microtitulação contendo a mistura dos três tipos de amostras é depois agitada num rotador durante aproximadamente 30 minutos para extrair o plasma (25) dos discos com amostras secas de plasma. O extracto de cada amostra é, depois, transferido da placa de microtitulação com fundo plano para uma placa de fundo cónico, por exemplo através de um sistema de tratamento de líquidos Gilson, para permitir um tratamento adicional. O solvente do padrão interno é depois removido (26) através de evaporação, preferivelmente sob corrente de azoto suave usando um evaporador de azoto SPE-Dry. Em variantes da invenção nas quais as amostras são derivatizadas, cada uma das amostras na placa de microtitulação depois é sujeita a esterificação (27). Tal é realizado através da adição de uma quantidade adequada de álcool acidificado, por exemplo, através de uma pipeta Eppendorf. Preferivelmente, o agente de derivatização inclui 50 μΐ de 3 mol/1 de HC1 em n-butanol em cada poço. No passo de esterificação, as amostras da placa de microtitulação são cobertas com septo azul ajustado à dimensão da placa, e posteriormente com uma placa metálica antes da placa ser colocada num forno e aquecida para estimular a derivatização. Preferivelmente, o aquecimento ocorre a aproximadamente 65°C durante cerca de 15 minutos.

Os espécimes derivatizados são imediatamente secos (28) no evaporador de azoto supra referido para remover o agente -31- volátil de derivatização. Depois do passo da secagem para remover o agente de derivatização, as amostras são depois reconstituídas (29) adicionando uma fase móvel, tipicamente cerca de 100 μΐ, através do manipulador de líquidos Gilson. A placa de microtitulação é depois selada com uma placa Micromat transparente antes da análise, de forma a retardar a evaporação da fase móvel.

Conforme descrito, as variantes preferidas da presente invenção utilizam a derivatização das carnitinas nas amostras de plasma de forma a aumentar a sensibilidade do ensaio. Opcionalmente, o passo de derivatização pode ser omitido do ensaio sempre que apropriado, por exemplo, quando são quantificadas concentrações relativamente grandes de carnitina.

Antes da análise da amostra, a optimização dos sistemas de MS/MS é alcançável através de injecção regular de uma solução de ajuste, por exemplo, diariamente. Em variantes preferidas, o limiar de sensibilidade é determinado por scans da [D5]fenilalanina, que deverá apresentar uma sensibilidade de pelo menos 25% com uma intensidade máxima de 5xl06 contagens por segundo ("cps") . O sistema de MS/MS de ionização por electrospray utilizado de acordo com as variantes preferidas é um sistema de baixo fluxo que utiliza uma linha de sílica fundida deslocada para a extremidade do eléctrodo. Sistemas de injecção automáticos usam a linha de sílica fundida para ligar directamente o -32- injector à extremidade do eléctrodo para minimizar o espaço morto. A velocidade de fluxo da fase móvel da MS/MS pode ser definida em cerca de 18,0 μΐ/min. e o volume de injecção pode ser definido em cerca de 15 μΐ para se obterem resultados fiáveis com um ciclo de tempo de cerca de 2 minutos. Os scans implementados para detectar os fragmentos necessários dos iões incluem a SRM positiva e scans percursores positivos. Os parâmetros de instrumentos adequados, que podem ser adaptados para optimização, são apresentados no Quadro 5.

Quadro 5

Parâmetros dos instrumentos de MS/MS Valor sugerido Gás nebulizador ("Neb") 9 Cortina de gás ("Cor") 7 Spray de iões ("IS") (eV) 5100 Gás de colisão ("CAD") 3 Potencial de desagregação ("DP") (eV) 29 Potencial de focagem ("FP") (eV) 120 Potencial de entrada ("EP") (eV) -10 Potencial de saída da célula de 5 colisão ("CPX") (eV)

Além disso, no Quadro 6 é apresentado um exemplo de parâmetros gerais adequados. -33-

Quadro 6

Parâmetro do scan Valor "Peak hopping" Ligado Dimensão dos passos 1,00 amu Defeito da massa 100,00 mmu (por 100 amu)

No Quadro 7 são apresentados exemplos de parâmetros de scan adequados a scans de SRM.

