CN111295577A

CN111295577A - 分析物检测方法

Info

Publication number: CN111295577A
Application number: CN201880071411.6A
Authority: CN
Inventors: G·帕尔兹; M·吴
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2020-06-16
Also published as: US20210086176A1; JP2021503609A; WO2019089746A1; EP3704466A1; CA3079837A1; JP7359772B2; EP3704466A4; EP3704466B1

Abstract

本文所述的方法、试剂盒和系统提供了收集、制备、处理和/或分析诸如血液的临床样品。所述方法、试剂盒和系统可以使用包含水和稳定溶剂如异丙醇的生物相容性溶液，以准确测试药物、营养物或代谢物的存在和/或量。

Description

分析物检测方法

交叉引用

本申请要求2017年11月1日提交的美国临时申请第62/580277号和2018年1月10日提交的美国临时申请第62/615,576号的权益，在此通过引用将其各自纳入本文。

政府资助的声明

本发明是在美国国立卫生研究院授予的合同5R01HD070795的政府支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。

发明领域

本发明涉及药物或代谢物水平的诊断测量。

发明背景

对于许多医学领域，从诊断测试中获得的结果对于正确的诊断和治疗非常重要。但是，用于临床测试的现有系统和方法具有许多缺点。当前，现有的方法不能准确地测试少量血液。此外，当前的许多尿液检测方法很容易受到干扰，从而损害了检测结果的准确性。

自从1963年以来，DBS方法就一直是新生儿诊断测试的首选方法，因为不需要放血，DBS易于存储，并且可以将DBS邮寄到分析地点。最近，DBS已用于监测治疗指数较窄的药物水平，分析转录组变化并测量生物标志物。

为了制备DBS，将来自针刺的标准体积的血液(通常为40至50微升)点在滤纸上的预打印圆圈(每个受试者通常为2-4)内。血液被干燥，材料是随后从滤纸上洗脱下来以进行分析的材料。

DBS的绝大多数测量都用于基因测试；它们确定是否存在特定的代谢物，并且不需要对分析物量进行准确定量。但是，药物和分析物的测量需要高精度。为了使DBS测量准确，必须在预打印的圆圈内放置标准血量。任何不均匀性都会导致变化，并且分析物必须能够有效地沉积并从滤纸上洗脱下来。而且，正在筛查越来越多的遗传疾病，尤其是在婴儿中(苯丙酮尿症，枫糖浆尿病等)。这种测试，尤其是那些评估分析物或药物水平是否发生变化的测试，需要仔细定量。

如果可以以微创的方式获得少量样品(例如血液)并且可以准确测量样品中的分析物，则可以改善健康护理。本公开解决了该需求并且还提供了许多优点。

发明内容

需要更快速和准确的诊断方法，以改善护理质量。特别地，非常需要用于样品收集、制备和分析以用于诊断测试的改进方法。还存在对易于访问的样品收集站点的需求，这些站点允许生成医疗保健专业人员可以依赖的数据。

还需要能够实现早期干预的系统和诊断方法，这将在几乎没有变化且人为错误减少的情况下为患者提供高质量的护理。本文公开的系统和方法满足了该需求并且还提供了相关的优点。

本公开提供了一种制备和测试少量样品(例如血液)的方法，该方法比DBS测量精确得多。本文所述的方法利用对临床环境安全的溶剂，例如异丙醇。在一个实施方式中，该方法仅需要10微升或更少的血液，例如8微升。重要的是，异丙醇是常用的溶剂；它通常用于许多不同的分析目的，包括：沉淀DNA或RNA，以及在许多用于HPLC、质谱和其他分析方法的柱色谱程序中用作溶剂。然而，本公开证明其具有新颖的实用性；异丙醇可用作稳定溶剂，可以添加非常少量的生物样品，这使这些样品可用于分析测试以确定许多重要药物和代谢物的水平。

在一些方面，本公开提供了一种检测分析物的方法，该方法包括：(a)对包含样品和生物相容性溶液的测试溶液进行测定；(b)检测样品中分析物的存在和/或浓度，其中所述生物相容性溶液包含稳定溶剂和水，并且其中所述样品通过毛细管微量采样(CMS)获得。

在一些方面，本公开提供了一种检测分析物的方法，该方法包括：(a)对包含样品和生物相容性溶液的测试溶液进行测定；(b)检测样品中分析物的存在和/或浓度，其中所述生物相容性溶液包含稳定溶剂和水，并且其中所述样品的量为约1-50μL。

在一些方面，本公开提供了一种进行测定的方法，该方法包括对包含样品和生物相容性溶液的测试溶液进行测定，其中样品的量为1-50μL，并且其中测定的误差比为＜20％。

在一些方面，本公开提供了用于连续监测从受试者获取的样品中的分析物的方法，该方法包括将通过毛细管微量采样(CMS)获得的所述样品添加到生物相容性溶液中，其中所述生物相容性溶液包含水和稳定溶剂，所述稳定溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇或其混合物；其中以指定的时间间隔采集一个或多个样品。在一些实施方式中，该方法还包括比较一个或多个样品。

在一些方面，本公开提供了一种制备用于检测分析物的样品的方法，该方法包括：将通过毛细管微量采样(CMS)获得的所述样品添加到生物相容性溶液中，其中所述生物相容性溶液包含水和稳定溶剂，所述稳定溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇或其混合物。

在本文公开的方法的一些实施方式中，样品是用于诊断测试的生物流体。生物流体可以是血液、尿液、眼泪、唾液、汗液、精液或脑脊液。在一些实施方式中，生物流体是新生儿血液。

在本文公开的方法的一些实施方式中，分析物是药物、营养物或代谢物。

在本文公开的方法的一些实施方式中，稳定溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇或其混合物。稳定溶剂可包含异丙醇。在一些实施方式中，稳定溶剂适合于临床环境。

在本文公开的方法的一些实施方式中，生物相容性溶液包含10-75％V/V的稳定溶剂。在一些实施方式中，生物相容性溶液基本上不含乙腈。

在本文公开的方法的一些实施方式中，所述测定是用于诊断测试的标准分析方法。分析方法可以是质谱法、色谱法、电泳法或酶联免疫吸附测定法(ELISA)。

在本文公开的方法的一些实施方式中，从受试者获得约2-50μL的样品。在一些实施方式中，样品被生物相容性溶液稀释约10倍。

在本文公开的方法的一些实施方式中，该方法还包括冷却样品。

在一些方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含：(a)被配置为通过毛细管作用从受试者获得样品的容器；(b)生物相容性溶液；和(c)说明书。

在本文公开的试剂盒的一些实施方式中，生物相容性溶液包含水和稳定溶剂。稳定溶剂可包括甲醇、乙醇、异丙醇或其混合物。在一些实施方式中，生物相容性溶液包含异丙醇和水。

在本文公开的试剂盒的一些实施方式中，试剂盒还包括配置为刺穿受试者皮肤的装置。

在一些方面，本公开提供了一种检测分析物的方法，该方法包括：(a)对包含样品和生物相容性溶液的测试溶液进行测定；和(b)检测样品中分析物的存在和/或浓度，其中所述生物相容性溶液包含稳定溶剂和水，并且其中所述样品通过毛细管微量采样(CMS)获得，其中所述样品的量为约1-50μL，并且其中稳定溶剂包含异丙醇。

在一些实施方式中，样品是用于诊断测试的生物流体。生物流体可以是血液、尿液、眼泪、唾液、汗液、精液或脑脊液。在一些实施方式中，生物流体是新生儿血液。在一些实施方式中，样品是在临床点从受试者获得的。

在一些实施方式中，分析物是药物、营养物或代谢物。在一些实施方式中，代谢物是遗传疾病的标志物或药物代谢物。

稳定溶剂可以适合于临床环境。

在一些实施方式中，生物相容性溶液可包含20-30％V/V的稳定溶剂。

在一些实施方式中，生物相容性溶液基本上不含乙腈。

在一些实施方式中，所述测定是用于诊断测试的标准分析方法。分析方法可以是质谱法、色谱法、电泳法或酶联免疫吸附测定法(ELISA)。

可以从受试者获得大约4-10μL的样品。在一些实施方式中，从受试者获得约8μL的样品。在一些实施方式中，样品被生物相容性溶液稀释约10倍。

该方法可以进一步包括在进行测定之前冷却样品。

附图简要说明

这里参考附图提供了各个方面、特征、实施方式和实施例的描述，在下面简要描述附图。附图可以整体或部分地示出一个或多个方面、特征、实施方式和/或实施例。附图是说明性的，不一定按比例绘制。

所附权利要求书中具体说明了本发明的新特征。可参考以下详述更好地理解本发明的特征和优点，这些详述阐述了利用本发明原理的说明性实施方式和附图，其中：

图1示出了收集、准备、处理和分析来自患者的血液。

图2A和图2B显示了在20个健康成人(图2A)和19个新生儿样品(图2B)中测量的恩丹西酮浓度(ng/ml)[ONDS]，其中通过两种不同方法获得了血液样品。测量血浆样品中的[ONDS](x轴)和同时从同一受试者获得的DBS样品中的[ONDS](y轴)。蓝色虚线表示为这些样品确定的趋势线。成人的趋势线(y＝0.7063x，左图)和婴儿样品的趋势线(y＝1.4726x，右图)明显不同。理论上的红色点线(y＝x)表示如果通过两种方法测得的[ONDS]相同，则会获得的结果。

图3A和图3B。图3A描绘了显示使用DBS方法确定的[ONDS]的标准曲线。用于制备DBS的血液中的[ONDS]范围为0.至250ng/ml，该线的r²为0.999；准确度在20％以内。这些样品中测得的浓度(代表受试者样品中测得的高、中、低浓度)全部包括在评估中，准确度在20％以内。图3B：给十二只小鼠施用恩丹西酮(10mg/kg PO)，并在给药后不同时间在全血(x轴)和血浆(y轴)中测量[ONDS](ng/ml)。显示了蓝色趋势虚线(y＝0.973x)和红色理论点线(y＝x)。获得50微升全血用于血浆分析，获得20微升全血用于全血分析。

图4A和图4B示出了DBS样品。图4A示出了在实验室环境中仔细点样的滤纸上的DBS。每个DBS具有50微升血液，其中注入了各种浓度的恩丹西酮。图4B：显示了在临床点由护士从新生儿获得的含有DBS的滤纸。一组DBS的血量均匀(左上)，但所有其他滤纸上的斑点血量却非常不一致。尽管在两种情况下都使用相同的滤纸，但在临床环境中，斑点血量存在很大差异。

图5示出了旋盖小瓶的图像，该旋盖小瓶包含72微升的缓冲液和带有小鼠血液的8微升EDTA涂覆的毛细管。图像显示了在涡旋之前(左)和涡旋之后(右)的管。

图6显示了在通过毛细管微量采样(CMS)获得的全血(x轴)或血浆(y轴)中测量的恩丹西酮浓度(ng/ml)。在施用恩丹西酮(10mg/kg PO)后的不同时间从12只小鼠采血。显示了蓝色趋势虚线(y＝0.949x)和红色理论点线(y＝x)。重要的是，CMS方法只能分析8微升的血液；并且理论线和趋势线之间的一致性表明CMS准确地测量了血浆恩丹西酮浓度。

