ES2316373T3 - Procedimiento clinico para la seleccion genetica de recien nacidos utilizando espectometria de masas en tandem. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para seleccionar recién nacidos que utiliza un sistema que emplea un espectrómetro de masas en tándem con electronebulización, que comprende las etapas de: recibir una pluralidad de gotas de sangre; combinar un patrón de aminoácidos y un patrón exento de carnitina/acilcarnitina para formar un patrón interno que contiene una pluralidad de compuestos marcados; preparar una pluralidad de muestras, comprendiendo cada una de dichas muestras dicho patrón interno, metanol, y un extracto de sangre procedente de una de dichas gotas de sangre; realizar un barrido de dicha pluralidad de muestras utilizando dicho espectrómetro de masas en tándem con electronebulización para producir unos resultados del barrido; preparar una pluralidad de muestras de sangre control, comprendiendo cada una de dichas muestras de sangre control sangre hemolizada, EDTA, y 2 H3-serina; preparar una pluralidad de patrones, comprendiendo cada uno de dichos patrones sangre hemolizada, EDTA, 2 H 3serina, y uno de dichos compuestos marcados; realizar un barrido de dicha pluralidad de muestras de sangre control para producir unos resultados de muestras control; realizar un barrido de dicha pluralidad de patrones para producir una pluralidad de resultados de patrones; y, comparar dichos resultados de muestras control obtenidos para cada una de dichas muestras de control de calidad con dicha pluralidad de resultados de patrones obtenidos para cada uno de dichos patrones; y, analizar dichos resultados del barrido utilizando dichos resultados de patrones y dichos resultados de muestras control.

Description

Procedimiento clínico para la selección genética de recién nacidos utilizando espectrometría de masas en tándem.

Campo técnico

Es la selección genética de bebés recién nacidos utilizando la espectrometría de masas en tándem. En particular, gotas de sangre tomadas de recién nacidos se reúnen con patrones internos y se barren para cuantificar la pluralidad de metabolitos sanguíneos para ayudar en el diagnóstico de trastornos metabólicos. Los controles de calidad y los indicadores de garantía de calidad utilizados en los patrones internos y las funciones de barrido aseguran unas técnicas de toma de muestras y unos análisis precisos para ayudar en el diagnóstico médico.

Antecedentes de la técnica

La espectrometría de masas ha contribuido significativamente al diagnóstico de enfermedades metabólicas durante 20 años. El análisis mediante espectrometría de masas en tándem con bombardeo de átomos rápidos ("Fast Atom Bombardment Tandem Mass Spectrometry", FAB-MS/MS) de acilcarnitinas en volúmenes muy pequeños de plasma o sangre completa se ha ido convirtiendo en una rutina. Véase Millington, et al., Mass Spectrometry: Clinical and Biomedical Applications, 1, capítulo 8, 299-318. Ha sido un procedimiento bioquímico muy satisfactorio para el diagnóstico diferencial de trastornos del catabolismo de ácidos grasos, y el procedimiento instrumental reconoce numerosos defectos en el catabolismo de aminoácidos de cadena ramificada. La frecuencia de aparición de estas enfermedades y su asociación con muertes súbitas e inesperadas ha generado un gran interés médico por el desarrollo de ensayos de selección neonatales.

También ha sido demostrado previamente el análisis rutinario de aminoácidos y acilcarnitinas mediante espectrometría de masas en tándem con iones secundarios líquida ("Liquid Secondary Ion Tandem Mass Spectrometry", LSIMS/MS) de gotas de sangre sobre papel de filtro. Véase Chace et al., "Neonatal Screening for Inborn Errors of Metabolism by Automated Dynamic Liquid Secondary Ion Tandem Mass Spectrometry", New Horizons in Neonatal Screening, 1994. Para aumentar el número y la velocidad a la cual pueden analizarse las muestras se requiere el desarrollo de la preparación automática de muestras, el análisis instrumental y la interpretación de los datos. El aumento en el rendimiento de las muestras y la facilidad en la preparación de las muestras permite un diagnóstico más eficaz y exacto de un gran número de trastornos metabólicos, un proceso necesario para determinar la salud de un bebé recién nacido o, en cualquier caso, de cualquier persona que requiera cuidados clínicos. La gama de síntomas clínicos y anomalías en los ensayos sanguíneos sencillos es tan grande que justifica una investigación bioquímica extensiva cuando se sospecha que existe una enfermedad metabólica, como se indica en Millington, et al., "Diagnosis of Metabolic Disease", en Biological Mass Spectrometry: Present and Future, 3.15, 1994.

La formación de perfiles metabólicos de aminoácidos y acilcarnitinas a partir de gotas de sangre mediante el uso de espectrometría de masas en tándem con electronebulización automática ("Electrospray Tandem Mass Spectrometry", ESI-MS/MS) es una herramienta de diagnóstico más poderosa para los errores congénitos del metabolismo. Véase Rashed, et al., Clinical Chem., 43:7, 1129-1141. Nuevas estrategias para la preparación de muestras y la interpretación de datos han ayudado a establecer la metodología como un procedimiento de selección neonatal robusto y de alto rendimiento. Comparada con procedimientos más antiguos, la ESI-MS/MS es mucho más versátil y menos trabajosa, porque la mayoría de las etapas puede realizarse de modo automático.

