JP2023095293A - 脂質量の測定方法及びアッセイキット - Google Patents

Abstract

【課題】生体試料に含まれる脂質量を簡便かつ精度よく測定する方法を提供すること。【解決手段】基板に固定化された生体試料を準備する準備工程と、脂質を染色する第一の色素を、前記生体試料に接触させ、前記生体試料に含まれる脂質を染色する第一染色工程と、前記生体試料に含まれる前記脂質以外の細胞組成物を染色する第二の色素を、前記生体試料に接触させ、前記脂質以外の細胞組成物を染色する第二染色工程と、前記第一染色工程及び第二染色工程後の生体試料を洗浄し、余剰の前記第一の色素及び前記第二の色素を除去する洗浄工程と、前記染色された生体試料から前記第一の色素及び前記第二の色素を抽出する抽出工程と、を含む、生体試料に含まれる脂質量の測定方法である。【選択図】なし

Description

本発明は、脂質量の測定方法及びアッセイキットに関する。

近年、スキンケア用品等の開発を指向し、細胞等の生体試料に含まれる脂質量を測定する技術の開発が、必要とされている。生体試料に含まれる脂質量を測定する手法としては、例えば、オイルレッドＯ等の脂質を染色する色素を用いて、細胞内の脂質を染色する手法が知られている（特許文献１等）。

Quantitative assessment of adipocyte differentiation in cell culture, Adipocyte, 5, 351-358 (2016)

上述のような従来の脂質染色による脂質量の測定では、生体試料に含まれる脂質を色素により染色した後に、生体試料を洗浄し余剰の色素を除去し、染色された脂質を含む生体試料を目視等で観測する。従来法では、この洗浄の際に、実験誤差が生じやすく、生体試料に含まれる脂質量を簡便かつ精度よく測定することが困難であった。
そこで本発明では、上記事情に鑑み、生体試料に含まれる脂質量を簡便かつ精度よく測定する方法及びこれを用いたアッセイキットを提供することにある。

前記課題を解決するための具体的手段には、下記の態様が含まれる。

＜１＞ 基板に固定化された生体試料を準備する準備工程と、
脂質を染色する第一の色素を、前記生体試料に接触させ、前記生体試料に含まれる脂質を染色する第一染色工程と、
前記生体試料に含まれる前記脂質以外の細胞組成物を染色する第二の色素を、前記生体試料に接触させ、前記脂質以外の細胞組成物を染色する第二染色工程と、
前記第一染色工程及び第二染色工程後の生体試料を洗浄し、余剰の前記第一の色素及び前記第二の色素を除去する洗浄工程と、
前記染色された生体試料から前記第一の色素及び前記第二の色素を抽出する抽出工程と、を含む、生体試料に含まれる脂質量の測定方法。
＜２＞ 前記第二の色素に対する前記第一の色素のモル比が１／１０～６００／１である、前記＜１＞に記載の脂質量の測定方法。
＜３＞ 可視吸収スペクトルの波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における、
前記第一の色素の極大ピークＰ_１と、
前記第二の色素の極大ピークＰ_２と、
の差の絶対値（｜Ｐ_１－Ｐ_２｜）が５０ｎｍ～３００ｎｍである、前記＜１＞又は＜２＞に記載の脂質量の測定方法。
＜４＞ 前記極大ピークＰ_１の半値幅が１０ｎｍ～５０ｎｍである、前記＜１＞～＜３＞のいずれか１つに記載の脂質量の測定方法。
＜５＞ 前記極大ピークＰ_２の半値幅が１０ｎｍ～５０ｎｍである、前記＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載の脂質量の測定方法。
＜６＞ 前記第一染色工程及び前記第二染色工程が同時に実施される、前記＜１＞～＜５＞のいずれか１つに記載の脂質量の測定方法。
＜７＞ 前記第一の色素がオイルレッドＯである、前記＜１＞～＜６＞のいずれか１つに記載の脂質量の測定方法。
＜８＞ 前記第二の色素がメチレンブルーである、前記＜１＞～＜７＞のいずれか１つに記載の脂質量の測定方法。
＜９＞ 前記第二の色素は、前記生体試料に含まれる前記脂質以外のアニオン性の細胞組成物を染色する、前記＜１＞～＜８＞のいずれか１つに記載の脂質量の測定方法。
＜１０＞ 脂質を染色する第一の色素を含む染色剤と、
脂質以外の細胞組成物を染色する第二の色素を含む染色剤と、
を備え、
前記＜１＞～＜９＞のいずれか１つに記載の脂質量の測定方法により対象物の脂質分泌量を測定する、アッセイキット。