图7A和图7B分别显示了在各种溶液中[ONDS]的响应比的图形表示，以及每个样品的[ONDS]的iso-CMS和血浆测量结果。图7A：稳定溶剂不会影响血液[ONDS]的CMS测量。对于这些分析，将全血稀释10倍至稳定溶液中，该稳定溶液包含75％的水和25％的乙腈、异丙醇、甲醇或乙醇。至于标准曲线的产生，将指示的[ONDS]稀释到血液/溶剂基质中，并通过LC/MS分析测量[ONDS](范围：0.20-100ng/ml)。该图绘制了[ONDS]与测得的响应强度(相对于内标(d²-恩丹西酮)的标准化值)的关系。不同的稳定溶液产生相同的结果。图7B：用恩丹西酮治疗小鼠(10或20mg/kg PO，每组n＝4只小鼠)。30分钟后，通过两种不同方法同时从每只小鼠采集血液：(i)200微升全血用于血浆[ONDS]的测量，或(ii)8微升用于iso-CMS的[ONDS]测量(使用异丙醇作为稳定溶液)。该图比较了每个样品的iso-CMS和血浆[ONDS]测量值。该图的两个特征表明血浆和iso-CMS的测量值高度一致：1)计算线的斜率(y＝0.99x)几乎与理论同一性线(y＝x)相同；并且2)R²为0.93，表明测量点与同一性线的整体偏差很小。

图8显示了具有不同化学结构的药物以及使用Iso-CMS的药物响应比的图形表示。测试了iso-CMS方法测量以下药物浓度的能力：波生坦，伊立替康及其代谢物(SN-38)，克立咪唑和速尿。对于这些分析，将全血稀释10倍至稳定溶液中，该稳定溶液包含25％的乙腈或25％的异丙醇和75％的水。就像生成标准曲线一样，将每种药物以指定的浓度稀释到血液/溶剂基质中，并使用我们公开的方法通过LC/MS分析测量药物浓度。该图描绘了所测得的响应强度(相对于每种药物两次氘化形式的内标标准化)相对于每种测试药物的药物浓度的关系。对于每种测试药物，在测试的药物浓度范围内，异丙醇稳定溶液产生的结果与乙腈稳定溶液的结果相同。

图9示出了芬太尼、吗啡和氢吗啡酮的校准曲线，其在0.5至1000ng/ml的浓度范围内进行了测试。图中给出了趋势线的方程式和R平方值(均>0.99)。

图10显示了通过iso-CMS确定的地塞米松浓度(ng/ml)，其与血浆样品中测得的浓度相对应。同时从15位受试者中获取血浆和iso-CMS样品，并通过LCMS分析测量每个样品中的地塞米松浓度。每个数据点显示通过对每位受试者的iso-CMS和血浆样品进行分析而确定的测得的地塞米松浓度。评估iso-CMS与血浆测量值之间的一致性的皮尔逊(Pearson)相关性和斯皮尔曼(Spearman)等级相关性分别为0.95和0.93。

图11显示了通过iso-CMS确定的美沙酮浓度(ng/ml)，其与血浆样品中测得的浓度相对应。同时从7位受试者中获取血浆和iso-CMS样品，并通过LCMS分析测量每个样品中的美沙酮浓度。每个数据点显示通过对每位受试者的iso-CMS和血浆样品进行分析而确定的测得的美沙酮浓度。评估iso-CMS与血浆测量值之间的一致性的R²为0.91。

图12显示了通过iso-CMS确定的加巴喷丁浓度(ng/ml)，其与血浆样品中测得的浓度相对应。同时从8位受试者中获取血浆和iso-CMS样品，并通过LCMS分析测量每个样品中的加巴喷丁浓度。每个数据点显示通过对每位受试者的iso-CMS和血浆样品进行分析而确定的测得的加巴喷丁浓度。评估iso-CMS与血浆测量值之间的一致性的R²为0.95。

图13A和13B显示了通过iso-CMS确定的恩丹西酮浓度(ng/ml)，其与血浆样品中测得的浓度相对应。图13A：通过LCMS分析测量从手术患者同时获得的44个血浆和iso-CMS样品中的恩丹西酮浓度。每个数据点显示通过对每位受试者的iso-CMS和血浆样品进行分析而确定的恩丹西酮测量浓度。评估iso-CMS与血浆测量值之间的一致性的R²为0.999。图13B：放大图13A中的区域，以更好地显示恩丹西酮浓度在15到60ng/ml之间的样品的血浆和CMS测量值之间的对应关系。

发明详述

下面参考示例性应用来描述本发明的几个方面以进行说明。应当理解，阐述了许多具体细节，关系和方法以提供对本发明的全面理解。然而，相关领域的普通技术人员将容易地认识到，可以在没有一个或多个特定细节的情况下实施本发明或用其他方法实施本发明。除非另有说明，否则本发明不受所例示的动作或事件的顺序的限制，因为某些动作可以以不同的顺序发生和/或与其他动作或事件同时发生。此外，并非所有示出的动作或事件都是实施根据本发明的方法所必需的。所公开的组合物中各种组分的浓度是示例性的，并不意味着限于所列举的浓度本身。

本文所用章节标题仅用于组织目的，而不应理解为限制所述客体。

本公开描述了一种用于精确测量少量生物流体样品中的分子的方法。这些分子可以是代谢物、药物、血液成分或其他分子。该测量可以是通过测量生理标志物来诊断遗传疾病或确定体内药物的量。

定义

除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。本文所引用的所有专利和出版物均通过引用纳入本文。

本文所用的术语仅仅用来描述具体的实施方式，而不是用于限制本发明。如本文所用，单数形式的“一个”，“一种”和“该”也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。此外，就在发明详述和/或权利要求中使用术语“包括”，“包含”，“具有”，“含有”，“有”或其变化形式的程度而言，这些术语意在以类似术语“包含”的方式表示含(inclusive)。

如本文所用，术语“受试者”或“个体”包括哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包括人和动物，例如小鼠，包括转基因和非转基因小鼠。本文所述的方法可用于人治疗，临床前和兽医应用中。在一些实施方式中，受试者是动物，并且在一些实施方式中，受试者是人。其他哺乳动物包括但不限于猿、黑猩猩、猩猩、猴子；家养动物(宠物)，例如狗、猫、豚鼠、仓鼠、小鼠、大鼠、兔子和雪貂；家养家畜，例如牛、水牛、野牛、马、驴、猪、绵羊和山羊；或动物园中常见的外来动物，例如熊、狮子、老虎、黑豹、大象、河马、犀牛、长颈鹿、羚羊、树懒、瞪羚、斑马、牛羚、草原犬鼠、考拉熊、袋鼠、熊猫、大熊猫、鬣狗、海豹、海狮和象海豹。

如本文所用，术语“基本上不含”是组合物含有小于约10％，小于约5％，小于约1％，小于约0.5％，小于0.1％或甚至更少的指定组分。例如，基本上不含乙腈的组合物可具有小于约10％的乙腈。

将理解的是，除非以其他方式隐含地或明确地理解或说明，否则本文以单数形式出现的单词涵盖其复数形式，并且本文以复数形式出现的单词涵盖其单数形式。此外，将理解的是，对于本文中描述的任何给定的部分，为该部分列出的任何可能的候选者或替代物，通常可以单独地或彼此以任何组合地使用，除非以其他方式隐含或明确地理解或陈述。另外，将理解的是，这样的候选者或替代者的任何列表仅是说明性的，而不是限制性的，除非以其他方式隐含或明确地理解或陈述。更进一步，将理解，本文呈现的任何数字或数值都是近似的，并且任何数值范围包括限定范围的最小数字和最大数字，无论是否使用单词“包含”等，除非以其他方式隐含或明确地理解或说明。通常，关于数字或数值或数量的术语“大约”或“约”或符号“～”包括落入其±5％范围内的数值，除非以其他方式隐含或明确地理解或陈述。此外，将理解的是，所采用的任何标题都是为了方便而不是限制。另外，将理解的是，除非以其他方式隐含或明确地理解或说明，否则任何宽松的、开放的或开放式语言分别包括对限制性语言的任何相对宽松，对封闭语言的不太开放，或对封闭式语言的不太开放式。

如本文所用，除非另有说明，否则本文的一些发明性实施方式考虑了数值范围。本发明的各个方面可以以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对发明范围的硬性限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值，就好像已明确写出一样。例如，应当认为诸如1至6的范围的描述具有具体公开的子范围，如1至3，1至4，1至5，2至4，2至6，3至6等，以及该范围内的个别数字，例如，1、2、3、4、5和6。这普遍适用，与范围广度无关。如果存在范围，则范围包括范围端点。

药物测试的挑战

在过去的十年中，阿片类药物的滥用流行对美国产生了重大影响。滥用处方阿片类的人比用其他所有非法药物加起来的人还多。从2006年开始，为获得阿片类药物而看医生的次数明显增加(每年3200万)；并且急剧转向处方高效阿片类(例如氢可酮和羟考酮)，其“黑市价”现在远远超过海洛因。由于广泛的阿片类滥用，针对阿片类药物的实验室测试已被纳入慢性阿片类使用者的临床护理以及在联邦和其他工作场所进行的强制性监测。

尽管针对阿片类的尿液药物测试(UDTO)是一种常用的监测方法，但它具有很多问题，可以通过本文公开的方法、系统和试剂盒解决这些问题，例如使用基于iso-CMS的阿片类分析方法(iCOAM)。由于尿液是私下收集的，因此有许多方法可以稀释样本或替换干净的尿液样本。使用UDTO，可以通过添加干扰用于阿片类检测的免疫测定的试剂来改变尿液样本，这些试剂包括家用产品(如漂白剂，醋和清洁剂)或非处方药(如滴眼液，NaCl，戊二醛(“Clean-X”)，硝酸钾(“Klear”)]。使用iCOAM可以缓解这些问题，因为可以通过手指针刺直接从已经正确识别了他/她身份的受试者那里获取血液样本，然后由授权的代理人将其放入稳定缓冲液中，从而消除了替换或变更的机会。

干血斑(DBS)方法的挑战

如图2A和图2B所示，血浆样品中测得的药物浓度(恩丹西酮浓度或[ONDS])与使用DBS测得的浓度有很大的不同。重要的是，由健康成人和婴儿产生的比较血浆和DBS测量值的趋势线的斜率相差很大(分别为0.71和1.47)(分别为图2A和图2B)。从新生儿获得的DBS中测得的[ONDS]小于血浆中测得的[ONDS]，而在成人中这种关系则相反。找不到对成人和婴儿都适用的将DBS中测得的[ONDS]转换为血浆中[ONDS]的校正因子。这种差异表明，DBS测定恩丹西酮浓度存在系统性问题。

值得注意的是，在滤纸上点样的血量不一致。为了使DBS测量准确，必须在滤纸的指定区域内点样恒定的血量。当在临床点获得DBS时，在指定区域内点样的血量会有很大变化。点样在滤纸上的血量不一致会导致使用DBS进行的测试结果不一致。这种变化会极大地改变使用标准曲线计算的DBS药物浓度测量值。在该计算中，假定圆内的血量始终是恒定的，并且使用从测试样品的标准曲线得出的线性方程式来确定药物或代谢物的量或量的变化。

在分析新生儿时，上述血量差异特别成问题。在这种情况下，存在着将较少量血液放置在滤纸上的系统性偏向。相反，如果将已知体积的血液用于DBS，则消除了相关的变化，因此药物或代谢物的测量是准确的。

