CN110187012A - 一种非衍生化法检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种非衍生化法检测试剂盒。具体地，本发明提供一种非衍生化法检测试剂盒，所述试剂盒包括内标品、萃取剂、流动相。本发明所述的试剂盒与高效液相‑质谱联用能够准确、快速、高效和高灵敏的检测出生物样品中氨基酸和酰基肉碱的含量，从而对疾病进行筛查和预防治疗，且操作简洁快速，准确率和灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析检测技术领域，具体地，本发明涉及一种非衍生化法检测试剂盒。
背景技术
遗传性代谢病又称先天性代谢缺陷(inborn error of metabolism，IEM)，常常是由基因突变导致遗传性生化代谢功能缺陷所造成的一类遗传病，涉及氨基酸、胆碱、有机酸、脂肪酸、碳水化合物、溶酶体、类固醇等多种物质代谢的异常。其单一病种患病率较低，但由于种类繁多，总体发病率较高。该类疾病发病后常呈进行性加重，如未能早期识别诊断、干预、治疗，常导致早期夭折或终身残疾，且以神经、智力残疾为最多，会严重影响人口素质，造成家庭和社会的沉重负担。因此开展IEM的早期筛查，实现早期诊断，成为IEM防治的关键，对避免和减少残疾儿童的发生，提高人口素质，推动国民经济发展有着重要的意义。目前，IEM的诊断方法主要有枯草杆菌抑制试验、酶活性测定、气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)、单基因分析等。这些诊断方法用于IEM筛查具有局限性：(1)普遍通量低，一般一次只能检测一种至几十种，不能满足IEM可检出病种的逐年增多，并且需要对遗传性代谢病有准确的预判；(2)不同IEM的检测方法各异，且样本多样，如一些疾病检测蛋白水平、而另一些疾病则检测基因水平，有些疾病需要尿液样本、而另一些则需要血液样本。因此不太适合开展大规模的遗传性代谢病的筛查，亟需要一种能高通量检测IEM多种疾病的技术。
综上，本领域亟需开发一种快速、高效、操作简洁、准确率和灵敏度高的检测方法，用来检测代谢物质，从而能够早期识别、诊断、干预、治疗遗传性代谢病。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、高效、操作简洁、准确率和灵敏度高的非衍生化法检测试剂盒，用来检测代谢物质，从而能够早期识别、诊断、干预、治疗遗传性代谢病。
本发明的第一方面，提供了一种非衍生化法检测试剂盒，所述试剂盒包括内标品、萃取剂、流动相；
其中，所述的内标品包括：同位素标记氨基酸内标品、同位素标记肉碱内标品、同位素标记酰基肉碱内标品，或其组合；
所述的流动相包含甲醇、水、羧酸，其中甲醇含量为50％-100％(v/v)，羧酸浓度为0.05-1mol/L，溶剂为水。
在另一优选例中，所述的萃取剂包括甲醇、水、羧酸混合液，其中甲醇含量为65％-95％(v/v)，优选70％-90％(v/v)，羧酸浓度为0.1-0.5mol/L，溶剂为水。
在另一优选例中，所述同位素标记的氨基酸包括同位素标记的丙氨酸、同位素标记的脯氨酸、同位素标记的亮氨酸、同位素标记的鸟氨酸、同位素标记的甲硫氨酸、同位素标记的苯丙氨酸、同位素标记的精氨酸、同位素标记的瓜氨酸、同位素标记的酪氨酸、同位素标记的甘氨酸、同位素标记的缬氨酸中的一种或多种。
在另一优选例中，所述的同位素标记酰基肉碱包括同位素标记乙酰基肉碱、同位素标记丙酰基肉碱、同位素标记丁酰基肉碱、同位素标记异戊酰基肉碱、同位素标记己酰肉碱、同位素标记辛酰基肉碱、同位素标记癸酰基肉碱、同位素标记十二烷酰基肉碱、同位素标记十四烷酰基肉碱、同位素标记十六烷酰基肉碱、同位素标记十八烷酰基肉碱、同位素标记丙二酰肉碱、同位素标记已二酰肉碱、同位素标记3-羟基-丁酰肉碱、同位素标记3-羟基-十四碳酰肉碱、同位素标记3-羟基-十六碳酰肉碱、同位素标记3-羟基-十八碳酰肉碱、同位素标记3-羟基-异戊酰肉碱、同位素标记甲基丙二酰肉碱、同位素标记戊二酰肉碱、同位素标记3-羟基-己酰肉碱、同位素标记异戊烯酰肉碱、同位素标记辛烯酰肉碱、同位素标记癸烯酰肉碱、同位素标记癸二烯酰肉碱、同位素标记十二碳烯酰肉碱、同位素标记十四碳烯酰肉碱、同位素标记十四碳二烯酰肉碱、同位素标记十六碳烯酰肉碱、同位素标记3-羟基-十六碳烯酰肉碱、同位素标记18碳烯酰肉碱、同位素标记18碳二烯酰肉碱和同位素标记3-羟基-十八碳烯酰肉碱中的一种或多种。
在另一优选例中，所述的羧酸选自下组：甲酸、乙酸、草酸，或其组合。