Los errores congénitos del metabolismo normalmente son el resultado de enzimas o cofactores defectuosos. La deficiencia en acil-CoA deshidrogenasa de longitud de cadena media (MCAD) es un trastorno muy común de la oxidación de ácidos grasos. Como se ve en Chace et al., Clin. Chem., 43:11, 2106-2113, la deficiencia en MCAD se diagnostica basándose en el aumento de acilcarnitinas con longitud de cadena media, identificable mediante procedimientos de espectrometría de masas con dilución de isótopos. Los ésteres butílicos de las acilcarnitinas comparten un patrón de fragmentación similar con un ion de fragmentación común a 85 Da después de una disociación inducida por colisión utilizando un espectrómetro de masas. Las diferencias en el patrón de fragmentación se comparan con espectros conocidos de individuos sanos y, por tanto, puede realizarse un diagnóstico. En un entorno clínico, es posible el análisis de acilcarnitinas mediante una espectrometría de masas en tándem, puesto que sus ésteres metílicos asociados permiten el reconocimiento diagnóstico de todos los pacientes con deficiencia en MCAD, independientemente de la mutación subyaciente, el estado sintomático o el tratamiento. Además, el análisis de aminoácidos, en forma de sus ésteres butílicos asociados, ha sido validado para la búsqueda en recién nacidos de fenilcetonuria (PKU), tirosinemia, enfermedad de la orina de jarabe de arce, y homocistinuria, todas las cuales, entre otras, pueden detectarse mediante una espectrometría de masas.

La espectrometría más selectiva y sensible, en relación con los trastornos genéticos, se realiza mediante un espectrómetro de masas en tándem con electronebulización automático. Se ha presentado el uso de ESI-MS/MS como la forma más rápida y exitosa para proporcionar un procedimiento de selección específico y preciso (Rashed, et al.). Sin embargo, el procedimiento en sí mismo debe complementarse con un procedimiento de toma de muestras eficaz y con un modo de función de barrido y de inyección óptimos para albergar, con la mayor precisión, muchas muestras al mismo tiempo, maximizando, con ello, el rendimiento mientras se mantiene la sensibilidad y la precisión.

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La eficacia de la ionización de los compuestos es muy alta con la utilización de la ionización con electronebulización. Como puede verse en la patente de EEUU nº 5.352.891, Monning, et al., la alta eficacia de la ionización permite obtener los espectros útiles requeridos incluso para cantidades muy pequeñas de material. En otras palabras, la espectrometría de masas en tándem con electronebulización es muy sensible y específica con respecto a sus sistemas de inyección de compuestos, permitiendo, con ello, cubrir un espectro más amplio de enfermedades, lograr una menor proporción de falsos positivos, obtener una alta especificidad, y permitir un tiempo analítico más corto. El uso de la MS/MS en tándem con electronebulización ha demostrado aumentar el rendimiento. Además, la técnica se ha aplicado con éxito al diagnóstico prenatal (Rashed, et al., 1130) y otros procesos de selección. Sin embargo, la optimización del procedimiento de selección de recién nacidos debe lograrse maximizando el rendimiento de las muestras de la forma más eficaz y precisa, comenzando con la preparación de muestras, y terminando con la garantía de calidad. El proceso, de forma global, se presta a dar tranquilidad a los padres y a conseguir unos resultados oportunos y baratos.

La preparación de muestras para la selección genética de un individuo para detectar carnitinas y \alpha-aminoácidos (marcadores genéticos de errores congénitos en el metabolismo) para su uso en la espectrometría de masas se contempla en la técnica. El procedimiento convencional de recogida de muestras para la selección neonatal es una punción en el tobillo, seguida del depósito de la sangre completa sobre un papel de filtro especial (o tarjetas Guthrie) en forma de gotas. Véase Millington, et al., International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes, 111, 212, 1991. El último procedimiento desarrollado para preparar derivados de éster butílico de acilcarnitinas y aminoácidos a partir de gotas de sangre consiste en procesar las muestras en microplacas. Un troquel de gotas de sangre automático corta una única gota de sangre desde cada tarjeta Guthrie directamente hacia los pocillos individuales de la microplaca. A cada trozo cortado de gota de sangre en cada pocillo se le añade una disolución metanólica que contiene concentraciones conocidas de patrones marcados con isótopos estables. Los patrones marcados pueden incluir glicina y alanina; valina, metionina y fenilalanina; leucina y tirosina; ornitina; carnitina; acetilcarnitina; propionilcarnitina; octanoilcarnitina; y palmitoilcarnitina, todas en combinación en alguna concentración para potenciar la sensibilidad por compuestos concretos, según requiera el respectivo protocolo de ensayo. Las muestras se extraen y los extractos entonces se trasladan a otra microplaca, en la que se elimina el metanol mediante evaporación. Al residuo en cada pocillo se le añade HCl butanólico u otros modificadores químicos, y se completa la derivatización mediante calentamiento. Los residuos finales se reconstituyen y se colocan en una bandeja de toma de muestras automática para su introducción en el MS.