为了说明这种现象的一个例子，进行了一系列实验以研究DBS结果不一致的基础。向50微升血液中注入各种浓度的恩丹西酮，并在实验室中小心地点样到滤纸上。在测定的[ONDS]范围内生成了可靠的标准曲线，这些[ONDS]与受试者中测得的相似(图3A和图3B)。这些结果表明，如果在实验室环境中精心准备DBS，则[ONDS]可以准确测量。临床样品结果的差异也可能是由于恩丹西酮分配到血液中存在的红细胞中，而不是分配到血浆中。测量同时制备的全血和血浆样品中的[ONDS]，所述样品是在恩丹西酮给药后的不同时间从小鼠获得的。由于血浆和全血的测量结果完全一致(图3A和图3B)，因此恩丹西酮的差异分配不会导致结果不一致。研究了由滤纸上点样的血量不一致引起的差异。为了使DBS测量准确，必须在滤纸的指定区域内点样恒定的血量。当在实验室中对血液仔细点样时，DBS具有恒定的血量。然而，检查了从临床点获得的DBS，在滤纸的指定区域内点样的血量有很大的变化(图4A和图4B)。对大量临床样品的检查证实，在滤纸上点样的血量存在很大变化。

结果不一致的原因是在临床点在滤纸上点样的新生儿血量不一致。我们的结果还表明，当对新生儿进行分析时，存在着在滤纸上放置较少量的血液的系统性偏向。这解释了为什么在新生儿中[ONDS]测量的趋势线的斜率明显低于成人样品的斜率(图2A和图2B)。当从成人获得血液时，更多的血量被放置在滤纸上。这种变化将显著改变使用DBS获得的药物浓度测量结果。实验室结果表明，如果点样正确的血量，DBS测量可以产生出色的结果；但是，当在临床环境中从新生儿获取血液时，可能很难做到这一点。

当前采样少量血液的方法不足以精确分析和测量血液中的药物和代谢物。在一些方面，本公开的方法和系统解决了用于精确测试分析物的少量样品的采样尺寸不一致的问题。

毛细管微量采样(CMS)可以改善药物测量

测量啮齿动物血液中不同药物浓度的研究表明，使用CMS方法获得的结果非常准确和可靠。典型的小鼠体重在20到25克之间，总血液量不到1.5mL。对于优选小鼠存活的研究，仅需要少量血液的采样程序是必需的，而CMS测量使用的血量小于10微升。CMS使得能够连续测量啮齿动物中的药物浓度，以进行药代动力学和毒代动力学研究。而且，在50多次小鼠CMS研究中显示，如果将稀释的样品适当涡旋，则可以将样品冷冻以便以后分析。鉴于这些正面成果，CMS研究的结果已被监管机构常规接受。

作为概念验证，在小鼠模型中进行了CMS研究。小鼠CMS研究使用8微升EDTA涂覆的玻璃毛细管，这些毛细管可以从商业供应商获得。进行针刺后收集8微升小鼠血液，然后，将毛细管放入含有预先添加的72微升提取缓冲液(水中含有25％V/V乙腈)的旋盖小瓶(1.10ml，V型底)中。将加盖的小瓶摇晃并剧烈涡旋，直到毛细管中的血液溶解在提取缓冲液中(图5)。将小瓶在湿冰上放置20分钟，然后将其保存在-80℃的冷冻柜中。如果需要，可以将样品发送到其他地方进行分析。该研究表明，可以将CMS(收集8微升血液)用于小鼠的系列[ONDS]测量，并且CMS结果与同时获得的小鼠血浆(每个样品收集100微升血液)的[ONDS]测量结果完全一致(图6)。此外，我们的结果表明，CMS测量[ONDS]比DBS测量要可靠得多，DBS测量需要至少10倍以上的血液。因此，CMS适用于少量血液采样，以准确测量和分析药物和代谢物。尽管具有乙腈的CMS显示出是可靠的，但是本公开提供了用于CMS分析的新的且改进的方法。

用于CMS分析的改进的新方法

上一节中描述的CMS实验中的提取缓冲液包含25％的乙腈作为溶剂，这在临床环境中会造成重大安全问题。乙腈在肝脏中被细胞色素P450分子代谢，产生氰化氢和甲醛，它们都是有毒分子。由于氰化物在体内积累，通常在接触后2到13小时会产生毒性作用。吸入含有低至100ppm乙腈的空气可引起毒性作用。值得注意的是，欧盟于2000年禁止在化妆品中使用乙腈。因此，需要使用毒性较小的提取缓冲液，以使获取和处理样品的临床人员能够安全地处理每个样品，甚至可以处理许多样品，以进行药物、代谢物和其他成分的分析和测量。

本公开提供了具有比乙腈毒性低的溶剂的生物相容性溶液(或“提取缓冲液”)。在一些实施方式中，本公开的提取缓冲液用于临床环境，例如在药房或药店。提取液可被认为可以安全使用。由于提取缓冲液的毒性低于乙腈，因此临床点的人员可以从受试者获取样品，然后将样品在临床点提取到提取缓冲液中。提取缓冲液中的提取样品可以现场测试以进行分析。

本文所述的提取缓冲液包含水和稳定溶剂，例如极性质子溶剂。在一些实施方式中，稳定溶剂是异丙醇、甲醇、乙醇或其混合物。在一个实施方式中，稳定溶剂是异丙醇。异丙醇，也被称为“摩擦醇(rubbing alcohol)”，由于其无毒性，可以使用。水中25％的异丙醇可用于临床环境。在一个实施方式中，提取缓冲液包含比例为75/25(V/V)水和稳定溶液。在一些实施方式中，提取缓冲液是比例为75/25(V/V)的水和异丙醇，在本文中称为“iso-CMS”。在一些实施方式中，稳定溶剂不是极性非质子溶剂。

图1示出了检测分析物的方法的说明性示例。本文描述的用于检测分析物的方法和系统通常如下进行。从受试者获得样品(例如101)。样品可以在临床点获得，临床点例如医生办公室，药房，诊所，药店，急诊中心等。从受试者收集样品的个人能够以准确的方式收集样品。个人可以使用毛细管或类似装置从受试者获得少量样品，例如生物流体(例如103)。在一些实施方式中，获得1-50μL，例如约8μL的样品。然后将带有样品的毛细管转移到装有一定体积的生物相容性溶液的容器中，该生物相容性溶液也称为提取缓冲液，其中该生物相容性溶液包含水和本文所述的稳定溶剂，例如异丙醇。将样品与稳定溶剂混合，从而将样品转移到生物相容性溶液中，并被生物相容性溶液稀释(例如105)。在生物相容性溶液中稀释的样品是稀释样品。然后可以通过本文所述的一种或多种技术，例如质谱法，对稀释样品进行处理或分析(例如107)，以检测和/或测量溶液中的一种或多种分析物(例如109)。稀释样品也可以在临床点进行测试。在一些实施方式中，样品是原始样品或未处理的样品。

在一些方面，本公开提供了一种检测分析物的方法，该方法包括：(a)对包含样品和生物相容性溶液的测试溶液进行测定；和(b)检测样品中分析物的存在和/或浓度，其中所述生物相容性溶液包含稳定溶剂和水，并且其中所述样品通过毛细管微量采样(CMS)获得。在一些实施方式中，通过CMS获得的样品量为约1-50μL。在一些实施方式中，稳定溶剂包括极性质子溶剂，例如异丙醇。

在一些方面，本公开提供了用于连续监测从受试者获取的样品中的分析物的方法，该方法包括将通过毛细管微量采样(CMS)获得的所述样品添加到生物相容性溶液中，其中所述生物相容性溶液包含水和稳定溶剂，所述稳定溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇或其混合物；其中以指定的时间间隔采集一个或多个样品。在一些实施方式中，该方法还包括比较一个或多个样品。样品可以来自同一受试者或来自不同受试者。可以将样品与标准品或对照品进行比较。可以监测样品中分析物的存在或浓度的变化。

在一些实施方式中，可能希望随时间监测受试者血液中的药物量。样品可以被连续监测。通常，连续监测方案包括使用本文所述的方法在不止一个时间间隔从患者收集不止一个样品。时间间隔可以是规则的或不规则的。可以每分钟，每小时，每2小时，每6小时，每12小时，每24小时，每2天，每周，每月，每年或与这些间隔之一相当的间隔对样品进行监测。

例如，可以随时间向患者施用药物，并且监测血浆药物水平以确定血浆中的药物浓度是否在该药物的治疗窗内。可以使用本文所述的CMS方法每天或以其他间隔获取血液样品，并对这些样品进行分析以确定血浆药物浓度。

在一些方面，本公开提供了一种确定疾病或病症的方法，该方法包括：(a)对包含样品和生物相容性溶液的测试溶液进行测定；和(b)检测样品中分析物的存在和/或浓度，其中所述生物相容性溶液包含稳定溶剂和水，并且其中所述样品通过毛细管微量采样(CMS)获得。在一些实施方式中，通过CMS获得的样品量为约1-50μL。在一些实施方式中，疾病或病症是遗传疾病。

生物相容性溶液

在本文公开的方法、系统或试剂盒的一些实施方式中，生物相容性溶液包含水和稳定溶剂。稳定溶剂可以是毒性低于乙腈的溶剂。在一些实施方式中，稳定溶剂是一种或多种极性质子溶剂。稳定溶剂可以是任选取代的烷基醇。稳定溶剂可包括甲醇、乙醇、异丙醇或其混合物。在一些实施方式中，稳定溶剂包括异丙醇。在一些实施方式中，稳定溶剂基本上由异丙醇组成。稳定溶剂可以被认为是安全使用的并且可以适合于临床环境。在一些实施方式中，生物相容性溶液用于将诸如血液的样品从毛细管提取到溶液中。在一些实施方式中，稳定溶剂不是极性非质子溶剂。

在一些实施方式中，生物相容性溶液包含10-80％V/V的稳定溶剂，例如异丙醇。例如，生物相容性溶液可包含约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％V/V的稳定溶剂。生物相容性溶液可以包含10-75％、15-50％、15-40％或20-30％V/V的稳定溶剂。在一些实施方式中，生物相容性溶液包含50-80％V/V的稳定溶剂。例如，生物相容性溶液包含75％V/V的异丙醇。在一些实施方式中，生物相容性溶液包含20-30％V/V的稳定溶剂。在一些实施方式中，生物相容性溶液包含约25％V/V的稳定溶剂。例如，生物相容性溶液包含25％V/V的异丙醇。

在一些实施方式中，测试溶液在约50-1000μL的生物相容性溶液，例如50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、900或1000μL的生物相容性溶液中包含少量样品。测试溶液可包含约50-100μL、100-200μL、200-300μL、300-400μL或400-500μL的生物相容性溶液。在一些实施方式中，测试溶液在约50-100μL的生物相容性溶液，例如约72μL的生物相容性溶液中包含少量样品。