在另一优选例中，所述的同位素标记为同位素标记氨基酸内标品、同位素标记肉碱内标品和/或同位素标记酰基肉碱内标品。
在另一优选例中，所述的同位素标记选自下组：D标记、13C标记、15N标记，或其组合。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括质控品，所述质控品选自下组的一种或多种试剂：氨基酸质控品、肉碱质控品、酰基肉碱质控品。
在另一优选例中，所述的氨基酸质控品包括丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、鸟氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸、酪氨酸、缬氨酸和甘氨酸一种或多种。
在另一优选例中，所述的肉碱质控品为游离肉碱。
在另一优选例中，所述的酰基肉碱质控品包括乙酰基肉碱、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、异戊酰基肉碱、己酰肉碱、辛酰基肉碱、癸酰基肉碱、十二烷酰基肉碱、十四烷酰基肉碱、十六烷酰基肉碱、十八烷酰基肉碱、丙二酰肉碱、已二酰肉碱、3-羟基-丁酰肉碱、3-羟基-十四碳酰肉碱、3-羟基-十六碳酰肉碱、3-羟基-十八碳酰肉碱、3-羟基-异戊酰肉碱、甲基丙二酰肉碱、戊二酰肉碱、3-羟基-己酰肉碱、异戊烯酰肉碱、辛烯酰肉碱、癸烯酰肉碱、癸二烯酰肉碱、十二碳烯酰肉碱、十四碳烯酰肉碱、十四碳二烯酰肉碱、十六碳烯酰肉碱、3-羟基-十六碳烯酰肉碱、18碳烯酰肉碱、18碳二烯酰肉碱和3-羟基-十八碳烯酰肉碱中的一种或多种。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括选自下组的一种或多种组件：蛋白过滤板、深孔板、透明封口膜、橡胶盖垫。
本发明第二方面，提供了一种本发明所述的试剂盒的用途，用于检测样品中氨基酸、肉碱和/或酰基肉碱的含量。
在另一优选例中，所述的样品为生物样品。
在另一优选例中，所述的生物样品来源于人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述的样品为体液，优选为血液。
在另一优选例中，所述的样品为新生儿的体液或血液。
在另一优选例中，所述的氨基酸包括丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、鸟氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸、酪氨酸、酪氨酸、甘氨酸和缬氨酸的一种或多种。
在另一优选例中，所述的酰基肉碱包括乙酰基肉碱、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、异戊酰基肉碱、己酰肉碱、辛酰基肉碱、癸酰基肉碱、十二烷酰基肉碱、十四烷酰基肉碱、十六烷酰基肉碱、十八烷酰基肉碱、丙二酰肉碱、已二酰肉碱、3-羟基-丁酰肉碱、3-羟基-十四碳酰肉碱、3-羟基-十六碳酰肉碱、3-羟基-十八碳酰肉碱、3-羟基-异戊酰肉碱、甲基丙二酰肉碱、戊二酰肉碱、3-羟基-己酰肉碱、异戊烯酰肉碱、辛烯酰肉碱、癸烯酰肉碱、癸二烯酰肉碱、十二碳烯酰肉碱、十四碳烯酰肉碱、十四碳二烯酰肉碱、十六碳烯酰肉碱、3-羟基-十六碳烯酰肉碱、18碳烯酰肉碱、18碳二烯酰肉碱和3-羟基-十八碳烯酰肉碱的一种或多种。
本发明第三方面，提供了一种用本发明所述试剂盒检测样品中氨基酸、肉碱和/或酰基肉碱的方法包括步骤：
(1)内标液制备
提供制备得到含有同位素标记氨基酸内标液、同位素标记肉碱内标液，和/或同位素标记酰基肉碱内标液；
(2)工作液准备
采用萃取剂稀释所述的同位素标记氨基酸内标液、同位素标记肉碱内标液，和/或同位素标记酰基肉碱内标液分别配制同位素标记氨基酸工作液、同位素标记肉碱工作液，和/或同位素标记酰基肉碱工作液；
(3)取样
将待测样品和任选的质控品置于蛋白过滤板中；
(4)样本萃取
将蛋白过滤板对准深孔板中的孔位，将同位素标记氨基酸工作液、同位素标记肉碱工作液，和/或同位素标记酰基肉碱工作液加入到蛋白过滤板的反应孔中，震荡混匀，离心；
(5)样本上机检测
高效液相色谱-串联质谱仪检测深孔板中样品中氨基酸、肉碱和/或酰基肉碱的含量。
在另一优选例中，在所述的步骤(1)中，所述的同位素标记氨基酸内标液、同位素标记肉碱内标液，和/或同位素标记酰基肉碱内标液是通过用萃取剂溶解同位素标记氨基酸内标品、同位素标记肉碱内标品，和/或同位素标记酰基肉碱内标品所制得。
在另一优选例中，在所述的步骤(1)中，所述的萃取剂包括甲醇、水、羧酸混合液，其中甲醇含量为65％-95％(v/v)，优选70％-90％(v/v)，羧酸浓度为0.1-0.5mol/L，溶剂为水。