本開示によれば、生体試料に含まれる脂質量を簡便かつ精度よく測定する方法及びこれを用いたアッセイキットが提供される。

第一染色液、第二染色液及び両者の混合液である特定染色液それぞれの吸収スペクトルである。 比較例１と実施例１それぞれにおける吸収波長４９２ｎｍでの吸光度のグラフである。 実施例１、実施例２、比較例１及び比較例２の相対吸光度のグラフである。 実施例１、実施例４、比較例１及び比較例４の相対吸光度のグラフである。

以下に、本発明の実施形態について説明する。これらの説明及び実施例は実施形態を例示するものであり、実施形態の範囲を制限するものではない。

本明細書において、数値範囲を示す「～」とはその前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用される。
本明細書中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。

本明細書において各成分は該当する物質を複数種含んでいてもよい。
本明細書において組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数種存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数種の物質の合計量を意味する。

本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても、その工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。

なお、本開示において、好ましい態様の組み合わせは、より好ましい態様である。

－生体試料に含まれる脂質量の測定方法－
本開示に係る脂質量の測定方法は、基板に固定化された生体試料を準備する準備工程と、脂質を染色する第一の色素を、前記生体試料に接触させ、前記生体試料に含まれる脂質を染色する第一染色工程と、前記生体試料に含まれる前記脂質以外の細胞組成物を染色する第二の色素を、前記生体試料に接触させ、前記脂質以外の細胞組成物を染色する第二染色工程と、前記第一染色工程及び第二染色工程後の生体試料を洗浄し、余剰の前記第一の色素及び前記第二の色素を除去する洗浄工程と、前記染色された生体試料から前記第一の色素及び前記第二の色素を抽出する抽出工程と、を含む、生体試料に含まれる脂質量の測定方法である。

生体試料に含まれる脂質量を測定は、スキンケア用品の開発等の観点から、着目されている。従来、生体試料に含まれる脂質量の測定方法としては、質量分析法、酵素活性測定法、染色測定法等が知られている。これらの中でも、染色測定法は、その材料入手の容易性や操作の簡便性といった観点から、さらなる発展が期待されている。

染色測定法は、一般に、生体試料に含まれる脂質を色素により染色した後に、生体試料を洗浄して余剰の色素を除去した後、有機溶媒等で色素を抽出し、この色素や生体試料由来成分を含む抽出液を紫外可視吸収スペクトル測定等で観測する。従来法では、この洗浄の際に、実験誤差が生じやすく、生体試料に含まれる脂質量を精度よく測定することが困難であった。

一方、本開示に係る脂質量の測定方法は、上記構成を有することにより、生体試料に含まれる脂質量を簡便かつ精度よく測定することができる。この要因は必ずしも明らかではないが以下のように推察される。

本開示に係る脂質量の測定方法は、第一の色素による脂質の染色に加えて、第二の色素による生体試料に含まれる脂質以外の細胞組成物の染色も含む。これにより、例えば、染色された生体試料を洗浄し余剰の色素が除去された後に、前記染色された生体試料から抽出された抽出物に含まれる第一の色素と第二の色素との相対量比によって、生体試料に含まれる脂質量を簡便かつ精度よく測定できると考えられる。

なお、一般に、生体試料に含まれる脂質以外の細胞組成物を染色する場合、染色対象となる細胞の播種数と、細胞その染色に用いる色素（本開示でいうところの第二の色素）の濃度や吸光度とが、比例関係にあるものと考えられていた。すなわち、第一の色素による脂質の染色に加えて、第二の色素による脂質以外の細胞組成物の染色を経たとしても、その後の抽出工程によって得られる第二の色素の濃度や吸光度は細胞播種数に応じて変動することから、相対比で脂質量を測定することは困難であると考えられていた。
これに対し、本発明者らは、鋭意検討の結果として、抽出工程における第二の色素の濃度は、細胞播種数によらず、ほぼ一定であることを発見し、本開示に係る構成により、第一の色素と第二の色素との相対量比から、生体試料に含まれる脂質量を簡便かつ精度よく測定できることを見出した。

以下、本開示に係る各工程について詳細に説明する。

［準備工程］
準備工程では、基板に固定化された生体試料を準備する。
基板は、後述する第一染色工程及び第二染色工程において生体試料と第一の色素及び第二の色素とを接触させることができるものであれば特に制限されないが、例えば、ウェルプレート、培養皿、培養フラスコ等が挙げられる。