在一些实施方式中，生物相容性溶液包含10-500μL的稳定溶剂，例如异丙醇。例如，生物相容性溶液可包含约10、20、30、40、50、60、70、80或90μL的稳定溶剂。生物相容性溶液可包含约100、110、120、130、140、150、160、170、180或190μL的稳定溶剂。生物相容性溶液可包含约200、210、220、230、240、250、260、270、280或290μL的稳定溶剂。生物相容性溶液可包含约300、310、320、330、340、350、360、370、380或390μL的稳定溶剂。生物相容性溶液可包含约400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500μL的稳定溶剂。在一些实施方式中，生物相容性溶液包含10-100μL、10-75μL、10-50μL、50-150μL、50-125μL、50-100μL或50-90μL的稳定溶剂。

在一些实施方式中，生物相容性溶液基本上不含有毒溶剂。生物相容性溶液可以不含有毒溶剂。在一些实施方式中，生物相容性溶液包含少于25％的有毒溶剂，例如少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％的有毒溶剂。在一些实施方式中，生物相容性溶液包含少于5％的有毒溶剂。在一些实施方式中，生物相容性溶液包含少于1％的有毒溶剂。

在一些实施方式中，生物相容性溶液基本上不含乙腈。生物相容性溶液可以不含乙腈。在一些实施方式中，生物相容性溶液包含少于25％的乙腈，例如少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％的乙腈。在一些实施方式中，生物相容性溶液包含少于5％的乙腈。在一些实施方式中，生物相容性溶液包含少于1％的乙腈。

分析物的测量

本文所述的方法或系统可用于测量样品中的一种或多种分析物。这些分析物可以在进行本文所述的任何方法之前，之中或之后被衍生、保存、纯化或以其他方式进行额外的处理。另外，可以在收集样品之后立即测量分析物，或者存在延迟，在此延迟期间存储、稀释、衍生化、验证或以其他方式处理样品。在一些实施方式中，样品是原始样品或未处理的样品。在本文公开的方法或系统的一些实施方式中，分析物是药物、代谢物或营养物。在一些实施方式中，测试抗癌剂，抗癫痫药，阿片类剂，镇痛药，激素治疗剂，例如类固醇，维生素A，维生素D等，以诊断疾病或病症。

药物.在本文公开的方法或系统的一些实施方式中，分析物是药物。药物可以是抗癌药，阿片类或药物活性剂。在一些实施方式中，分析物是地塞米松。这些药物类型包括前药和药物代谢物。在一些实施方式中，药物是药物的组合。

抗癌药.可以通过这种方法检测的一些药物是用于治疗癌症的药物，在本文中称为抗癌药。癌症是一组涉及异常细胞生长的疾病，可能侵袭或扩散到身体的其他部位，或发生转移。抗癌药可以是化学治疗药物，靶向治疗药物或激素治疗药物。

化学治疗药物包括烷化剂、抗代谢物、抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂和细胞毒性抗生素。靶向治疗药物包括激素治疗药物、信号转导抑制剂、基因表达调节剂、凋亡诱导剂、血管生成抑制剂、免疫治疗药物和毒素传递分子。激素治疗药物包括干扰激素以阻止或减慢激素敏感性肿瘤生长的药物。

可以通过本文所述的方法检测的化学治疗药物的实例包括但不限于环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿霉素、多西他赛、博来霉素、长春碱、达卡巴嗪、芥子长春新碱(mustine vincristine)、丙卡巴嗪(procarbazine)、泼尼松龙、依托泊苷、顺铂、表阿霉素、卡培他滨、亚叶酸和奥沙利铂。

阿片类药物.在本文公开的方法的一些实施方式中，药物可以是阿片类药物。提出了基于Iso-CMS的阿片类分析方法(iCOAM)，用于多种感兴趣的阿片类，包括但不限于海洛因，吗啡，可待因，羟考酮及其代谢物(去甲羟考酮(noroxycodone)，羟吗啡酮(oxymorphone))，氢可酮及其代谢物(氢吗啡酮)，美沙酮，丁丙诺啡芬太尼，氢吗啡酮和二乙酰吗啡。

其他药物.可以使用本文所述的方法测量的其他药物包括抗焦虑药，抗生素，抗凝剂，抗惊厥药，抗抑郁药，抗组胺药，抗高血压药，抗高血脂药，抗偏头痛药，抗精神病药，抗病毒药，β-肾上腺素阻断剂，苯二氮卓，支气管扩张剂，钙通道阻断剂，皮质类固醇，利尿剂，麻醉剂，神经肌肉阻滞剂或质子泵抑制药。所测量的药物可以是激动剂，反向激动剂或拮抗剂。

可以通过本文描述的方法测量的其他药物的一些实例包括但不限于华法林、波生坦、克立咪唑、加巴喷丁和速尿。可以通过本文描述的方法测量的药物的代谢物包括但不限于SN-38、羟吗啡酮和去甲羟考酮。

代谢物.在本文公开的方法或系统的一些实施方式中，分析物是代谢物。本文讨论的代谢物是在代谢过程中形成的物质，代谢包括分子的合成代谢和分解代谢。代谢物可以是代谢的中间产物或最终产物。代谢物可以由药物、营养物或其他分子的代谢形成。

可以使用本文描述的方法来测量位于生物流体中的代谢物，所述代谢物可以使用标准分析方法来测量，所述标准分析方法包括但不限于质谱法、光谱法、色谱法、电泳法或ELISA。

在某些情况下，需要测量药物或营养物的代谢物，而不是测量药物或营养物本身。在某些情况下，由于代谢物是有毒的，需要测量代谢物，因此必须对其水平进行监测，以避免不良影响。

在某些情况下，需要测量代谢物，因为代谢物提供了一些额外的好处，因此应监测其水平以确保获得好处。在某些情况下，需要测量代谢物，因为药物的半衰期非常短，但代谢物的半衰期较长，因此代谢物的水平可能更能指示受试者的状况。在某些情况下，需要测量代谢物，因为代谢物比药物或营养物更稳定，因此，使用代谢物时方法可以更容易或更准确地进行。在某些情况下，需要测量代谢物，因为代谢物可以为研究目的提供额外的信息。

营养物.在本文公开的方法或系统的一些实施方式中，分析物是营养物。如果分析物是营养物，则其可以是微量营养物或大量营养物。如果营养物是大量营养物，则其可以是蛋白质、氨基酸、碳水化合物、甾醇或脂质。如果营养物是微量营养物，则其可以是维生素或矿物质。

蛋白质和氨基酸.在一些实施方式中，营养物是蛋白质或氨基酸。氨基酸是含有胺和羧基官能团以及侧链的有机化合物。蛋白质是氨基酸的组装链。

通过本文描述的方法测量的氨基酸可以是脂族的，芳族的，酸性的，碱性的，含羟基的，含硫的，含酰胺基的，非必需的或必需的。

如果营养物是氨基酸，则其可以是苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，别异亮氨酸，丙氨酸，甘氨酸，脯氨酸缬氨酸，色氨酸，酪氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，精氨酸，组氨酸，赖氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，蛋氨酸，天冬酰胺或谷氨酰胺。

在一些实施方式中，由于氨基酸是遗传疾病的标志物，因此测量氨基酸被用作诊断工具。例如，苯丙氨酸是苯丙酮尿症(PKU)的标志物，因此可以使用本文所述的方法测量苯丙氨酸以诊断PKU。另外，亮氨酸、异亮氨酸和别异亮氨酸是枫糖浆尿病(MSUD)的标记，因此可以使用本文所述的方法对它们进行测量以诊断MSUD。关于这些实施方式的更多细节可以参见实施例部分。

碳水化合物.在一些实施方式中，本文公开的方法或系统可用于测量碳水化合物。

碳水化合物及其代谢对于健康至关重要。因此，测试和监测碳水化合物符合公共卫生的利益。本文所述的Iso-CMS和方法可以检测少量样品中的碳水化合物。

甾醇.在本文公开的方法的一些实施方式中，分析物是甾醇。在一些实施方式中，本文公开的方法或系统用于测量样品中的甾醇胆固醇。人体需要胆固醇来制造激素，维生素D和消化助剂。除了饮食来源外，人体还会产生胆固醇。胆固醇过多会导致心脏病和其他疾病，因此监测此分子的水平至关重要。

在其他实施方式中，本文公开的方法或系统用于测量其他甾醇，包括植物甾醇和甾烷醇。食用植物甾醇和甾烷醇后，它们可以降低受试者体内的循环胆固醇水平，从而降低受试者患心脏病的风险。

脂质.在本文公开的方法的一些实施方式中，分析物是脂质。脂质是脂肪酸及其衍生物，包括甘油三酸酯，甘油二酸酯，甘油单酸酯和磷脂，以及其他含甾醇的代谢物。这些分子通常不溶于水，但可溶于其他溶剂，包括本文方法中所述的溶剂。脂质可以是脂肪酸，甘油脂，甘油磷脂，鞘脂，甾醇脂，孕烯醇酮脂(prenol lipids)，糖脂或聚酮。

考虑到监测饮食中脂肪摄入和身体脂肪状况的重要性，测量和监测受试者中的脂质是令人感兴趣的。本文描述的方法可用于使用小样本量来测量脂质。

维生素.维生素可以是维生素，维生素原或其前体。例如，维生素可以是维生素A，维生素B，维生素C，维生素D或维生素E。在本公开的方法的一些实施方式中，分析物是维生素D。由于这些维生素对于健康是必不可少的，因此测试和监测它们以防止缺乏或过量以及与这些状况相关的疾病符合公共卫生的利益。

维生素B.

维生素B及其代谢物的测量可以使用几种当前可用的测量技术进行，包括质谱，色谱技术和其他技术。本文提供的方法可用于从少量生物流体样品中测量维生素B。

维生素C.

维生素C是重要的循环抗氧化剂，具有抗炎和免疫支持作用，是重要的单加氧酶和双加氧酶的辅助因子。越来越多的针对创伤，局部缺血/再灌注和脓毒症模型的临床前研究表明，以药理剂量给药的维生素C可减轻氧化应激和炎症，并恢复内皮和器官功能。较早的研究表明，给予补充剂量的维生素C(每天2-3g静脉注射维生素C)可以减少器官功能障碍。最近使用药理剂量(6–16g/天)进行的小型对照研究表明，维生素C可以减少血管加压药支持和器官功能障碍，甚至可以降低死亡率。

测试和监测维生素C的水平符合公共卫生的利益。可以使用本文所述的方法使用少量样品来进行这种测试和监测。

维生素D.本文所述的方法(例如iso-CMS)能够测量血液中营养物的量。这可以是大量营养物或微量营养物，例如维生素或矿物质。例如，维生素D可以通过使用iso-CMS收集的样品进行测量。在一些实施方式中，可以测试样品以评估骨骼健康。

已知维生素D在钙和骨代谢，怀孕期间的孕产妇健康和儿童发育中起重要作用。最近发现它与多种其他医学病症有关，包括糖尿病，心血管疾病，关节炎，多发性硬化症和癌症。

由于它们的低丰度和低电离势，化学衍生化策略可通过将可电离基团引入维生素D代谢物来提高检测灵敏度。狄尔斯–阿尔德(Diels-Alder)衍生化反应用于使亲二烯试剂与维生素D的顺式二烯基反应。但是，最近已经开发了第二代衍生化方法，该方法现在使多种维生素D代谢物的测定成为可能。这些方法即使在样本量较小的情况下也可以进行测定，例如在iso-CMS中。

