JPH05133958A - タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方法 - Google Patents
タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方法Info
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- JPH05133958A JPH05133958A JP30081891A JP30081891A JPH05133958A JP H05133958 A JPH05133958 A JP H05133958A JP 30081891 A JP30081891 A JP 30081891A JP 30081891 A JP30081891 A JP 30081891A JP H05133958 A JPH05133958 A JP H05133958A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 酵素を用いることなく、簡便な操作でタンパ
ク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸
配列を決定する。 【構成】 タンパク質あるいはペプチドに一般式、ＣＦ
3−（ＣＦ2）n−ＣＯＯＨ（ｎは０以上の整数）で表さ
れる有機酸の、酸無水物、例えばトリフルオロ酢酸（ｎ
＝０）、ペンタフルオロプロピオン酸（ｎ＝１）あるい
はヘプタフルオロ酪酸（ｎ＝２）の酸無水物を作用さ
せ、その結果生じた反応混合物を質量分析装置にかける
ことにより質量スペクトルを得て、反応混合物に含まれ
る各化学種の質量を測定することにより、タンパク質あ
るいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を
決定する。
ク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸
配列を決定する。 【構成】 タンパク質あるいはペプチドに一般式、ＣＦ
3−（ＣＦ2）n−ＣＯＯＨ（ｎは０以上の整数）で表さ
れる有機酸の、酸無水物、例えばトリフルオロ酢酸（ｎ
＝０）、ペンタフルオロプロピオン酸（ｎ＝１）あるい
はヘプタフルオロ酪酸（ｎ＝２）の酸無水物を作用さ
せ、その結果生じた反応混合物を質量分析装置にかける
ことにより質量スペクトルを得て、反応混合物に含まれ
る各化学種の質量を測定することにより、タンパク質あ
るいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を
決定する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、タンパク質あるいはペ
プチドの１次構造解析法に関する。
プチドの１次構造解析法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、タンパク質あるいはペプチドのカ
ルボキシ末端（Ｃ末端）からのアミノ酸配列を決定する
ためには、図２に示すようにタンパク質あるいはペプチ
ドにカルボキシペプチダーゼを作用させ、酵素消化液を
経時的に１部ずつ採取し、その酵素消化液をアミノ酸分
析装置で分析して、遊離されたアミノ酸を定量する方法
が用いられてきた。（日本生化学会編、生化学実験講座
第１巻、タンパク質の化学２、２０３−２１１ページ、
１９７６年発行） また、その酵素消化液を質量分析装置にかけて、Ｃ末端
側のアミノ酸を失ったタンパク質あるいはペプチドの質
量を測定する方法も報告されている。（A. Tsugita, R.
van den Broek, M. Pyzybylski, FEBS. Lett. 137, 19
(1982)） さらに図３に示すように、Ｃ末端を無水酢酸で活性化
し、トリメチルシリルイソチオシアネート（ＴＭＳ−Ｉ
ＴＣ）を結合させた後に、塩酸で切断する、という一連
の操作を繰り返すことを利用した配列分析法も報告され
ている。（D. H.Hawke, H-. W. Lahm, J. E. Shively,
C. W. Todd, Anal. Biochem. 166, 298(1987)）
ルボキシ末端（Ｃ末端）からのアミノ酸配列を決定する
ためには、図２に示すようにタンパク質あるいはペプチ
ドにカルボキシペプチダーゼを作用させ、酵素消化液を
経時的に１部ずつ採取し、その酵素消化液をアミノ酸分
析装置で分析して、遊離されたアミノ酸を定量する方法
が用いられてきた。（日本生化学会編、生化学実験講座
第１巻、タンパク質の化学２、２０３−２１１ページ、
１９７６年発行） また、その酵素消化液を質量分析装置にかけて、Ｃ末端
側のアミノ酸を失ったタンパク質あるいはペプチドの質
量を測定する方法も報告されている。（A. Tsugita, R.
