JP5599669B2 - 細胞または物質の定量用試薬 - Google Patents
細胞または物質の定量用試薬 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5599669B2 JP5599669B2 JP2010166268A JP2010166268A JP5599669B2 JP 5599669 B2 JP5599669 B2 JP 5599669B2 JP 2010166268 A JP2010166268 A JP 2010166268A JP 2010166268 A JP2010166268 A JP 2010166268A JP 5599669 B2 JP5599669 B2 JP 5599669B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- staining
- present
- cell
- dye
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本発明による定量用試薬において使用される「アニオン性界面活性剤」としては、例えば、アルキルベンゼンスルホン酸またはその塩、石鹸等が挙げられる。
本発明による方法によれば、本発明による定量用試薬を用いて、対象細胞または対象物質を定量的に測定することができる。
(i)細胞培養系において、検出対象である細胞または検出対象を含んでなる細胞を染色液で染色する工程;
(ii)工程(i)で得られた染色された細胞に、本発明による定量用試薬を接触させる工程;および
(iii)工程(ii)で得られた溶液中の染色液色素を定量する工程。
(i’)検出対象を含んでなる組織切片または検出対象であるタンパク質を染色液で染色する工程;
(ii’)工程(i’)で得られた染色された組織切片やタンパク質に、本発明による定量用試薬を接触させる工程;および
(iii’)工程(ii’)で得られた溶液中の染色液色素を定量する工程。
本発明によれば、本発明による方法を実施するための定量用キットが提供される。
(1)トリパンブルー染色法を用いた付着細胞の生死判定試験
ヒト歯髄由来細胞を24ウェルプレート(Costar社製)に10,000個/ウェルで播種し、5日間培養した後、0.4w/v%トリパンブルー染色液(和光純薬工業株式会社製)を300μl/ウェルで添加し、位相差顕微鏡(Nikon社製)で観察した。なお、本願明細書の実施例において、ヒト歯髄由来細胞は、日本歯科大学の倫理委員会により承認されたガイドラインのもと日本歯科大学病院で14〜22歳のボランティアから採取されたヒト正常埋伏第三臼歯から得られたヒト歯髄由来の細胞である(以下、「ヒト歯髄由来細胞」はこのようにして得られた細胞を使用する。)。
その結果、付着力のある細胞は、トリパンブルー染色液で染色されなかったが(図2A)、付着力がない細胞(死細胞)はトリパンブルー染色液で染色された(図2B)。
ヒト不死化口腔粘膜上皮細胞(NDUSD−1細胞; Odontology, 1998, 86, p37-47の記載に従って取得することができる)を60mm培養皿(NUNC社製)に50,000個/培養皿で播種し、5日培養した。その後、100%メタノールを添加し(1ml/培養皿)、室温で5分間固定した。100%メタノールを除去し、室温で乾燥させた後、10%ギムザ染色液(MERCK社製)を添加し、室温で30分間染色した。染色液を除去した後、細胞を水洗し、室温で乾燥させた後、位相差顕微鏡で観察した。次いで、1.5w/v%直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム(化学名:n―ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、和光純薬工業株式会社製;1.5gの直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムを100mlの蒸留水に溶解して作製)を添加し、マイクロシェーカー(IKA社製)で30分間振とうさせた。得られた脱色液を除去した後、細胞を水洗し、位相差顕微鏡で観察した。
実施例1の(2)で得られた脱色液について、吸光スペクトルをマイクロプレートリーダー(日立社製)で測定した。その結果、波長631nmにピークがあることが確認された(図4)。
ヒト歯髄由来細胞を24ウェルプレート(Costar社製)に10,000個/ウェルで播種し、5日培養した。その後、100%メタノールを添加し(300μl/ウェル)、室温で5分間固定した。100%メタノールを除去し、室温で乾燥させた。次いで、10%ギムザ染色液(MERCK社製)を添加し、室温で30分間染色した。染色液を除去した後、細胞を水洗し、室温で乾燥させた。ここに、下記表1に示す各種溶液を添加し、マイクロシェーカー(IKA社製)で30分間振とうさせた後、上清を100μlずつ取って96ウェルプレート(IWAKI社製)に移し、マイクロプレートリーダー(日立社製)を用いて波長300−800nmの範囲で吸光スペクトルを測定した。ここで、各種溶液の脱色前の原液を対照として、対照と比べて吸光スペクトルに著しい変化があるものを脱色能があると判定し、対照と比べて吸光スペクトルに変化がないものを脱色能がないと判定した。
脱色能の評価に関しては、位相差顕微鏡で細胞の脱色を観察することにより行った。具体的には、各ウェルについて、以下の基準で評価を行った。
+++(優れた脱色能がある):染色液色素が完全に除去された。
++(脱色能がある):染色液色素が70〜50%除去された。
+(弱い脱色能がある):染色液色素が50〜20%除去された。
±(わずかな脱色能しかない):染色液色素が20%未満しか除去されない。
−(脱色能がない):染色液色素が全く除去されない。
なお、位相差顕微鏡で細胞の構造が確認できなかったものは細胞融解されたと判定した。(※で示した。)
染色液として、ギムザ染色液に代えて、メチルグリーン染色液(和光純薬工業株式会社製)、ナイルブルー染色液(MP Biomedicals,Inc製)、ボンソーキシリジン染色液(和光純薬工業株式会社製)、ライトグリーン染色液(和光純薬工業株式会社製)およびオイルレッドO染色液(Sigma社製)を使用し、各種溶液として直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムを使用する以外は、実施例1の(4)の記載に従って脱色能の測定を行った(なお、オイルレッドO染色液の測定のみ、OP9細胞(理化学研究所、Cell Bankより入手)を使用した)。