La incorporación de técnicas de dilución de isótopos como patrones proporciona información cuantitativa acerca de los componentes específicos de cada muestra. Resulta necesaria una concentración óptima de una combinación de 12 patrones de aminoácidos y 8 patrones de acilcarnitina/carnitina para mejorar la precisión y proporcionar un control de calidad, así como para proporcionar una serie de funciones de barrido que maximicen la información sobre los metabolitos con un alto rendimiento. El control de calidad y la garantía de calidad en un entorno clínico resultan importantísimos, debido al procedimiento e instrumentación que han se han desarrollado para la optimización del rendimiento de las muestras. Esto resulta especialmente importante, puesto que los resultados de la espectrometría de masas se correlacionan con la población general de recién nacidos, de forma que muestren unos resultados precisos en la tendencias demográficas.

Las ventajas de la ESI-MS/MS frente a otros procedimientos de análisis son su alta especificidad y precisión de cuantificación mediante el uso de la técnica de dilución de isótopos, además de su velocidad y adaptabilidad a realizarse de modo automático. Véase Chace, et al., Clin. Chem., vol, 39, nº 1, 1993. Habiendo unido la sensibilidad en la detección con la necesidad de que la selección de recién nacidos requiere un rendimiento rápido, una alta fiabilidad, una alta precisión, una alta selectividad y un alto valor de bajo coste, ahora existe una necesidad en un entorno clínico, satisfecha por la presente invención, de un medio preciso para asegurar la calidad de los datos para el diagnóstico de trastornos genéticos obtenidos de una manera organizada y precisa. Esta calidad puede unirse al procedimiento más eficaz de preparar y seleccionar muestras, de forma que se reduce el número de falsos positivos y falsos negativos, y el rendimiento de las muestras se maximiza necesariamente en el entorno clínico de diagnóstico.

La patente de EEUU nº 5.538.897, 23 de julio, 1996 (Yates, III, et al.) muestra un procedimiento para correlacionar un espectro de masas de fragmentos de péptidos con las secuencias de aminoácidos derivadas de una base de datos. Un péptido se analiza mediante un espectrómetro de masas en tándem para producir un espectro de masas de fragmentos del péptido. Se emplea una base de datos de secuencias de proteínas o una base de datos de secuencias de nucleótidos para predecir uno o más espectros de fragmentos para su comparación con el espectro de los fragmentos obtenido de forma experimental. Los diversos espectros de masas predichos se comparan con el espectro de los fragmentos obtenido de forma experimental utilizando una medida de ajuste más cercano, calculado preferiblemente con un proceso en dos etapas, incluyendo el cálculo de una puntuación preliminar y, para los espectros predichos con mayor puntuación, el cálculo de una función de correlación.

La patente de EEUU nº 5.206.508, 27 de abril, 1993 (Alderdice, et al.) indica un sistema de espectrometría de masas en tándem capaz de obtener espectros de masas en tándem para cada ion progenitor sin la separación de los iones progenitores que se diferencian en su masa. Además, este sistema proporcionaría la capacidad de seleccionar un ion particular antes de la excitación.

La patente de EEUU nº 5.352.891, 4 de octubre, 1994 (Monning, et al.) demuestra que la producción de espectros de masas de compuestos químicos de elevado peso molecular que tienen una multiplicidad de picos mejora mediante la generación de un espectro de masas mejorado a partir del espectro de masas frente a carga observado. La proporción de señal frente al ruido puede mejorarse, en algunas aplicaciones, incluyendo en el producto todas las porciones dentro de los picos discretos en el espectro de masas frente a carga, que están contenidas dentro de una ventana alrededor de cada uno de los picos discretos.

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Descripción de la invención

El objetivo de la presente invención es mejorar el procedimiento de selección de recién nacidos poniendo en práctica protocolos de toma de muestras y controles de calidad de datos eficaces. Como etapas inicial y final en el uso de la espectrometría de masas en tándem con electronebulización para la selección de errores congénitos de metabolitos, la eficacia de las muestras y la garantía de calidad complementan un procedimiento de rendimiento de las muestras más rápido con un alto valor de bajo coste. Todos los valores se comparan con umbrales conocidos, como un medio para evaluar los contenidos de la muestra. La alta fiabilidad y la alta precisión obtenidas en un gran número de muestras proporcionará, con gran rapidez, un diagnóstico coherente al nivel clínico.

La espectrometría de masas en tándem con electronebulización es muy sensible y específica, y puede detectar un amplio espectro de trastornos al nivel genético. El tiempo analítico, que ya es más corto, y la alta especificidad aumenta la velocidad a que se pueden analizarse las muestras. La inclusión de patrones internos en la preparación de las muestras, que disminuyen el error de extracción y permiten funciones de barrido de modo mixto, aumenta aún más el rendimiento de las muestras. Los patrones internos se utilizan para proporcionar la información cuantitativa necesaria para detectar componentes específicos. El uso de las proporciones adecuadas de cada ion particular permite la detección de muchos metabolitos al mismo tiempo, eliminado, con ello, el análisis por duplicado, permitiendo emplear los ensayos secundarios para la garantía de calidad y el ensayo de suficiencia, en lugar de emplearlos para la detección de compuestos preliminares.