维生素E.维生素E是描述生育酚和生育三烯酚化学类别的α-，β-，δ-和γ-形式的总称。

测试和监测维生素E的水平符合公共卫生的利益。可以使用本文所述的方法使用少量样品来进行这种测试和监测。

矿物质.在一些实施方式中，本文描述的方法可以用于测量来自受试者的样品中的矿物质的量。矿物质作为受试者饮食的一部分被消耗。矿物质是生物体所需的化学元素。必须保持每种饮食矿物质的适当摄入量，以保持身体健康。

可以通过本文描述的方法测量的矿物质包括但不限于钙，磷，钾，硫，氯化钠，镁，铁，锌，铜，锰，碘，硒，钼，铬和氟化物。在每种情况下，矿物质的量对于健康都是重要的，因为太多或太少都会对受试者的健康产生有害影响。

遗传病的诊断

在一些方面，本公开提供了一种确定疾病或病症的方法，该方法包括：(a)对包含样品和生物相容性溶液的测试溶液进行测定；(b)检测样品中分析物的存在和/或浓度，其中所述生物相容性溶液包含稳定溶剂和水，并且其中所述样品的量为约1-50μL。在一些实施方式中，疾病或病症是遗传疾病。

超过500种疾病与导致蛋白质/酶产生受损的基因突变有关，这些疾病被称为先天性代谢缺陷(IEM)。其中的91种如果在任何早期阶段被诊断出就可以治疗。此外，可治疗的IEM中有13种是影响氨基酸产生或分解代谢的疾病(氨基酸代谢缺陷症)：苯丙酮尿症(PKU)，枫糖浆尿病(MSUD)，同型胱氨酸尿症/四氢叶酸亚甲基还原酶(MTHFR)缺乏症，II型酪氨酸血症，I型和II型瓜氨酸血症，精氨酸琥珀酸尿症，氨基甲酰磷酸合成酶I(CPS)缺乏症，精氨酸血症(精氨酸酶缺乏症)，高鸟氨酸血症-高氨血症-高瓜氨酸尿症(HHH)综合征，N-乙酰谷氨酸合酶(NAGS)缺乏症，鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症和丙酮酸脱氢酶(PDH)复合体缺乏症。如果存在有效的新生儿筛查计划，则可以减轻这些IEM造成的经济和心理负担。如果尽早做出诊断，可以进行饮食或其他改良措施以防止疾病引起的损害。

样品

本文所述的任何方法或系统，包括iso-CMS，也可用于测量样品，例如血液和其他生物液体。在一些实施方式中，样品是用于诊断测试的生物流体。Iso-CMS可对血液、眼泪、汗液、脑脊液(CSF)和其他体液进行无创采样，以进行分析。

在一些实施方式中，样品选自下组：血液、血清、血浆、鼻拭子或鼻咽洗液、唾液、尿液、眼泪、胃液、脊髓液、粪便、黏液、汗液、耳垢、油、腺分泌物、脑脊液、组织、精液和阴道液、咽拭子、呼气、头发、指甲、皮肤、活检物、胎盘液、羊水、脐带血、强调液、腔液、痰、黏液、脓疱、微生物群、胎粪、母乳和/或其他排泄物。在一些实施方式中，生物流体是血液、尿液、眼泪、唾液、汗液、精液或脑脊液。在一些实施方式中，样品是血液。在一些实施方式中，样品是新生儿血液。

在一些实施方式中，从受试者获得少量样品，例如血液。在一些实施方式中，从受试者获得的样品量为约或至少约2μL、3μL、4μL、5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL、500μL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL或10mL。在一些实施方式中，从受试者获得约2-100μL的样品和/或该量的用品用于测试。例如，从受试者中获得2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100μL的样品和/或该量的样品用于测试。在一些实施方式中，获自受试者的样品量为或约为2-25μL、4-15μL或4-10μL和/或该量的样品用于测试。在一些实施方式中，从受试者获得约8μL的样品和/或该量的样品用于测试。在一些实施方式中，在分析之前，用生物相容性溶液稀释从受试者获得的样品量。

在一些实施方式中，样品被生物相容性溶液稀释。在一些实施方式中，样品被生物相容性溶液稀释约3至20倍，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20倍。样品被生物相容性溶液稀释约5到15倍。在一些实施方式中，样品被生物相容性溶液稀释约10倍。

在本文公开的方法的一些实施方式中，该方法还包括对样品进行冷却。样品可以被冷却以保存样品以备后用。例如，可以将样品放在冰上，冷水中或温度受控的设备(如冰箱或冷冻柜)中。冷却样品可以包括将样品保持在大约低于0°F的温度。在一些实施方式中，在进行测定之前将样品冷却。样品可以预先冷冻，在进行测定之前融化。在本文所述方法的一些实施方式中，所述方法还包括添加抗凝剂或防腐剂。

在单独或组合地实施上述或本文其他地方所述的任何方法时，对样品的定性和/或定量评估可以在将样品从采样点运输到能够测试样品的机构或不进行这种运输的情况下进行。在一些实施方式中，该机构是临床点，例如药房或药店。

测定

本文描述的方法或系统可以与任何一种或多种测定结合，所述测定是可以用于诊断测试的标准分析方法。该组测定包括但不限于质谱、光谱、色谱、电泳或酶联免疫吸附测定(ELISA)。

质谱是一种分析化学物种的分析技术，它根据质荷比将分析物产生的离子分离。质谱可以应用于分析纯样品以及复杂样品，例如本文所述的生物流体。

光谱是基于电磁辐射与样品之间相互作用的样品分析。用于样品的光谱分析的装置包括光谱仪、分光光度计、摄谱仪和光谱分析仪。

色谱是通过将混合物以溶液形式或以蒸气形式通过介质而使混合物分离，在该介质中组分以不同的速率移动。这样，可以分离出样品的成分；这样就可以对它们进行识别和量化。

色谱可以与质谱或光谱结合使用以分析样品。这种组合的例子包括LCMS(液相色谱/质谱)和GCMS(气相色谱/质谱)。

在一些方面，本公开提供了一种进行测定的方法，该方法包括对包含样品和生物相容性溶液的测试溶液进行测定，其中样品的量为1-50μL，并且其中测定的误差比等于或小于20％。在一些方面，本公开提供了一种进行测定的方法，该方法包括对包含样品和生物相容性溶液的测试溶液进行测定，其中样品通过CMS获得，并且其中测定的误差比小于20％。

如本文所用，误差比(ER)是从本文描述的方法测量的分析物的量与从金标准方法收集的血浆测量的分析物的量的偏差的标准化值，其计算如下：

其中A_CMS是从通过本文所述MS方法获得的样品测得的分析物的量，而A_血浆是从通过金标准方法同时获得的样品测得的分析物的量，其中金标准方法可以是通过静脉穿刺获得血浆。ER为0表示该方法与金标准完全吻合。较低的ER(接近0)表示该方法产生的结果与金标准的结果相似，而较高的ER表示该方法产生的结果与金标准的结果不同。ER的范围可以是0至100％。

受试者

在本文描述的任何方法或系统中，受试者是人或动物。受试者可以是婴儿、儿童、青少年、成人或老年受试者。受试者可能患有遗传疾病、慢性疼痛、癌症、感染性疾病、心血管疾病、营养缺乏症、代谢病，药物成瘾或其他疾病，或处于患这些疾病的风险中。受试者可以是怀孕的，例如孕妇。在一些实施方式中，受试者是新生儿。在一些实施方式中，受试者患有营养缺乏症。

在本文描述的任何方法的一些实施方式中，受试者是人。例如，人受试者可以是成人、儿童或婴儿。在一个示例性实施方式中，人受试者是成人。人受试者可以是18岁或年龄更大的成人。人受试者可以在18岁至90岁之间。在某个实施方式中，人受试者在40岁至85岁之间。在一个示例性实施方式中，人受试者在65岁至80岁之间。

在本文描述的任何方法的一些实施方式中，受试者是动物。动物受试者可以是家养动物，例如狗或猫。动物受试者可以是小鼠或大鼠。动物受试者可以是至少7周龄的小鼠或大鼠。动物受试者可以是7至15周龄的小鼠或大鼠。动物受试者可以是10至11周龄的小鼠或大鼠。

遗传测试患者.如果受试者患有遗传疾病或处于患遗传疾病的风险中，则本文所述的任何方法均可用于分析样品中该遗传疾病的标志物的存在。在两个值得注意的实施方式中，受试者处于患PKU或MSUD的风险中。如果受试者有患PKU的危险，则本文所述的任何方法可用于测量苯丙氨酸水平，因为苯丙氨酸是PKU的标志物。

如果受试者有患MSUD的危险，则本文所述的任何方法可用于分析支链氨基酸的水平，所述支链氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和别异亮氨酸，它们是MSUD的标志物。

如果受试者是婴儿，则受试者可能处于患遗传疾病的风险中，本文所述的任何方法可以用于测试受试者的PKU，MSUD或本文所述的任何其他遗传疾病。

慢性疼痛.如果受试者是慢性疼痛患者，则该患者可以具有一种或多种阿片类或其他镇痛药物的处方。在该实施方式中，可以分析患者样品中是否存在处方或非处方阿片类或其他镇痛药物，以监测治疗安全性和依赖性风险。

营养缺乏.如果受试者患有营养缺乏症或处于营养缺乏的风险中，则本文所述的任何方法可用于分析样品中营养物的缺乏。在这种情况下，营养物可以是大量营养物或微量营养物。如果营养物是大量营养物，则其可以是蛋白质、氨基酸、碳水化合物或脂质。如果营养物是微量营养物，则其可以是维生素或矿物质。如果营养素是维生素，则其可以是维生素A、维生素B、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K或这些维生素的任何前体或代谢物。如果营养物是矿物质，则其可以是钙、磷、钾、硫、氯化钠、镁、铁、锌、铜、锰、碘、硒、钼、铬或氟化物。

感染性疾病.如果受试者患有感染性疾病或处于患感染性疾病的风险中，则本文所述的任何方法可用于分析样品中感染性疾病的标志物或给予受试者以治疗感染性疾病的抗生素、抗病毒药、抗真菌药或抗寄生虫药。

心血管疾病.如果受试者患有心血管疾病或处于患心血管疾病的风险中，则本文所述的任何方法可用于分析样品中的胆固醇。同样在该实施方式中，本文描述的任何方法可用于分析样品中用于治疗心血管疾病的药物，包括但不限于他汀类、正性肌力药物、变时性药物或其他可治疗心血管疾病的药物。