在另一优选例中，在所述的步骤(1)中，所述的羧酸选自下组：甲酸、乙酸、草酸，或其组合。
在另一优选例中，在所述的步骤(2)中，所述的萃取剂包括甲醇、水、羧酸混合液，其中甲醇含量为65％-95％(v/v)，优选70％-90％(v/v)，羧酸浓度为0.1-0.5mol/L，溶剂为水。
在另一优选例中，在所述的步骤(2)中，所述的羧酸选自下组：甲酸、乙酸、草酸，或其组合。
在另一优选例中，在所述的步骤(2)中：
萃取剂：同位素标记氨基酸内标液为1：100-300(v/v)，优选1:150-250(v/v)，更优选为1:200(v/v)；和/或
萃取剂：同位素标记肉碱内标液为1：100-300(v/v)，优选1:150-250(v/v)，更优选为1:200(v/v)；和/或
萃取剂：同位素标记酰基肉碱内标液为1：100-300(v/v)，优选1:150-250(v/v)，更优选为1:200(v/v)。
在另一优选例中，在所述的步骤(3)中，所述的待测样品的加入量为0.5-10μL，优选为1-5μL，优选为3.2μL。
在另一优选例中，在所述的步骤(3)中，所述质控品的加入量量为0.5-10μL，优选为1-5μL，优选为3.2μL。
在另一优选例中，在所述的步骤(4)中，所述的同位素标记氨基酸工作液、同位素标记肉碱工作液，和/或同位素标记酰基肉碱工作液的加入量为20-200μl，优选为50-150μl更优选为100μl。
在另一优选例中，在所述的步骤(5)中，所述的高效液相色谱条件如下：
进样体积：5-20μL，优选为10μL；流动相进样梯度：0-0.01min为0.22μL/min，0.01-0.20min为0.22μL/min，0.20-0.25min为0.018μL/min，0.25-1.01min为0.018μL/min，1.01-1.1min为0.6μL/min，1.1-1.30min为0.6μL/min，1.30-1.40min为0.22μL/min，1.40-1.50min为0.22μL/min。
在另一优选例中，在所述的步骤(5)中，所述质谱的条件如下：
质谱采用电喷雾阳离子方式，离子源温度350-450℃，优选为450℃；离子源电压4500-5500V，优选为5500V；雾化器30-35psi，优选为35psi；碰撞气5-10psi，优选为5psi；气帘气10-20psi，优选为15psi；辅助加热气30-55psi，优选为45psi。
在另一优选例中，在所述的步骤(5)中，所述的质谱条件中，多反应监测离子对(MRM)及相应的电压参数如表1：
表1多反应监测离子对(MRM)及相应的电压参数
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为本发明实施例中氨基酸、肉碱和酰基肉碱及其同位素标准离子流叠加图。
图2为本发明实施例中脯氨酸标准离子流图。
图3为本发明实施例中脯氨酸同位素标准离子流图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而又深入的研究，开发了一种非衍生化法检测试剂盒，所述试剂盒包括内标品、萃取剂、流动相。本发明开发的试剂盒结合能够准确、快速、高效和高灵敏的检测出生物样品(如新生儿的体液或血液)中氨基酸、肉碱和/或酰基肉碱的含量，从而对疾病(如新生儿的遗传代谢病)进行筛查和预防治疗，且具有操作简洁快速，准确率和灵敏度高等优点。基于上述发现，发明人完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用，不仅包括开放式定义，还包括半封闭式、和封闭式定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
非衍生化法检测试剂盒
本发明提供一种非衍生化法检测试剂盒，所述试剂盒包括内标品、萃取剂、流动相；
其中，所述的内标品包括：同位素标记氨基酸内标品、同位素标记肉碱内标品、同位素标记酰基肉碱内标品，或其组合；
所述的流动相包含甲醇、水、羧酸，其中甲醇含量为50％-100％(v/v)，羧酸浓度为0.05-1mol/L，溶剂为水。
在本发明的一个优选例中，所述的萃取剂包括甲醇、水、羧酸混合液，其中甲醇含量为65％-95％(v/v)，优选70％-90％(v/v)，羧酸浓度为0.1-0.5mol/L，溶剂为水。
在另一优选例中，所述同位素标记的氨基酸包括同位素标记的丙氨酸、同位素标记的脯氨酸、同位素标记的亮氨酸、同位素标记的鸟氨酸、同位素标记的甲硫氨酸、同位素标记的苯丙氨酸、同位素标记的精氨酸、同位素标记的瓜氨酸、同位素标记的酪氨酸、同位素标记的甘氨酸、同位素标记的缬氨酸中的一种或多种。