Un segundo objetivo del presente procedimiento es incluir patrones de EDTA que puedan determinar si la sangre fue recogida de forma adecuada o no. La sangre contaminada o la sangre recogida en tubos, en lugar de mediante una punción en el tobillo, no resulta adecuada y este patrón puede identificarla.

Un tercer objetivo del presente procedimiento es incluir patrones de garantía de calidad, tal como ^{2}H_{3}-serina (serina marcada con deuterio 3) para demostrar que el ordenador está reconociendo compuestos que normalmente no aparecen. La ^{2}H_{3}-serina es un aminoácido que no se incluye ni se reconoce en un barrido normal, de manera que la ^{2}H_{3}-serina se añade a una muestra para demostrar que, cuando este compuesto se detecta y se muestra como un pico, el ordenador es capaz de detectar compuestos extraños. En efecto, pueden detectarse muestra contaminadas o sin fármacos.

Un cuarto objetivo del presente procedimiento es incluir factores de corrección, valores de masas, marcadores de garantía de calidad y marcadores de preparación de muestra apropiados como valores de entrada, que complementan una base de datos que se utiliza para comprobar los cálculos producidos utilizando una hoja de cálculo, asegurando, con ello, una reducción en los datos precisos. Esto proporciona una mayor garantía de calidad. Cuando se advierte una muestra anómala debe realizarse una acción recomendada. La conservación de valores en la base de datos facilita el informe de los datos de la proporción de enfermedad, la generación y el análisis de tendencias, los valores totales de muestras por día, y los análisis de QA/QC.

Un quinto objetivo del presente procedimiento es incluir una etapa de control de calidad que utiliza patrones no marcados y patrones de sangre control para asegurar la coherencia y la precisión en la detección de los veinte metabolitos.

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Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un diagrama de bloques simplificado que muestra la metodología global. Se correlacionan cinco procesos principales, desde la preparación de las muestras hasta el diagnóstico del sistema.

La figura 2 es un diagrama de bloques que muestra con más detalle las etapas implicadas en la preparación de la muestra.

La figura 3 es un diagrama de bloques que muestra con más detalle las etapas implicadas en el uso automático de un espectrómetro de masas en tándem con electronebulización que incluye el uso de las funciones de barrido apropiadas para maximizar un rendimiento preciso.

La figura 3a es una hoja de cálculo que muestra los posibles umbrales superiores o inferiores utilizados para determinar qué muestran deben marcarse para una posterior toma de decisiones o un reensayo.

La figura 3b es un ejemplo de un barrido MRM de carnitina libre que muestra los picos pertinentes y los valores para la garantía de calidad.

La figura 3c es un ejemplo de un barrido MRM de acetilcarnitina que muestra los picos pertinentes y los valores para la garantía de calidad.

La figura 3d es un ejemplo de un perfil de barrido completo de acetilcarnitina que muestra los picos pertinentes y los valores para la garantía de calidad.

La figura 3e es un ejemplo de un perfil de barrido completo aminoácidos que muestra los picos pertinentes y los valores para la garantía de calidad.

La figura 3f es un ejemplo de un barrido MRM de aminoácidos básicos que muestra los picos pertinentes y los valores para la garantía de calidad.

La figura 4 es un diagrama de bloques que muestra con más detalle las etapas implicadas en el procesamiento de los datos después de la adquisición de los valores, que se han producido en el espectrómetro.

La figura 5 es un diagrama de bloques que muestra con más detalle las etapas implicadas en la interpretación de los datos, con relación a la demografía y la toma de decisiones.

La figura 6 es un diagrama de bloques que muestra con más detalle las etapas implicadas en el control del diagnóstico del sistema y la introducción de controles de calidad.

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Mejor modo de realizar la invención

A continuación la invención se describirá en detalle con relación a una realización preferida y su ejecución, cuya naturaleza es servir de ejemplo y ser descriptivamente específica según se describe. Como siempre, se entenderá que con ello no se pretende limitar el alcance de la invención. La invención incluye las alteraciones y otras modificaciones en el dispositivo ilustrado, y otras aplicaciones de los principios de la invención ilustrada en la presente, que normalmente surgen en los expertos en la técnica con que se relaciona la invención.