(1)細胞生存能の測定試験
ヒト歯髄由来細胞を24ウェルプレート(Costar社製)に1〜5×104個/ウェルの範囲で播種し、4日間培養した後、本発明による方法、WST−1法の各方法を用いてそれぞれ細胞数を測定した。
ヒト歯髄由来細胞を24ウェルプレートに20,000個/ウェルで播種した後、ヒドロキシウレア(HU;Sigma社製)を添加し(1日目)、4日目に、各方法を用いてヒドロキシウレアの細胞毒性を測定した。
ヒト歯髄由来細胞を24ウェルプレートに20,000個/ウェルで播種した後、ヒドロキシウレアを添加し(1日目)、各方法を用いて、ヒドロキシウレアの細胞毒性について経時変化を測定した。
ヒト歯髄由来細胞を24ウェルプレートに30,000個/ウェルで播種し、2日間培養し100%融合した後、Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 2000, 97, 13625-30の記載に従って、石灰化分化培地で2週間、石灰化の分化誘導を行った。その後、石灰化が誘導された細胞を4%パラホルムアルデヒド(300μl/ウェル)で30分間固定した。次いで、アリザリンレッド染色液(Sigma社製)で染色(室温、60分間)した後、染色液を除去し、細胞を水洗し、室温で乾燥させた後、位相差顕微鏡で観察した。ここに1.5%直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムを添加し、マイクロシェーカーで30分間振とうさせた後、マイクロプレートリーダーで吸光スペクトルを測定した。さらに、得られた抽出液を除去した後、細胞を水洗し、位相差顕微鏡で観察した。
その結果、1.5%直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムによりアリザリンレッド染色液の脱色が可能であることが確認された(図10A〜C)。また、波長517nmにピークがあることが確認された(図10D)。
また、脂肪酸ナトリウムおよび脂肪酸カリウムについても同様に、アリザリンレッド染色液の脱色が可能であることが確認された(データ省略)。
OP9細胞(理化学研究所、Cell bankより入手)からProteoExtract(登録商標) Subcellular Proteome Extration Kit (Calbiochem Cat# 539790、EMD Chemicals Inc製)で細胞の質、膜、核および骨格のたんぱく質をそれぞれ抽出し、SDS−PAGE後、PVDFメンブレン(Invitrogen社製)にタンパク質を転写し、クーマシーブリリアントブルー(CBB)染色液で染色を行った(図11A)。その後、PVDFメンブレンを1.5%直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムに浸して、マイクロシェーカーで30分間振とうさせた。その結果、たんぱく質と結合したCBB色素は脱色された(図11B)。その後さらに、このPVDFメンブレンに対してCBB染色を行うと、最初の染色と同様の位置で染色された(図11C)。
Claims (4)
- 染色された対象細胞または対象物質に、アニオン性界面活性剤を接触させ、除去または抽出された染色液色素を定量することを含んでなる、細胞または物質の定量方法であって、対象物質が、細胞または組織中に含まれる物質である、方法。
- 請求項1に記載の方法に用いるための、アニオン性界面活性剤を含んでなる、細胞または物質の定量用試薬。
- 請求項2に記載の定量用試薬を含んでなる、細胞または物質の定量用キット。
- 請求項1に記載の方法に用いるための、アニオン性界面活性剤を含んでなる、色素抽出剤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010166268A JP5599669B2 (ja) | 2010-07-23 | 2010-07-23 | 細胞または物質の定量用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010166268A JP5599669B2 (ja) | 2010-07-23 | 2010-07-23 | 細胞または物質の定量用試薬 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2012026887A JP2012026887A (ja) | 2012-02-09 |
JP5599669B2 true JP5599669B2 (ja) | 2014-10-01 |
Family
ID=45779982
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010166268A Expired - Fee Related JP5599669B2 (ja) | 2010-07-23 | 2010-07-23 | 細胞または物質の定量用試薬 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5599669B2 (ja) |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09227347A (ja) * | 1996-02-24 | 1997-09-02 | Kao Corp | 1剤式毛髪脱色剤 |
JP2003310299A (ja) * | 2002-04-25 | 2003-11-05 | Sysmex Corp | 乳試料中に含まれる体細胞を測定するための乳試料処理方法及び試薬ならびに方法 |
JP2009148236A (ja) * | 2007-12-20 | 2009-07-09 | Glycoresearch Kk | 線維芽細胞の細胞識別方法 |
-
2010