在另一优选例中，所述的同位素标记酰基肉碱包括同位素标记乙酰基肉碱、同位素标记丙酰基肉碱、同位素标记丁酰基肉碱、同位素标记异戊酰基肉碱、同位素标记己酰肉碱、同位素标记辛酰基肉碱、同位素标记癸酰基肉碱、同位素标记十二烷酰基肉碱、同位素标记十四烷酰基肉碱、同位素标记十六烷酰基肉碱、同位素标记十八烷酰基肉碱、同位素标记丙二酰肉碱、同位素标记已二酰肉碱、同位素标记3-羟基-丁酰肉碱、同位素标记3-羟基-十四碳酰肉碱、同位素标记3-羟基-十六碳酰肉碱、同位素标记3-羟基-十八碳酰肉碱、同位素标记3-羟基-异戊酰肉碱、同位素标记甲基丙二酰肉碱、同位素标记戊二酰肉碱、同位素标记3-羟基-己酰肉碱、同位素标记异戊烯酰肉碱、同位素标记辛烯酰肉碱、同位素标记癸烯酰肉碱、同位素标记癸二烯酰肉碱、同位素标记十二碳烯酰肉碱、同位素标记十四碳烯酰肉碱、同位素标记十四碳二烯酰肉碱、同位素标记十六碳烯酰肉碱、同位素标记3-羟基-十六碳烯酰肉碱、同位素标记18碳烯酰肉碱、同位素标记18碳二烯酰肉碱和同位素标记3-羟基-十八碳烯酰肉碱中的一种或多种。
发明人对所述流动相和所述萃取剂中的羧酸进行筛选和优选，在一个优选例中，所述的羧酸选自下组：甲酸、乙酸、草酸，或其组合。
在另一优选例中，所述的同位素标记为同位素标记氨基酸内标品、同位素标记肉碱内标品和/或同位素标记酰基肉碱内标品。
优选地，所述的同位素标记选自下组：D标记、13C标记、15N标记，或其组合。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括质控品，所述质控品选自下组的一种或多种试剂：氨基酸质控品、肉碱质控品、酰基肉碱质控品。
在另一优选例中，所述的氨基酸质控品包括丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、鸟氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸、酪氨酸、缬氨酸和甘氨酸一种或多种。
在另一优选例中，所述的肉碱质控品为游离肉碱。
在另一优选例中，所述的酰基肉碱质控品包括乙酰基肉碱、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、异戊酰基肉碱、己酰肉碱、辛酰基肉碱、癸酰基肉碱、十二烷酰基肉碱、十四烷酰基肉碱、十六烷酰基肉碱、十八烷酰基肉碱、丙二酰肉碱、已二酰肉碱、3-羟基-丁酰肉碱、3-羟基-十四碳酰肉碱、3-羟基-十六碳酰肉碱、3-羟基-十八碳酰肉碱、3-羟基-异戊酰肉碱、甲基丙二酰肉碱、戊二酰肉碱、3-羟基-己酰肉碱、异戊烯酰肉碱、辛烯酰肉碱、癸烯酰肉碱、癸二烯酰肉碱、十二碳烯酰肉碱、十四碳烯酰肉碱、十四碳二烯酰肉碱、十六碳烯酰肉碱、3-羟基-十六碳烯酰肉碱、18碳烯酰肉碱、18碳二烯酰肉碱和3-羟基-十八碳烯酰肉碱中的一种或多种。
在另一优选例中，所述的试剂盒还包括选自下组的一种或多种组件：蛋白过滤板、深孔板、透明封口膜、橡胶盖垫。
本发明所述试剂盒与PerkinElmer非衍生化多种氨基酸肉碱试剂盒比较，本发明试剂盒采用蛋白沉淀板过滤前处理溶液，能有效减少样本颗粒带来的质谱检测过程中的影响。
用途
本发明提供了一种所述试剂盒的用途，用于检测样品中氨基酸、肉碱和/或酰基肉碱的含量。
在另一优选例中，所述的样品生物样品。
在另一优选例中，所述的生物样品来源于人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述的样品为体液，优选为血液，优选为新生儿的体液或血液。
在另一优选例中，所述的氨基酸包括丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、鸟氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、瓜氨酸、酪氨酸、酪氨酸、甘氨酸和缬氨酸的一种或多种。
在另一优选例中，所述的酰基肉碱包括乙酰基肉碱、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、异戊酰基肉碱、己酰肉碱、辛酰基肉碱、癸酰基肉碱、十二烷酰基肉碱、十四烷酰基肉碱、十六烷酰基肉碱、十八烷酰基肉碱、丙二酰肉碱、已二酰肉碱、3-羟基-丁酰肉碱、3-羟基-十四碳酰肉碱、3-羟基-十六碳酰肉碱、3-羟基-十八碳酰肉碱、3-羟基-异戊酰肉碱、甲基丙二酰肉碱、戊二酰肉碱、3-羟基-己酰肉碱、异戊烯酰肉碱、辛烯酰肉碱、癸烯酰肉碱、癸二烯酰肉碱、十二碳烯酰肉碱、十四碳烯酰肉碱、十四碳二烯酰肉碱、十六碳烯酰肉碱、3-羟基-十六碳烯酰肉碱、18碳烯酰肉碱、18碳二烯酰肉碱和3-羟基-十八碳烯酰肉碱的一种或多种。