van den Broek, M. Pyzybylski, FEBS. Lett. 137, 19
(1982)） さらに図３に示すように、Ｃ末端を無水酢酸で活性化
し、トリメチルシリルイソチオシアネート（ＴＭＳ−Ｉ
ＴＣ）を結合させた後に、塩酸で切断する、という一連
の操作を繰り返すことを利用した配列分析法も報告され
ている。（D. H.Hawke, H-. W. Lahm, J. E. Shively,
C. W. Todd, Anal. Biochem. 166, 298(1987)）
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来のカルボキシペプ
チダーゼを用いる方法は、酵素の基質特異性や活性がＣ
末端アミノ酸あるいはそれに隣接するアミノ酸によって
さまざまであること、そして他の酵素の混在があること
から正確な分析が困難になることがあり、また酵素の自
己消化性によってアミノ酸が遊離されるため高感度分析
には適していなかった。
チダーゼを用いる方法は、酵素の基質特異性や活性がＣ
末端アミノ酸あるいはそれに隣接するアミノ酸によって
さまざまであること、そして他の酵素の混在があること
から正確な分析が困難になることがあり、また酵素の自
己消化性によってアミノ酸が遊離されるため高感度分析
には適していなかった。
【０００４】また、ＴＭＳ−ＩＴＣを用いる方法は３種
類の試薬を繰り返し作用させる必要があるため操作が煩
雑であるばかりでなく、繰り返し収率が悪いためいまだ
実用化されるに至っていない。そこで本発明は、酵素あ
るいは他の複雑な有機化合物を用いることなく、簡便な
操作でタンパク質あるいはペプチドのＣ末端からのアミ
ノ酸配列を決定する方法を提供しようとするものであ
る。
類の試薬を繰り返し作用させる必要があるため操作が煩
雑であるばかりでなく、繰り返し収率が悪いためいまだ
実用化されるに至っていない。そこで本発明は、酵素あ
るいは他の複雑な有機化合物を用いることなく、簡便な
操作でタンパク質あるいはペプチドのＣ末端からのアミ
ノ酸配列を決定する方法を提供しようとするものであ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明においては、上記
の欠点を克服しＣ末端からのアミノ酸の配列分析を実行
するために、タンパク質あるいはペプチドに、一般式、
ＣＦ3−（ＣＦ2）n−ＣＯＯＨ（ｎは０以上の整数）で
表される有機酸の、酸無水物、例えばトリフルオロ酢酸
（ｎ＝０）、ペンタフルオロプロピオン酸（ｎ＝１）あ
るいはヘプタフルオロ酪酸（ｎ＝２）の酸無水物を作用
させた。
の欠点を克服しＣ末端からのアミノ酸の配列分析を実行
するために、タンパク質あるいはペプチドに、一般式、
ＣＦ3−（ＣＦ2）n−ＣＯＯＨ（ｎは０以上の整数）で
表される有機酸の、酸無水物、例えばトリフルオロ酢酸
（ｎ＝０）、ペンタフルオロプロピオン酸（ｎ＝１）あ
るいはヘプタフルオロ酪酸（ｎ＝２）の酸無水物を作用
させた。
【０００６】
【作用】上記手段により、酵素あるいは他の複雑な有機
化合物を用いることなく、簡便な操作でタンパク質ある
いはペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を決定するこ
とが可能になる。
化合物を用いることなく、簡便な操作でタンパク質ある
いはペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を決定するこ
とが可能になる。
【０００７】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明
する。 （実施例１）ここでは実験方法の詳細を述べる。図１は
本発明の分析方法を示す工程図である。タンパク質ある
いはペプチドにトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ペンタフ
ルオロプロピオン酸（ＰＦＰＡ）、あるいはヘプタフル
オロ酪酸（ＨＦＢＡ）の酸無水物を作用させ、Ｃ末端か
らのペプチド鎖の逐次切断反応を生じさせる。さらに、
この反応混合物に水を作用させた後、ファーストアトム
ボンバードメント質量分析装置（ＦＡＢ−ＭＳ）にかけ
て質量スペクトルを得る。
する。 （実施例１）ここでは実験方法の詳細を述べる。図１は
本発明の分析方法を示す工程図である。タンパク質ある
いはペプチドにトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ペンタフ
ルオロプロピオン酸（ＰＦＰＡ）、あるいはヘプタフル
オロ酪酸（ＨＦＢＡ）の酸無水物を作用させ、Ｃ末端か
らのペプチド鎖の逐次切断反応を生じさせる。さらに、
この反応混合物に水を作用させた後、ファーストアトム
ボンバードメント質量分析装置（ＦＡＢ−ＭＳ）にかけ
て質量スペクトルを得る。
【０００８】本発明の分析手順は以下のとおりである。
まずタンパク質あるいはペプチドを含む試料溶液１を小
試験管２に入れた後乾燥させる。この試験管をあらかじ
めＴＦＡ、ＰＦＰＡ、あるいはＨＦＢＡの酸無水物のア
セトニトリル溶液３（酸無水物の濃度は１０％）を入れ
ておいた試験管４に入れる。この際、試料１と有機酸の
酸無水物３とは互いに接していない。次いで、この外側
の試験管を零下３０°Ｃの温度で、減圧しながら封管す