La figura 1 representa un esquema global del procedimiento de seleccionar recién nacidos en un entorno de diagnóstico clínico que implica cinco etapas principales, cada una de las cuales es importante para lograr un análisis de las muestras rápido, automático y preciso. Una preparación de la muestra (10) eficaz resulta necesaria para asegurar una derivatización precisa de los metabolitos, y se introducen ciertos aditivos o patrones internos que resultan importantes para proporcionar información cuantitativa para los componentes específicos de cada muestra. Después de la preparación de la muestra (10), las muestras se cargan sobre el espectrómetro de masas en tándem con electronebulización (12), que incluye muchas características automáticas para asegurar la velocidad y coherencia del barrido de las muestras. Entonces se adquieren los datos y se procesan hasta una forma reducida y organizada, como se observa en el recuadro (14). Los valores producidos a partir del barrido del espectrómetro de masas se procesan y se imprimen en forma de una hoja de cálculo para permitir la posterior comprobación de los cálculos, un medio para asegurar un número preciso de producción y calidad. Los datos adquiridos entonces se interpretan mediante un sistema de interpretación de diagnóstico asistido (16) que integra los resultados con los datos demográficos relacionados con el bebé y permite la correlación con un trastorno específico basado en cualquier de los picos marcados. El proceso, que trabaja junto con un programa informático, permite elaborar un informe con los datos, que es una manera de controlar los resultados diarios y ayudar en la toma de decisiones necesaria para futuras acciones, tales como un seguimiento o un reensayo. Todos los datos espectrales se mantienen precisos utilizando comprobaciones de diagnóstico del sistema y muestras de control de calidad como se observa en la etapa (18). Para asegurar la precisión del diagnóstico y la calidad de la muestra se emplean comprobaciones periódicas de la integridad del sistema y muestras control que incluyen aditivos específicos. En combinación, las etapas mencionadas anteriormente maximizan la velocidad y la calidad en que se seleccionan muestras de sangre de recién nacidos para detectar trastornos metabólicos, que resultan necesarias en un entorno clínico.

La figura 2 muestra un esquema global del procedimiento de preparación de muestras (etapa 1 de la figura 1). Se realiza una entrada inicial de la muestra (20) codificando cada muestra, asociando, con ello, la muestra a un emplazamiento específico en un pocillo de microvaloración. Las muestras consisten en gotas de sangre colocadas sobre áreas designadas de papel de filtro. Las gotas se cortan con un diámetro en el intervalo de 0,47 cm a 0,32 cm y se colocan en el pocillo de microvaloración designado. Se preparan preparaciones de patrón interno (22) en metanol para producir un disolvente de extracción, que se añade a la gota de sangre seca en cada pocillo. Las adiciones del disolvente de extracción (24) se realizan utilizando un equipo de manipulación de muestras automático.

El metanol actúa como medio del disolvente de extracción, mientras que los patrones internos actúan para cuantificar los metabolitos en la matriz de sangre seca. Las preparaciones de patrón interno (22) comprenden una mezcla ideal de veinte isótopos estables (doce patrones de aminoácidos y ocho patrones de acilcarnitina/carnitina). En la figura 2a aparece una lista de los patrones de aminoácidos. La columna de la izquierda muestra las concentraciones patrón de la disolución madre de trabajo concentrada (20a). La disolución madre se diluye 1:100 v/v con metanol para producir concentraciones de patrones de trabajo diarios (22a). Las concentraciones de los patrones de trabajo diarios (22a) pueden ajustarse para que analicen dos gotas de sangre seca de 0,47 cm, dos de 0,32 cm o una de 0,32 cm, ajustando el volumen de las adiciones del disolvente de extracción 24 (figura 2) o la concentración de la disolución madre de trabajo (20a). Los patrones de trabajo diarios (22a) actúan como disolvente de extracción y como medio para la estandarización interna del análisis.

Los patrones internos de carnitina libre y acilcarnitina se listan en la figura 2b. De nuevo, la columna de la izquierda lista las concentraciones de la disolución madre de trabajo (20b) utilizada en la dilución con metanol 1:100 v/v para producir los patrones de trabajo diarios (22b). Además, los patrones de trabajo diarios (22b) pueden ajustarse como se describió anteriormente para el análisis de gotas de sangre.

Ambos grupos de patrones se proporcionan en el medio de extracción para las funciones de barrido en modo mixto óptimas, que maximizan la detección de metabolitos. Los grupos de metabolitos detectados incluyen los \alpha-aminoácidos (alanina, fenilalanina, tirosina, ácido glutámico, ornitina, citrulina, arginina) y las carnitinas (carnitina libre, acilcarnitinas, acetilcarnitina, octanoilcarnitina, palmitoilcarnitina).

Siguiendo con la figura 2, después de la adición del disolvente de extracción (24), el disolvente se traslada en la etapa (26) a una placa o placa de microvaloración que tiene pocillos de fondo redondo, en los que se elimina el disolvente utilizando un sistema de secado de nitrógeno en la etapa (27). El extracto de sangre entonces sufre una esterificación y es modificado químicamente y calentado en la etapa (28) para convertirse en un derivado. El exceso de derivado se elimina en la etapa (29) y se añade un disolvente de fase móvil utilizando un sistema de manipulación de muestras automático. Un sellado de las placas retrasa cualquier evaporación del disolvente.