癌症患者.利用本公开方法的受试者包括已被诊断患有以下疾病的受试者：急性髓系白血病，急性髓系白血病，青少年癌症，儿童肾上腺皮质癌，艾滋病相关癌症(例如淋巴瘤和卡波西氏肉瘤)，肛门癌，阑尾癌，星形细胞瘤，非典型畸胎瘤，基底细胞癌，胆管癌，膀胱癌，骨癌，脑干胶质瘤，脑瘤，乳腺癌，支气管肿瘤，伯基特淋巴瘤，类癌，非典型畸胎瘤，胚胎性肿瘤，生殖细胞肿瘤，原发性淋巴瘤，宫颈癌，儿童期癌症，脊索瘤，心脏肿瘤，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，慢性髓细胞性白血病(CML)，慢性骨髓增生性疾病，结肠癌，结直肠癌，颅咽管瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，肝外导管原位癌(DCIS)，胚胎性肿瘤，中枢神经系统癌，室管膜瘤，食道癌，嗅神经母细胞瘤，尤因肉瘤，颅外生殖细胞瘤，性腺外生殖细胞瘤，眼癌，骨纤维组织细胞瘤，胆囊癌，胃癌，胃肠道类癌，胃肠道间质瘤(GIST)，生殖细胞瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，毛细胞白血病，头颈癌，心脏癌，肝癌，霍奇金淋巴瘤，下咽癌，眼内黑色素瘤，胰岛细胞瘤，胰腺神经内分泌肿瘤，肾癌，喉癌，唇和口腔癌，肝癌，小叶原位癌(LCIS)，肺癌，淋巴瘤，原发隐匿性转移性鳞状颈癌，中线癌(midline tract carcinoma)，口癌，多发性内分泌肿瘤综合征，多发性骨髓瘤/浆细胞瘤，蕈样肉芽肿，骨髓增生异常综合征，骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤，多发性骨髓瘤，默克尔细胞癌，恶性间皮瘤，骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤，鼻腔和鼻窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，非霍奇金淋巴瘤，非小细胞肺癌(NSCLC)，口癌，唇和口腔癌，口咽癌，卵巢癌，胰腺癌，乳头状瘤病，副神经节瘤，鼻窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，咽癌，胸膜肺母细胞瘤，原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤，前列腺癌，直肠癌，移行细胞癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，唾液腺癌，皮肤癌，胃癌(胃肿瘤)，小细胞肺癌，小肠癌，软组织肉瘤，T细胞淋巴瘤，睾丸癌，喉癌，胸腺瘤和胸腺癌，甲状腺癌，肾盂输尿管移行细胞癌，滋养细胞肿瘤，儿童期罕见癌症，尿道癌，子宫肉瘤，阴道癌，外阴癌，病毒性癌症，白血病，血液系统恶性肿瘤，实体瘤癌，前列腺癌，去势抵抗性前列腺癌，乳腺癌，尤因肉瘤，骨肉瘤，原发性骨肉瘤，T细胞前淋巴细胞白血病，胶质瘤，成胶质细胞瘤，肝细胞癌，肝癌或糖尿病，相关疾病，以及它们的组合。在一些实施方式中，用本公开的食品组合物、液体组合物和/或干组合物治疗的受试者包括已经被诊断患有以下疾病的受试者：非癌性高增生性疾病，例如皮肤良性增生(例如牛皮癣)，再狭窄良性增生和前列腺良性增生(例如，良性前列腺肥大(BPH))。受试者可具有癌症的遗传易感性。

系统

根据本发明的另一个方面，可以提供一种用于评估从受试者收集的样品以帮助诊断、治疗或预防疾病的系统。在一些方面，本公开提供一种评估从受试者收集的样品的系统，该系统包括(a)被配置为从设备接收数据的通信单元，其中该设备被配置为处理样品，从而生成随后定性和/或定量评估所述样品所需的数据，其中所述设备包括(i)被配置为接收样品的样品收集单元；(ii)样品制备单元，其被配置为制备生物样品用于随后的定性和/或定量评估，其中所述样品制备单元允许将生物相容性溶液添加到血液样品中；和(iii)传输单元，其被配置为将数据传输到授权的分析机构和/或其附属机构；和(b)处理器，该处理器处理所述数据，以随后在授权的分析结构和/或其附属机构处定性和/或定量地评估所述血液样品，其中所述生物相容性溶液包含水和稳定溶剂。样品可以在临床点或实验室收集。

单独或组合地，上文或本文其他地方描述的系统可以包括被配置为接收与所述定性和/或定量评估有关的信息的设备，并且任选地在该设备上显示所述信息。单独或组合地，上文或本文其他地方描述的系统可以包括检测分析物，例如药物、代谢物或营养物。在一些实施方式中，样品通过CMS收集。在一些实施方式中，样品是在医疗保健提供者的办公室、医院、诊所、药店、药房或医疗机构收集的。在一些实施方式中，样品是在药房收集的。在一些实施方式中，样品是在家收集的。单独或组合地，在上文或本文其他地方描述的系统中，定性和/或定量评估可以涉及检测分析物的存在或浓度。

单独或组合地，在上文或本文其他地方描述的一些系统中，可以通过针刺收集生物样品。在一些实施方式中，从受试者获得约2-100μL的样品和/或将该量的样品用于测试。在一些实施方式中，生物流体是血液、尿液、眼泪、唾液、汗液、精液或脑脊液。

机构

本公开提供了用于制造和/或施用本文所述的试剂盒的机构以及用于使用本文所述的方法的机构。在一些方面，本公开提供了一种机构，其包括本文所述的多个试剂盒。在某些实施方式中，该机构制造本文所述的试剂盒或其组件。在一个实施例中，机构是制造场所。在某些实施方式中，机构分配本文所述的试剂盒或其组件。例如，机构可以是分配中心。在某些实施方式中，机构向患者、医疗保健提供者、医院、诊所、药店、药房、医疗机构等提供本文所述的试剂盒及其组件。在一个实施方式中，机构可以将试剂盒出售给药店。在另一个实施方式中，机构可以制备本文公开的试剂盒。在另一个实施方式中，该机构可以将试剂盒施用于受试者。例如，机构可以是医院、诊所、药店、药房或医疗机构。该机构可以位于医院、诊所、药店、药房或医疗机构的内部或附近，例如在医院、诊所、药店、药房或医疗机构的0.1、0.5、1或5英里范围之内。

试剂盒

本公开提供了试剂盒。试剂盒可用于本文公开的任何方法和/或系统。试剂盒可以包括在适当包装中的本文所述的容器和溶液，以及可以包括使用说明、副作用列表等的书面材料。在一些方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含：(a)被配置为通过毛细管作用从受试者获得样品的容器，(b)生物相容性溶液，和(c)说明书。此类试剂盒还可包含信息，例如科学文献参考，包装说明书材料和/或这些内容的概述等，它们指示或确定本文所述方法的活性和/或优势，和/或描述给药方式，副作用或对医疗保健提供者和/或患者有用的其他信息。在一些实施方式中，容器可以被构造成从受试者提取少量样品，例如1-50μL。在本文公开的试剂盒的一些实施方式中，生物相容性溶液包含水和稳定溶剂。稳定溶剂可包括极性质子溶剂。稳定溶剂可包括甲醇、乙醇、异丙醇或其混合物。在一些实施方式中，生物相容性溶液包含异丙醇和水。在本文公开的试剂盒的一些实施方式中，试剂盒还包括用于样品保存的抗凝剂等。在本文公开的试剂盒的一些实施方式中，试剂盒还包括配置为刺穿受试者皮肤的装置。在本文公开的试剂盒的一些实施方式中，试剂盒还包括毛细管。在一些实施方式中，说明书描述了进行毛细管微量采样(CMS)以将样品吸入毛细管中，将毛细管插入含有生物相容性溶液的容器中，并且搅拌容器直到样品被转移至生物相容性溶液中。

在一些实施方式中，用于样品和生物相容性溶液的容器在试剂盒内以不同的容器提供。在一些实施方式中，用于样品和生物相容性溶液的容器在试剂盒内作为一个容器提供。合适的包装和使用的其他物品(例如，用于液体制剂的量杯，将空气暴露最小化的箔包装等)在本领域中是已知的，并且可以包括在试剂盒中。可以向包括医生、护士、药剂师、处方官员等在内的健康服务提供者提供、销售和/或推广本文所述的试剂盒。在一些实施方式中，也可以直接向消费者提供、销售和/或推广试剂盒。

在一些实施方式中，本文所述的试剂盒可包含用于多次测试的供应品。试剂盒可包含指导在数天、数周或数月的时间内使用供应品的说明。

实施例

实施例1：用于CMS和iso-CMS方法的稳定溶剂鉴定。

为了鉴定替代溶剂，检查了血液[ONDS]测量的标准曲线和检测灵敏度，其在CMS条件下进行，如图3A和3B所示。将全血稀释10倍至稳定溶液中，该稳定溶液包含乙腈、异丙醇、甲醇或乙醇中的一种(25％V/V)和水，这些溶剂各自的毒性低于乙腈，即需要更高的剂量才能使它们表现出毒性效应。然后将它们用于测定注入了一定范围[ONDS]的血样。如上所述进行测定。所有测试的提取溶剂均产生与乙腈对照样品相同的结果(图7A)。选择异丙醇进行进一步测试，并在临床环境中将其用作[ONDS]测量的稳定溶剂。同样，如上所述进行这些测试和测量。研究表明，使用在水中包含异丙醇(25％V/V)的稳定溶液进行CMS方法(iso-CMS)可以在用恩丹西酮给药后在小鼠中准确测定[ONDS](图7B)。重要的是，通过iso-CMS测量确定的[ONDS]与通过血浆分析测量的[ONDS]相同。

可以准确测量使用iso-CMS方法获得的样品中具有不同化学结构的多种其他药物的浓度。也就是说，iso-CMS可准确测量波生坦、速尿、克立咪唑、伊立替康和伊立替康代谢物SN-38的浓度。将已知量的这些药物添加到已采集并稀释到稳定溶液中的少量血液样品中，用于CMS(含乙腈)或iso-CMS(异丙醇)方法。对于这些分析，将全血稀释10倍至稳定溶液中，该稳定溶液包含25％的乙腈或25％的异丙醇和75％的水，然后使用LC-MS分析来测量药物的浓度。对于每种药物，创建了描绘相对于样品中药物浓度的响应比或测得的响应强度的图。图8中显示了描绘典型数据的代表性图。分析结果的线性回归分析表明，iso-CMS方法测量这些药物的线性和灵敏度与使用乙腈的方法相似。实际上，对于每种测试药物，在测试的药物浓度范围内，异丙醇稳定溶液产生的结果与乙腈稳定溶液的结果相同。因此，在这种方法中，血样的量足够一致，并且药物具有足够的可溶性；当稳定溶液中使用异丙醇(省略乙腈)时，可以获得准确的测量结果。鉴于上述结果，当在稳定溶液的组成中使用甲醇、乙醇或其混合物时，预期iso-CMS方法取得相似的效果。

实施例2：用iso-CMS检测血液标志物

在该实施例中，通过本文所述的iso-CMS方法准确地测量了遗传疾病的血液标志物。因此，研究表明，使用这些方法可以轻松、快速且无创地诊断出这种遗传疾病。

苯丙酮尿症(PKU)提供了一种可治疗IEM的例子。PKU(OMIM261600)是一种常染色体隐性IEM，它是由染色体12q23.2上的171kB基因编码的452氨基酸酶(苯丙氨酸羟化酶，PAH)缺乏引起的，该酶介导苯丙氨酸(Phe)代谢。有毒的Phe代谢物的积累会导致生长衰竭，小头畸形，癫痫发作，发育迟缓和严重的智力障碍。

筛查和治疗。PKU是第一种获得有效治疗的遗传疾病，该治疗是在饮食中限值摄入苯丙氨酸。因此，对新生儿进行PKU筛查至关重要。通常，新生儿血液的获得是通过脚后跟针刺采血并收集在滤纸上，然后通过串联MS进行分析。新生儿全血或血浆中Phe的最高参考限值为<150μmol/L(而年龄较大的儿童则略低(<120μmol/L))。饮食中限制Phe可非常有效地预防神经系统发育受损，应至少在整个神经发育期间持续。定期监测血液中的Phe水平以评估饮食的依从性。

