CN117929585A - 分步内标法检测干血斑中的神经递质 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及质谱检测技术领域，具体涉及分步内标法检测干血斑中的神经递质。本发明通过干血斑采集待测样本，经打孔、稀释、复溶、分步添加内标等前处理步骤后，过程中采用和样本采集同样的方法制备干血斑标准样品和干血斑质控品，采用标准曲线法进行液相色谱质谱联用法分析。
Description
技术领域：
本发明涉及质谱检测技术领域，具体涉及分步内标法检测干血斑中的神经递质。
背景技术：
神经递质是神经元之间或神经元与效应器细胞如肌肉细胞、腺体细胞等之间传递信息的化学物质，被释放出来的神经递质可与位于突触后膜的受体进行结合，引起下游神经元兴奋性的改变，最终实现神经元之间信号的转导，在神经元发挥其生理功能中起着十分重要的作用，它们与多种疾病息息相关，如多巴胺与心情愉悦和调节运动相关，它的水平失调是精神分裂症和帕金森症的重要原因；5-羟色胺参与体温调节、情感情绪、食欲睡眠等多个行为活动；吲哚胺的体内水平与阿尔茨海默症、抑郁症、帕金森症等密切相关(Roy etal,2021；O'Connor et al,2009)；组胺系统影响认知功能(Passani M B et al,2004)；准确的定性定量研究神经递质对于神经发育相关的机制、病理研究、疾病诊断和临床疗效研究等方面具有重要意义。
对神经递质的现有检测技术有生物检测技术、电化学检测技术等，但传统的生物检测技术需要特定的抗体或荧光探针，检测种类非常有限，电化学检测技术也仅适用于少数容易离子化的化合物，并且这些技术统一的缺点是灵敏度较低。近几年的多项研究证实了，液相色谱-质谱联用技术(LC/MS)能够简单快速地实现多种神经递质的痕量检测，灵敏度可达几fmol到pmol水平(Tufi S et al,2015)，并且可对血液、肾上腺、下丘脑等多个部位标本中的神经递质进行精准测定。液相色谱-质谱联用技术在神经递质检测中具有检测时间短，灵敏度高等特点及优势，近年来在疾病的诊断、预防，以及动物病理模型实验等领域中得到了广泛的应用。但因为神经递质在血液中的浓度低，本身稳定性不够等一系列问题，在样品的采集、存储和运输等方面有着苛刻的要求，传统的液相色谱-质谱联用检测方法应用于血液神经递质检测面临着巨大的挑战。
干血斑(DryBloodSpotDBS)是将全血样品收集在专用卡纸上，干燥后形成的斑点，再经溶剂萃取后通过检测其中待测组分的信息的样品采集方式。与传统的血样采集方式相比，干血斑(DBS)技术创造了生物分析的新模式。与传统的采血方式相比，DBS优点众多：1)微量采样，样品取样体积显著下降(≤100微升)；2)采集方便，扎手指等末梢血采血方式对身体的伤害非常小，对新生儿、老人、病人等群体非常友好；3)取血以后不需要做任何的后续处理；4)运输存储方便，运输储藏DBS卡只需在室温条件下进行，无需冷链运输储藏；5)以上因素均带来了成本上的大幅降低。
因为干血斑基质和普通体液基质的区别，一直以来干血斑样本的内标添加存在着争议，内标添加的方案多种多样。目前干血斑样品分析中常见的内标添加方式有四种：1)在提取溶剂中加入内标；2)DBS卡中预先加入内标；3)全血样品中加入内标；4)在提取前的干血斑样片中加入内标。这些内标加入的方式各有优缺点，如：1)在提取溶剂中加入内标方法简单、应用广泛、重现性好，它可抵消基质效应和提取回收率对分析结果的影响，也不受样品处理过程中带来的损失和分析仪器灵敏度波动的影响。但在这种方法中，由于内标没有被加入到基质和样品采集卡上，不能抵消样品提取过程种种波动带来的影响，此外无法反映样品储存对提取回收率的影响。2)DBS卡中预先加入内标是在全血样品点样前，先将内标加入DBS卡，内标将和分析物混合，在一起进行提取。这种预先将内标加入集采卡的方法较费时，且成本很高。此外，后续全血样品的点样过程对内标的影响无法明确。3)全血样品中加入内标是在点样前将内标加入全血样品。此方法的优点是内标和分析物同样处于全血基质中。但缺点是在绝大多数临床中心此做法不具备实际操作性，而且在采集患有感染性疾病患者血样时会带来额外的安全风险。4)在提取前在干血斑样片中加入内标的方法直接在最终检测体系中融入了内标物，分析精密度和准确度较好，但此方法需要给予足够的时间以使内标与样品基质及样品卡材质相混合，该部分效果难以量化评估，同时需要保证过程对样品的分布没有负面影响。