Quadro 7

Massa Q1 (amu) Massa Q3 (amu) Tempo (mseg.) CE (eV) 218,26 103,10 200,00 26,00 221,25 103,10 200,00 26,50 227,25 03,10 200,00 27,50

Da mesma forma, Quadro 8 é apresentado um exemplo de parâmetros de scan adequados específicos para os scans de percursores positivos (para percursores de 86,06 amu).

Quadro 8

Início (amu) Paragem (amu) Tempo (mseg.) Rampa CE (eV) 258,00 486,00 445,00 29,00-59,00

Depois de as análises de MS/MS serem realizadas de acordo com a presente invenção, os dados obtidos deverão ser analisados de forma a calcular as concentrações de carnitina livre, acilcarnitinas e carnitina total presentes -34- nas amostras dos pacientes. Preferivelmente, estes cálculos são realizados de forma automática usando um computador e um software de aquisição de dados de MS/MS e de manipulação de dados comerciais. Um software de aquisição de dados adequado inclui o software Chemoview e proqramas de software Analyst, disponíveis através da empresa Applied Biosystems. Mais especificamente, o software Chemoview permite um cálculo automático das proporções relativas dos analitos (por exemplo, L-carnitina livre) em comparação com o seu padrão interno (ou seja, [D9]L-carnitina) permitindo ao utilizador definir as massas dos analitos e associar ao mesmo massas de padrões internos de interesse e a concentração de padrões internos desejados. 0 software de aquisição de dados também multiplica a razão analito-massa padrão pela concentração do padrão interno, de forma a quantificar a concentração do analito. Infelizmente, a hidrólise das acilcarnitinas em carnitina livre e as quantidades de padrão interno em relação ao analito requer correcções às concentrações do analito fornecidas pelo software de aquisição de dados. Preferivelmente, estas correcções são realizadas pelo software de manipulação de dados (tal como, por exemplo, um programa de cálculo comercial) .

Em primeiro lugar, deverá ser realizada uma correcção pós-aquisição para ajustar as concentrações relativas dos analitos desconhecidos as amostras de plasma analisadas -35- através da estimativa do volume de plasma tipicamente recuperado do disco puncionado (conhecendo-se a quantidade e concentração dos padrões internos). Assumindo que se detectou 25 μΐ de plasma no papel de filtro, a observação empírica conclui que uma marcação de 25 μΐ num adequado papel de filtro produz uma marcação com um diâmetro médio de 13,4 mm, ou um raio equivalente (assumindo uma forma circular) de 6,7 mm. A área de superfície média de uma marcação de plasma de 25 μΐ em papel de filtro seria de cerca de 0,6 cm2 (calculada usando a equação padrão para a área de um círculo). Também se poderia calcular que uma punção com 0,5 cm de diâmetro produziria um disco com uma área de superfície de 0,07 cm2, enquanto que uma punção de 0,3 cm produziria um disco com uma área de superfície de 0,031 cm2. Assim, é óbvio que todas as amostras de plasma marcadas no papel de filtro não serão recuperadas por uma punção de 0,5 cm ou de 0,3 cm. Consequentemente, será reconstituído um menor volume de plasma (e de carnitina nele contida) do que o total de 25 μΐ. Para este factor, pode estimar-se o volume contido numa punção de acordo com a seguinte equação, em que: (eCfUãÇãO i) Vol. 25 μΐ* (B.T&ã.punçào / ã-EGõ-marcação de plasma média) -36-