该研究试图确定iso-CMS方法是否可用于诊断PKU。从10名受试者中收集血浆样品，其中5名正常，5名患有PKU。将每个样品的8ul血浆放入8μL涂覆有EDTA的玻璃毛细管中(威格斯医疗(Vitrex Medical)A/S，丹麦)。将该管放入装有72μL溶液的离心管中，该溶液由25％异丙醇的水溶液组成。然后将混合物充分涡旋，并从该血浆样品的1/10稀释液中制备后续的稀释液。将等份的稀释样品与等体积的作为内标添加的0.8μM D8-苯丙氨酸混合。加入三倍体积的冰冷乙腈，蛋白质沉淀，将混合物离心。获得上清液；将其蒸发至干，然后重新悬浮于HPLC水中。使用丹磺酰(Dansyl)衍生化并结合LC/MS分析的半靶向代谢组学方法(STMM)进行了分析，我们已成功地利用该方法在其他系统中以无偏方式分析了代谢组学变化。丹磺酰衍生化可改善反相色谱柱上的代谢物分离，并将检测灵敏度提高10到1000倍。使用我们先前描述的方法[Wu M，Zheng M，Zhang W，Suresh S，Schlecht U，Fitch WL，Aronova S，Baumann S，Davis R，St Onge R，Dill DL，Peltz G.2012，《通过酵母中的化学基因组和代谢组学分析鉴定药物靶标》(Identification of drug targets bychemogenomic and metabolomic profiling in yeast)，Pharmacogenet Genomics 22：877-86]将样品丹磺酰化，在配备Infinity 1290UPLC系统的安捷伦QTOF 6520[加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦公司(Agilent,Santa Clara,CA)]上分析该丹磺酰化的样品。使用安捷伦QTOF定量分析软件，相对于标准曲线可计算出苯丙氨酸浓度。为了进行比较，在临床实验室改进修正案(CLIA)认证的实验室(斯坦福病理学临床实验室)中，使用先前描述的方法[Le A,Ng A,Kwan T,Cusmano-Ozog K,Cowan TM.2014，《通过液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)快速灵敏地定量分析未衍生化的氨基酸的方法》(A rapid,sensitive method forquantitative analysis of underivatized amino acids by liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS))，J Chromatogr B Analyt Technol Biomed LifeSci944:166-74)]测量了每个血浆样品中的氨基酸浓度。为了评估丹磺酰化CMS与直接血浆测量之间的相关性，计算了皮尔逊相关性，并使用R评估了观察到的相关系数的统计显著性(www.r-project.org)。还使用斯皮尔曼rho统计对数据进行了评估。

如表1所示，从iso-CMS分析获得的值与通过CLIA认证的实验室获得的值高度一致。为比较两种不同方法获得的数据而计算的皮尔逊相关系数为0.997，这表明两种方法获得的结果具有很高的相关性。根据此数据计算出的斯皮尔曼rho统计量为0.963。

表1.从五个正常受试者(#1-#5)和五个PKU受试者(#6-#10)获得的血浆中的血浆苯丙氨酸浓度(μM)测量值。通过两种不同的方法测量每个血浆样品中的苯丙氨酸浓度：(i)丹磺酰标记的iso-CMS方法，使用8μl样品；(ii)使用从ml样品中获得的血浆通过离子对LCMS进行直接氨基酸测量。

表1.血浆中血浆苯丙氨酸浓度(μM)测量值

实施例3：通过iso-CMS测量的遗传疾病的生物标志物

枫糖浆尿病(MSUD，MIM#248600)是一种常染色体隐性先天性代谢异常(IEM)。支链α-酮酸脱氢酶(BCKAD)复合物的正常活性被突变破坏，这会干扰包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸在内的支链氨基酸(BCAA)的分解代谢。患病受试者血浆和尿液中的BCAA升高。MSUD的特征是神经和发育迟缓，脑病，进食问题和尿液中的枫糖浆味。如果不治疗，MSUD可能导致代谢失代偿，不可逆的神经系统损害和死亡。最近对五种IEM的MS/MS筛查数据进行的分析表明，西方人群中每10万活产儿中这五种IEM的发生率为0.5到1.06：MSUD 0.71；同型胱氨酸尿症0.53；戊二酸尿症1.06；异戊酸血症0.79；长链3-羟酰基辅酶A脱氢酶缺乏症0.65。当检查全球人口时，它们的发生率通常更高。

BCAA分解代谢对于正常的生理功能至关重要，并且大多数BCAA分解代谢发生在骨骼肌(而非肝脏)中。在大脑中，BCAA代谢对于维持谷氨酸水平至关重要，后者是一种神经递质，在大脑发育和功能中起着重要作用。而且，亮氨酸积累是高度神经毒性的。BKAD由E1α，E1β，E2和E3亚基组成。这些亚基中的纯合或复合杂合突变，其BKAD活性导致MSUD。MSUD的经典型存在于新生儿期，与BCKAD酶活度的<2％相关。MSUD也有中间型，与正常BCKAD酶活度的30％有关；并且它们呈现出通常与分解代谢状态有关的发作性症状。

筛查和治疗。BCAA存在于富含蛋白质的饮食中，并且是人生命必不可少的9种氨基酸之一。MSUD治疗包括饮食中的BCAA限制和代谢监测。如果提早开始治疗，效果会很好。因此，常规地对新生儿进行MSUD筛查。2011年开发了一种快速进行的高通量反相LC/MS方法，用于定量检测血斑和血浆中的支链氨基酸水平。该方法可以分离和定量亮氨酸、异亮氨酸和别异亮氨酸。在4年的时间里，加利福尼亚州有超过220万婴儿接受了筛查；发现了17例MSUD病例，有3例漏诊。对5个漏诊病例的回顾性分析表明，没有一个病例符合常规标准(亮氨酸>200μM，亮氨酸/丙氨酸比>1.5)，并且它们似乎具有间歇型MSUC。漏诊的病例中有两个病例的异亮氨酸代谢物(别异亮氨酸)的水平升高。因此，在某些情况下，对别异亮氨酸进行二级筛选可能很重要。

为了确定是否可以使用具有丹磺酰标记的iso-CMS方法诊断MSUD，我们测量了上述10个样品中的亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸水平。如表2所示，从iso-CMS分析获得的值与通过CLIA认证的实验室获得的值高度一致。

表2.在五个正常受试者(#1-#5)和五个PKU受试者(#6-#10)中测量血浆的支链氨基酸(BCAA)浓度(μM)。通过两种不同的方法测量每个血浆样品中的BCAA浓度：(i)丹磺酰标记的iso-CMS方法；和(ii)通过离子对LCMS进行直接氨基酸测量。每种氨基酸下方显示了为比较两种不同方法获得的数据而计算的皮尔逊相关系数和斯皮尔曼rho统计量。通过两种方法获得的结果高度相关。

表2.支链氨基酸(BCAA)的血浆浓度(μM)

实施例4：测量其他氨基酸的血浆水平

为了确定是否可以使用具有丹磺酰标记的iso-CMS方法诊断其他IEM，我们测量了上述10个样品中的精氨酸、蛋氨酸和酪氨酸水平。如表3所示，从iso-CMS分析获得的值与通过CLIA认证的实验室获得的值高度一致。这些结果表明，可以通过具有丹磺酰(或其他STMM)标记的iso-CMS方法对任何氨基酸进行定量分析。

表3.在五个正常受试者(#1-#5)和五个PKU受试者(#6-#10)中测量三种其他氨基酸的血浆浓度(μM)。通过两种不同的方法测量每个血浆样品中的浓度：(i)丹磺酰标记的iso-CMS方法；和(ii)通过离子对LCMS进行直接氨基酸测量。每种氨基酸下方显示了为比较两种不同方法获得的数据而计算的皮尔逊相关系数和斯皮尔曼rho统计量。通过两种方法获得的结果高度相关。

表3.精氨酸、蛋氨酸和酪氨酸的血浆浓度(μM)

实施例5：阿片类分析

上述阿片类中的叔胺确保在电喷雾电离后可以有效地检测它们。已经开发出非常灵敏和特异的LC/MS测定方法，它们已广泛用于阿片类定量。这些测定方法在这里适用作为海洛因、吗啡、可待因、羟考酮及其代谢物(去甲羟考酮，羟吗啡酮)、氢可酮及其代谢物(氢吗啡酮)、美沙酮，丁丙诺啡和芬太尼的iCOAM。制定了评估这些阿片类中的8种(吗啡，可待因，羟吗啡酮，羟考酮，去甲羟考酮，氢可酮，氢吗啡酮和芬太尼)(图9中显示了3种)的检测灵敏度的标准曲线。

将来自8μL CMS样品的全血稀释10倍至稳定溶液中，该稳定溶液包含异丙醇的水溶液(25％/75％V/V)(稳定溶液)。这是通过将毛细管插入微量离心管中并涡旋样品直到血液分散到稳定溶液中来完成的。这是iso-CMS样品。

在这些研究中，氘代类似物(西格玛(Sigma))用作内标；并向50ul的每个iso-CMS血液样品中注入指定浓度的这些内标的混合物。加入冷乙腈使蛋白质沉淀；将样品干燥，然后重新悬浮于5％乙腈的0.1％甲酸溶液中，用以下仪器进行分析：安捷伦QTOF6520并结合UHPLC Infinity 1290，其具有飞诺美公司(Phenomenex，加利福尼亚州托伦斯)的Poreshell Kinetex C18(2.0x100)柱。流动相A为0.1％甲酸，流动相B为乙腈，梯度在15分钟内从5％移至50％B。从校准曲线确定每种阿片类的最低定量限(LoQ)。当注入标准iso-CMS样品体积的1/10时，确定8种药物中每种药物的LoQ均<0.5ng/ml(图9)。这些阿片类的已知最低有效血浆镇痛浓度(MEAC)(ng/ml)为：芬太尼(0.6)，氢吗啡酮(1.5)，吗啡(8)和美沙酮(60)。这些结果表明，通过我们的iso-CMS方法可轻松检测这些阿片类的MEAC。

这些测定法测量了在SUH同时从经过阿片类治疗的受试者通过iso-CMS和静脉穿刺获得的样品中的[阿片类]。海洛因在美国并未用作治疗剂，但所有其他药物在SUH手术室中经常使用。

实施例6：测量治疗药物

除阿片类外，iso-CMS还可用于测量许多治疗药物及其代谢物的血浆浓度。这对患者安全非常重要，因为当药物在其治疗窗口之外或在产生治疗响应但不会对患者造成明显副作用的剂量范围之外时，它们可能变得无用或危险。当药物在其治疗窗口之外时，它们将不再发挥治疗作用。当药物超过其治疗窗口时，它们开始产生对患者有毒的作用。即使对于通常被公众视为“安全”的药物也是如此。

特别关注的是华法林，它是一种具有抗凝特性的维生素K拮抗剂，通常被处方为口服药物，用于预防和治疗静脉血栓形成以及预防和治疗与房颤相关的血栓栓塞性并发症。华法林也已被用于预防复发性短暂性脑缺血发作，并降低复发性心肌梗塞的风险。

华法林治疗的治疗窗口极窄，并且与许多药物-药物和药物-食物的相互作用有关。这意味着接受华法林治疗的患者一直处于由于服药过量而引起不良反应的风险中，该不良反应包括严重出血并可能导致死亡。因此，接受华法林治疗的患者必须得到持续监测，并且必须接受频繁的血液检查。