为解决上述样品采集存储难、低浓度检出和内标添加准确定量困难的问题，本专利提出了一种干血斑采样的基于液相色谱串级质谱分析的分步内标添加的神经递质检测方法，有别于传统的方法，本发明有效避免了神经递质血液检测样本存储难、干血斑LC-MS/MS检测定量难的问题。
发明内容：
本发明正是针对上述问题，提供了一种分步内标法检测干血斑中的神经递质的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案，通过干血斑采集待测样本，经打孔、稀释、复溶、分步添加内标等前处理步骤后，过程中采用和样本采集同样的方法制备干血斑标准样品和干血斑质控品(QC-DBS)，采用标准曲线法进行液相色谱质谱联用法分析，具体的步骤为，
1、血液样本的干血斑采集：
准备新鲜全血样品，取血样点在干血斑采集卡上，在25℃室温条件下干燥2h，干燥后得到干血斑标样，密封保存；准备新鲜全血样品的方式可以为传统的采血方式，也可以为末梢血采血方式；
2、干血斑标准样品制备：
取六份2ml空白血基质，分别加入六个不同浓度水平的神经递质标准溶液，涡旋混匀后，取步骤1相同体积滴加在干血斑采集卡纸上，待液体扩散后，于25℃室温条件下干燥2h，干燥后得到干血斑标样，密封保存；
3、干血斑质控品(QC-DBS)制备：
取三份2ml空白血基质，分别加入三个不同浓度水平的神经递质标准溶液，涡旋混匀后，取步骤1相同体积滴加在干血斑采集卡纸上，待液体扩散后，于25℃室温条件下干燥2h，干燥后得到干血斑质控品，密封保存；
4、干血斑样本打孔：
打孔对象为步骤1得到的已干燥过的含血样点的干血斑采集卡，使用3～8mm打孔器打孔，获得3～8mm直径的干血斑样品片；
5、干血斑样本稀释：
干血斑样品片中加入含0.1％甲酸的甲醇、体积比1：1的甲醇-水混合液或体积比1：1的乙腈-水混合液，振荡、涡旋混匀20～60min；取上清液冷冻干燥，加入工作液复溶，在4℃14000rcf条件下低温高速离心，取上清液备用；
6、干血斑样本内标分步添加：
使用含0.1％甲酸的甲醇、体积比1：1的甲醇-水混合液或体积比1：1的乙腈-水混合液溶解待测神经递质内标物配置内标液；内标液可添加到下述三个步骤制得的样品中的两个或三个：a.在步骤1全血样品点样过程中加入内标液；b.在步骤5)第一步加入工作液时添加内标液；c.在步骤4)的样品片上添加内标液，添加量单个步骤5-10μL；
7、干血斑标准样品和干血斑质控品(QC-DBS)打孔：
打孔对象为步骤2中得到的已干燥过的干血斑标样和步骤3中得到的已干燥过的干血斑质控品，使用3～8mm打孔器打孔，获得3～8mm直径的干血斑标准样品片和干血斑质控品片；
8、干血斑标准样品和干血斑质控品(QC-DBS)稀释：
步骤7得到的干血斑标样中加入含0.1％甲酸的甲醇、体积比1：1的甲醇-水混合液或体积比1：1的乙腈-水混合液，振荡、涡旋混匀20～60min；取上清液冷冻干燥，加入工作液复溶，在4℃14000rcf条件下低温高速离心，取上清液备用；步骤7)得到的干血斑质控品中加入含0.1％甲酸的甲醇、体积比1：1的甲醇-水混合液或体积比1：1的乙腈-水混合液，振荡、涡旋混匀20～60min；取上清液冷冻干燥，加入工作液复溶，在4℃14000rcf条件下低温高速离心，取上清液备用；
9、干血斑标准样品和干血斑质控品(QC-DBS)内标添加：
使用含0.1％甲酸的甲醇、体积比1：1的甲醇-水混合液或体积比1：1的乙腈-水混合液溶解待测神经递质内标物配置内标液；干血斑标准样品和干血斑质控品内标分步添加，内标液可添加到下述三个步骤制得的样品中的两个或三个：a.在步骤1全血样品点样过程中加入内标液；b.在步骤5第一步加入工作液时添加内标液；c.在步骤4的样品片上添加内标液，添加量单个步骤5-10μL；