Assim, nos casos em que é utilizada uma punção de 0,5 cm, pode estimar-se que aproximadamente 3,2 μΐ de plasma está contido num disco puncionado das amostras de plasma secas. Este volume médio de plasma contido num disco puncionado pode, depois, ser usado para se obter um factor de conversão para cada analito, para comparar com as concentrações obtidas através do software de aquisição de dados. De acordo com o procedimento supra descrito, para [D9] L-carnitina são adicionados cerca de 300 μΐ de solução de trabalho P.I. a cada disco puncionado de plasma, o que significa que um total de aproximadamente 38 pmol de [Dg]L-carnitina é misturado com os 3,2 ul de plasma reconstituídos do disco com 0,5 cm. Assim, a concentração de [Dg]L-carnitina no plasma analisado em cada amostra é conhecida por ser de aproximadamente 11,9 pmol/l. Os softwares de aquisição de dados para utilização em espectrómetros de massa tandem geralmente proporcionam concentrações relativas de cada analito no que respeita aos seus padrões internos correspondentes, ou em alternativa, fornecem as concentrações absolutas de referência de cada analito ao assumir uma concentração de referência para o seu padrão interno. O factor de conversão permite, assim, o cálculo de uma rigorosa concentração absoluta para cada analito. Por exemplo, já que o software Chemoview assume uma concentração nominal do padrão interno de 10 mmol/1, o factor de conversão para multiplicar os dados de -37- concentração de L-carnitina é 1,19 (11,9 μιηοΐ/ΐ, real / 10,00 μιηοΐ/ΐ nominal). Concentrações semelhantes são aplicáveis a cada analito para obter factores de conversão idênticos e dados relativos ao padrão interno ajustados ao volume.

Os dados obtidos a partir das amostras para obtenção da curva de calibração são utilizados pelo computador para interpolar os valores de concentração da carnitina das amostras dos pacientes e nas amostras para controlo de qualidade através da construção de curvas de calibração. As curvas de calibração, curvas padrão, produzidas pelo software de aquisição de dados, permite a obtenção de concentrações interpoladas para serem assumidas como concentrações reais por métodos conhecidos na arte.

Estes dados brutos ajustados ao volume (que incluem as concentrações ajustadas ao volume dos analitos da MS/MS) são depois exportados para o software de manipulação de dados, como por exemplo um programa de cálculo, para aplicar as equações ii a v para corrigir a interferência do ácido glutâmico e a hidrólise das acilcarnitinas em carnitina livre.

As análises de MS/MS deverão ter em conta o facto de os espectrómetros de massa não distinguirem prontamente os analitos com as mesmas massas moleculares que tenham também os mesmos iões produto e iões moleculares (tais como os isótopos). Exemplos de tais analitos problemáticos incluem -38- a leucina e a isoleucina. No entanto, sabe-se que se não forem partilhados iões produto, então os iões com a mesma massa molecular não interferem nas análises de MS/MS. Embora o éster butilo do ácido glutâmico e a acetilcarnitina não possuam as mesmas massas moleculares (259 m/z e 260 m/z, respectivamente), a forma protonada do ácido glutâmico partilha a mesma massa do ião molecular da acetilcarnitina (260 m/z). O glutamato apresenta concentrações fisiológicas 10 a 100 vezes superiores àquelas da acetilcarnitina. Assim, o sinal a 260 m/z, usado na detecção da acetilcarnitina, também é afectado pela contribuição do ácido glutâmico. No entanto, a abundância isotópica natural do ácido glutâmico, e particularmente da sua forma protonada, poderia ser usada para estimar qual a contribuição do ácido glutâmico para o sinal de detecção da acetilcarnitina. De acordo com as variantes da invenção, a contribuição do glutamato a 260 é calculada com referência ao sinal em 261, já que 261 é também a abundância isotópica naturas M + 1 da acetilcarnitina (por vezes abreviada para "C2"). É utilizada uma fórmula correctora que, em primeiro lugar, faz uma estimativa da contribuição isotópica a 261 por parte da acetilcarnitina. A diferença entre a contribuição estimada a 261 da acetilcarnitina e os dados brutos reais representa a contribuição do glutamato. Por fim, usando o dipolo de intensidade praticamente idêntica -39- para o glutamato a 260, pode determinar-se a concentração real da acetilcarnitina.