基于静脉穿刺的血液检查会比较痛苦且不方便。iso-CMS方法可以减轻血液检查的痛苦并加快该检查的速度，并且可以减少每次检查从患者身上抽取的血量。因此，该方法可以改善接受华法林治疗或其他药物治疗的患者的患者护理结果。

将来自CMS样品的全血稀释10倍至稳定溶液中，该稳定溶液包含异丙醇的水溶液(25％/75％V/V)(稳定溶液)。这可以通过将毛细管插入微量离心管中并涡旋样品直到血液分散到稳定溶液中来完成。这是制备的CMS样品。然后对该制备的CMS样品进行LCMS分析，以确定血液中的华法林的量，并与测量金标准进行比较。根据以下其他药物测量实施例的结果，预期iso-CMS方法可用于获得样品，从该样品可以测量血液或其他体液中的华法林或任何其他药物。

实施例7：通过iso-CMS获得的样品的分析的准确性

将地塞米松、美沙酮、加巴喷丁和恩丹西酮这四种药物对不同的受试者进行给药。使用静脉穿刺和iso-CMS方法从每位患者抽取血液，并将通过iso-CMS方法采集的样品中的药物量与通过静脉穿刺(金标准)方法获取的样品中的药物量进行比较。

15名人受试者口服至少一剂安全剂量的地塞米松。地塞米松给药后，使受试者经历至少30分钟但不超过24小时的等待期，以使地塞米松在全身分布。

另有7名人受试者口服至少一剂安全剂量的美沙酮。美沙酮给药后，使受试者经受至少1小时但不超过30小时的等待期，以使美沙酮在全身分布。

另有8名受试者口服至少一剂安全剂量的加巴喷丁。加巴喷丁给药后，使受试者经历至少4小时但不超过24小时的等待期，以使加巴喷丁在全身分布。

另有44名最近接受了手术的人受试者口服至少一剂安全剂量的恩丹西酮。恩丹西酮给药后，使受试者经历至少2小时但不超过12小时的等待期。

在上述四组中的每组中，通过静脉穿刺抽取至少1mL血液，并从血液中分离血浆并进行保存(静脉穿刺样品)。同时，使用本文所述方法的一个实施方式将8μL血液吸入毛细管中，该方法为如下详述的iso-CMS方法(CMS样品)。

将来自CMS样品的全血稀释10倍至稳定溶液中，该稳定溶液包含异丙醇的水溶液(25％/75％V/V)(稳定溶液)。这是通过将毛细管插入微量离心管中并涡旋样品直到血液分散到稳定溶液中来完成的。这是制备的CMS样品。

静脉穿刺样品和制备的CMS样品均进行LCMS分析，使用特定于检测每个样品中预期药物的方案。例如，对接受地塞米松给药的患者的样品进行LCMS方案，该方案能够准确且精确地定量样品中的地塞米松。

还准备了每种药物的标准曲线，并在LCMS仪器上进行了分析，以便可以量化每个样品中的药物量并将其与其他样品进行比较。使用每种药物的适当标准曲线，计算每个样品中的药物量。将数据绘制为使用静脉穿刺样品测定的血浆药物量相对于使用制备的CMS样品测定的血浆药物量。通过这种方式，可以看到iso-CMS方法准确测量样品中每种药物的量的可靠性。

对于每个图，将线性曲线拟合到数据，并计算R²值。R²值是测量相关性的度量，范围为0到1，其中0代表无相关性，1代表完全的1:1相关性，或者每种采样方法之间的测量值相同。此外，还为其中一些数据集计算了皮尔逊相关性和斯皮尔曼等级相关性。皮尔逊相关性是两个变量之间线性相关的度量，范围从0到1，其中1表示完全相关。斯皮尔曼等级相关性是等级相关性的非参数度量，用于评估使用单调函数描述两个变量之间的关系的效果如何。简而言之，它的范围也从0到1，其中1同样表示两个变量之间的完全相关。

在图10中，该图描绘了两种采样方法的LCMS分析测得的地塞米松浓度，其中每个点代表一名患者，x轴表示使用iso-CMS方法获得的样品中测得的血浆地塞米松浓度，单位为ng/ml，y轴表示使用静脉穿刺法获得的样品中测得的血浆地塞米松浓度，单位为ng/ml。计算出线性拟合，并用虚线表示。皮尔逊和斯皮尔曼等级相关值分别为0.95和0.93，表明相关性良好，说明iso-CMS能够准确测量地塞米松。

在图11中，该图描绘了两种采样方法的LCMS分析测得的美沙酮浓度，其中每个点代表一名患者，x轴表示使用静脉穿刺法获得的样品中测得的血浆美沙酮浓度，单位为ng/ml，y轴表示使用iso-CMS方法获得的样品中测得的血浆美沙酮浓度，单位为ng/ml。计算出线性拟合，并用虚线表示。计算得出R²值为0.91，表明相关性良好，说明iso-CMS能够准确测量美沙酮。

在图12中，该图描绘了两种采样方法的LCMS分析测得的加巴喷丁浓度，其中每个点代表一名患者，x轴表示使用静脉穿刺法获得的样品中测得的血浆加巴喷丁浓度，单位为ng/ml，y轴表示使用iso-CMS方法获得的样品中测得的血浆加巴喷丁浓度，单位为ng/ml。计算出线性拟合，并用虚线表示。计算得出R²值为0.95，表明相关性良好，说明iso-CMS能够准确测量加巴喷丁。

在图13A和图13B中，该图描绘了两种采样方法的LCMS分析测得的恩丹西酮浓度，其中每个点代表一名患者，x轴表示使用静脉穿刺法获得的样品中测得的血浆恩丹西酮浓度，单位为ng/ml，y轴表示使用iso-CMS方法获得的样品中测得的血浆恩丹西酮浓度，单位为ng/ml。图13A表示来自所有患者的数据，包括具有异常高水平血浆恩丹西酮的受试者。图13B显示了恩丹西酮浓度为15至60ng/ml的受试者的数据。计算出线性拟合，并用虚线表示。计算得出R²值为0.999，表明相关性极佳，说明iso-CMS能够准确测量恩丹西酮。

虽然本文显示和描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员显然了解这些实施方式仅以举例方式提供。本领域技术人员在不背离本发明的情况下可以作出多种改变、变化和替代。应理解，本文所述的本发明实施方式的各种替代形式可用于实施本发明。所附权利要求书确定了本发明范围，这些权利要求范围内的方法和结构以及其等同物均为本发明所涵盖。

Claims

1.一种检测分析物的方法，所述方法包括：

(a)对包含样品和生物相容性溶液的测试溶液进行测定；和

(b)检测样品中分析物的存在和/或浓度，

其中，所述生物相容性溶液包含稳定溶剂和水，并且

其中，所述样品通过毛细管微量采样(CMS)获得。

2.一种检测分析物的方法，所述方法包括：

(a)对包含样品和生物相容性溶液的测试溶液进行测定；和

(b)检测样品中分析物的存在和/或浓度，

其中，所述生物相容性溶液包含稳定溶剂和水，并且

其中，所述样品的量为约1-50μL。

3.一种进行测定的方法，所述方法包括对包含样品和生物相容性溶液的测试溶液进行测定，

其中，所述样品的量为1-50μL，并且

其中，测定的误差比<20％。

4.一种连续监测从受试者获取的样品中的分析物的方法，所述方法包括将通过毛细管微量采样(CMS)获得的所述样品添加到生物相容性溶液中，其中所述生物相容性溶液包含水和稳定溶剂，所述稳定溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇或其混合物；其中以指定的时间间隔采集一个或多个样品。

5.如权利要求4所述的方法，其还包括对一个或多个样品进行比较。

6.一种制备用于检测分析物的样品的方法，所述方法包括：将通过毛细管微量采样(CMS)获得的所述样品添加到生物相容性溶液中，其中所述生物相容性溶液包含水和稳定溶剂，所述稳定溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇或其混合物。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述样品是用于诊断测试的生物流体。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述生物流体是血液、尿液、眼泪、唾液、汗液、精液或脑脊液。

9.如权利要求8所述的方法，其中，所述生物流体是新生儿血液。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述分析物是药物、营养物或代谢物。

11.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，稳定溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇或其混合物。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其种，所述稳定溶剂包括异丙醇。

13.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述稳定溶剂适用于临床环境。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中，所述生物相容性溶液包含10-75％V/V的稳定溶剂。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中，所述生物相容性溶液基本不含乙腈。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，所述测定是用于诊断测试的标准分析方法。

17.如权利要求16所述的方法，其中，分析方法是质谱法、色谱法、电泳法或酶联免疫吸附测定法(ELISA)。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，从受试者获得约2-50μL的样品。

19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，样品被生物相容性溶液稀释约10倍。

20.如权利要求1所述的方法，其还包括对样品进行冷却。

21.一种试剂盒，其包括：

(a)被配置为通过毛细管作用从受试者获得样品的容器；

(b)生物相容性溶液；和

(c)说明书。

22.如权利要求21所述的试剂盒，其中，所述生物相容性溶液包含水和稳定溶剂。

23.如权利要求22所述的试剂盒，其中，稳定溶剂包括甲醇、乙醇、异丙醇或其混合物。

24.如权利要求23所述的试剂盒，其中，所述生物相容性溶液包含异丙醇和水。

25.如权利要求21-24中任一项所述的试剂盒，其还包括配置为刺穿受试者皮肤的装置。

26.一种检测分析物的方法，所述方法包括：

(a)对包含样品和生物相容性溶液的测试溶液进行测定；和

(b)检测样品中分析物的存在和/或浓度，

其中，所述生物相容性溶液包含稳定溶剂和水，

其中，所述样品通过毛细管微量采样(CMS)获得，

其中，所述样品的量为约1-50μL，并且

其中，所述稳定溶剂包括异丙醇。

27.如权利要求26所述的方法，其中，所述样品是用于诊断测试的生物流体。

28.如权利要求27所述的方法，其中，所述生物流体是血液、尿液、眼泪、唾液、汗液、精液或脑脊液。

29.如权利要求28所述的方法，其中，所述生物流体是新生儿血液。

30.如权利要求26所述的方法，其中，所述样品是在临床点从受试者获得的。

31.如权利要求26所述的方法，其中，所述分析物是药物、营养物或代谢物。

32.如权利要求31所述的方法，其中，代谢物是遗传疾病的标志物或药物代谢物。

33.如权利要求26所述的方法，其中，所述稳定溶剂适用于临床环境。

34.如权利要求26所述的方法，其中，所述生物相容性溶液包含20-30％V/V的稳定溶剂。

35.如权利要求26所述的方法，其中，所述生物相容性溶液基本不含乙腈。

36.如权利要求26所述的方法，其中，所述测定是用于诊断测试的标准分析方法。

37.如权利要求36所述的方法，其中，分析方法是质谱法、色谱法、电泳法或酶联免疫吸附测定法(ELISA)。

38.如权利要求26所述的方法，其中，从受试者获得约4-10μL的样品。

39.如权利要求26所述的方法，其中，从受试者获得约8μL的样品。

40.如权利要求26所述的方法，其中，样品被生物相容性溶液稀释约10倍。

41.如权利要求26所述的方法，其还包括在进行所述测定之前冷却样品。