La figura 3 muestra las etapas implicadas después de que se prepare la muestra y se incluyan los patrones y ya se pueda introducir en el espectrómetro de masas en tándem con electronebulización automático. Se logra la optimización de los sistemas de MS/MS (30) utilizando una disolución de ajuste, y el sistema de MS/MS de electronebulización (32) es un sistema de bajo caudal que utiliza una línea de sílice fusionado desplazada hacia la punta del electrodo. Los sistemas de inyección automática (34) utilizan la línea de sílice fusionado para conectar directamente el inyector con la punta del electrodo para minimizar el espacio muerto. Los barridos incluidos para detectar los fragmentos necesarios de los iones consisten en cinco funciones de barrido de modo mixto (36) para maximizar la información de los metabolitos y la garantía de calidad. Las funciones de barrido de modo mixto 36 incluyen MRM de carnitina libre, MRM de acetilcarnitina, barrido completo de acilcarnitina, barrido completo de aminoácidos, y MRM de aminoácidos básicos, mientras que el barrido completo cubre una gama más amplia de proporciones de masa frente a carga y, por tanto, puede compararse una gama más amplia de picos. Cada pico se corresponde con un número de umbral o concentración, y se compara con un umbral superior o inferior conocido.

En la figura 3a pueden observarse ejemplos de los valores de los umbrales. Debe entenderse que todos los valores de las muestras necesarios en la determinación de errores metabólicos o la garantía de calidad que se encuentran por encima o por debajo de un cierto umbral se marcan, o se identifican, para objetivos de diagnóstico, reensayo u otras tomas de decisiones clínicas.

La figura 3b demuestra que un MRM de carnitina libre proporciona una garantía de calidad. Un MRM es un barrido para un compuesto concreto que muestra masas duales (401) (la masa progenitora y la masa hija, respectivamente). Un primer pico (403) se detecta como los fragmentos de carnitina libre. Entonces se obtiene la concentración resultante de carnitina libre (405). En este barrido se garantiza la calidad observando el pico de CN exenta de d_{3} (carnitina exenta de deuterio 3) (404) que surge de la hidrólisis de acilcarnitinas marcadas con d_{3}. El valor de concentración "hidrolibre" resultante (409) es un marcador de garantía de calidad para la hidrólisis de acilcarnitina, y también es una corrección para las concentraciones verdaderas de carnitina libre (405).

La figura 3c muestra un MRM de acetilcarnitina. El pico (501) es el pico de acetilcarnitina (acetilCN) y el pico (503) es un pico de garantía de calidad (QA) que manifiesta la hidrólisis del glutamato. La concentración de glutamato resultante (505) muestra la cantidad de interferencia desde un glutamato, que está corregida en la determinación de la concentración de acetilCN (504). En este barrido se incluyen otras comprobaciones de QA para la propionil CN como los picos duplicados (507) y (509).

En la figura 3d se muestra un perfil del barrido completo de acilcarnitina. Los patrones internos añadidos están fragmentados y se revelan como los picos (601, 602, 603, 604, 605). Entonces se obtiene una lista de las concentraciones de los metabolitos detectables (610), así como las proporciones molares (612). En este barrido se incluye un ensayo de QA como un valor de derivado malo (614) que surge de cualquier pico que se encuentre alrededor de un valor de amu, m/z de (403). El valor de derivado malo (614) revela una mala preparación de la muestra si es elevado. También se incluye un marcador de QA de EDTA (616) para revelar el procedimiento de recogida de muestras. Unos valores elevados del marcador de QA de EDTA (616) manifiestan que las muestras se extrajeron de tubos en lugar de punciones en el tobillo, o revelan un extenso mantenimiento de la conservación.

Se utiliza otro procedimiento de QA en este barrido, que revela un valor de intensidad (618). Un valor de intensidad elevado demuestra que la muestra se ha barrido con una sensibilidad adecuada. Si el valor de intensidad (618) es demasiado bajo, la muestra se marcará (anotará) y puede reensayarse dependiendo del protocolo.

La figura 3e es un ejemplo de un análisis de barrido completo de aminoácidos. Los aminoácidos en los fragmentos de patrones internos se muestran como los picos (710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717). Se listan los valores de la concentración de aminoácidos (701), junto con un valor de marcador de QA (703) alrededor de un valor de amu, m/z de (165). El valor del marcador de QA (703) se producirá, de forma más probable, tras la adición de ^{2}H_{3}-serina, que se añade a la muestra para manifestar la detección adecuada de compuestos que normalmente no aparecen en una muestra de rutina, puesto que la serina es un aminoácido que no está incluido en la lista de aminoácidos pertinentes a cualquier trastorno. También se incluye un marcador de intensidad (705) para mostrar una sensibilidad adecuada en la detección.

La figura 3f es un ejemplo de un MRM de aminoácidos básicos. El marcador de QA aparece en el pico (802), y el barrido incluye un análisis de citrulina por duplicado (804), que normalmente forma un pico alrededor de un valor m/z de 215 y 232.