10、液相色谱串联质谱上机分析：
(1)取步骤4制得的干血斑样品片、步骤7制得的干血斑标样样品片和步骤8制得的干血斑质控品样品片上清液进行液相色谱分离；
(2)质谱分析，多反应监测模式(MRM)检测待测离子对。
干血斑采集卡纸采集的样本可以为全血，也可以为血浆、血清。
根据所要检测的对象不同，干血斑样本来源可以为人类，也可以为动物。
所述的工作液为含0.1％甲酸的甲醇、体积比1：1的甲醇-水混合液或体积比1：1的乙腈-水混合液。
步骤6的内标液添加到步骤1的全血样品点样过程中和步骤5的干血斑样本第一步加入工作液时。
步骤9的内标液添加到步骤3的干血斑质控品点样过程中和步骤8中干血斑质控品稀释第一步加入工作液时的。
内标为同位素内标或结构类似物内标，优选为同位素内标。
神经递质标准溶液为不同浓度的待测神经递质物质纯样品溶解在空白血基质中。
本发明的有益效果：
1、干血斑样本采集方式优点众多，如样品取样体积下降；末梢血采血方式对身体伤害小；取血后不需要做任何的后续处理；运输储藏DBS卡更简单、成本更低；为无生物分析实验室的地区检测提供方便。
2、和干血斑样本采集同步的干血斑标准样品和干血斑质控品制备方式，保证了标准曲线的准确性和一致性。
3、液相色谱质谱联用法的分析方式，具备选择性好、灵敏度高、分析时间短的优点。
4、创新提出了一种全新的分步内标添加的方式，弥补了传统干血斑分析内标添加过程的诸多缺陷，相比于传统干血斑在神经递质检测提高了定量的准确性。
附图说明：
图1分步内标法检测干血斑中的神经递质步骤示意图。
具体实施方式：
下面结合实施例给出本发明进一步的描述，以详细说明技术方案。
实施例1
分步内标校正法检测干血斑中的神经递质方法，包括如下步骤：
1、干血斑样本内标液配置，使用含0.1％甲酸的甲醇-水混合液(体积比1：1)溶解下表对应的待测神经递质内标物配置内标液：
| 同位素内标 | 浓度(nmol/L) |
| 多巴胺-d4 | 30 |
| 色氨酸-d5 | 7.5×105 |
| 5-羟色胺-d4 | 150 |
| 酪氨酸-d5 | 1.5×105 |
| 肾上腺素-d3 | 30 |
| 甲氧基肾上腺素-d3 | 30 |
| 去甲肾上腺-d4 | 30 |
| 甲氧基去甲肾上腺素-d3 | 30 |
后续干血斑样本内标将分两步添加到体系中：1)在步骤2全血样品点样过程中的血样中加入10μL内标液；2)在步骤6第一步加入工作液时添加10μL内标液。
2、准备新鲜全血样品，取30μL血样点在干血斑采集卡上，加入步骤1配置的内标液10μL，在25℃室温条件下干燥2h，干燥后得到干血斑标样，密封保存。
3、每组取六份30μL空白血基质，分别加入30μL含六个不同浓度水平的多巴胺、色氨酸、5-羟色胺、酪氨酸、肾上腺素、甲氧基肾上腺素、去甲肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素混合组成的神经递质标准溶液，六种标准溶液对应的各个组分的具体浓度数值如下：
涡旋混匀后，取30μL滴加在干血斑采集卡纸上，加入步骤1配置的内标液10μL，待液体扩散后至于室温条件下干燥2h，干燥后得到干血斑标样，密封保存；
4、每组取三份30μL空白血基质，分别加入30μL三个不同浓度水平的多巴胺、色氨酸、5-羟色胺、酪氨酸、肾上腺素、甲氧基肾上腺素、去甲肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素混合组成的神经递质标准溶液，三种标准溶液对应的各个组分的具体浓度数值如下：
涡旋混匀后，30μL体积滴加在干血斑采集卡纸上，加入步骤1配置的内标液10μL，待液体扩散后至于室温条件下干燥2h，干燥后得到干血斑质控品，密封保存。该样本作为质控样品QC，在测试过程中，用于监测整个分批中样品测定的稳定性，和常规质控品使用方法一致。
5、使用5mm打孔器，对步骤2中得到的已干燥过的含血样点的干血斑采集卡进行打孔，获得2片5mm直径的干血斑样品片。