Para se obter uma concentração corrigida da acetilcarnitina que tenha em conta a interferência do ácido glutâmico (ou seja, "C2corrigida") , utiliza-se a equação ii: (e<JU3Ç30 H) C2corrigida C2ale£jida C2glutamato em que C2medida é o valor ajustado ao volume da concentração real da acetilcarnitina proporcionado pelo software de aquisição de dados, e C2glutamato corresponde à contribuição real do glutamato. C2glutamat0 pode ser determinada a partir da seguinte equação iii: (equação iii) C2glutamato = Glutamato26i - C2iso em que glutamato2fn é o valor ajustado ao volume da concentração real do glutamato a 261 proporcionado pelo software de aquisição de dados, e C2iS0 corresponde à concentração estimada de isótopos a 261 da acetilcarnitina. C2iso pode ser estimada a partir da seguinte equação iv: (equação iv) C2iso = 0,14 x 02^^ a 2eo em que o valor do factor 0,14 consiste na contribuição determinada e natural da abundância Μ + 1 da consiste no valor de acetilcarnitina, e C2medida a 260 -40- concentração real ajustado ao voluma da acetilcarnitina a 260 proporcionado pelo software de aquisição de dados.

Para obter os valores correctos da concentração de carnitina livre numa amostra dos pacientes que tenha em conta a hidrólise da acilcarnitina: [eCfUâÇãO v) FCcorrigida ~ FCmedida ~ ^^hidrolisada em que FCmedida consiste no valor da concentração real ajustado ao volume da carnitina livre de uma determinada amostra fornecida pelo software de aquisição de dados, e FC^idroiisada consiste na porção da FCmedida devida à hidrólise das acilcarnitinas em carnitina livre. FCmdroiisada pode ser calculada a partir da seguinte equação:

(equação vi) FChídroiísada = %hidrólise X AC em que a %hidróiise consiste na percentagem de carnitina livre medida que é produzida a partir da hidrólise das acilcarnitinas, e AC consiste no valor de concentração real total ajustado ao volume da acilcarnitina, tendo em conta o valor corrigido da concentração da acetilcarnitina. Como a hidrólise das acilcarnitinas ocorre essencialmente a uma velocidade constante, %hidróiise pode ser calculada a partir das concentrações padrão internas utilizando a seguinte equação víí: -41 -

(equação vii) % hidrólise = [D3]FCí,idrolisada /5,0 M em que [D3] FChidroiisada consiste na concentração de carnitina livre deuterada medida a 221 e o valor 5,0 M representa a concentração de padrão interno de acetilcarnitina deuterada utilizado nas amostras.

Para calcular as concentrações reais da acilcarnitina total ("AC"), é utilizada a equação viii: (equação viii) AC = Σ (C2corrigida C3, C4, C5:l, C5, C40H, C6, C50H, C60H, C8:1, C8 C80H(C3DC), CIO:2, C10:l, CIO, C4DC, C5DC(C10OH), C12:l, C12, C6DC, C120H, C14:2, C14:l, C14, C140H, C16:l, C16, C160H,C18:2, C18:1, C18)

Por fim, a concentração de carnitina total pode ser calculada a partir das concentrações corrigidas da carnitina livre e acilcarnitina de acordo com a equação ix.

(equação ix) TC = FCCOrrigida + AC -42-

As designações dos ésteres butilo de acilcarnitina supra indicadas na equação viii podem ser reconhecidas usando o seguinte Quadro 9 ("*"indica um padrão interno).

