ES2604055A2 - Kits novedosos para la detección de trastornos del ciclo de la urea usando espectrometría de masas - Google Patents

Kits novedosos para la detección de trastornos del ciclo de la urea usando espectrometría de masas Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a kits de exploración de recién nacidos para exploración de alto rendimiento y análisis de trastornos metabólicos usando cromatografía líquida - espectrometría de masas (LC-MS). Los trastornos metabólicos pueden ser trastornos de aminoácidos, ácidos orgánicos u oxidación de ácido graso, y particularmente trastornos o deficiencias del ciclo de la urea, hiperamonemia, hiperornitinemia-hiperamonemia-homocitrulinuria (HHH), y/o aciduria argininosuccínica.

Claims (26)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método para detectar la presencia y/o medición de los niveles de uno o más metabolitos en una muestra obtenida de un sujeto, por espectrometría de masas en tándem, comprendiendo los metabolitos al menos glutamina y comprendiendo el 5 método los siguientes pasos:
    (i) extraer dichos metabolitos de la muestra con una solución de extracción;
    (ii) proporcionar, antes o después del paso (i), una solución que comprende una cantidad conocida de un o más patrones internos marcados con isótopos estables 10 que corresponden a dichos metabolitos que se detectan en la muestra,
    (iii) ionizar dichos metabolitos y dichos uno o más patrones internos marcados con isótopos estables, para generar iones,
    (iv) adquirir la relación de masa a carga (m/z) de dicho uno o más iones en el espectro de masas en el modo de Monitoreo de Reacción Múltiple (MRM), y 15
    (v) determinar la suma de glutamina y lisina en el modo MRM,
    (vi) detectar y cuantificar la cantidad de glutamina con un patrón interno marcado con isótopos estables que corresponde a la lisina.
  2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, para la diagnosis in vitro de una o 20 más deficiencias metabólicas seleccionadas entre trastornos del ciclo de la urea, y/o hiperamonemia, hiperornitinemia-hiperamonemia-homocitrulinuria (HHH), y/o aciduria argininosuccínica, que comprende además un paso (vii) en donde se detecta un nivel elevado de glutamina como se obtiene en el paso (vi) en comparación con un nivel fisiológico de glutamina. 25
  3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde además, uno o más metabolitos seleccionados entre aminoácidos, ácidos orgánicos, acilcarnitinas, una pluralidad de carnitinas, y/o succinilacetona, se detectan y se cuantifican, y en donde dicho método comprende además un paso (v) para determinar la presencia y/o las 30 cantidades de dichos uno o más metabolitos, analizando el espectro MRM de masas como se obtiene en el paso (iv).
  4. 4. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichos aminoácidos comprenden ácido aspártico, serina, prolina, fenilalanina, 35 tirosina, metionina, valina, leucina, citrulina, homocitrulina, ornitina, arginina, alanina, N-acetil glutamato, ácido glutámico, glicina, argininosuccinato y/u oxoprolina, y/o en donde dicho ácido orgánico comprende ácido orótico, y/o en donde dichas acil carnitinas o pluralidad de carnitinas, comprenden carnitinas libres, acetil-carnitina, propionilcarnitina, butirilcarnitina, isovalerilcarninitina, glutarilcarnitina, hexanoilcarnitina, octanoilcarnitina, decanoilcarnitina, lauroilcarnitina, miristoilcarnitina, palmitoilcarnitina, y/o estearoilcarnitina. 5
  5. 5. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dichos uno o más patrones internos marcados con isótopos estables están secas y/o comprenden al menos un patrón interno marcado con isótopos estables de lisina, y además comprende un o más patrones internos marcados con isótopos 10 estables correspondientes a alanina, arginina, citrulina, glicina, leucina, metionina, ornitina, fenilalanina, glutamina, valina, lisina, ácido aspártico, ácido glutámico, tirosina, serina, oxoprolina, prolina, argininosuccinato, succinilacetona, ácido orótico, carnitina libre, acetil carnitina, propionilcarnitina, butirilcarnitina, isovalerilcarninitina, glutarilcarnitina, hexanoilcarnitina, octanoilcarnitina, decanoilcarnitina, lauroilcarnitina, 15 miristoilcarnitina, palmitoilcarnitina y/o estearoilcarnitina.
  6. 6. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha muestra es una muestra de fluido corporal, y/o en donde dicho sujeto es un sujeto, tal como un neonato, un recién nacido, o un niño, preferentemente un recién 20 nacido, que se sospecha que tiene un trastorno metabólico.
  7. 7. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha muestra es una muestra de sangre, y/o en donde dicho sujeto es un sujeto, tal como un neonato, un recién nacido, o un niño, preferentemente un recién 25 nacido, que se sospecha que tiene un trastorno metabólico.
  8. 8. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha muestra es una muestra de sangre seca, y/o en donde dicho sujeto es un sujeto, tal como un neonato, un recién nacido, o un niño, preferentemente un recién 30 nacido, que se sospecha que tiene un trastorno metabólico.
  9. 9. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho paso de ionización (iii) se realiza suministrando dichos metabolitos extraídos y patrones a una fuente de iones del espectrómetro de masas por un 35 sistema de cromatografía líquida, y/o en donde dicho paso de adquisición de datos (iv) se realiza con un espectrómetro de masas de triple cuadrúpolo o espectrómetro de masas de alta resolución, y/o en donde el paso (v) se realiza seleccionando al menos iones de una relación de masa a carga (m/z) precisa que corresponde a al menos una relación de masa a carga (m/z) calculada de dichos uno o más metabolitos presentes en dicha muestra.
    5
  10. 10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cantidad determinada o la presencia de glutamina se correlaciona con la presencia o ausencia de un trastorno del ciclo de urea, y/o hiperamonemia, y/o Hiperornitinemia-hiperamonemia-homocitrulinuria (HHH), y/o aciduria argininosuccínica.
    10
  11. 11. El método de acuerdo con las reivindicaciones anteriores, que además comprende de manera simultánea o secuencial, el análisis de polipéptidos, comprendiendo dicho polipéptido un polipéptido elegido entre hemoglobina, variantes de hemoglobina, albúmina, mioglobina, citocromos, enzimas bacterianas, determinantes peptídicos de antigenicidad, glucoproteínas y proteínas variantes asociadas con diversos trastornos 15 congénitos en donde dicho método comprende además el paso de (v) ensayar la actividad enzimática del polipéptido en la muestra, y/o (vi) ensayar la composición de aminoácidos de dicho polipéptido.
  12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, en donde el ensayo de la 20 actividad enzimática en dicha muestra comprende (a) añadir a dicha muestra un sustrato para dicha actividad enzimática y (b) analizar la muestra con respecto a la presencia o ausencia de dicho substrato y/o con respecto a la presencia o ausencia de un producto resultante de dicha actividad enzimática en dicho sustrato, y/o en donde el ensayo de la composición de aminoácidos comprende (i) añadir una endopeptidasa, 25 (ii) analizar los polipéptidos en dicha muestra después del tratamiento con endopeptidasa, y (iii) deducir la composición de aminoácidos de dicho polipéptido.
  13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 11 o 12, en donde la técnica de ionización se usa para producir un espectro múltiplemente cargado, para detectar (a) 30 la presencia o ausencia de un polipéptido o derivado de un polipéptido, o (b) la presencia o ausencia de una variante de un polipéptido o derivado de un polipéptido, en donde el escaneo de la muestra fija como diana las especies ionizadas seleccionadas de relación masa/carga conocida, siendo la ausencia del valor esperado de la relación masa/carga indicativa de la ausencia del polipéptido conocido o derivado 35 del mismo, o siendo la presencia del polipéptido variante o derivado del mismo indicada por un cambio en la relación masa/carga del valor esperado.
  14. 14. Un kit de exploración de recién nacidos para detectar la presencia y/o medición de niveles de glutamina en una muestra de sangre de un recién nacido, mediante espectrometría de masas en tándem, que comprende además al menos una placa o microplaca, controles de mancha de sangre seca, solución de extracción, solución eluyente, una solución de patrón interno que comprende al menos un patrón interno 5 marcado con isótopos estables que corresponde a lisina, y/o una o más cubiertas.
  15. 15. Kit de exploración de recién nacidos de la reivindicación 14 que comprende uno o más de los siguientes elementos:
    10
    - placas de extracción;
    - placas de análisis;
    - controles de manchas de sangre seca;
    - patrones internos marcados con isótopos estables almacenados de concentraciones conocidas, 15
    - solución de extracción;
    - solución eluyente;
    - cubiertas de plástico adhesivas;
    - cubiertas de lámina delgada de aluminio.