La figura 4 describe el procesamiento de los datos adquiridos de las funciones de barrido utilizadas para el espectrómetro de masas. La etapa (40) es la entrada de todos los valores de masas, las constantes para los cálculos de la concentración, los factores de corrección para la eficacia de la extracción, las proporciones de datos de concentración, y los valores de corte. También se introducen los marcadores de garantía de calidad, los marcadores de la preparación de la muestra, y los marcadores de sensibilidad. Los marcadores incluyen los picos descritos anteriormente, los valores de intensidad, los valores de derivados malos, y los valores de EDTA, y son importantes porque revelan si las muestras están o no contaminadas o sin fármacos, y son muy indicativos de cómo se han conservado las muestras o de dónde se han extraído las muestras. Además ayudan a mantener la precisión y la coherencia del instrumento. Los resultados se procesan y se imprimen en la etapa (42). Las funciones de barrido descritas en las figuras 3a-3e puede detectar múltiples enfermedades basándose en los fragmentos de metabolitos detectados. Los picos reveladores conducen finalmente a los perfiles indicados en los recuadros (43a) y (43b). Los perfiles también pueden incluir la anotación de picos elegidos utilizando los patrones de garantía de calidad o de control de calidad.

La figura 5 muestra las etapas implicadas en la interpretación de los datos organizados. Los datos de la hoja de cálculo se introducen en un módulo de base de datos para el reconocimiento del tipo de archivo y de muestra. Como puede observarse en la etapa (50), los datos se interpretan de forma que pueden asignarse parámetros a la muestra concreta, y se ofrecen los resultados. Los resultados entonces se integran en la etapa (52) con los datos demográficos del recién nacido. Los datos demográficos pueden incluir edad, tipo de espécimen, u otra indicación, tal como si el bebé es o no prematuro, etc. Las muestras que muestran anomalías, o parece que muestran un pico revelador, se marcan para ser interpretadas utilizando una guía de referencia, y se toman las decisiones sobre las acciones siguientes en la etapa (54). La siguiente etapa es la referencia al árbol de decisiones y la recomendación de la acción, en la etapa (56). Las muestras marcadas se correlacionan con el módulo de base de datos utilizado para distinguir los picos anómalos, y se toma la decisión de reensayar o de diagnóstico. En la etapa (58), como una medida de la garantía de calidad y el control de calidad, se registra la muestra media de los días y la generación de tendencias para realizar un seguimiento de la aparición estadística de enfermedades, y para mantener un alto rendimiento de la toma de muestras. Esto incluye el informe de datos automático y el informe de comunicaciones por Internet.

La figura 6 muestra las etapas implicadas en mantener aún más la garantía de calidad utilizando muestras de control de calidad y el mantenimiento de la integridad del sistema. Las muestras de control de calidad se preparan en la etapa (60). Las muestras consisten en líquidos y gotas de sangre de QA preparados como patrones sin marcar a las mismas concentraciones que los patrones internos, y se realiza un barrido. Los patrones de sangre control incluidos en esta etapa (60) consisten en sangre hemolizada, EDTA y ^{2}H_{3}-serina, u otro marcador reconocido. Se ensayan y se comparan con patrones que consisten en sangre hemolizada, EDTA, ^{2}H_{3}-serina y uno de los veinte compuestos que son los mismos que los utilizados en los patrones internos pero que están sin marcar. El ordenador se ajusta de forma adecuada para que reconozca e interprete los resultados. Otra etapa para mantener la garantía de calidad se proporciona en la etapa (61). Los sistemas se controlan en un programa de base de datos para detectar cambios en la integridad o la sensibilidad del sistema. Una etapa final para mantener el diagnóstico del sistema se incluye en la etapa (63). Los procedimientos y programas de mantenimiento se siguen y se controlan constantemente mediante un sistema de archivos y mediante Internet a través de un control en marcha de los datos de la espectrometría de masas.

Aplicabilidad industrial

La invención se utiliza para ayudar en el diagnóstico de muchos trastornos metabólicos que deben detectarse y tratarse en los primeros días tras el nacimiento para asegurarse de que el bebé se desarrolle con normalidad y/o sobreviva. Al nivel clínico, los ensayos deben realizarse con una alta proporción de rendimiento, manteniéndose precisos y fiables. Cualquier resultado positivo o negativo también debe unirse a unos controles de calidad rigurosos para asegurar esta precisión y fiabilidad. Se cree que la invención se convertirá en el proceso de selección fundamental para ayudar en el diagnóstico de todos los trastornos neonatales que se producen al nivel genético.

Claims (23)

1. Un procedimiento para seleccionar recién nacidos que utiliza un sistema que emplea un espectrómetro de masas en tándem con electronebulización, que comprende las etapas de:

recibir una pluralidad de gotas de sangre;

combinar un patrón de aminoácidos y un patrón exento de carnitina/acilcarnitina para formar un patrón interno que contiene una pluralidad de compuestos marcados;

preparar una pluralidad de muestras, comprendiendo cada una de dichas muestras dicho patrón interno, metanol, y un extracto de sangre procedente de una de dichas gotas de sangre;

realizar un barrido de dicha pluralidad de muestras utilizando dicho espectrómetro de masas en tándem con electronebulización para producir unos resultados del barrido;

preparar una pluralidad de muestras de sangre control, comprendiendo cada una de dichas muestras de sangre control sangre hemolizada, EDTA, y ^{2}H_{3}-serina;