る。そしてこの試験管を零下１８°Ｃに保つ（図４）。
この後、封管をあけて減圧乾燥させる。乾燥された試料
にピリジンを含む弱アルカリ性条件下で水の蒸気を作用
させた後、ジメチルホルムアミドで溶解し、さらにグリ
セロールと混合した後、ＦＡＢ−ＭＳによって分析す
る。
まずタンパク質あるいはペプチドを含む試料溶液１を小
試験管２に入れた後乾燥させる。この試験管をあらかじ
めＴＦＡ、ＰＦＰＡ、あるいはＨＦＢＡの酸無水物のア
セトニトリル溶液３（酸無水物の濃度は１０％）を入れ
ておいた試験管４に入れる。この際、試料１と有機酸の
酸無水物３とは互いに接していない。次いで、この外側
の試験管を零下３０°Ｃの温度で、減圧しながら封管す
る。そしてこの試験管を零下１８°Ｃに保つ（図４）。
この後、封管をあけて減圧乾燥させる。乾燥された試料
にピリジンを含む弱アルカリ性条件下で水の蒸気を作用
させた後、ジメチルホルムアミドで溶解し、さらにグリ
セロールと混合した後、ＦＡＢ−ＭＳによって分析す
る。
【０００９】ここで述べた最後の水処理操作は必ずしも
必要としない。用いた質量分析の条件は以下のとおりで
ある。 ＦＡＢ−ＭＳ 装置本体：日本電子製 ＨＸ１１０型 イオン化法：ＦＡＢ（ポジティブ） イオン化ガス：キセノン 加速電圧：１０ｋＶ マトリックス：グリセロール （実施例２）本発明を説明するために、ここでは配列番
号１のオクタペプチド、 Lys-Lys-Lys-His-Pro-Asp-Tyr
-Ile、を試料ペプチドとして選び実験を行った。以下の
説明においては、例えばLys-Lys-Lys-Hisはペプチド1-
4、のように呼ぶこととする。
必要としない。用いた質量分析の条件は以下のとおりで
ある。 ＦＡＢ−ＭＳ 装置本体：日本電子製 ＨＸ１１０型 イオン化法：ＦＡＢ（ポジティブ） イオン化ガス：キセノン 加速電圧：１０ｋＶ マトリックス：グリセロール （実施例２）本発明を説明するために、ここでは配列番
号１のオクタペプチド、 Lys-Lys-Lys-His-Pro-Asp-Tyr
-Ile、を試料ペプチドとして選び実験を行った。以下の
説明においては、例えばLys-Lys-Lys-Hisはペプチド1-
4、のように呼ぶこととする。
【００１０】図６はＴＦＡ、図７はＰＦＰＡそして図８
はＨＦＢＡの酸無水物をそれぞれ作用させた反応混合物
をＦＡＢ−ＭＳによって分析した結果を示したものであ
る。この時、用いた酸無水物の濃度はそれぞれ１０％で
あり、零下１８°Ｃにおいて２時間作用させた。図５は
比較のために、有機酸の酸無水物を作用させていない配
列番号１のペプチドそのものを分析した結果を示したも
のである。
はＨＦＢＡの酸無水物をそれぞれ作用させた反応混合物
をＦＡＢ−ＭＳによって分析した結果を示したものであ
る。この時、用いた酸無水物の濃度はそれぞれ１０％で
あり、零下１８°Ｃにおいて２時間作用させた。図５は
比較のために、有機酸の酸無水物を作用させていない配
列番号１のペプチドそのものを分析した結果を示したも
のである。
【００１１】ＴＦＡの酸無水物を作用させた場合にＣ末
端からの配列分析ができることが図６に示されている。
それぞれＴＦＡが付加した（アシル化された）ペプチド
1-8（1-8+Acylと表記する）,1-7, 1-6,1-5, 1-4, 1-3,
1-2 が検出されており、Ｃ末端から６残基のアミノ酸配
列が決定されることがわかる。また、−Ｈ2Ｏ印で示し
たように、各ペプチドから水が１分子失われた生成物に
由来するピークも観測されている。
端からの配列分析ができることが図６に示されている。
それぞれＴＦＡが付加した（アシル化された）ペプチド
1-8（1-8+Acylと表記する）,1-7, 1-6,1-5, 1-4, 1-3,
1-2 が検出されており、Ｃ末端から６残基のアミノ酸配
列が決定されることがわかる。また、−Ｈ2Ｏ印で示し
たように、各ペプチドから水が１分子失われた生成物に
由来するピークも観測されている。
【００１２】図７からわかるように、ＰＦＰＡの酸無水
物を作用させた場合にも、それぞれＰＦＰＡが付加した
ペプチド 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, および
アミノ末端のアミノ酸（1+Acylと表記する）が検出され
ており、Ｃ末端から全てのアミノ酸配列が決定されるこ
とがわかる。この際同時に、ＰＦＰＡが２個付加したペ
プチド1-8 （同様に1-8+diAcylと表記する）も検出され
ている。さらに、−Ｈ 2Ｏ印で示したように、前述の各
ペプチドから水が１分子失われた生成物も検出されてい
る。
物を作用させた場合にも、それぞれＰＦＰＡが付加した
ペプチド 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, および
アミノ末端のアミノ酸（1+Acylと表記する）が検出され
ており、Ｃ末端から全てのアミノ酸配列が決定されるこ
とがわかる。この際同時に、ＰＦＰＡが２個付加したペ
プチド1-8 （同様に1-8+diAcylと表記する）も検出され
ている。さらに、−Ｈ 2Ｏ印で示したように、前述の各
ペプチドから水が１分子失われた生成物も検出されてい
る。
【００１３】ＨＦＢＡの酸無水物を作用させた場合に
も、同様にＣ末端からの配列分析ができることが図８に