检测方法
本发明还提供一种用本发明所述的试剂盒检检测样品中氨基酸、肉碱和/或酰基肉碱的方法，其特征在于，包括步骤：
(1内标液制备
提供制备得到含有同位素标记氨基酸内标液、同位素标记肉碱内标液，和/或同位素标记酰基肉碱内标液；
(2)工作液准备
采用萃取剂稀稀所述的同位素标记氨基酸内标液、同位素标记肉碱内标液，和/或同位素标记酰基肉碱内标液分别配制同位素标记氨基酸工作液、同位素标记肉碱工作液，和/或同位素标记酰基肉碱工作液；
(3)取样
将待测样品和任选的质控品置于蛋白过滤板中；
(4)样本萃取
将蛋白过滤板对准深孔板中的孔位，将同位素标记氨基酸工作液、同位素标记肉碱工作液，和/或同位素标记酰基肉碱工作液分别加入到蛋白过滤板的反应孔中，震荡混匀，离心；
(5)样本上机检测
高效液相色谱-串联质谱仪检测深孔板中样品中氨基酸、肉碱和/或酰基肉碱的含量。
在另一优选例中，在所述的步骤(1)中，所述的同位素标记氨基酸内标液、同位素标记肉碱内标液，和/或同位素标记酰基肉碱内标液是通过用萃取剂溶解同位素标记氨基酸内标品、同位素标记肉碱内标品，和/或同位素标记酰基肉碱内标品所制得。
在另一优选例中，在所述的步骤(1)中，所述的萃取剂包括甲醇、水、羧酸混合液，其中甲醇含量为65％-95％(v/v)，优选70％-90％(v/v)，羧酸浓度为0.1-0.5mol/L，溶剂为水。
在另一优选例中，在所述的步骤(1)中，所述的羧酸选自下组：甲酸、乙酸、草酸，或其组合。
在另一优选例中，在所述的步骤(2)中，所述的萃取剂包括甲醇、水、羧酸混合液，其中甲醇含量为65％-95％(v/v)，优选70％-90％(v/v)，羧酸浓度为0.1-0.5mol/L，溶剂为水。
在另一优选例中，在所述的步骤(2)中，所述的羧酸选自下组：甲酸、乙酸、草酸，或其组合。
在另一优选例中，在所述的步骤(2)中：
萃取剂：同位素标记氨基酸内标液为1：100-300(v/v)，优选1:150-250(v/v)，更优选为1:200(v/v)；和/或
萃取剂：同位素标记肉碱内标液为1：100-300(v/v)，优选1:150-250(v/v)，更优选为1:200(v/v)；和/或
萃取剂：同位素标记酰基肉碱内标液为1：100-300(v/v)，优选1:150-250(v/v)，更优选为1:200(v/v)。
在另一优选例中，在所述的步骤(3)中，所述的待测样品的加入量为0.5-10μL，优选为1-5μL，优选为3.2μL。
在另一优选例中，在所述的步骤(3)中，所述质控品的加入量量为0.5-10μL，优选为1-5μL，优选为3.2μL。
在另一优选例中，在所述的步骤(4)中，所述的同位素标记氨基酸工作液、同位素标记肉碱工作液，和/或同位素标记酰基肉碱工作液的加入量为20-200μl，优选为50-150μl更优选为100μl。
在另一优选例中，在所述的步骤(5)中，所述的高效液相色谱条件如下：
进样体积：5-20μL，优选为10μL；流动相进样梯度：0-0.01min为0.22μL/min，0.01-0.20min为0.22μL/min，0.20-0.25min为0.018μL/min，0.25-1.01min为0.018μL/min，1.01-1.1min为0.6μL/min，1.1-1.30min为0.6μL/min，1.30-1.40min为0.22μL/min，1.40-1.50min为0.22μL/min。
在另一优选例中，在所述的步骤(5)中，所述质谱的条件如下：
质谱采用电喷雾阳离子方式，离子源温度350-450℃，优选为450℃；离子源电压4500-5500V，优选为5500V；雾化器30-35psi，优选为35psi；碰撞气5-10psi，优选为5psi；气帘气10-20psi，优选为15psi；辅助加热气30-55psi，优选为45psi。
在另一优选例中，在所述的步骤(5)中，所述的质谱条件中，多反应监测离子对(MRM)及相应的电压参数如表2：
表2多反应监测离子对(MRM)及相应的电压参数
本发明中一种优选的检测样品中氨基酸、肉碱和酰基肉碱的方法，包括步骤：
(1)内标液制备
A.取萃取剂加入含有同位素标记氨基酸内标品、同位素标记肉碱内标品，和同位素标记酰基肉碱内标品的冻干粉小瓶中，盖紧瓶盖震荡混匀，使其中的粉末完全溶解，溶解困难时，可置于超声仪中超声，注意放置冰块避免温度升高；
B.内标液可在-80℃冰箱保存。
(2)工作液准备