    20
  16. 16. Kit de exploración de recién nacidos de la reivindicación 14 o 15, donde dicha solución de patrón interno comprende además uno o más patrones internos marcados con isótopos estables que corresponden a uno o más metabolitos seleccionados entre aminoácidos etiquetados, acilcarnitinas etiquetadas, succinilacetona etiquetada y ácido argininosuccínico etiquetado. 25
  17. 17. El kit de exploración de recién nacidos de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en donde dicha solución de patrón interno comprende además uno o más patrones internos marcados con isótopos estables que corresponden a alanina, arginina, citrulina, homocitrulina, glicina, leucina, metionina, 30 ornitina, fenilalanina, valina, ácido aspártico, ácido glutámico, tirosina, serina, oxoprolina, prolina, argininosuccinato, succinilacetona, ácido orótico, carnitina libre, acetilcarnitina, propionilcarnitina, butirilcarnitina, isovalerilcarninitina, glutarilcarnitina, hexanoilcarnitina, octanoilcarnitina, decanoilcarnitina, lauroilcarnitina, miristoilcarnitina, palmitoilcarnitina, y/o estearoilcarnitina, y en donde dicho kit permite la diagnosis en 35 dichos recién nacidos de una o más deficiencias metabólicas seleccionadas entre trastornos del ciclo de la urea, y/o hiperamonemia, Hiperornitinemia-hiperamonemia-homocitrulinuria (HHH), y/o aciduria argininosuccínica, así como trastornos metabólicos adicionales de recién nacidos, seleccionados entre trastornos de aminoácidos, trastornos de oxidación de ácido graso (FAO) y acidurias orgánicas (OA).
    5
  18. 18. El kit de exploración de recién nacidos de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en donde dicha solución de patrón interno comprende al menos 13C6-15N2-lisina, y además comprende uno o más patrones seleccionados entre 2H4-alanina, 2H2-citrulina, 15N-13C-glicina, 2H3-leucina, 2H3-metionina, 2H6-ornitina, 13C6-fenilalanina, 2H8-valina, 2H3-ácido aspártico, 2H3-ácido glutámico, 13C3-10 serina, 13C6-tirosina, 2H5-prolina, 13C5-succinilacetona, 15N4-13C6-argininosuccinato, 2H9-carnitina, 2H3-acetilcarnitina, 2H3-propionilcarnitina, 2H3-butirilcarnitina, 2H9-isovalerilcarnitina, 2H3-glutarilcarnitina, 2H3-hexanoilcarnitina, 2H3-octanoilcarnitina, 2H3-decanoilcarnitina, 2H3-lauroilcarnitina, 2H9-miristoilcarnitina, 2H3-palmitoilcarnitina, y/o 2H3-estearoilcarnitina. 15
  19. 19. El kit de exploración de recién nacidos de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en donde dicha muestra es una muestra de sangre.
  20. 20. El kit de exploración de recién nacidos de conformidad con una cualquiera de las 20 reivindicaciones 14 a 19, en donde dicha muestra es una muestra de sangre seca.
  21. 21. El kit de exploración de recién nacidos de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, en donde dichos patrones internos marcados con isótopos estables se almacenan en frascos separados o en un frasco común. 25
  22. 22. El kit de exploración de recién nacidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 21, en donde dichos patrones internos marcados con isótopos estables están en forma seca.
    30
  23. 23. El kit de exploración de recién nacidos de conformidad con la reivindicación 15, en donde dicha placa de extracción es una microplaca de fondo en forma de U y/o en donde dicha placa de análisis es una microplaca de fondo en forma de V.
  24. 24. Una solución de patrón interno que comprende al menos un patrón interno 35 marcado con isótopos estables de lisina, y que además comprende uno o más patrones internos marcados con isótopos estables que corresponden a alanina, arginina, citrulina, homocitrulina, glicina, leucina, metionina, ornitina, glutamina, fenilalanina, valina, ácido glutámico, ácido aspártico, tirosina, serina, oxoprolina, prolina, argininosuccinato, succinilacetona, ácido orótico, carnitina libre, acetilcarnitina, propionilcarnitina, butirilcarnitina, isovalerilcarninitina, glutarilcarnitina, hexanoilcarnitina, octanoilcarnitina, decanoilcarnitina, lauroilcarnitina, miristoilcarnitina, 5 palmitoilcarnitina, y/o estearoilcarnitina.
  25. 25. Una solución de patrón interno de la reivindicación 24 que comprende al menos 13C6-15N2-lisina, y además comprende uno o más patrones seleccionados entre 2H4-alanina, 2H2-citrulina, 15N-13C-glicina, 2H3-leucina, 2H3-metionina, 2H6-10 ornitina, 13C6-fenilalanina, 2H8-valina, 2H3-ácido aspártico, 2H3-ácido glutámico, 13C3-serina, 13C6-tirosina, 2H5-prolina, 13C5-succinilacetona, 15N4-13C6-argininosuccinato, 2H9-carnitina, 2H3-acetilcarnitina, 2H3-propionilcarnitina, 2H3-butirilcarnitina, 2H9-isovalerilcarnitina, 2H3-glutarilcarnitina, 2H3-hexanoilcarnitina, 2H3-octanoilcarnitina, 2H3-decanoilcarnitina, 2H3-lauroilcarnitina, 2H9-miristoilcarnitina, 2H3-15 palmitoilcarnitina, y/o 2H3-estearoilcarnitina.
  26. 26. Una solución de patrón interno de la reivindicación 24 o 25, en donde dichos patrones están secos.
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