示されている。それぞれＨＦＢＡが付加したペプチド1-
8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 およびアミノ末端の
アミノ酸が検出されており、Ｃ末端から全てのアミノ酸
配列が決定されることがわかる。この際も同時に、ＨＦ
ＢＡが２個付加したペプチド1-8 も検出されている。ま
た同様に、−Ｈ2Ｏ印で示したように、前述の各ペプチ
ドから水が１分子失われた生成物も検出されている。
も、同様にＣ末端からの配列分析ができることが図８に
示されている。それぞれＨＦＢＡが付加したペプチド1-
8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 およびアミノ末端の
アミノ酸が検出されており、Ｃ末端から全てのアミノ酸
配列が決定されることがわかる。この際も同時に、ＨＦ
ＢＡが２個付加したペプチド1-8 も検出されている。ま
た同様に、−Ｈ2Ｏ印で示したように、前述の各ペプチ
ドから水が１分子失われた生成物も検出されている。
【００１４】そして、上記のいずれの場合においてもペ
プチド鎖内部のペプチド結合の開裂によって生成するペ
プチドは検出されていない。そのため、配列分析のため
のデータの解析が容易である。このように、タンパク質
あるいはペプチドに、一般式、ＣＦ3−（ＣＦ2）n−Ｃ
ＯＯＨ（ｎは０以上の整数） で表わされる有機酸の、
酸無水物を作用させた反応生成物を質量分析装置にかけ
ることにより質量スペクトルを得て、各生成物の質量を
測定することによって、タンパク質あるいはペプチドの
カルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定出来ることが
わかった。
プチド鎖内部のペプチド結合の開裂によって生成するペ
プチドは検出されていない。そのため、配列分析のため
のデータの解析が容易である。このように、タンパク質
あるいはペプチドに、一般式、ＣＦ3−（ＣＦ2）n−Ｃ
ＯＯＨ（ｎは０以上の整数） で表わされる有機酸の、
酸無水物を作用させた反応生成物を質量分析装置にかけ
ることにより質量スペクトルを得て、各生成物の質量を
測定することによって、タンパク質あるいはペプチドの
カルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定出来ることが
わかった。
【００１５】（実施例３）次に、有機酸の酸無水物を作
用させる際の反応温度の配列分析に及ぼす影響を調べ
た。ここでは、配列番号２のドデカペプチドAla-Arg-Gl
y-Ile-Lys-Gly-Ile-Arg-Gly-Phe-Ser-Gly を用い、ＰＦ
ＰＡの酸無水物を作用させた。それぞれ、図１０は零下
１８°Ｃ、図１１は０°Ｃで、それぞれ２時間ＰＦＰＡ
の酸無水物を作用させた反応混合物を質量分析装置にか
けた結果である。
用させる際の反応温度の配列分析に及ぼす影響を調べ
た。ここでは、配列番号２のドデカペプチドAla-Arg-Gl
y-Ile-Lys-Gly-Ile-Arg-Gly-Phe-Ser-Gly を用い、ＰＦ
ＰＡの酸無水物を作用させた。それぞれ、図１０は零下
１８°Ｃ、図１１は０°Ｃで、それぞれ２時間ＰＦＰＡ
の酸無水物を作用させた反応混合物を質量分析装置にか
けた結果である。
【００１６】図９は比較のために有機酸の酸無水物を作
用させていない配列番号２のペプチドそのものを分析し
た結果を示したものである。図１０、および図１１にお
いて、各反応条件下でそれぞれＰＦＰＡが付加したペプ
チド 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-
4, 1-3, 1-2 が検出されており、これらの条件下でＣ末
端から１０残基のアミノ酸配列が決定されることがわか
る。この際同時に、それぞれＰＦＰＡが２個付加したペ
プチド1-12も検出されている。
用させていない配列番号２のペプチドそのものを分析し
た結果を示したものである。図１０、および図１１にお
いて、各反応条件下でそれぞれＰＦＰＡが付加したペプ
チド 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-
4, 1-3, 1-2 が検出されており、これらの条件下でＣ末
端から１０残基のアミノ酸配列が決定されることがわか
る。この際同時に、それぞれＰＦＰＡが２個付加したペ
プチド1-12も検出されている。
【００１７】また、図１１に示されるように、０°Ｃで
２時間ＰＦＰＡの酸無水物を作用させた場合には、ＰＦ
ＰＡが２個付加したペプチド1-11、も検出されている。
さらにこの場合、同定されていないピークがより多く検
出されている。この結果から、より低温で処理した場合
に副反応生成物に由来するシグナルの数が少なく、かつ
主反応生成物由来のシグナルの相対強度が高いことがわ
かる。
２時間ＰＦＰＡの酸無水物を作用させた場合には、ＰＦ
ＰＡが２個付加したペプチド1-11、も検出されている。
さらにこの場合、同定されていないピークがより多く検
出されている。この結果から、より低温で処理した場合
に副反応生成物に由来するシグナルの数が少なく、かつ
主反応生成物由来のシグナルの相対強度が高いことがわ
かる。
【００１８】（実施例４）図１４乃至図１７は、有機酸