Quadro 9

Notação química MS/MS Nome comum Éster butilo -m/z CO (livre) L-carnitina 218 d3-C0 (livre) L-carnitina deuterada 221 d9-C0* (livre) L-carnitina deuterada p.i. 227 C2 Acetil 260 d3-C2* Acetil deuterado p.i. 263 C3 Propionil 274 d3-C3* Propionil deuterado p.i. 277 C4 Butiril 288 d3-C4* Butiril deuterado p.i. 291 C40H 3-hidroxi butiril 304 C5 Isovaleril 302 -K LO O 1 oh T5 Isovaleril deuterado p.i. 311 -43- C6 Hexanoil 316 C50H 3-hidroxi isovaleril 318 C4DC Metilmalonil 374 C5:1 Tiglil 300 C60H 3-hidroxi hexanoil 332 C5DC Glutiril 388 C8 :1 Octenoil 342 C8 Octanoil 344 C6DC Adipil, metil glutiril 402 d3-C8* Octanoil deuterado p.i. 347 C80H 3-hidroxi octanoil 360 Cl 0 :2 Decadienoil 368 CIO: 1 Decenoil 370 CIO Decanoil 372 C8DC Suberil 430 ClOOH 3-hidroxi decanoil 388 C12 :1 Dodecenoil 398 C12 Dodecanoil 400 C10DC Dihidrosebacil 458 C120H 3-hidroxi dodecanoil 416 C14 :2 Tetradecadienoil 424 Cl 4 :1 Tetradecenoil 426 C14 Miristoil 428 -44- C12DC Ácido dodecanoildioico 486 d9-Cl4* Miristoil deuterado p.i. 437 C140H 3-hidroxi miristoil 444 Cl 6:1 Palmitoleil 454 Cl 6 Palmitoil 456 C14DC Ácido tetradecanoidioico 514 d3-C16* Palmitoil deuterado p.i. 459 Cl6:10H 3-hidroxi palmitoleil 470 C160H 3-hidroxi palmitoil 472 Cl 8 :2 Linoleil 480 Cl 8 :1 Oleil 482 C18 Estearoil 484 C18:20H 3-hidroxi linoleil 496 Cl8:10H 3-hidroxi oleil 498 C180H 3-hidroxi estearoil 500

Tal como será perceptível aos conhecedores da arte, os métodos de quantificação do nivel da carnitina supra referidos, de acordo com as variantes da presente invenção -45- podem vantajosamente ser utilizados, num cenário de diagnóstico clinico, no diagnóstico do nível de deficiência de carnitina em pacientes submetidos a diálise. Tal diagnóstico poderá, por sua vez, ser utilizado pelos médicos especialistas na selecção e implementação das adequadas terapias preventivas e terapêuticas, incluindo a administração intravenosa de levocarnitina injectável após sessões de diálise em pacientes com ESRD. É possível que, num cenário de diagnóstico clínico, os métodos e cálculos de constituintes supra referidos possam ser interpretados de forma a seguir um determinado curso de acção, dependendo dos níveis de concentração da carnitina.

Para facilitar o diagnóstico dos pacientes, poderão ser utilizadas árvores de decisão para interpretar o nível de deficiência de carnitina, e para auxiliar o utilizador ou intérprete na determinação do seguinte curso de acção e no sentido da leitura da concentração. Embora os valores iniciais e corrigidos da concentração possam ser aplicados ao guia de interpretação, é, obviamente, preferível a utilização dos valores corrigidos da acilcarnitina e da carnitina livre, devido à sua maior precisão.