生体試料は、脂質を含んでいても、脂質を含んでいなくてもよい。
生体試料としては、例えば、ヒト、非ヒト動物（ヒトを除く哺乳類等）等の検査対象に由来する検体が挙げられる。生体由来の検体は、特に制限されないが、例えば、基板に固定化しやすい観点から、細胞であることが好ましい。

脂質は、生体試料内に含まれうる脂質であれば特に制限されないが、例えば、中性脂肪のトリグリセリド、コレステロールエステル等が挙げられる。

固定化とは、物理吸着、化学結合による化学吸着などによって、各工程で生体試料が基板から分離されがたくなるように基板上に留めること指す。
生体試料を基板に固定化する手法は、特に制限されないが、例えば下記の手法が適用できる。
１）生体試料を固定液に浸けて基板に固定化する浸漬法
２）生体試料を低温凍結用包埋剤等に浸してから凍結し液体窒素中で保存する凍結法
３）生体試料を風乾して固定する乾燥法

上記の中でも、生体試料を基板に固定化する手法は、脂質量をより簡便且つ精度よく測定する観点から、１）生体試料を固定液に浸けて基板に固定化する浸漬法であることが好ましい。なお、固定液としては、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルダルアルデヒド等の非アルコール系固定液が挙げられる。

本開示の一態様として、準備工程は、生体試料を４℃～２８℃の固定液に３０分～２時間、含侵することにより基板に固定化された生体試料を準備する工程であってもよい。

［第一染色工程］
第一染色工程では、脂質を染色する第一の色素を、前記生体試料に接触させ、前記生体試料に含まれる脂質を染色する。

第一の色素は、脂質を染色する。
第一の色素は、脂質を染色できる色素であれば特に制限されないが、例えば、オイルレッドＯ、スダンＩ～ＩＶ、ナイルレッド、ファットレッド７Ｂ等の脂溶性色素が挙げられる。

上記の中でも、第一の色素は、生体試料に含まれる脂質量をより精度よく測定する観点から、オイルレッドＯであることが好ましい。特に、生体試料に含まれる脂質が中性脂肪である場合、オイルレッドＯは染色性に優れ、好ましい。

第一の色素は、生体試料に含まれる脂質量をより精度よく測定する観点から、可視吸収スペクトルの波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における、極大ピークＰ_１の半値幅が、１０ｎｍ～５０ｎｍであることが好ましく、１０ｎｍ～４０ｎｍであることがより好ましく、１０ｎｍ～３５ｎｍであることがさらに好ましい。

前記極大ピークＰ_１の半値幅が上記範囲内である第一の色素としては、例えば、オイルレッドＯ、スダンＩＩＩ、スダンＩＶ、ナイルレッド、ファットレッド７Ｂ等が挙げられる。

可視吸収スペクトルは、例えば、石英セル、吸光度測定装置ＭＰＳ－２０００（島津製作所製）を用いて下記の条件で測定することができる。
試料濃度：１．０×１０^―１ｍｍｏｌ／Ｌ
溶媒：２－プロパノール又はエタノール／酢酸の９９／１（ｖ／ｖ）の混合溶液
測定温度：室温（２５℃）

前記極大ピークＰ_１の半値幅とは、極大ピークＰ_１の高さ（つまり最大吸収波長における吸光度）の１／２の高さにおけるピーク幅（半値全幅：Full width at half maximum）を表す。

第一の色素を生体試料に接触させる方法は、特に制限されないが、例えば、下記１）～３）の方法が挙げられる。
１）第一の色素を含む染色液を、生体試料が固定化されているウェルプレート等の基板に添加することで、第一の色素を生体試料に接触させる態様；
２）基板に固定化されている生体試料に対し、第一の色素をそのまま添加することで、第一の色素を生体試料に接触させる態様；
３）基板に固定化されている生体試料に対し、第一の色素が溶解する溶剤を予め添加し、そこに第一の色素をさらに添加することで、第一の色素を生体試料に接触させる態様

上記１）における染色液で用いる溶剤は、第一の色素が溶解するものであれば特に制限されないが、例えば、２－プロパノール等のアルコール、イオン交換水、緩衝液、及びこれらの混合液などが挙げられる。

第一の色素の濃度は、生体試料の量及び想定される脂質量の割合に応じて適宜設定できるが、例えば、生体試料に含まれる脂質量をより精度よく測定する観点から、２００μｍｏｌ／Ｌ以上飽和濃度以であることが好ましく、２ｍｍｏｌ／Ｌ以上飽和濃度以下であることがより好ましく、飽和濃度であることが更に好ましい。

第一染色工程は、例えば、第一の色素を含む染色液を、生体試料が固定化されている基板に添加し、１８℃～２８℃で、１０分間～３０分間インキュベートすることで、第一の色素を生体試料に接触させる態様であってもよい。

［第二染色工程］
第二染色工程では、前記生体試料に含まれる前記脂質以外の細胞組成物を染色する第二の色素を、前記生体試料に接触させ、前記脂質以外の細胞組成物を染色する。

第二の色素は、脂質以外の細胞組成物を染色し、脂質以外のアニオン性の細胞組成物、例えば核酸やアニオン性のタンパク質などを染色することが好ましく、細胞核や細胞質基質などを染色することがより好ましい。

第二の色素は、脂質以外の細胞組成物を染色できる色素であれば特に制限されないが、例えば、メチレンブルー、トリパンブルー、クマシーブリリアントブルー等が挙げられる。

上記の中でも、第二の色素は、生体試料に含まれる脂質量をより精度よく測定する観点から、メチレンブルーであることが好ましい。特に、生体試料が脂肪細胞である場合、メチレンブルーは染色性に優れ、好ましい。

第二の色素は、生体試料に含まれる脂質量をより精度よく測定する観点から、可視吸収スペクトルの波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における、極大ピークＰ_２の半値幅が、１０ｎｍ～５０ｎｍであることが好ましく、１０ｎｍ～４０ｎｍであることがより好ましく、１０ｎｍ～３０ｎｍであることがさらに好ましい。

前記極大ピークＰ_２の半値幅が上記範囲内である第二の色素としては、例えば、メチレンブルー、クマシーブリリアントブルーG-２５０等が挙げられる。

可視吸収スペクトルは、例えば、１ｃｍ四方の石英セルと、吸光度測定装置ＭＰＳ－２０００（島津製作所製）を用いて下記の条件で測定することができる。
試料濃度：３．０×１０^―２ｍｍｏｌ／Ｌ
溶媒：２－プロパノールまたはエタノール／酢酸の９９／１（ｖ／ｖ）の混合溶液
測定温度：室温（２５℃）

前記極大ピークＰ_２の半値幅とは、極大ピークＰ_２の高さ（つまり最大吸収波長における吸光度）の１／２の高さにおけるピーク幅（半値全幅：Full width at half maximum）を表す。

第二の色素を生体試料に接触させる方法は、特に制限されないが、例えば、先述の第一の色素を生体試料に接触させる方法と同様の方法、つまり、第二の色素を含む染色液を用いる手法が挙げられる。

染色液を用いる場合等において、第二の色素の濃度は、生体試料の量及び想定される脂質量の割合に応じて適宜設定できるが、例えば、生体試料に含まれる脂質量をより精度よく測定する観点から、１μｍｏｌ／Ｌ以上６０μｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、５μｍｏｌ／Ｌ以上３０μｍｏｌ／Ｌ以下であることがより好ましく、１０μｍｏｌ／Ｌ以上２０μｍｏｌ／Ｌ以下であることが更に好ましい。

第二染色工程は、例えば、第二の色素を含む染色液を、生体試料が固定化されている基板に添加し、１８℃～２８℃で、１０分間～３０分間インキュベートすることで、第二の色素を生体試料に接触させる態様であってもよい。

第一の色素及び第二の色素は、生体試料に含まれる脂質量をより精度よく測定する観点から、可視吸収スペクトルの波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における、第一の色素の極大ピークＰ_１と第二の色素の極大ピークＰ_２との差の絶対値（｜Ｐ_１－Ｐ_２｜）が、５０ｎｍ～３００ｎｍであることが好ましく、１００ｎｍ～２５０ｎｍであることがより好ましく、１００ｎｍ～２２０ｎｍであることがさらに好ましい。

第二の色素に対する第一の色素のモル比は、生体試料に含まれる脂質量をより精度よく測定する観点から、１／１０～６００／１であることが好ましく、３０／１～６００／１であることがより好ましく、２００／１～６００／１であることがさらに好ましい。

例えば、生体試料に含まれる脂質量をより精度よく測定する観点から、第一染色工程及び第二染色工程は同時に実施されることが好ましい。
第一の色素と第二の色素とを生体試料に同時に接触させる方法は、特に制限されないが、例えば、下記１）及び２）の方法が挙げられる。
１）第一の色素及び第二の色素を含む染色液を、生体試料が固定化されているウェルプレート等の基板に添加することで、第一の色素を生体試料に接触させる態様；
２）基板に固定化されている生体試料に対し、第一の色素及び第二の色素の両方が溶解する溶剤を予め添加し、そこに第一の色素及び第二の色素をさらに添加することで、両色素を生体試料に接触させる態様。
なお、上記染色液で用いる溶剤は、先述の第一の色素を生体試料に接触させる方法における染色液で用いる溶剤と同様の溶剤が挙げられる。

第一染色工程と第二染色工程は、同時に実施してもよく、順次実施してもよい。例えば、生体試料に含まれる脂質量をより精度よく測定する観点から、第一染色工程と第二染色工程は、同時に実施されることが好ましい。

第一染色工程と第二染色工程を同時に実施する場合、例えば、第一の色素及び第二の色素を含む染色液を予め用意し、前記染色液を基板に固定化された生体試料と接触させる態様であってもよく、基板上で第一の色素及び第二の色素が溶解する溶液と生体試料とを予め混合しておき、これに個体である第一の色素及び第二の色素を添加することで生体試料と接触させる態様であってもよい。

第一染色工程と第二染色工程とを順次実施する場合、その順番は制限されず、第一染色工程の後に第二染色工程を行う態様、第二染色工程の後に第一染色工程を行う態様のどちらでもよい。
第一染色工程と第二染色工程とを順次実施する場合、第一染色工程と第二染色工程との間に、後述する洗浄工程をさらに含んでいてもよいが、例えば、脂質量をより精度よく測定する観点からは、第一染色工程の後には他の工程を経ずに第二染色工程を順次実施することが好ましい。

［洗浄工程］
洗浄工程では、上述の第一染色工程及び第二染色工程後の生体試料を洗浄し、余剰の第一の色素及び第二の色素を除去する。

洗浄工程は、例えば、洗浄液を用いて、上述の第一染色工程及び第二染色工程後の生体試料を洗浄し、余剰の第一の色素及び第二の色素を除去する工程であってもよい。
洗浄液を用いて生体試料を洗浄する操作は、洗浄液を新調して２回以上行ってもよい。使用する洗浄液の量は、余剰の第一の色素及び第二の色素を十分に除去する観点から、生体試料と十分に接触する量であることが好ましい。

洗浄液は、生体色素を染色している第一の色素及び第二の色素が溶出しない溶剤であれば特に制限されないが、例えば、６０％（ｖ／ｖ）の２－プロパノール水溶液、水等が挙げられる。洗浄液に用いられる水は特に制限されないが、不純物が少ないという観点から、蒸留水、イオン交換水、純水等が好ましい。洗浄液は、必要に応じて、溶剤の他に、界面活性剤等の添加剤をさらに含有してもよい。

［抽出工程］
抽出工程では、前記染色された生体試料から前記第一の色素及び前記第二の色素を抽出する。

抽出工程は、例えば、生体試料に含まれる脂質量をより精度よく測定する観点から、上述の第一染色工程及び第二染色工程において第一の色素及び第二の色素で染色され、かつ、上述の洗浄工程において余剰の第一の色素及び第二の色素が除去された生体試料と、抽出溶剤とを接触させ、前記生体試料を染色していた第一の色素及び第二の色素を抽出した抽出液を得る工程であってもよい。
抽出溶剤を用いて生体試料を抽出する操作は、抽出溶剤を新調して２回以上行ってもよい。使用する抽出溶剤の量は、生体試料を染色していた第一の色素及び第二の色素を十分に抽出する観点から、生体試料と十分に接触する量であることが好ましい。

抽出溶剤は、生体色素を染色している第一の色素及び第二の色素が溶出する溶剤であれば特に制限されないが、例えば、エタノール、酢酸、２－プロパノール、水及びこれらの混合液（好ましくはエタノール／酢酸の混合液）等の溶剤が挙げられる。
抽出溶剤に用いられる水は特に制限されないが、不純物が少ないという観点から、蒸留水、イオン交換水、純水等が好ましい。

［その他の工程］
本開示に係る脂質量の測定方法は、準備工程、第一染色工程、第二染色工程、洗浄工程及び抽出工程以外のその他の工程（以下、単に「その他の工程」とも称す。）を含んでいてもよい。

その他の工程としては、例えば、抽出工程の後に測定工程を更に含んでいてもよい。
測定工程では、生体試料から抽出された前記第一の色素及び前記第二の色素の存在比を測定し、生体試料中に含まれる脂質の量を推定する。

生体試料から抽出された前記第一の色素及び前記第二の色素の存在比を測定する具体的な測定方法は、特に制限されず、可視吸収スペクトル測定、発光スペクトル測定等の公知の測定方法が適用できる。
測定工程は、例えば、生体試料に含まれる脂質量をより精度よく測定する観点から、抽出工程で得られた抽出物の可視吸収スペクトル測定により、前記抽出物に含まれる第一の色素及び第二の色素に由来する各吸光度の相対比を求め、この光学的強度比から、生体試料中に含まれる脂質の量を推定する工程であることがより好ましい。

前記測定される抽出物は、液体であっても固体であってもよい。
前記測定される抽出物が、固体である場合、測定方法に応じて、固体のまま測定されていてもよく、溶剤に溶解させ溶液として測定されていてもよい。
前記測定される抽出物が液体である場合（つまり抽出液である場合）、抽出物の測定は、原液そのままであってもよく、濃縮又は希釈された液体の測定であってもよい。

測定工程は、例えば、生体試料に含まれる脂質量をより簡便かつ精度よく測定する観点から、抽出工程にて抽出溶剤を用いて抽出された抽出液をそのまま測定に用いることが好ましい。

－アッセイキット－
本開示に係るアッセイキットは、脂質を染色する第一の色素を含む染色剤と、脂質以外の細胞組成物を染色する第二の色素を含む染色剤と、を備え、本開示に係る脂質量の測定方法により対象物の脂質量を測定する。

本開示に係るアッセイキットによれば、上記構成を有することにより、対象物に含まれる脂質量を簡便かつ精度よく測定することができる。

対象物は、脂質を含んでいても、脂質を含んでいなくてもよい。
対象物の好適な例としては、本開示に係る脂質量の測定方法における生体試料で挙げられる例と同様のものが挙げられる。

脂質及び脂質以外の細胞組成物、並びに、第一の色素及び第二の色素の詳細については、既述したとおりである。

染色剤は、必要に応じて、第一の色素又は第二の色素の他、界面活性剤、塩等を含んでいてもよい。

以下、本開示を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本開示は下記実施例により限定されるものではない。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理手順等は、本開示の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。

－第一染色液の調製－
２－プロパノール１０ｍＬに、第一の色素であるオイルレッドＯ３０ｍｇを溶かした。この溶液とイオン交換水とを、３：２の割合で混合し、１０分間静置した後、０．２２μｍの疎水性ＰＶＤＦメンブレンフィルターでろ過することで、第一の色素を含む染色液（第一染色液とも称す。）を調製した。

－第二染色液の調製－
イオン交換水１０ｍＬに、第二の色素であるメチレンブルー５０ｍｇを溶かすことで、第二の色素を含む染色液（第二染色液とも称す。）を調製した。なお、メチレンブルーは、生体試料における脂質以外のアニオン性の細胞組成物（例えば核酸やタンパク質など）を染色する。

［参考例１］
図１に、第一染色液、第二染色液及び両者の混合液である特定染色液それぞれの吸収スペクトルを示す。図１に示すように、第一の色素と第二の色素とでは、観測する吸収波長が重複しないことを確認した。

［実施例１］
－準備工程－
ＳＴ－１３細胞を、１２ウェルプレートに２×１０５cell/wellで播種し、二酸化炭素インキュベータを用い、５％（ｖ／ｖ）の二酸化炭素、３７℃で翌々日まで静置した。その後、１μＭのデキサメタゾン、０．５ｍＭの３－イソブチル－１－メチルキサンチン、及び１０μｇ／ｍＬのインスリンを添加した分化培地で、ＳＴ－１３細胞を２日間培養し、脂肪分泌細胞に分化誘導した。
脂肪分泌細胞に分化誘導した後、培地を、１０μｇ／ｍＬのインスリンが新たに添加された培地へと交換し、さらに５日間培養した。その後、脂肪分泌細胞に分化誘導されたＳＴ－１３細胞を、生体試料とし、これを、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温（２５℃）で３０分間、インキュベートし、基板である１２ウェルプレートに固定化した。その後、パラホルムアルデヒドの洗浄にリン酸緩衝食塩水０．５ｍLを用いて室温（２５℃）で３０秒間インキュベートし、基板に固定化された生体試料を準備した。

－第一染色工程及び第二染色工程－
上記で調製した第一染色液と、第二染色液とを、第二の色素に対する第一の色素のモル比が３００／１になるように混合し、第一の色素及び第二の色素を含む特定染色液を得た。図１に、２－プロパノールの６０％（ｖ／ｖ）水希釈液を用いて、第一染色液の１０％（ｖ／ｖ）希釈液、第二染色液の０．２％（ｖ／ｖ）希釈液、及び第一染色液の１０％（ｖ／ｖ）と第二染色液の０．２％（ｖ／ｖ）の混合希釈液の吸収波長スペクトラムを示す。
図１に示すように、可視吸収スペクトルの波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における、第一の色素の極大ピークＰ１と、前記第二の色素の極大ピークＰ２と、の差の絶対値（｜Ｐ１－Ｐ２｜）は、１４０ｎｍである。また、極大ピークＰ１の半値幅は３１ｎｍであり、極大ピークＰ２の半値幅は１９ｎｍであった。

染色前操作として、リン酸緩衝食塩水で洗浄直後、２－プロパノールの６０％（ｖ／ｖ）水希釈液０．５ｍLを用いて室温（２５℃）で１分間インキュベートした。
染色前操作の直後、前記特定染色液０．２５ｍＬを、生体試料が固定化されているウェルプレート内に添加し、脂肪分泌細胞と第一の色素及び第二の色素とを接触させた。そして、これを室温（２５℃）で２０分間、インキュベートし、第一の色素による脂質の染色と、第二の色素による脂質以外の細胞組成物の染色を同時に実施した。

－洗浄工程、抽出工程、及び測定工程－
ウェルプレート内に洗浄液：２－プロパノール６０％（ｖ／ｖ）水希釈液、１ｍＬを添加し、室温（２５℃）で３０秒間インキュベートした後、この洗浄液を取り除くことにより、余剰の第一の色素及び第二の色素を除去した（１回目の洗浄工程）。続いて、２、３回目の洗浄として、イオン交換水０．５ｍLを用いて、室温（２５℃）で３０秒間インキュベートした。

上記洗浄工程により余剰の第一の色素及び第二の色素が除去され、且つ、第一の色素及び第二の色素により染色された生体試料が固定化されているウェルプレート内に、０．２２ｍＬのエタノール／酢酸の９９／１（ｖ／ｖ）の混合溶液を添加し、室温（２５℃）、５分間、シェーカーでインキュベートすることにより、生体試料を染色していた第一の色素及び第二の色素が含まれる抽出液を得た（抽出工程）。得られた抽出液の原液について、吸光度測定を行った（測定工程）。

［実施例２］
抽出工程の際に、テクニカルエラーの人為的仕様として、０．２２ｍＬのエタノール／酢酸の９９／１（ｖ／ｖ）の混合溶液及び前記１回目の洗浄工程で除去された余剰色素を含む洗浄液０．０３ｍLを添加し、抽出液を得た。得られた溶液の原液について、吸光度測定を行った以外は、実施例１と同様の手法とした。

［実施例３］
インスリンの添加量を、０μｇ／ｍLへと変更した以外は、実施例１と同様の操作を行った。

［実施例４］
インスリンの添加量を、１μｇ／ｍLへと変更した以外は、実施例１と同様の操作を行った。

［比較例１］
比較例１では、第二染色工程を含まず、第一染色工程の後に洗浄工程以降の工程を経る仕様とした以外は、実施例１と同様の操作を行った。

［比較例２］
抽出工程の際に、テクニカルエラーの人為的仕様として、０．２２ｍＬのエタノール／酢酸の９９／１（ｖ／ｖ）の混合溶液及び前記１回目の洗浄工程で除去された余剰色素を含む洗浄液０．０３ｍLを添加し、抽出液を得た。得られた溶液の原液について、吸光度測定を行った以外は、比較例１と同様の手法とした。

［比較例３］
インスリンの添加量を、０μｇ／ｍLへと変更した仕様とする以外は、比較例１と同様の操作を行った。

［比較例４］
インスリンの添加量を、１μｇ／ｍLへと変更した仕様とする以外は、比較例１と同様の操作を行った。

［評価１：脂質の染色性の確認］
図２に、比較例１と実施例１それぞれにおける吸収波長４９２ｎｍでの吸光度のグラフを示す。なお、統計的有意性はウェルチのｔ検定を使用して決定した。図２に示すように、メチレンブルー混在下においても、第一染色液による脂質の染色性は阻害されないことがわかった。

［評価１：疑似的なテクニカルエラー発生下での脂質量測定の精度評価］
図３に、実施例１、実施例２、比較例１及び比較例２の相対吸光度のグラフに示す。
図中、実施例の吸光度は、吸収波長４９２ｎｍの吸光度と６６５ｎｍの吸光度との比（４９２／６６５）を表し、比較例の吸光度は、吸収波長４９２ｎｍの吸光度を表す。
図中、実施例２の相対吸光度は、実施例１の吸光度を基準としてノーマライズドした値を指す。同様に、比較例２の相対吸光度は、比較例１の吸光度を基準としてノーマライズドした値を指す。
なお、統計的有意性はウェルチのｔ検定を使用して決定した。
図３に示すように、抽出工程及び洗浄工程においてテクニカルエラーが発生した場合においても、実施例では測定される吸光度の変動が少ない、つまり、精度がよく脂質の量を測定できることがわかった。

［評価２：インスリン投与量ごとにみる脂質量測定の精度評価］
図４に、実施例１、実施例４、比較例１及び比較例４の相対吸光度のグラフを示す。
図中、実施例の吸光度は、吸収波長４９２ｎｍの吸光度と６６５ｎｍの吸光度との比（４９２／６６５）を表し、比較例の吸光度は、吸収波長４９２ｎｍの吸光度を表す。
図中、実施例１及び実施例４の相対吸光度は、実施例３（インスリン投与量が０μｇ／ｍＬの例）の吸光度を基準としてノーマライズドした値を指す。同様に、比較例１及び比較例４の相対吸光度は、比較例３（インスリン投与量が０μｇ／ｍＬの例）の吸光度を基準としてノーマライズドした値を指す。
なお、統計的有意性はウェルチのｔ検定を使用して決定した。
図４に示すように、同じインスリン添加量である実施例１と比較例１、実施例４と比較例４等をそれぞれ対比すると、インスリンによって細胞内で産生された脂質量の測定は、実施例の方が比較例よりも精度がよいことがわかった。

Claims (10)

1. 基板に固定化された生体試料を準備する準備工程と、
   脂質を染色する第一の色素を、前記生体試料に接触させ、前記生体試料に含まれる脂質を染色する第一染色工程と、
   前記生体試料に含まれる前記脂質以外の細胞組成物を染色する第二の色素を、前記生体試料に接触させ、前記脂質以外の細胞組成物を染色する第二染色工程と、
   前記第一染色工程及び第二染色工程後の生体試料を洗浄し、余剰の前記第一の色素及び前記第二の色素を除去する洗浄工程と、
   前記染色された生体試料から前記第一の色素及び前記第二の色素を抽出する抽出工程と、を含む、生体試料に含まれる脂質量の測定方法。
2. 前記第二の色素に対する前記第一の色素のモル比が１／１０～６００／１である、請求項１に記載の脂質量の測定方法。
3. 可視吸収スペクトルの波長４００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の範囲における、
   前記第一の色素の極大ピークＰ_１と、
   前記第二の色素の極大ピークＰ_２と、
   の差の絶対値（｜Ｐ_１－Ｐ_２｜）が５０ｎｍ～３００ｎｍである、請求項１又は請求項２に記載の脂質量の測定方法。
4. 前記極大ピークＰ_１の半値幅が１０ｎｍ～５０ｎｍである、請求項３に記載の脂質量の測定方法。
5. 前記極大ピークＰ_２の半値幅が１０ｎｍ～５０ｎｍである、請求項３又は請求項４に記載の脂質量の測定方法。
6. 前記第一染色工程及び前記第二染色工程が同時に実施される、請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の脂質量の測定方法。
7. 前記第一の色素がオイルレッドＯである、請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の脂質量の測定方法。
8. 前記第二の色素がメチレンブルーである、請求項１～請求項７のいずれか１項に記載の脂質量の測定方法。
9. 前記第二の色素は、前記生体試料に含まれる前記脂質以外のアニオン性の細胞組成物を染色する、請求項１～請求項８のいずれか１項に記載の脂質量の測定方法。
10. 脂質を染色する第一の色素を含む染色剤と、
    脂質以外の細胞組成物を染色する第二の色素を含む染色剤と、
    を備え、
    請求項１～請求項９のいずれか１項に記載の脂質量の測定方法により対象物の脂質分泌量を測定する、アッセイキット。

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