の酸無水物を作用させる反応時間の、アミノ酸配列分析
に及ぼす影響を調べた結果である。ここでは、配列番号
３のアミノ酸２３残基から成るペプチドを用い、ＰＦＰ
Ａの酸無水物を零下１８°Ｃにおいて、それぞれ１０分
間（図１４）、３０分間（図１５）、１時間（図１
６）、そして５時間（図１７）作用させた。
の酸無水物を作用させる反応時間の、アミノ酸配列分析
に及ぼす影響を調べた結果である。ここでは、配列番号
３のアミノ酸２３残基から成るペプチドを用い、ＰＦＰ
Ａの酸無水物を零下１８°Ｃにおいて、それぞれ１０分
間（図１４）、３０分間（図１５）、１時間（図１
６）、そして５時間（図１７）作用させた。
【００１９】図１３は比較のために有機酸の酸無水物を
作用させていない配列番号３のペプチドそのものを分析
した結果を示したものである。１０分間作用させた場合
（図１４）には、配列分析に必要な１連のペプチドの生
成を示すシグナルの強度は低かったが、ペプチド1-22,
1-21, 1-20, 1-19,1-18, 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-1
3, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8が検出された。またＰ
ＦＰＡによるアシル化は、ペプチド1-22, 1-21に起きて
いることが認められた。
作用させていない配列番号３のペプチドそのものを分析
した結果を示したものである。１０分間作用させた場合
（図１４）には、配列分析に必要な１連のペプチドの生
成を示すシグナルの強度は低かったが、ペプチド1-22,
1-21, 1-20, 1-19,1-18, 1-17, 1-16, 1-15, 1-14, 1-1
3, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8が検出された。またＰ
ＦＰＡによるアシル化は、ペプチド1-22, 1-21に起きて
いることが認められた。
【００２０】３０分間作用させた場合（図１５）には、
ペプチド1-20, 1-19, 1-18, 1-17,1-16, 1-15, 1-14, 1
-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-
4が検出された。この場合には、ＰＦＰＡによるアシル
化は完全ではない。また、１時間（図１６）および５時
間（図１７）作用させた場合には、それぞれＰＦＰＡが
付加したペプチド1-20, 1-19, 1-18, 1-17, 1-16, 1-1
5, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-
6, 1-5, 1-4が十分検出されている。そして、これら２
つの条件下では得られた各シグナルの強度はほぼ同じで
ある。
ペプチド1-20, 1-19, 1-18, 1-17,1-16, 1-15, 1-14, 1
-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-
4が検出された。この場合には、ＰＦＰＡによるアシル
化は完全ではない。また、１時間（図１６）および５時
間（図１７）作用させた場合には、それぞれＰＦＰＡが
付加したペプチド1-20, 1-19, 1-18, 1-17, 1-16, 1-1
5, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-
6, 1-5, 1-4が十分検出されている。そして、これら２
つの条件下では得られた各シグナルの強度はほぼ同じで
ある。
【００２１】このことから、有機酸の酸無水物を作用さ
せる時間は５時間以内でよいことがわかる。 （実施例５）図１２は、配列番号２のドデカペプチドに
零下１８°Ｃで２時間ＰＦＰＡの酸無水物を作用させた
後乾燥させた反応混合物に、さらにピリジンを含む弱ア
ルカリ性条件下で水を作用させた後、分析した結果を示
したものである。
せる時間は５時間以内でよいことがわかる。 （実施例５）図１２は、配列番号２のドデカペプチドに
零下１８°Ｃで２時間ＰＦＰＡの酸無水物を作用させた
後乾燥させた反応混合物に、さらにピリジンを含む弱ア
ルカリ性条件下で水を作用させた後、分析した結果を示
したものである。
【００２２】図１１との比較からわかるように、それぞ
れＰＦＰＡが付加したペプチド1-12, 1-11, 1-10, 1-9,
1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2から水が１分子失
われた一連のペプチドの検出強度が低くなっていること
から、この条件によればより容易に配列分析が解析可能
であることがわかる。以上述べてきた結果をまとめると
次のようになる。
れＰＦＰＡが付加したペプチド1-12, 1-11, 1-10, 1-9,
1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2から水が１分子失
われた一連のペプチドの検出強度が低くなっていること
から、この条件によればより容易に配列分析が解析可能
であることがわかる。以上述べてきた結果をまとめると
次のようになる。
【００２３】乾燥されたペプチドに、一般式、ＣＦ3−
（ＣＦ2）n−ＣＯＯＨ （ｎは０以上の整数）で表され