- 2010-07-23 JP JP2010166268A patent/JP5599669B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2012026887A (ja) | 2012-02-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Sherr et al. | Staining of heterotrophic protists for visualization via epifluorescence microscopy | |
Li et al. | Design and synthesis of a highly selective fluorescent turn-on probe for thiol bioimaging in living cells | |
US10267714B2 (en) | Composition for preparing biomaterial with excellent light-transmitting property, and use thereof | |
US9128097B2 (en) | Method and kit for assessing viable cells | |
EP2534463B1 (en) | Method for analysis of cellular dna content | |
Meyer-Almes | Fluorescence lifetime based bioassays | |
KR101789356B1 (ko) | 전기화학발광 검출에 있어서의 신호 증강 화합물의 용도 | |
Xu et al. | First report on a BODIPY-based fluorescent probe for sensitive detection of oxytetracycline: application for the rapid determination of oxytetracycline in milk, honey and pork | |
JP2019515251A (ja) | 電気化学発光検出における分枝鎖アミン | |
Gavanji et al. | Cytotoxic activity of herbal medicines as assessed in vitro: a review | |
KR20160137697A (ko) | 미생물 검출, 동정 또는 계수 방법 및 이를 이용한 시스템 | |
CN110092773A (zh) | 一种氧杂蒽类衍生物及其制备方法和应用 | |
US20130137127A1 (en) | Dating bloodstains and biological fluids with fluorescence lifetime techniques | |
JP5599669B2 (ja) | 細胞または物質の定量用試薬 | |
Mandavilli et al. | Tools to measure cell health and cytotoxicity using high content imaging and analysis | |
CN109369455A (zh) | 一种双光子近红外双大斯托克斯位移荧光染料及其合成方法与应用 | |
JP3077628B2 (ja) | 細胞毒性試験方法 | |
Baruah et al. | Selective BODIPY® based fluorescent chemosensor for imaging Pb2+ ion in living cells | |
JPWO2008023489A1 (ja) | スクエア酸誘導体化合物、及び該化合物を含むタンパク質検出用試薬、並びに該試薬を用いたタンパク質の検出方法 | |
Burdíková et al. | Testate amoebae examined by confocal and two-photon microscopy: implications for taxonomy and ecophysiology | |
TWI535710B (zh) | 以苯并噁-1,3-二唑骨架爲主的化合物及偵測一待測品中是否存有生物硫醇的方法 | |
CN111087362A (zh) | 一种高选择性检测甲醛的荧光探针及其合成方法与应用 | |
Frydrych | Cell cycle analysis by flow cytometry | |
Alves Da Silva et al. | In Vitro Biological Testing in the Development of New Devices | |
Yumnamcha et al. | Confocal Microscopy Technique in Teratogenicity Testing Using Zebrafish (Danio rerio) Embryos as Model |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130116 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20130510 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130514 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130716 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140507 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140627 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140718 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140813 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5599669 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |