CN103857690A

CN103857690A - 蛋白质检测

Info

Publication number: CN103857690A
Application number: CN201280050243.5A
Authority: CN
Inventors: A·T·R·M·A·尼夫斯; B·佩基
Original assignee: ACQUASCIENCE Ltd
Current assignee: Proteome Co ltd
Priority date: 2011-08-19
Filing date: 2012-05-24
Publication date: 2014-06-11
Anticipated expiration: 2032-05-24
Also published as: US20150253337A1; CN103857690B; EP3599244B1; ES2876181T3; CN106940376A; US9091694B2; EP2744817A1; JP6074428B2; US20140315315A1; WO2013027008A1; JP2016218079A; CN106940376B; EP2744817B1; EP3599244A1; JP6475671B2; JP2014529739A; US9377467B2; ES2800315T3

Abstract

本发明涉及从洗涤剂中分离蛋白质的试剂、在洗涤剂存在的情况下检测蛋白质的试剂及其应用方法。分离试剂含有环状寡聚物诸如环糊精和纤维素衍生物诸如2-羟乙基纤维素。在组合标准蛋白质复合染料应用时，试剂允许以毫微克水平在电泳凝胶中检测蛋白质。

Description

蛋白质检测

本发明涉及从洗涤剂中分离蛋白质的试剂、在洗涤剂存在的情况下检测蛋白质的试剂及其应用方法。

本发明的背景

通常发现蛋白质与洗涤剂结合。例如，在从细胞中提取蛋白质时，洗涤剂常常用于分裂细胞膜，以使其分裂。洗涤剂还通常在利用凝胶电泳分离蛋白质混合物时被应用。由于洗涤剂不利地影响考马斯染料与蛋白质结合时的颜色变化，所以洗涤剂必需通过若干洗涤步骤被去除，导致染色程序延长和复杂。还已知一些洗涤剂诸如十二烷基硫酸钠使蛋白质变性。因此，常常期望在其随后的应用之前从洗涤剂中分离蛋白质。

WO2007/125372公开蛋白质检测试剂，其含有考马斯染料与糊精诸如环糊精。据其声称，糊精的存在克服与考马斯染料一起存在的洗涤剂的困难。因此，不需要进行通常要求的费力的洗涤步骤。然而，已经发现WO2007/125372中公开的试剂——含有酸诸如磷酸——常常稳定性差并且由于不期望的沉淀而具有高的背景染色。

仍需要提供另外的试剂，以从洗涤剂中分离蛋白质。还需要提供另外的高灵敏度和稳定性试剂，以检测蛋白质。

发明概述

本发明提供组合物（下文称为“分离组合物”），用于从洗涤剂中分离蛋白质，所述组合物包括

a）纤维素衍生物，和

b）环状寡聚物。

本发明还提供方法（下文称为“分离方法”），用于从洗涤剂中分离蛋白质，所述方法，包括

1）使含蛋白质样品和洗涤剂与溶液接触，所述溶液包括

a）纤维素衍生物，和

b）环状寡聚物；和

2）从洗涤剂中分离蛋白质。

本发明还提供方法（下文称为“染色方法”），以检测和/或量化蛋白质，包括

i）使含蛋白质样品与包括环状寡聚物的第一溶液接触；

ii）使含蛋白质样品与包括蛋白质复合染料的第二溶液接触；和

iii）检测和/或量化染料/蛋白质复合物的形成。

优选地，第一或第二溶液中的至少一种包括pKa为4或更小的酸。

优选地，第一溶液包括纤维素衍生物。

本发明还提供组合物（下文称为“染色组合物”），以检测蛋白质，包括：

a）蛋白质复合染料；

b）环状寡聚物；和

c）羟基羧酸。

优选地，染色组合物中的羟基羧酸是酒石酸。

优选地，染色组合物包括纤维素衍生物。

发明详述

本发明组合物通常含有纤维素衍生物。

“本发明组合物”意为上述“染色组合物”和/或“分离组合物”。同样，“本发明方法”意为上述“染色方法”和/或“分离方法”。

“纤维素衍生物”意为其中至少一些游离羟基基团已经被烷基、羟烷基或羧基烷基基团官能化的纤维素。

优选地，纤维素衍生物包括具有两个或三个碳原子的羟烷基或羧基烷基基团。因而，优选纤维素衍生物包括羟乙基、羟丙基、羧甲基和羧乙基。

优选纤维素衍生物选自羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素。

优选地，纤维素衍生物选自羟乙基纤维素、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。因此，用于本发明组合物的优选纤维素衍生物包括具有如下通式的重复单元：

其中，R表示R’、R”或R”’，其中

R’表示H或CH₂CH₂OH（即，羟乙基纤维素），

R”表示H或CH₂CH(OH)CH₃（即，羟丙基纤维素），和

R”’表示H、CH₃或CH₂CH(OH)CH₃（即，羟丙基甲基纤维素）。

特别优选的纤维素衍生物选自羟乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素（即，R表示R’或R”）。最优选的纤维素衍生物是羟乙基纤维素（即，R表示R’）诸如2-羟乙基纤维素。

本发明组合物还含有环状寡聚物。

“环状寡聚物”意为形成环（或大环）的寡聚物。换言之,“环状寡聚物”不意为环状单体单元的寡聚物（尽管这些可被术语诸如环状低聚糖包含）而是形式为单体单元的连续环的寡聚物。

合适的环状寡聚物具有亲水基团诸如羟基，以使它们溶于水性溶液。环状寡聚物是环形的，并具有内腔。优选地，环状寡聚物有一定大小，以便其内腔可容纳分子诸如染料、表面活性剂或洗涤剂。

优选的环状寡聚物选自环状低聚糖、杯芳烃、葫芦脲（cucurbituril）、柱芳烃（pillararene）或其衍生物。

“环状低聚糖”意为低聚糖或由糖分子制成的化合物，其形成环（或大环）。任何类型的环状低聚糖理论上均可被利用，尽管优选利用仅含一种类型糖分子的环状低聚糖。

优选地，环状低聚糖的环含有5至12个糖分子，更优选地，6至8个糖分子，最优选地，6个糖分子。

优选环状低聚糖选自环糊精（或环-α(1→4)-葡糖苷）、环葡聚糖（环-α(1→6)-葡糖苷）、环凝胶多糖（环-β(1→3)-葡糖苷）、环甘露聚糖（环-α(1→4)-甘露糖苷）、环果聚糖（环-β(1→2)-果苷糖）和环催乳激素（环-β(1→4)-半乳糖苷）。

可用于本发明组合物的特别优选的环糊精选自α-环糊精（环-α(1→4)-葡己糖苷）、β-环糊精（环-α(1→4)-葡庚糖苷）和γ-环糊精（环-α(1→4)-葡辛糖苷），其中α-环糊精（环-α(1→4)-葡己糖苷）是最优选的。

优选杯芳烃选自杯[4]芳烃、杯[6]芳烃和杯[8]芳烃。

优选葫芦脲选自葫芦脲[6]脲和葫芦[8]脲。

优选柱芳烃选自柱[5]芳烃和柱[6]芳烃。

术语“环状寡聚物”和“环状低聚糖”和上述各具体的环状寡聚物/低聚糖还包含这些化合物的衍生物诸如低聚糖，其中，游离羟基基团已经被官能化，或含有亲水基团和/或能够与水氢键合的基团的环状寡聚物。这些类型的衍生物是优选的，因为它们提高环状寡聚物在水中的溶解度。

合适的衍生物包括环状寡聚物，例如任意上述具体环状寡聚物或环状低聚糖，其中，游离羟基基团中的一个或多个已经用C_1-4烷基、羧甲基、磺酰基、乙酰基、羟乙基或羟丙基官能化。亲水的和/或能够与水氢键合的衍生基团包括羧甲基、磺酰基、羟乙基或羟丙基。

本发明组合物通常是水性溶液。因为蛋白质可对离子强度敏感，所以优选利用去离子水，以形成本发明组合物，尽管这不是必要的。

分离组合物通常使蛋白质游离并可用于进一步的应用，诸如用于形成蛋白质-染料复合物。因此，分离组合物优选地不含有任何蛋白质复合染料。

“蛋白质-复合染料”意为蛋白质-染料复合物的形成时显示光学性质变化的任意部分，诸如吸收光谱的变化或发射光谱的变化。

本发明组合物中任选的另外的成分包括增溶剂，以在洗涤剂-环状寡聚物复合物形成时帮助避免蛋白质集结。可利用的合适的增溶剂包括醇诸如甲醇、乙醇和异丙醇，其中乙醇是特别优选的。

本发明分离组合物中每种成分的典型量总结在下表中（所有量均作为百分比w/v，即克/ml给出）：

组分	典型量	优选量	最优选量
				环状寡聚物	0.1-20%	0.5-6%	2-5%
纤维素衍生物	0.01-2%	0.05-1%	0.1-0.5%
				增溶剂（例如乙醇）	0-10%	0.5-4%	1-3%

上面表中的量是彼此独立的，并且代表本发明分离组合物中含有的每种成分的典型和优选量。

环状寡聚物的其它优选范围包括0.1至10%w/v，优选地，0.1至4%w/v，更优选地，0.5至4%w/v，例如1至3%w/v。

增溶剂的其它优选范围包括0至5%w/v。

分离组合物在从洗涤剂分离蛋白质中具有用途。因此，优选分离组合物本身不含有任何洗涤剂/表面活性剂。

分离组合物可通过简单地将成分混合在一起而制成，例如以形成水性溶液。然而，优选在加入下一种成分之前确保每种成分充分溶解。这可包括一些适度加热，例如至大约40-50℃。典型地，环状寡聚物溶于去离子水中混合直到获得平衡溶液（例如达大约30分钟至1小时，如果需要可能更长）。纤维素衍生物在此时加入，例如通过形成纤维素衍生物在去离子水中的溶液和将其加入含有环状寡聚物的溶液。然而，其它加入顺序当然也是可能的。

最近，已经提议低聚糖诸如环糊精可用于克服与干扰蛋白质-染色染料颜色变化的洗涤剂和表面活性剂有关的困难。不希望受理论的限制，据信洗涤剂与本发明分离组合物中存在的环状寡聚物形成复合物。通过利用合适量的一种或多种环状寡聚物，洗涤剂可被捕获在寡聚物-洗涤剂复合物中，从而使其与蛋白质分离。

本发明分离组合物能够捕获洗涤剂/表面活性剂，使其能够容易地与蛋白质分离。分离组合物在蛋白质/洗涤剂混合物包含在电泳凝胶中时尤其有用。在这样的情况下，洗涤剂常常存在，以减轻蛋白质集结，确保蛋白质能够在凝胶中有效分离。分离后，凝胶可暴露于含有环状寡聚物的溶液，以捕获洗涤剂。蛋白质然后可通过继续电泳而与洗涤剂分离。

因此，本发明还提供方法（下文称为“分离方法”），用于从洗涤剂中分离蛋白质，所述方法包括

1）使含蛋白质样品和洗涤剂与溶液接触，所述溶液包括

a）纤维素衍生物，和

b）环状寡聚物；和

2）从洗涤剂中分离蛋白质。

在本发明分离方法中，环状寡聚物和洗涤剂形成复合物，其能够与蛋白质分离。技术人员会知道从洗涤剂中分离蛋白质的合适方法。合适的方法包括但不限于离心法；层析法诸如尺寸排阻层析法、离子交换层析法、亲和层析法和高效液相层析法（HPLC）；和电泳。

在优选实施方式中，含蛋白质样品是电泳凝胶，和方法中步骤2）包括施加电压至凝胶，以分离蛋白质。

虽然本发明分离组合物通常用于分离蛋白质和洗涤剂，但在用蛋白质复合染料染色之前其作为预处理尤其有用。因此，本发明分离组合物优选地形成试剂盒的部分，所述试剂盒包括

i）第一溶液，包括

a）纤维素衍生物，和

b）环状寡聚物；和

ii）第二溶液，包括蛋白质复合染料。

优选地，第一（或分离）溶液不含有蛋白质复合染料。

蛋白质-复合染料在本领域中是悉知的。一般而言，任何Bradford分析试剂或其他考马斯蛋白质染色试剂均可组合本发明分离组合物而使用。可以使用的商售蛋白质复合染料的实例包括考马斯亮蓝G-250和考马斯亮蓝R-250，可获自Sigma-Aldrich。

对于一些蛋白质染色染料，尤其地，诸如考马斯染料，要求低pH，以在染料与蛋白质复合时获得期望的颜色变化。典型地，蛋白质染色试剂的pH需要低于大约4，诸如大约pH1-2。这些低pH值常常通过加入无机酸诸如磷酸而达到。

然而，已经发现，含有环状寡聚物和蛋白质复合染料的蛋白质-染色试剂在利用酸诸如磷酸时可具有高水平的不期望的沉淀物。这些沉淀物导致高背景噪音，其使得小量蛋白质的检测困难——如果不是不可能的话。因此，含有环糊精、考马斯染料和磷酸的“耐受洗涤剂的”试剂的典型检测水平大约为20-30ng（毫微克）蛋白质。

令人惊讶地，发现本发明分离组合物降低当酸诸如磷酸与蛋白质复合染料组合使用时形成的沉淀物的量。如实施例中所示，磷酸可包括在本发明分离组合物中和/或与蛋白质复合染料组合（即，包括在本发明试剂盒中的第一和/或第二溶液中），以提供不含沉淀物的蛋白质检测系统。

与蛋白质-染色染料组合使用的酸的pKa为4或更小，优选地，1至4，更优选地，2至3.5。可包括在本发明分离组合物中或与蛋白质复合染料组合使用的合适的酸包括磷酸、亚磷（膦）酸、高碘酸、硒酸、马来酸、草酸、二氯乙酸和羟基羧酸（例如α-羟基羧酸）。优选的酸是磷酸和α-羟基羧酸，例如酒石酸。

优选地，本发明分离组合物利用α-羟基羧酸。

优选α-羟基羧酸选自酒石酸、苹果酸、柠檬酸、异柠檬酸、乙二醇酸和乳酸。特别优选的α-羟基羧酸选自酒石酸、苹果酸、柠檬酸和异柠檬酸，以酒石酸最优选。

优选利用α-羟基羧酸，因为它们通常比酸诸如磷酸毒性更小。此外，发现α-羟基羧酸诸如酒石酸提供高度灵敏的染色系统，该染色系统能够以低至4ng的水平检测蛋白质，而没有由于沉淀物导致的高背景噪音引起的问题。

典型地，酸存在时其在本发明试剂盒的第一和/或第二溶液中的量是1至30%w/v（即，g/ml），优选地，5至25%w/v，最优选地，15至25%w/v。技术人员会知道，如果pH太低，蛋白质复合染料可能不能适当发挥作用。因此，第一和/或第二溶液通常仅含有5至15%w/v的强酸诸如磷酸，而较弱的酸诸如酒石酸可以较高的量诸如15至25%w/v存在。

令人惊讶地，发现纤维素衍生物诸如2-羟乙基纤维素的包含大大提高蛋白质凝胶染色的反衬度（对比度，contrast），所述蛋白质凝胶已经通过本发明分离或染色组合物进行处理。产生该效果的具体机制尚未被充分了解。然而，可能是纤维素衍生物使环状寡聚物-洗涤剂复合物稳定，进一步降低游离洗涤剂的量和减轻洗涤剂可能对蛋白质-染料复合物的任何干扰。

本发明还提供方法（下文称为“染色方法”），用于检测和/或量化蛋白质，包括

i）使含蛋白质样品与包括环状寡聚物的第一溶液接触；

iii）检测和/或量化染料/蛋白质复合物的形成。

本发明优选染色方法利用本发明优选分离组合物作为第一溶液，和本发明优选试剂盒，其中试剂盒中的成分i）对应于染色方法中的第一溶液，和试剂盒中的成分ii）对应于染色方法中的第二溶液，所述优选组合物和试剂盒与上面和权利要求书中给出的一样。

尤其地，本发明染色方法中的第一溶液优选含有纤维素衍生物，诸如上述纤维素衍生物。还优选第一或第二溶液中的至少一种包括pKa为4或更小的酸，诸如上述优选酸。

优选地，第一和第二溶液是水性溶液。

在本发明染色方法的步骤i）中，环状寡聚物与可能存在于含蛋白质样品中的任意洗涤剂形成复合物。因此，当蛋白质复合染料在步骤ii）中被加入时，洗涤剂不能干扰蛋白质-染料复合物形成。染色方法因此允许以非常低的水平检测蛋白质，即使明显量的洗涤剂存在于初始含蛋白质样品中。

因此，环状寡聚物诸如环糊精与蛋白质-染色染料的组合应用提供“耐受洗涤剂的”蛋白质染色系统，该系统不需要费力的洗涤步骤来去除可能存在的任意洗涤剂。这些试剂大大简化在电泳期间用于给蛋白质染色的方案。

本发明染色方法中利用的第二溶液可以是任意类型的蛋白质复合染料，尽管考马斯染料是特别优选的。商售蛋白质复合染料可用作本发明染色方法中的第二溶液——如所提供的或诸如通过加入pKa为4或更小的酸被适当改性。

第一（或分离）溶液充当“预处理”，以去除存在的洗涤剂（或取消存在的洗涤剂的作用）。第二溶液然后可用于根据针对该染料的普通程序给蛋白质染色。利用根据本发明的预处理（即，第一溶液）的优势是不言而喻的，因为通常必须采取的任意去除洗涤剂的步骤均可省略。

含蛋白质样品的形式可以是溶液诸如水性溶液（溶解的或作为悬浮液）、作为固体诸如沉淀物或形式为含有蛋白质的支持物。

可含有蛋白质的典型支持物包括层析板、滤纸、硝基纤维素膜或树脂或凝胶基质诸如电泳凝胶。合适的凝胶基质是技术人员所知道的，其包括聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。

当含蛋白质样品是蛋白质溶液或悬浮液时，一旦形成，则从溶液中分离环状寡聚物/洗涤剂复合物通常是不值得的。相反，蛋白质复合染料可被简单地加入染色方法的步骤i）中形成的溶液。

当含蛋白质样品的形式为含有所述蛋白质的支持物时，支持物可在步骤i）后在步骤ii）中加入第二溶液之前从第一溶液（例如通过倒掉第一溶液）中去除。这避免含有蛋白质复合染料的溶液变得太稀释，这有助于保持形成蛋白质-染料复合物所需的时间最少。任选地，支持物可在步骤ii）之前被漂洗。然而，这不是必须的，因为第一和第二溶液彼此相容。

典型地，本发明染色和分离方法在室温下完成。然而，在需要时可使用微高的温度诸如上至50℃。

环状寡聚物/洗涤剂复合物形成的速率将取决于含蛋白质样品的准确形式。例如，如果含蛋白质样品是溶液，则形成速率几乎是瞬间的。然而，在蛋白质被捕获在基质诸如电泳凝胶中的情况下，使含蛋白质样品与第一溶液接触的步骤在大多数情况下通常耗费上至15分钟，但可耗费上至1小时，这取决于洗涤剂在含蛋白质样品中的浓度。步骤ii）需要类似的时段，以形成蛋白质-染料复合物。

当被用于给凝胶诸如电泳凝胶染色时，第一溶液优选在微波中与凝胶一起被加热上至30秒，例如20秒。这些值是针对典型的1000W微波。微波加热后，组合物和凝胶通常在室温（例如20-25℃）或在高温诸如50℃下静置例如15分钟。可通过利用水浴或任意其他合适的手段维持高温。在需要时，该方案可任选地重复步骤ii）。然而，步骤ii）的方案可根据所使用的蛋白质复合染料而轻微变化。技术人员会知道应该用于任意给定蛋白质复合染料的合适的方案。

尽管这些是优选方案，但实施例显示本发明染色试剂盒可在室温下用于在仅15分钟内给电泳凝胶染色。典型地，本发明方法包括暴露电泳凝胶于第一溶液达上至30分钟，例如5至15分钟；倾倒第一溶液；和暴露电泳凝胶于第二溶液达上至30分钟，例如5至15分钟。当然，凝胶暴露于第一和第二溶液越久，该方法将越灵敏，尤其当凝胶在上述高温下被染色时。

因此，在优选实施方式（尤其当含蛋白质样品是电泳凝胶和要求高灵敏度时）中，本发明染色方法包括在使第一溶液与含蛋白质样品接触的步骤之后加热第一溶液和含蛋白质样品（诸如在微波中加热10-30秒，优选地，15-20秒）和维持溶液和样品处于20-60℃，优选地，20-50℃的温度达上至1小时，优选地，达5至30分钟，更优选地，5至20分钟。

有利地，环状寡聚物的利用意为在检测蛋白质之前不需要去除洗涤剂和/或表面活性剂。因此，电泳凝胶可利用本发明组合物被染色而无需跑完凝胶后被洗涤。在优选方面，本发明因此涉及检测和/或量化蛋白质的方法，包括

a）提供含蛋白质凝胶，

b）施加电场至所述凝胶，

c）暴露凝胶于包括环状寡聚物的第一溶液，

d）任选地，从第一溶液中去除凝胶，

e）暴露含蛋白质样品于含有蛋白质复合染料的第二溶液，和

f）检测和/或量化染料/蛋白质复合物形成。

在这样的方法中，优选凝胶在步骤b）后和步骤c）前不被洗涤。任何合适的电泳凝胶均可用于该方法，诸如聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶。

步骤d）中“任选地从第一溶液中去除凝胶”意为凝胶和第一溶液通过任意手段被分离，以便在步骤e）期间当凝胶暴露于第二溶液时第一溶液不再存在。在实践中，可能不期望在步骤d）中实际上移动凝胶，因为电泳凝胶通常是十分易碎的。相反，步骤d）通常包括倒掉第一溶液，以便凝胶保留在该方法正在使用的容器中。

在本发明染色方法中，检测蛋白质/染料复合物可包括量化存在的蛋白质/染料复合物的量，以便确定蛋白质的量或浓度。典型地，蛋白质-染料复合物的形成导致染料光谱学性质的变化，这可利用已知的方法检测和分析。例如，量化可通过包括测量染料/蛋白质复合物吸收或发射光谱的变化的方法执行。量化可包括例如测量颜色变化。对于大部分蛋白质复合染料，吸光度通常在大约400至大约700nm范围内的波长处被测量。

利用合适的实时光谱学手段允许测量吸光度随时间的变化。对于考马斯亮蓝G-250，吸光度在大约595nm的波长处被测量，在与蛋白质复合时该染料的吸光度最大。当利用考马斯亮蓝G-250时，蛋白质可通过监测由于形成染料/蛋白质复合物吸光度在595nm处的增加而被检测。

为确定蛋白质浓度，测量的吸光度或发射（emission）可以与标准值、标准值集或标准曲线进行比较。

本发明方法高度易于自动化和分析大量样品。合适的高通量设备是商业上可得的，技术人员应该知道。

如上所示，本发明分离组合物的应用避免组合利用无机酸诸如磷酸与蛋白质复合染料和环状寡聚物诸如环糊精时产生的问题。令人惊讶地，发现当羟基羧酸被用于“多效合一”染色组合物中时这些缺点还可被克服。

本发明因此涉及组合物（本文中被称为“染色组合物”），用于检测蛋白质，所述组合物包括：

a）蛋白质复合染料；

b）环状寡聚物；和

c）羟基羧酸。

在一些实施方式中，染色组合物中的环状寡聚物不是α-环糊精（环-α(1→4)-葡己糖苷）。

优选地，染色组合物中的羟基羧酸是α-羟基羧酸，诸如酒石酸、苹果酸、柠檬酸、异柠檬酸、乙二醇酸或乳酸。最优选的羟基羧酸是酒石酸。

优选地，染色组合物还包括纤维素衍生物，诸如上面在分离组合物背景下提及的任意优选纤维素衍生物。最优选的纤维素衍生物是羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素，其中羟乙基纤维素，尤其是2-羟乙基纤维素是特别优选的。

本发明染色组合物中各种成分的典型量显示在以下表中（所有量均作为百分比w/v，即克/ml给出）：

成分	典型量	优选量	最优选量
				染料	0.0001-0.1%	0.0005-0.01%	0.001-0.005%
环状寡聚物	0.1-4%	0.5-4%	1-3%
				羟基羧酸	10-30%	15-25%	18-22%
纤维素衍生物	0-2%	0.05-1%	0.1-0.5%
				增溶剂（例如乙醇）	0-5%	0.5-4%	1-3%

虽然本发明染色组合物的形式可以是溶液诸如水性溶液，但含有两种或更多种溶液——组合以形成本发明染色组合物——的试剂盒也形成本发明的部分。因此，本发明还提供试剂盒，包括

a）蛋白质复合染料，

b）环状寡聚物，和

c）羟基羧酸，

其中成分a）、b）和c）以两种或更多种独立的组合物存在，其在组合时形成用于蛋白质检测的组合物。

在本发明优选实施方式中，试剂盒包括

i）组合物，包括蛋白质-染色染料，和

ii）组合物，包括环状寡聚物和羟基羧酸，

其中成分i）和ii）在组合时形成用于蛋白质检测的组合物。

在这样的试剂盒中，第一溶液优选地还包括羟基羧酸诸如α-羟基羧酸。优选α-羟基羧酸在上面提及，以酒石酸最优选。

提供试剂盒形式的染色组合物是有利的，因为它可增加组合物作为整体的稳定性和保存期限。

这样的试剂盒还优选在第二溶液中含有纤维素衍生物。优选纤维素衍生物在上面提及，以2-羟乙基纤维素最优选。

这样的试剂盒还优选在第二溶液中含有增溶剂。优选增溶剂在上面提及，以乙醇最优选。

环状寡聚物、α-羟基羧酸、任选的纤维素衍生物和任选的增溶剂的优选类型和量涉及本发明分离组合物时在上面提及。

本发明染色组合物还可在本发明可选方法中直接应用于含蛋白质样品。

因此，本发明还提供检测和/或量化蛋白质的方法，包括使含蛋白质样品与溶液接触，所述溶液包括

a）蛋白质复合染料，

b）环状寡聚物，和

c）羟基羧酸；和

检测和/或量化染料/蛋白质复合物形成。

优选地，含蛋白质样品的形式为含有所述蛋白质的支持物诸如电泳凝胶。

因此，利用染色组合物的特别优选的方法包括

i）提供含蛋白质凝胶，

ii）施加电场至所述凝胶，

iii）暴露凝胶于本发明染色组合物，和

iv）检测和/或量化染料/蛋白质复合物形成。

在这样的方法中，凝胶优选在步骤ii）后和步骤iii）前不被洗涤。任何合适的电泳凝胶均可用于该方法，诸如聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶。

如上所述，染料/蛋白质复合物形成的速率将取决于含蛋白质样品的具体形式。例如，在蛋白质被捕获在基质诸如电泳凝胶中的情况下，使含蛋白质样品与本发明染色组合物接触的步骤通常在大多数情况下通常耗费上至15分钟，但可耗费上至1小时，以有效地给仅以非常低浓度存在的蛋白质染色。

典型地，利用上面针对分离组合物提出的相同方法，染色组合物被应用于电泳凝胶以给蛋白质染色。因此，当被用于给凝胶诸如电泳凝胶染色时，本发明染色组合物优选在微波中与凝胶一起被加热上至30秒例如20秒。这些值是针对典型的1000W微波。微波加热后，组合物和凝胶通常在室温（例如20-25℃）或在高温诸如50℃下静置例如15分钟。可通过利用水浴或任意其他合适的手段维持高温。

如上所述，本发明试剂盒中第一（即，分离）和第二溶液的应用降低蛋白质复合染料与含蛋白质样品接触时形成的沉淀物的量。即使如此，在利用α-羟基羧酸诸如酒石酸时仍获得最佳结果。此外，利用纤维素衍生物提高染料/蛋白质-复合物——尤其在存在于电泳凝胶中时——的反衬度。

本发明因此还涉及羟基羧酸，尤其是α-羟基羧酸诸如酒石酸降低含蛋白质复合染料的酸化溶液中沉淀物的量的用途。

本发明还涉及纤维素衍生物诸如羟乙基纤维素（例如2-羟乙基纤维素）增强染料/蛋白质复合物染色的用途。

本发明还涉及纤维素衍生物诸如羟乙基纤维素（例如2-羟乙基纤维素）和环状寡聚物诸如环糊精（例如α-、β-或γ-环糊精）的组合来增强染料/蛋白质复合物染色的用途。

清楚地是，用于检测蛋白质的组合物中的沉淀物必将提供任意染色混合物诸如染色电泳凝胶的不清楚的背景。

本发明因此涉及羟基羧酸尤其是α-羟基羧酸诸如酒石酸和纤维素衍生物诸如羟乙基纤维素（例如2-羟乙基纤维素）的组合增强染料/蛋白质复合物的染色的用途。

本发明还涉及羟基羧酸尤其是α-羟基羧酸诸如酒石酸、纤维素衍生物诸如羟乙基纤维素（例如2-羟乙基纤维素）和环状寡聚物诸如环糊精（例如α-、β-或γ-环糊精）的组合增强染料/蛋白质复合物的染色的用途。

“增强染色”意为使染料/蛋白质-复合物更容易在染色混合物中被鉴别，例如通过提高已经被暴露于蛋白质复合染料的含有蛋白质的凝胶中的反衬度。该提高可通过染料/蛋白质-复合物形成或通过降低不含有任何蛋白质的区域中背景的量或通过两者。染色增强的提高可通过计算信噪比，例如通过利用光密度分析法而被确定。

因此，鉴于其它方面，本发明涉及纤维素衍生物诸如羟乙基纤维素（例如2-羟乙基纤维素）提高凝胶中染色的染料/蛋白质复合物的信号/噪音比——优选如通过光密度分析法所测定的——的用途。

本发明还涉及纤维素衍生物诸如羟乙基纤维素（例如2-羟乙基纤维素）和环状寡聚物诸如环糊精（例如α-、β-或γ-环糊精）的组合提高凝胶中染色的染料/蛋白质复合物的信号/噪音比——优选如通过光密度分析法所测定的——的用途。

本发明还涉及羟基羧酸尤其是α-羟基羧酸诸如酒石酸和纤维素衍生物诸如羟乙基纤维素（例如2-羟乙基纤维素）的组合提高凝胶中染色的染料/蛋白质复合物的信号/噪音比——优选如通过光密度分析法所测定的——的用途。

本发明还涉及羟基羧酸尤其是α-羟基羧酸诸如酒石酸、纤维素衍生物诸如羟乙基纤维素（例如2-羟乙基纤维素）和环状寡聚物诸如环糊精（例如α-、β-或γ-环糊精）的组合提高凝胶中染色的染料/蛋白质复合物的信号/噪音比——优选如通过光密度分析法所测定的——的用途。

在上述用途中，纤维素衍生物优选作为溶液的部分（即，纤维素衍生物不是固体基质）而存在。本发明因此优选涉及纤维素衍生物——任选组合羟基羧酸和/或环状寡聚物——的溶液实现上述效果的用途。

提高的信号/噪音比是可实现的，即使在本发明方法中第一溶液在加入第二溶液之前被去除。这据信是由于在本发明方法的步骤i）期间浸渍或涂布凝胶的纤维素衍生物。因此，即使在步骤ii）之前第一溶液被去除和凝胶被漂洗，至少一些纤维素衍生物保留在凝胶中以引起信噪比的提高。

相同的考虑因素适用于α-羟基羧酸，其可存在于第一和/或第二溶液中。因此，即使α-羟基羧酸仅包括在第一溶液中，酸浸渍凝胶并被保留，即使第一溶液被去除。酸因此可引起信号/噪音比提高，即使其不包含在第二溶液中。当然，在第一和第二溶液中均利用α-羟基羧酸时获得最佳结果。

本发明将通过参考以下非限制性实例和附图被进一步描述，在所述附图中：

图1显示具有制剂A（图1a）和速溶蓝（Instant Blue）（图1b）的小瓶

图2显示未洗涤的、通过制剂A染色的凝胶

图3显示未洗涤的、通过速溶蓝染色的凝胶

图4显示获自实施例2a的凝胶

图5显示获自实施例2b的凝胶

图6显示获自实施例2c的凝胶

图7显示获自实施例3a的凝胶

图8显示获自实施例3b的凝胶

图9显示获自实施例3c的凝胶

图10显示获自实施例3d的凝胶

图11显示利用制剂B染色的凝胶的扫描

图12显示利用制剂C染色的凝胶的扫描

图13显示利用制剂D染色的凝胶的扫描

图14显示利用制剂A和速溶蓝染色的凝胶的信号/噪音比

实施例1

以下制剂通过在去离子水中混合成分而制备：

制剂A：

作为对照，“速溶蓝”获自Expedeon Limited，据信其含有磷酸、α-环糊精、乙醇和考马斯染料，与WO2007/125372的实施例一致。

图1a显示含有制剂A的小瓶，而图1b显示含有速溶蓝的小瓶。这些图清楚地显示本发明的染色制剂是透明的而没有沉淀物，并具有浅蓝/绿颜色。相比之下，速溶蓝呈混浊棕色，具有明显量的悬浮颗粒/沉淀物。

这些制剂被用于给含有各种浓度BSA的PAGE凝胶染色。染色1小时后不期望的凝胶显示于图2和3。速溶蓝中高水平的沉淀物使其在背景下难以看到低水平的BSA。

该实施例清楚地显示蛋白质-染色溶液——含有环状寡聚物诸如环糊精和磷酸——中高水平的沉淀物。

实施例2

以下制剂通过在去离子水中混合成分而制备：

制剂I-1

制剂I-2

制剂I-3

α-环糊精 4%w/v

乙醇 2%w/v

2-羟乙基纤维素 0.3w/v

制剂II-1

G250染料 0.013%w/v

酒石酸 20%w/v

制剂II-2

G250染料 0.013%w/v

磷酸 10%w/v

含有各浓度BSA的PAGE凝胶利用上面显示的制剂I和II的以下组合进行染色：

实施例	预处理	染色
			2a	I-1	II-1
2b	I-2	II-2
			2c	I-3	II-2

PAGE凝胶首先在室温下被暴露于预处理I达10分钟。暴露后，处理溶液被倒掉和染色溶液II被加入。然后，使凝胶在室温下另外静置5分钟，然后去除染色溶液。

来自2a、2b和2c的染色凝胶分别显示于图4、5和6。这些凝胶清楚地显示根据本发明的试剂盒可组合酸诸如磷酸使用而不经历任何沉淀问题。此外，图4和5/6之间的比较显示，利用酒石酸时染色的带清楚地多。

实施例3

以下制剂通过在去离子水中混合成分而制备：

制剂I-4

α-环糊精 4%w/v

乙醇 2%w/v

2-羟乙基纤维素 0.3w/v

制剂I-5

酒石酸 20%w/v

乙醇 2%w/v

2-羟乙基纤维素 0.3w/v

制剂I-6

酒石酸 20%w/v

α-环糊精 4%w/v

乙醇 2%w/v

实施例	预处理	染色
			3a	I-1	II-1
3b	I-4	II-1
			3c	I-5	II-1
3d	I-6	II-1

来自3a、3b、3c和3d的染色凝胶分别显示于图7、8、9和10。图7和8中的凝胶显示酒石酸不需要包括在第一溶液中（即，预处理）。图9清楚地显示，如果在预处理省略环状寡聚物，则看不到带。此外，图10显示如果在预处理省略纤维素衍生物，则带几乎不可见。

实施例4

以下制剂通过在去离子水中溶解各成分而制备：

制剂B：

制剂C：

制剂D：

PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）利用商业凝胶产品在标准条件下完成。产生商售和购买的牛血清白蛋白（标准品）样品并在凝胶（一个或多个）上运行。商业标记也包括在内。一旦电泳结束，从其塑料护套中移出凝胶并插入含有上述制剂之一的小槽中。利用每种制剂允许和测试同样的凝胶。染色时间对于每种制剂是一致的。图11至13显示染色凝胶的扫描。

凝胶中中间四条带是感兴趣的测试带，其中外面的泳道是标准标记。在扫描仪上获得凝胶图片，这导致凝胶背景为浅灰——其中水层已经被捕获在凝胶和扫描仪的玻璃屏之间——或白色——其中空气层（或气泡）在凝胶和屏之间。

即使由于在凝胶和扫描仪玻璃板之间存在或不存在水层而产生的背景中存在差异，但图11-13所示结果清楚地显示，利用酒石酸取代磷酸提高四条测试带的反衬度，使其更易于鉴别（见图11和12）。此外，图12和13显示加入2-羟乙基纤维素导致染色蛋白质样品和背景之间甚至更大的反衬度。

实施例5

上述制剂A和速溶蓝被用于给含有各种浓度BSA的PAGE凝胶染色。染色蛋白质与背景之比通过光密度分析法测量。结果显示在图14a-c中。

图14c清楚地显示，制剂A能够在低于20ng的浓度检测蛋白质。此外，图14a、14b和14c各显示通过利用根据本发明的染色组合物获得的信噪比的明显提高。

Claims

1.从洗涤剂中分离蛋白质的组合物，所述组合物包括

a）纤维素衍生物，和

b）环状寡聚物。

2.权利要求1所述的组合物，其中所述环状寡聚物选自环状低聚糖、杯芳烃、葫芦脲和柱芳烃。

3.权利要求2所述的组合物，其中所述环状低聚糖选自环糊精、环葡聚糖、环凝胶多糖、环甘露聚糖、环果聚糖和环催乳激素。

4.权利要求1所述的组合物，其中所述环状寡聚物是环糊精，优选地，α-环糊精。

5.任意前述权利要求所述的组合物，其中所述环状寡聚物以0.1至10%w/v的量存在。

6.任意前述权利要求所述的组合物，其中所述纤维素衍生物选自羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素。