る有機酸の、酸無水物を作用させ、その反応混合物をＦ
ＡＢ−ＭＳにかけることにより、試料としたペプチド及
びそのペプチドのＣ末端のアミノ酸が逐次分解反応によ
って切断された一連のペプチドの質量スペクトルを得る
ことができる。これを解析することによって、試料とし
たペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を決定すること
ができる。
（ＣＦ2）n−ＣＯＯＨ （ｎは０以上の整数）で表され
る有機酸の、酸無水物を作用させ、その反応混合物をＦ
ＡＢ−ＭＳにかけることにより、試料としたペプチド及
びそのペプチドのＣ末端のアミノ酸が逐次分解反応によ
って切断された一連のペプチドの質量スペクトルを得る
ことができる。これを解析することによって、試料とし
たペプチドのＣ末端からのアミノ酸配列を決定すること
ができる。
【００２４】有機酸の酸無水物を作用させる反応時間は
５時間以内で十分ある。反応温度を０°Ｃ以下とするこ
とによって、副反応の進行を低く抑えることができる。
また、有機酸の酸無水物を作用させた後、反応生成物に
水を作用させることにより、脱水ピークを低く抑えるこ
とができ、解析が容易になる。またこの方法の特徴は、
ペプチド鎖内部のペプチド結合の開裂によって生成する
ペプチドが検出されないため、配列分析のためのデータ
の解析が容易なことである。
５時間以内で十分ある。反応温度を０°Ｃ以下とするこ
とによって、副反応の進行を低く抑えることができる。
また、有機酸の酸無水物を作用させた後、反応生成物に
水を作用させることにより、脱水ピークを低く抑えるこ
とができ、解析が容易になる。またこの方法の特徴は、
ペプチド鎖内部のペプチド結合の開裂によって生成する
ペプチドが検出されないため、配列分析のためのデータ
の解析が容易なことである。
【００２５】
【発明の効果】本発明の重要な点は、タンパク質あるい
はペプチドに、一般式、ＣＦ3−（ＣＦ2）n−ＣＯＯＨ
（ｎは０以上の整数）で表される有機酸の、酸無水物、
例えばトリフルオロ酢酸（ｎ＝０）、ペンタフルオロプ
ロピオン酸（ｎ＝１）あるいはヘプタフルオロ酪酸（ｎ
＝２）の酸無水物を作用させることにより、酵素あるい
は他の複雑な有機化合物を用いることなく簡便な操作で
タンパク質あるいはペプチドのＣ末端からのアミノ酸配
列を決定することが可能になったことである。
はペプチドに、一般式、ＣＦ3−（ＣＦ2）n−ＣＯＯＨ
（ｎは０以上の整数）で表される有機酸の、酸無水物、
例えばトリフルオロ酢酸（ｎ＝０）、ペンタフルオロプ
ロピオン酸（ｎ＝１）あるいはヘプタフルオロ酪酸（ｎ
＝２）の酸無水物を作用させることにより、酵素あるい
は他の複雑な有機化合物を用いることなく簡便な操作で
タンパク質あるいはペプチドのＣ末端からのアミノ酸配
列を決定することが可能になったことである。
【００２６】よって、本発明によるタンパク質あるいは
ペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定す
る方法はその工業的価値が大である。 （配列表） 配列番号：１ 配列の長さ：８ 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：２ 配列の長さ：１２ 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：３ 配列の長さ：２３ 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
ペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定す
る方法はその工業的価値が大である。 （配列表） 配列番号：１ 配列の長さ：８ 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：２ 配列の長さ：１２ 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号：３ 配列の長さ：２３ 配列の形：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【図１】本発明の分析方法を示す工程図である。
【図２】カルボキシペプチダーゼを用いた場合の従来の
分析方法を示す工程図である。
分析方法を示す工程図である。
【図３】トリメチルシリルイソチオシアナートを用いた
場合の従来の分析方法である。
場合の従来の分析方法である。
【図４】本発明の分析に用いる試料の封管状態を示す模
式図である。
式図である。
【図５】酸無水物を作用させていない配列番号１のペプ
チドそのものを分析した結果を示す図である。
チドそのものを分析した結果を示す図である。
【図６】ＰＦＰＡの酸無水物を作用させた反応混合物を
分析した結果を示す図である。
分析した結果を示す図である。
【図７】ＨＦＢＡの酸無水物を作用させた反応混合物を
分析した結果を示す図である。
分析した結果を示す図である。
【図８】ＴＦＡの酸無水物を作用させた反応混合物を分
析した結果を示す図である。
析した結果を示す図である。
【図９】酸無水物を作用させていない配列番号２のペプ
チドそのものを分析した結果を示す図である。
チドそのものを分析した結果を示す図である。
【図１０】零下１８°Ｃで２時間酸無水物を作用させた