Após a leitura das conclusões supra referidas, serão rapidamente notórias aos conhecedores da arte várias modificações das variantes descritas. Por exemplo, poderão ser utilizados quaisquer ensaios de análise de amostras adequados em variantes alternativas da invenção, para determinar as concentrações de carnitina nas amostras de -46- plasma secas. Será óbvio que os métodos de MS/MS e seus conceitos poderão ser adaptados à análise de outros espécimes biológicos, incluindo urina, sangue, liquido cérebro-espinal e extractos de tecidos (por exemplo, homogenizados com um veiculo liquido adequado e centrifugado). -47-

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO A presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o IEP não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição • US 6335369 B [0004] • US 6429230 B, Cavazza [0004] • US 6268605 B [0009] • WO 0204945 A, Chace [0009]

Literatura não relacionada com patentes, citada na descrição • D. W. Johnson. J. Inher. Metab. Dis., 1999, vol. 22, 201-202 [0011] • D.Constantin-Teodosiu et al. Kidney International, 1996, vol.49, 158-162 [0014]

Lisboa, 15/02/2010

Claims (26)

1. Reivindicações 1. Método de quantificação dos níveis de concentração de carnitina livre, acilcarnitinas totais e carnitina total em amostras de plasma de pacientes submetidos a diálise, usando espectrometria de massa tandem, sendo que tal método inclui: recolher várias amostras para obtenção de curvas de calibração contendo plasma dialisado, tendo misturado nessas amostras concentrações conhecidas de carnitina livre; preparar várias amostras de pacientes contendo plasma recolhido de um paciente e as referidas amostras para obtenção de curva de calibração para análise, que inclui a extracção das amostras dos pacientes e das amostras para a curva de calibração com uma solução alcoólica contendo padrões internos marcados; analisar as referidas amostras dos pacientes para quantificar as concentrações de carnitina livre e de acilcarnitinas relativamente às dos padrões internos para produzir dados relativos a um paciente, e analisar as referidas curvas de calibração para quantificar as concentrações de carnitina livre e de acilcarnitinas -2- relativamente às dos padrões internos para produzir dados de uma curva de calibração; comparar os referidos dados de um paciente com os referidos dados da curva de calibração para obter os dados relativos à concentração de carnitina, sendo que estes dados relativos à concentração de carnitina incluem a concentração de carnitina livre, a concentração de acetilcarnitina e a concentração de acilcarnitinas totais em cada uma das amostras dos pacientes; e, corrigir a referida concentração de carnitina livre e a referida concentração de acetilcarnitina para obter uma concentração quantificada de carnitina livre, uma concentração quantificada de acilcarnitina total e uma concentração quantificada de carnitina total em cada uma das amostras dos pacientes, sendo que a correcção da concentração de carnitina livre tem em conta a hidrólise das acilcarnitinas em carnitina livre e a correcção da concentração da acetilcarnitina tem em conta a interferência do ácido glutâmico e em que a concentração quantificada da carnitina total é determinada através da soma da referida concentração quantificada de acilcarnitinas totais com a referida concentração quantificada de carnitina livre. -3-
2. 2. Método da reivindicação 1, em que as referidas amostras dos pacientes são preparadas colocando gotas do referido plasma recolhido do referido paciente sob um papel de filtro e secando as amostras para se obterem amostras de plasma secas em papel de filtro.
3. 3. Método da reivindicação 2, em que o referido papel de filtro é segmentado para que uma só folha possa conter várias amostras secas de um determinado paciente.
4. 4. Método da reivindicação 3, em que as referidas amostras secas de um determinado paciente são seleccionadas entre o grupo constituído por amostras de plasma recolhidas antes de uma sessão de diálise, amostras de plasma recolhidas depois de uma sessão de diálise e amostras de plasma recolhidas durante uma sessão de diálise e combinações das mesmas.
5. 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, em que as referidas amostras de plasma secas em papel de filtro são obtidas através de correio para quantificação.
6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, em que o referido papel de filtro contendo gotas secas de amostras dos pacientes pode ser armazenado e transportado à temperatura ambiente durante aproximadamente -4- uma semana após a sua colheita do referido paciente antes de ser analisado.
7. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o referido paciente é um paciente com um doença renal em fase terminal que é submetido a sessões de diálise periódicas, sendo que as referidas amostras dos pacientes incluem plasma recolhido do referido paciente antes de uma sessão de diálise.