7.权利要求6所述的组合物，其中所述纤维素衍生物是羟乙基纤维素，优选地，2-羟乙基纤维素。

8.任意前述权利要求所述的组合物，其中所述纤维素衍生物以0.05至2%w/v的量存在。

9.任意前述权利要求所述的组合物，进一步包括醇，优选地，量为0.5至10%w/v。

10.权利要求9所述的组合物，其中所述醇是乙醇（诸如变性乙醇或无水乙醇）。

11.任意前述权利要求所述的组合物，进一步包括pKa为4或更小的酸。

12.权利要求11所述的组合物，其中所述酸是α-羟基羧酸。

13.权利要求12所述的组合物，其中所述酸是酒石酸。

14.任意前述权利要求所述的组合物，特征在于其不含有任何蛋白质复合染料。

15.任意前述权利要求所述的组合物，其中所述组合物是水性溶液。

16.试剂盒，包括

i）第一溶液，包括权利要求15所述的组合物，和

ii）第二溶液，包括蛋白质复合染料。

17.权利要求16所述的试剂盒，其中所述蛋白质复合染料是考马斯染料。

18.权利要求16或17所述的试剂盒，其中所述第一或第二溶液至少之一包括pKa为4或更小的酸。

19.权利要求18所述的试剂盒，其中所述第一和第二溶液包括pKa为4或更小的酸。

20.权利要求18或19所述的试剂盒，其中所述酸是α-羟基羧酸，优选地，酒石酸。

21.检测和/或量化蛋白质的方法，包括

i）使含蛋白质样品与包括环状寡聚物的第一溶液接触；

ii）使所述含蛋白质样品与包括蛋白质复合染料的第二溶液接触；和

iii）检测和/或量化染料/蛋白质复合物的形成。

22.权利要求21所述的方法，其中所述含蛋白质样品的形式为含有所述蛋白质的支持物。

23.权利要求22所述的方法，其中所述支持物是电泳凝胶。

24.权利要求22或23所述的方法，其中所述含蛋白质样品在步骤ii）之前从所述第一溶液中被除去。

25.权利要求23所述的方法，其中步骤i）、ii）和iii）包括如下步骤

a）提供含蛋白质凝胶，

b）施加电场至所述凝胶，

c）暴露所述凝胶于所述第一溶液,

d）任选地，从所述第一溶液去除所述凝胶，

e）暴露所述含蛋白质样品于含有蛋白质复合染料的第二溶液，和

f）检测和/或量化所述染料/蛋白质复合物的形成。

26.权利要求25所述的方法，其中所述凝胶在步骤b）之后和步骤c）之前不被洗涤。

27.权利要求21至26任一项所述的方法，其中所述检测和/或量化包括检测和/或量化所述染料/蛋白质复合物的吸收或发射光谱的变化。

28.权利要求27所述的方法，其中所述变化是颜色变化，例如在595nm处。

29.权利要求21至28任一项所述的方法，其中所述第一溶液包括纤维素衍生物。

30.权利要求21至29任一项所述的方法，其中所述第一或第二溶液至少之一，优选两者，包括pKa为4或更小的酸。

31.α-羟基羧酸诸如酒石酸降低含蛋白质复合染料的酸化溶液中的沉淀物量的用途。

32.纤维素衍生物诸如羟乙基纤维素（例如2-羟乙基纤维素）增强染料/蛋白质复合物染色的用途。

33.α-羟基羧酸诸如酒石酸和纤维素衍生物诸如羟乙基纤维素（例如2-羟乙基纤维素）的组合增强染料/蛋白质复合物的染色的用途。

34.权利要求33所述的用途，其中所述蛋白质/染料复合物包含在凝胶中，所述凝胶已经被暴露于蛋白质复合染料，并且所述增强是通过提高含有蛋白质/染料复合物的凝胶区域和不含有任何蛋白质的区域之间的反衬度。

35.从洗涤剂中分离蛋白质的方法，所述方法包括

1）使含蛋白质样品和洗涤剂与溶液接触，所述溶液包括

a）纤维素衍生物，和

b）环状寡聚物；和

2）从所述洗涤剂中分离所述蛋白质。

36.用于蛋白质检测的组合物，包括

a）蛋白质复合染料，

b）环状寡聚物，和

c）羟基羧酸。

37.权利要求36所述的组合物，其中所述羟基羧酸是酒石酸。

38.权利要求36或37所述的组合物，进一步包括纤维素衍生物诸如2-羟乙基纤维素。

39.检测和/或量化蛋白质的方法，包括使含蛋白质样品与根据权利要求36-38任一项的组合物接触，并检测和/或量化染料/蛋白质复合物的形成。

40.权利要求39所述的方法，其中所述含蛋白质样品的形式为含有所述蛋白质的支持物。

41.权利要求40所述的方法，其中所述支持物是电泳凝胶。

42.权利要求41所述的方法，包括如下步骤

i）提供含蛋白质凝胶，

ii）施加电场至所述凝胶，

iii）暴露所述凝胶于本发明组合物，和

iv）检测和/或量化所述染料/蛋白质复合物的形成。

43.权利要求42所述的方法，其中所述凝胶在步骤ii）之后和步骤iii）之前不被洗涤。