反応混合物を分析した結果を示す図である。
反応混合物を分析した結果を示す図である。
【図１１】０°Ｃで２時間酸無水物を作用させた反応混
合物を分析した結果を示す図である。
合物を分析した結果を示す図である。
【図１２】零下１８°Ｃで２時間酸無水物を作用させた
後乾燥させた反応混合物にさらにピリジンを含む弱アル
カリ性条件下で水を作用させた後、分析した結果を示す
図である。
後乾燥させた反応混合物にさらにピリジンを含む弱アル
カリ性条件下で水を作用させた後、分析した結果を示す
図である。
【図１３】酸無水物を作用させていない配列番号３のペ
プチドそのものを分析した結果を示す図である。
プチドそのものを分析した結果を示す図である。
【図１４】零下１８°Ｃで１０分間酸無水物を作用させ
た反応混合物を分析した結果を示す図である。
た反応混合物を分析した結果を示す図である。
【図１５】零下１８°Ｃで３０分間酸無水物を作用させ
た反応混合物を分析した結果を示す図である。
た反応混合物を分析した結果を示す図である。
【図１６】零下１８°Ｃで１時間酸無水物を作用させた
反応混合物を分析した結果を示す図である。
反応混合物を分析した結果を示す図である。
【図１７】零下１８°Ｃで５時間酸無水物を作用させた
反応混合物を分析した結果を示す図である。
反応混合物を分析した結果を示す図である。
１ 試料溶液 ２ 小試験管 ３ 有機酸の酸無水物の溶液 ４ 試験管
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 内田 豊明 東京都江東区亀戸６丁目31番１号 セイコ ー電子工業株式会社内
Claims (6)
- 【請求項１】 タンパク質あるいはペプチドに、一般
式、 ＣＦ3−（ＣＦ2）n−ＣＯＯＨ（ｎは０以上の整数）で
表される有機酸の、酸無水物を作用させることを特徴と
した、タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端か
らのアミノ酸配列を決定する方法。 - 【請求項２】 タンパク質あるいはペプチドに作用させ
る上記有機酸の酸無水物は、揮発性有機溶媒を用いた溶
液として用いることを特徴とした、請求項１記載のタン
パク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ
酸配列を決定する方法。 - 【請求項３】 タンパク質あるいはペプチドに上記有機
酸の酸無水物を作用させる温度は０°Ｃ以下であること
を特徴とした、請求項１記載のタンパク質あるいはペプ
チドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方
法。 - 【請求項４】 タンパク質あるいはペプチドに上記有機
酸の酸無水物を作用させる時間は５時間以内であること
を特徴とした、請求項１記載のタンパク質あるいはペプ
チドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方
法。 - 【請求項５】 タンパク質あるいはペプチドに上記有機
酸の酸無水物を作用させた反応混合物に水またはその蒸
気を作用させることを特徴とした、請求項１記載のタン
パク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ
酸配列を決定する方法。 - 【請求項６】 上記タンパク質あるいはペプチドに上記
有機酸の酸無水物を作用させた反応混合物に水またはそ
の蒸気を作用させた反応生成物を、質量分析装置にかけ
ることにより質量スペクトルを得ることを特徴とした、
請求項１記載のタンパク質あるいはペプチドのカルボキ
シ末端からのアミノ酸配列を決定する方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3300818A JP2686506B2 (ja) | 1991-11-15 | 1991-11-15 | タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方法 |
| US07/931,931 US5521097A (en) | 1991-08-28 | 1992-08-18 | Method of determining amino acid sequence of protein or peptide from carboxy-terminal |
| DE69214571T DE69214571T2 (de) | 1991-08-28 | 1992-08-26 | Verfahren zur Analyse von einem Protein oder einem Peptid |
| EP92114531A EP0529604B1 (en) | 1991-08-28 | 1992-08-26 | Method of analysing a protein or a peptide |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3300818A JP2686506B2 (ja) | 1991-11-15 | 1991-11-15 | タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05133958A true JPH05133958A (ja) | 1993-05-28 |