6、2片干血斑样品片放置于2mL离心管中，加入100μL含1％甲酸的甲醇-水混合液(1：1)，加入步骤1配置的内标液10μL，振荡、涡旋混匀20-60min；取上清液冷冻干燥，加入100μL含1％甲酸的甲醇-水混合液(1：1)复溶，在4℃14000rcf条件下低温高速离心，取上清液50μL备用。
7、使用5mm打孔器，对步骤3中得到的已干燥过的干血斑标样采集卡进行打孔，获得2片5mm直径的干血斑标样片。
8、2片干血斑标样片放置于2mL离心管中，加入100μL含1％甲酸的甲醇-水混合液(1：1)，加入步骤1配置的内标液10μL，振荡、涡旋混匀20-60min；取上清液冷冻干燥，加入100μL含1％甲酸的甲醇-水混合液(1：1)复溶，在4℃14000rcf条件下低温高速离心，取上清液50μL备用。
9、使用5mm打孔器，对步骤4中得到的已干燥过的干血斑质控品采集卡进行打孔，获得2片5mm直径的干血斑质控品片。
10、2片干血斑质控品片放置于2mL离心管中，加入100μL含1％甲酸的甲醇-水混合液(1：1)，加入步骤1配置的内标液10μL，振荡、涡旋混匀20-60min；取上清液冷冻干燥，加入100μL含0.1％甲酸的甲醇-水混合液(1：1)复溶，在4℃14000rcf条件下低温高速离心，取上清液50μL备用。
11、超高液相色谱串联质谱上机检测：
(1)进样量5μL；
(2)流动相：流动相A相为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸甲醇溶液；流速为400μL/min；
(3)色谱柱：WatersACQUITYUPLCBEH Phenyl Column；
(4)柱温：40℃；
(5)液相梯度：0-2min流动相B维持在40％，2-5min流动相B逐渐升到70％，5-7min流动相B维持在70％，7-8min 95％流动相，8-10min 40％流动相B；
(6)质谱离子源电喷雾离子源(ESI)，离子源温度：450℃；气路1(Gas1)：60；气路2(Gas2)：60；帘气(CUR)：30；电喷雾电压：4500V。
(7)质谱检测模式为多反应监测模式(MRM)
各离子对及对应的电压参数如下：
实施例1中制作的干血斑标准样品采集卡经液相色谱串联质谱上机分析，以各浓度的积分面积与内标之比作为纵坐标，以各浓度为横坐标，建立标准曲线，如下：
实施例1中采集的干血斑样本检测结果如下：
为进一步验证发明方法的准确度和精密度，开展了准确度考察和精密度考察测试。
精密度考察采用加标回收率试验进行评估。随机抽取一例人全血样品，其中一份不加标准品，其他三份分别加入低、中、高三个浓度的标准品，以上述相同的步骤重复处理并测试5次，结果如下表所示：
测试结果显示，8种神经递质的加标回收率在91.5％-109.6％之间，加标回收率均在85％-115％之间。
精密度考察取正常人全血样品一天内重复处理6批，以同位素内标法定量测试8种神经递质的浓度，测试批内精密度；三日内分3批处理，测试批间精密度，测试结果如下表所示：
/>
测试结果显示，批内精密度为4.29％-12.78％，批间精密度为5.84％-11.46％。
以上实施例仅为本发明的其中一种较佳实施例，所涉及到的具体参数、数值，检测目标的数量、使用的具体设备型号等并不用以限制本发明，凡在本发明精神和原则内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.分步内标法检测干血斑中的神经递质，其特征在于，通过干血斑采集待测样本，经打孔、稀释、复溶、分步添加内标等前处理步骤后，过程中采用和样本采集同样的方法制备干血斑标准样品和干血斑质控品，采用标准曲线法进行液相色谱质谱联用法分析，
具体的步骤为，
(1)血液样本的干血斑采集
准备新鲜全血样品，取血样点在干血斑采集卡上，在25℃室温条件下干燥2h，干燥后得到干血斑标样，密封保存；
(2)干血斑标准样品制备