A.将内标液置室温20分钟。
B.以每孔100μL萃取剂用量，计算当天待测样本和任选的质控品所需的萃取剂总量。
C.按稀释倍数萃取剂：同位素标记氨基酸内标液为1:200、萃取剂：同位素标记肉碱内标液为1：200和萃取剂：同位素标记酰基肉碱内标液为1：200配制包含同位素标记氨基酸、同位素标记肉碱和同位素标记酰基肉碱工作液。例如需要20mL的日常工作溶液，需要从内标液中各取0.1mL，将其在19.8mL的萃取剂中稀释；
(3)取样
将质控血片和待测血片在蛋白过滤板排序，用3.2mm的打孔器按顺序将血片打入蛋白过滤板中；
(4)样本萃取
将蛋白过滤板对准孔位，架设在96深孔板上，将100μL含内标的工作液分别加入蛋白过滤板的反应孔中，透明封口膜密封过滤板，在45℃的恒温混匀仪中，750rpm震荡45分钟，注意避光；
(5)样本上机检测
将蛋白过滤板与96孔板一同放在多管架自动平衡离心机上，配平，4000rpm离心2分钟将液体从蛋白过滤板过滤到96深孔板内，用橡胶盖垫密封96深孔板，将板置入自动进样器内，供质谱检测，进样10μL，进样梯度：0-0.01min为0.22μL/min，0.01-0.20min为0.22μL/min，0.20-0.25min为0.018μL/min，0.25-1.01min为0.018μL/min，1.01-1.1min为0.6μL/min，1.1-1.30min为0.6μL/min，1.30-1.40min为0.22μL/min，1.40-1.50min为0.22μL/min。采用串联质谱仪电喷雾阳离子方式。离子源温度450℃，离子源电压5500V，雾化器35psi，碰撞气5psi，气帘气15psi，辅助加热气45psi。
本发明的主要优点包括：
1、本发明所述的试剂盒能够准确、快速、高效和高灵敏的检测出生物样品(如新生儿的体液或血液)中氨基酸和酰基肉碱的含量，从而对疾病(如新生儿的遗传代谢病)进行筛查和预防治疗，且操作简洁快速，准确率和灵敏度高。
2、本发明是基于非衍生化法的优势进行产品开发，开发出满足市场需求的简单、准确和高效的试剂盒，用于临床医生遗传代谢病筛查。本发明的非衍生化试剂盒能够减少试剂排放造成的环境污染和样本前处理过程，从而节省了试剂成本和时间成本，更加简单、快速和环保。本发明的非衍生化试剂盒结合液相质谱仪器大大提高检测的灵敏度和效率。
3、本发明所述的试剂盒中包含的蛋白沉淀板能有效的规避操作过程中的样本残留，降低仪器故障率，提高检测精度和效率。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
采试剂盒对样本中待测血片进行多种氨基酸、肉碱和酰基的检测，所述的试剂盒如表3所示，
表3实施例1试剂盒的组成
检测步骤如下
1.内标液制备
A.分别取1.0mL的萃取剂，在萃取剂中加入同位素标记氨基酸内标品、同位素标记肉碱内标品和同位素标记酰基肉碱内标品的冻干粉小瓶中，盖紧瓶盖震荡混匀，使其中的粉末完全溶解，溶解困难时，可置于超声仪中超声，注意放置冰块避免温度升高；
B.内标液可在-80℃冰箱保存。
2.工作液制备
A.将内标液置室温20分钟。
B.以每孔100μL萃取剂用量，计算当天待测样品和质控品所需的萃取剂总量。
C.按倍数稀释萃取剂：同位素标记氨基酸内标液为1:200、萃取剂：同位素标记肉碱内标液为1：200和萃取剂：同位素标记酰基肉碱内标液为1：200配制包含同位素标记氨基酸、同位素标记肉碱和同位素标记酰基肉碱工作液。例如需要20mL的日常工作溶液，需要从内标液中各取0.1mL，将其在19.8mL的萃取剂中稀释；
3.取样
将质控血片和样本血片在蛋白过滤板排序，用3.2mm的打孔器按顺序将血片打入蛋白过滤板中；
4.样本萃取
将蛋白过滤板对准孔位，架设在96深孔板上，将100μL含内标的工作液分别加入蛋白过滤板的反应孔中，透明封口膜密封过滤板，在45℃的恒温混匀仪中，750rpm震荡45分钟，注意避光；
5.样本上机检测
将蛋白过滤板与96孔板一同放在多管架自动平衡离心机上，配平，4000rpm离心2分钟将液体从蛋白过滤板过滤到96深孔板内，用橡胶盖垫密封96深孔板，将板置入自动进样器内，供高效液相色谱-串联质谱仪检测，高效液相的条件如下：流动相：进样10μL，进样梯度：0-0.01min为0.22μL/min，0.01-0.20min为0.22μL/min，0.20-0.25min为0.018μL/min，0.25-1.01min为0.018μL/min，1.01-1.1min为0.6μL/min，1.1-1.30min为0.6μL/min，1.30-1.40min为0.22μL/min，1.40-1.50min为0.22μL/min。每份样本1.619min。