| JP2686506B2 JP2686506B2 (ja) | 1997-12-08 |
Family
ID=17889479
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3300818A Expired - Fee Related JP2686506B2 (ja) | 1991-08-28 | 1991-11-15 | タンパク質あるいはペプチドのカルボキシ末端からのアミノ酸配列を決定する方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2686506B2 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1981001922A1 (en) * | 1979-12-29 | 1981-07-09 | Sony Corp | Tone control circuit |
| JP2002168869A (ja) * | 2000-12-05 | 2002-06-14 | Sumitomo Chem Co Ltd | ペプチドのアミノ酸配列の決定方法 |
| US7651859B2 (en) | 2002-12-10 | 2010-01-26 | Nec Corporation | Method of analyzing c-terminal amino acid sequence of peptide |
| JP2010032219A (ja) * | 2008-07-24 | 2010-02-12 | Nec Corp | ペプチドの分解方法、ペプチドの分析方法、ペプチドの分解装置、ペプチドの分析装置 |
| US7670841B2 (en) | 2002-11-29 | 2010-03-02 | Nec Corporation | Method of analyzing C-terminal amino acid sequence of peptide |
| CN108732254A (zh) * | 2017-04-18 | 2018-11-02 | 深圳华大基因研究院 | 一种用于氨基酸检测的方法及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS52136101A (en) * | 1976-05-07 | 1977-11-14 | Durrum Instr | Method of successive decomposition of peptide or proteins |
| JPS6391564A (ja) * | 1986-10-06 | 1988-04-22 | Agency Of Ind Science & Technol | ペプチドのアミノ酸配列推定方法 |
-
1991
- 1991-11-15 JP JP3300818A patent/JP2686506B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPS52136101A (en) * | 1976-05-07 | 1977-11-14 | Durrum Instr | Method of successive decomposition of peptide or proteins |
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| WO1981001922A1 (en) * | 1979-12-29 | 1981-07-09 | Sony Corp | Tone control circuit |
| JP2002168869A (ja) * | 2000-12-05 | 2002-06-14 | Sumitomo Chem Co Ltd | ペプチドのアミノ酸配列の決定方法 |
| US7670841B2 (en) | 2002-11-29 | 2010-03-02 | Nec Corporation | Method of analyzing C-terminal amino acid sequence of peptide |
| US7651859B2 (en) | 2002-12-10 | 2010-01-26 | Nec Corporation | Method of analyzing c-terminal amino acid sequence of peptide |
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| JP4631943B2 (ja) * | 2008-07-24 | 2011-02-16 | 日本電気株式会社 | ペプチドの分解方法、ペプチドの分析方法、ペプチドの分解装置、ペプチドの分析装置 |
| CN108732254A (zh) * | 2017-04-18 | 2018-11-02 | 深圳华大基因研究院 | 一种用于氨基酸检测的方法及其应用 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2686506B2 (ja) | 1997-12-08 |
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