取六份2ml空白血基质，分别加入六个不同浓度水平的神经递质标准溶液，涡旋混匀后，取步骤1)相同体积滴加在干血斑采集卡纸上，待液体扩散后，于25℃室温条件下干燥2h，干燥后得到干血斑标样，密封保存；
(3)干血斑质控品制备
取三份2ml空白血基质，分别加入三个不同浓度水平的神经递质标准溶液，涡旋混匀后，取步骤1)相同体积滴加在干血斑采集卡纸上，待液体扩散后，于25℃室温条件下干燥2h，干燥后得到干血斑质控品，密封保存；
(4)干血斑样本打孔
打孔对象为步骤1)得到的已干燥过的含血样点的干血斑采集卡，使用3～8mm打孔器打孔，获得3～8mm直径的干血斑样品片；
(5)干血斑样本稀释
干血斑样品片中加入含0.1％甲酸的甲醇、体积比1：1的甲醇-水混合液或体积比1：1的乙腈-水混合液，振荡、涡旋混匀20～60min；取上清液冷冻干燥，加入工作液复溶，在4℃14000rcf条件下低温高速离心，取上清液备用；
(6)干血斑样本内标分步添加
使用含0.1％甲酸的甲醇、体积比1：1的甲醇-水混合液或体积比1：1的乙腈-水混合液溶解待测神经递质内标物配置内标液；内标液可添加到下述三个步骤制得的样品中的两个或三个：a.在步骤1全血样品点样过程中加入内标液；b.在步骤5)第一步加入工作液时添加内标液；c.在步骤4)的样品片上添加内标液，添加量单个步骤5-10μL；
(7)干血斑标准样品和干血斑质控品打孔
打孔对象为步骤2)中得到的已干燥过的干血斑标样和步骤3)中得到的已干燥过的干血斑质控品，使用3～8mm打孔器打孔，获得3～8mm直径的干血斑标准样品片和干血斑质控品片；
(8)干血斑标准样品和干血斑质控品稀释
步骤7)得到的干血斑标样中加入含0.1％甲酸的甲醇、体积比1：1的甲醇-水混合液或体积比1：1的乙腈-水混合液，振荡、涡旋混匀20～60min；取上清液冷冻干燥，加入工作液复溶，在4℃14000rcf条件下低温高速离心，取上清液备用；步骤7)得到的干血斑质控品中加入含0.1％甲酸的甲醇、体积比1：1的甲醇-水混合液或体积比1：1的乙腈-水混合液，振荡、涡旋混匀20～60min；取上清液冷冻干燥，加入工作液复溶，在4℃14000rcf条件下低温高速离心，取上清液备用；
(9)干血斑标准样品和干血斑质控品内标添加
使用含0.1％甲酸的甲醇、体积比1：1的甲醇-水混合液或体积比1：1的乙腈-水混合液溶解待测神经递质内标物配置内标液；干血斑标准样品和干血斑质控品内标分步添加，内标液可添加到下述三个步骤制得的样品中的两个或三个：a.在步骤1)全血样品点样过程中加入内标液；b.在步骤5)第一步加入工作液时添加内标液；c.在步骤4)的样品片上添加内标液，添加量单个步骤5-10μL；
(10)液相色谱串联质谱上机分析：
a.取步骤4制得的干血斑样品片、步骤7制得的干血斑标样样品片和步骤8制得的干血斑质控品样品片上清液进行液相色谱分离；
b.质谱分析，多反应监测模式(MRM)检测待测离子对。
2.根据权利要求1所述的分步内标法检测干血斑中的神经递质，其特征在于，步骤1)准备新鲜全血样品的方式为传统的采血方式或末梢血采血方式。
3.根据权利要求1所述的分步内标法检测干血斑中的神经递质，其特征在于，干血斑采集卡纸采集的样本可以为全血，也可以为血浆、血清。
4.根据权利要求1所述的分步内标法检测干血斑中的神经递质，其特征在于，所述的工作液为含0.1％甲酸的甲醇、体积比1：1的甲醇-水混合液或体积比1：1的乙腈-水混合液。
5.根据权利要求1所述的分步内标法检测干血斑中的神经递质，其特征在于，步骤6)的内标液添加到步骤1)的全血样品点样过程中和步骤5)的干血斑样本第一步加入工作液时。
6.根据权利要求1所述的分步内标法检测干血斑中的神经递质，其特征在于，步骤9)的内标液添加到步骤3)的干血斑质控品点样过程中和步骤8)中干血斑质控品稀释第一步加入工作液时的。
7.根据权利要求1所述的分步内标法检测干血斑中的神经递质，其特征在于，内标为同位素内标或结构类似物内标，优选为同位素内标。
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