多反应监测离子对(MRM)及相应的电压参数如表4：
表4多反应监测离子对(MRM)及相应的电压参数
其他质谱参数：
离子源温度450℃，
离子源电压5500V，
雾化器35psi，
碰撞气5psi，
气帘气15psi，
辅助加热气45psi。
上机检测
取处理好的质控品和检测样本溶液注入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测，并记录色谱图与检测样本中多种氨基酸和肉碱的峰面积和多种氨基酸和肉碱同位素内标的峰面积。
其中，图1显示氨基酸、肉碱和酰基肉碱及其同位素标准离子流叠加图，图2和图3分别显示了脯氨酸标准离子流图和脯氨酸同位素标准离子流图。
定量分析
采用软件ChemoView 3.0版本，根据同位素内标和各种丁酯化的氨基酸和酰基肉碱的离子峰强度，由已知浓度的内标，根据软件设定程序自动计算出所测样品中各种氨基酸和酰基肉碱的浓度。
计算公式：
上式中：
C1：待测物浓度值
A1：待测物质谱响应值
As：待测物对应内标的质谱响应值
Cs：待测物对应内标的浓度(μmol/L)
RRF：待测物对应的相对响应因子，RRF＝31.25，通过100μL内标工作液加入到3.2μL滤纸干血片中计算得到的待测物稀释倍数。
其中，内标为同位素标记内标品。
检测样本结果的计算：将检测样本的质谱响应值与内标谱响应值代入上述公式中，计算检测样本中待测化合物的浓度，见表5。
表5两种氨基酸浓度
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种非衍生化法检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括内标品、萃取剂、流动相；
其中，所述的内标品包括：同位素标记氨基酸内标品、同位素标记肉碱内标品、同位素标记酰基肉碱内标品，或其组合；
所述的流动相包含甲醇、水、羧酸，其中甲醇含量为50％-100％(v/v)，羧酸浓度为0.05-1mol/L，溶剂为水。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的萃取剂包括甲醇、水、羧酸混合液，其中甲醇含量为65％-95％(v/v)，优选70％-90％(v/v)，羧酸浓度为0.1-0.5mol/L，溶剂为水。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的羧酸选自下组：甲酸、乙酸、草酸，或其组合。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的同位素标记为同位素标记氨基酸内标品、同位素标记肉碱内标品和/或同位素标记酰基肉碱内标品。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的同位素标记选自下组：D标记、13C标记、15N标记，或其组合。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括质控品，所述质控品选自下组的一种或多种试剂：氨基酸质控品、肉碱质控品、酰基肉碱质控品。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括选自下组的一种或多种组件：蛋白过滤板、深孔板、透明封口膜、橡胶盖垫。
8.一种如权利要求1所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于检测样品中氨基酸、肉碱和/或酰基肉碱的含量。
9.一种用权利要求1所述的试剂盒检测样品中氨基酸、肉碱和/或酰基肉碱的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)内标液制备
提供制备得到含有同位素标记氨基酸内标液、同位素标记肉碱内标液，和/或同位素标记酰基肉碱内标液；
(2)工作液准备
采用萃取剂稀释所述的同位素标记氨基酸内标液、同位素标记肉碱内标液，和/或同位素标记酰基肉碱内标液分别配制同位素标记氨基酸工作液、同位素标记肉碱工作液，和/或同位素标记酰基肉碱工作液；
(3)取样
将待测样品和任选的质控品置于蛋白过滤板中；
(4)样本萃取
将蛋白过滤板对准深孔板中的孔位，将同位素标记氨基酸工作液、同位素标记肉碱工作液，和/或同位素标记酰基肉碱工作液加入到蛋白过滤板的反应孔中，震荡混匀，离心；
(5)样本上机检测