8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, incluindo também a obtenção de várias amostras para controlo de qualidade, e a preparação e análise das referidas amostras para controlo de qualidade para produzir dados de controlo de qualidade.
9. 9. Método da reivindicação 8, em que os referidos dados relativos ao controlo de qualidade são utilizados para afinar os parâmetros do equipamento para a realização da referida espectrometria de massa tandem.
10. 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 ou 9, em que as referidas amostras para controlo de qualidade contêm plasma dialisado. -5-
11. 11. Método da reivindicação 10, em que o referido plasma dialisado contém concentrações conhecidas de carnitina livre e acetilcarnitina.
12. 12. Método da reivindicação 8, em que as referidas amostras para controlo de qualidade contêm espécimes de plasma dialisado com concentrações conhecidas de carnitina livre e acetilcarnitina.
13. 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, em que as referidas amostras para controlo de qualidade incluem gotas do referido plasma secas em papel de filtro.
14. 14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que as referidas amostras para obtenção da curva de calibração incluem espécimes de plasma dialisado com concentrações conhecidas de carnitina livre.
15. 15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que as referidas amostras para obtenção da curva de calibração incluem gotas do referido plasma secas em papel de filtro.
16. 16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que os referidos padrões internos marcados -6- contidos na solução alcoólica usada na extracção das amostras dos pacientes são seleccionados entre o grupo constituído por [D9]carnitina, [D3]acetilcarnitina, [D3]propionilcarnitina, [D3]butirilcarnitina, [D9]isovalerilcarnitina, [D3]octanoilcarnitina, [D9]miristoilcarnitina e [D3]palmitoilcarnitina.
17. 17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, em que as referidas amostras de plasma incluem manchas de plasma secas em papel de filtro, sendo que a preparação das referidas amostras de plasma inclui a punção de um disco das referidas manchas de plasma secas em papel de filtro para cada amostra de plasma, e as referidas concentrações quantificadas têm em conta um volume estimado das referidas manchas de plasma recuperadas a partir dos referidos discos puncionados.
18. 18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em que a referida preparação das referidas amostras inclui a derivatização das amostras de plasma recuperadas com um álcool acidificado.
19. 19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, em que a referida concentração quantificada de acilcarnitina total é determinada através da soma de vários ésteres butílicos de acilcarnitina. -7-
20. 20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, que inclui também a detecção de quaisquer alterações nas referidas concentrações quantificadas de um determinado paciente ao longo do tempo, através da quantificação dos níveis de carnitina livre, acilcarnitinas e carnitina total nas amostras dos pacientes para um determinado doente, em que as referidas amostras são provenientes de várias sessões de diálise de um determinado paciente.
21. 21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, em que as referidas amostras dos pacientes são preparadas através de colocação de gotas em papel de filtro e secagem das amostras de plasma dos pacientes obtidas em cada uma das sessões de diálise do paciente.
22. 22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, em que a correcção referida da concentração de acetilcarnitina inclui a medição da contribuição do glutamato e a subtracção da referida contribuição medida do glutamato da concentração de acetilcarnitina.
23. 23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, em que a correcção da concentração de carnitina livre inclui a determinação de uma percentagem de hidrólise das acilcarnitinas, a determinação de uma quantidade de -8- acilcarnitinas hidrolisadas a partir da referida percentagem e a subtracção da referida quantidade de acilcarnitinas hidrolisadas da referida concentração de carnitina livre.
24. 24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, em que a análise das referidas amostras da curva de calibração para quantificar as concentrações de carnitina livre e de acilcarnitinas inclui a produção de uma curva de calibração para interpolação das concentrações dos analitos de carnitina.
25. 25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, em que as referidas amostras para obtenção de curva de calibração incluem espécimes de plasma seco dialisado com concentrações conhecidas de carnitina livre.
26. 26. Uso do método conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 25, para auxiliar no diagnóstico da deficiência de carnitina num paciente que está a ser submetido a sessões regulares de diálise. Lisboa, 15/02/2010