preparar una pluralidad de patrones, comprendiendo cada uno de dichos patrones sangre hemolizada, EDTA, ^{2}H_{3}-serina, y uno de dichos compuestos marcados;

realizar un barrido de dicha pluralidad de muestras de sangre control para producir unos resultados de muestras control;

realizar un barrido de dicha pluralidad de patrones para producir una pluralidad de resultados de patrones; y,

comparar dichos resultados de muestras control obtenidos para cada una de dichas muestras de control de calidad con dicha pluralidad de resultados de patrones obtenidos para cada uno de dichos patrones; y,

analizar dichos resultados del barrido utilizando dichos resultados de patrones y dichos resultados de muestras control.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que cada una de dichas muestras se prepara en un pocillo de fondo redondo de una placa de microvaloración.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, que comprende además la etapa de codificar cada una de dichas muestras para asociar cada una de dichas muestras con dicho pocillo de fondo redondo.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además las etapas de:

organizar dichos resultados del barrido mediante una hoja de cálculo;

introducir dichos resultados del barrido en una base de datos adaptada para ayudar a organizar, reconocer e interpretar dichos datos del barrido;

asignar dichos resultados del barrido a los datos demográficos de cada uno de dichos recién nacidos que se corresponden con cada una de dichas muestras;

marcar cada una de dichas muestras que revelan una anomalía, formando, con ello, una pluralidad de muestras marcadas, en el que cada una de dichas muestras marcadas puede interpretarse utilizando una guía de referencia, y en el que pueden tomarse unas acciones siguientes para cada una de dichas muestras marcadas.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho patrón de aminoácidos contiene doce aminoácidos marcados.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dichos doce aminoácidos marcados se seleccionan del grupo que consiste en ^{15}N^{13}C-glicina, ^{2}H_{4}-alanina, ^{2}H_{8}-valina, ^{2}H_{3}-leucina, ^{2}H_{3}-metionina, ^{2}H_{5}-fenilalanina, ^{2}H_{4}-tirosina, ^{2}H_{3}-aspartato, ^{2}H_{3}-glutamato, ^{2}H_{2}-ornitina-2HCl, ^{2}H_{2}-citrulina, y ^{2}H_{4}^{13}C-arginina-HCl.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dichos patrones de carnitina libre/acilcarnitina contienen ocho carnitinas marcadas.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que dichas ocho carnitinas marcadas se seleccionan del grupo que consiste en ^{2}H_{9}-carnitina, ^{2}H_{3}-acetilcarnitina, ^{2}H_{3}-propionilcarnitina, ^{2}H_{3}-butirilcarnitina, ^{2}H_{9}-isovalerilcarnitina, ^{2}H_{3}-octanoilcarnitina, ^{2}H_{9}-miristoilcarnitina, y ^{2}H_{3}-palmitoilcarnitina.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que para la etapa de barrido de dichas muestras se proporciona una función de barrido MRM de carnitina libre.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicha función de barrido MRM de carnitina libre proporciona unos datos de garantía de calidad para la hidrólisis de la acilcarnitina.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dichos datos de garantía de calidad para la hidrólisis de la acilcarnitina son un pico de masa dual observado alrededor de 221,3/103,1 unidades de masa atómica.

12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que para la etapa de barrido de dichas muestras se proporciona una función de barrido MRM de acetilcarnitina.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicha función de barrido MRM de acetilcarnitina proporciona unos datos de garantía de calidad para la hidrólisis del glutamato y dos marcadores de garantía de calidad para la propionilcarnitina.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dichos datos de garantía de calidad para la hidrólisis del glutamato son un pico de masa dual observado alrededor de 261,3/85,1 unidades de masa atómica.

15. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que para la etapa de barrido de dichas muestras se proporciona un barrido completo de acilcarnitina.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicho barrido completo de acilcarnitina proporciona datos de garantía de calidad para un valor de derivado malo, mediante los cuales se revela una mala preparación de dichas muestras, y en el que dicho barrido completo de acilcarnitina proporciona unos datos de garantía de calidad para EDTA, mediante los cuales dicha muestra puede identificarse como que ha sido barrida con una sensibilidad adecuada.

17. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que para la etapa de barrido de dichas muestras se proporciona un barrido completo de aminoácidos.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dicho barrido completo de aminoácidos proporciona unos datos de garantía de calidad para la precisión en la detección de aminoácidos.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que dichos datos de garantía de calidad para la precisión en la detección de aminoácidos son un valor de concentración que corresponde a una cantidad de ^{2}H_{3}-serina.

20. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que para la etapa de barrido de dichas muestras se proporciona un MRM de aminoácidos básicos.

21. El procedimiento de la reivindicación 20, en el que dicho MRM de aminoácidos básicos incluye datos de garantía de calidad para la citrulina.

22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que dichos datos de garantía de calidad para la citrulina son un pico que se observa alrededor de un valor de masa dual de 232,3/113,1 unidades de masa atómica.

23. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de determinar unas acciones siguientes para diagnosticar o reensayar a dicho recién nacido.