高效液相色谱-串联质谱仪检测深孔板中样品中氨基酸、肉碱和/或酰基肉碱的含量。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在所述的步骤(2)中：
萃取剂：同位素标记氨基酸内标液为1：100-300(v/v)，优选1:150-250(v/v)，更优选为1:200(v/v)；和/或
萃取剂：同位素标记肉碱内标液为1：100-300(v/v)，优选1:150-250(v/v)，更优选为1:200(v/v)；和/或
萃取剂：同位素标记酰基肉碱内标液为1：100-300(v/v)，优选1:150-250(v/v)，更优选为1:200(v/v)。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111272888A (zh) * | 2020-01-10 | 2020-06-12 | 山东英盛生物技术有限公司 | 一种新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法 |
| CN112379016A (zh) * | 2020-11-02 | 2021-02-19 | 江苏宝众宝达药业有限公司 | 一种高效液相色谱法测定3-o-十二酰-l-肉碱中左旋肉碱含量的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080274556A1 (en) * | 2007-05-04 | 2008-11-06 | Perkinelmer Las, Inc. | Detecting isomers using differential derivatization mass spectrometry |
| CN103278584A (zh) * | 2013-05-28 | 2013-09-04 | 上海市儿童医院 | 一种串联质谱非衍生化法检测试剂盒 |
| CN106483208A (zh) * | 2015-09-02 | 2017-03-08 | 实验室系统诊断有限公司 | 用于使用质谱法检测尿素循环障碍的新方法和试剂盒 |
| CN106591273A (zh) * | 2016-12-07 | 2017-04-26 | 中国人民解放军陆军总医院 | 一组与先天性代谢缺陷病相关的基因新突变及检测试剂盒 |
-
2018
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080274556A1 (en) * | 2007-05-04 | 2008-11-06 | Perkinelmer Las, Inc. | Detecting isomers using differential derivatization mass spectrometry |
| CN103278584A (zh) * | 2013-05-28 | 2013-09-04 | 上海市儿童医院 | 一种串联质谱非衍生化法检测试剂盒 |
| CN106483208A (zh) * | 2015-09-02 | 2017-03-08 | 实验室系统诊断有限公司 | 用于使用质谱法检测尿素循环障碍的新方法和试剂盒 |
| CN106591273A (zh) * | 2016-12-07 | 2017-04-26 | 中国人民解放军陆军总医院 | 一组与先天性代谢缺陷病相关的基因新突变及检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MARCUS J. MILLER 等: "Untargeted metabolomic analysis for the clinical screening of inborn errors of metabolism", 《J INHERIT METAB DIS》 * |
| 田国力 等: "非衍生化串联质谱技术筛查上海部分地区新生儿遗传代谢病的回顾性分析", 《临床检验杂志》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111272888A (zh) * | 2020-01-10 | 2020-06-12 | 山东英盛生物技术有限公司 | 一种新生儿血片中氨基酸及肉碱筛查预处理方法 |
| CN112379016A (zh) * | 2020-11-02 | 2021-02-19 | 江苏宝众宝达药业有限公司 | 一种高效液相色谱法测定3-o-十二酰-l-肉碱中左旋肉碱含量的方法 |
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