TWI535710B - 以苯并噁－１，３－二唑骨架爲主的化合物及偵測一待測品中是否存有生物硫醇的方法 - Google Patents
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Description
本發明是有關於一種以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物，特別是指一種能用於目標化偵測生物硫醇(硫化氫、半胱胺酸、高半胱胺酸或穀胱甘肽)之以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物。
生物硫醇[硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)、半胱胺酸(cysteine,Cys)、高半胱胺酸(homocysteine,Hcy)和穀胱甘肽(glutathione,GSH)]在人體內扮演許多重要的角色，特別是近年來已被研究報導出和許多慢性疾病或生理病變有正向關係，例如：肝臟損傷(N.Engl.J.Med.,1997,337,237-240)、癌症或心血管疾病(Clin.Chem.,1998,44,1833-1843)、阿茲海默症(N.Engl.J.Med.,2002,346,476-483)、愛滋病(Biomed.Pharmacother.,2003,57,145-155)及骨質疏鬆症(N.Engl.J.Med.,2004,350,2033-2041)等。因此，藉由觀察生物硫醇在活體內和活體
外的表現，能對此些疾病的診斷及治療有極大的幫助。
至今已有一些檢測分析生物硫醇的方法被報導出來，如高效液相色譜法(HPLC)(J.Pharm.Biomed.Anal.,2008,48,1375-1380)、質譜法(Mass Spectrometry)(J.Chromatogr.A,1997,776,342-347)、電化學法(electrochemistry)(Talanta,2003,60,205-214)等。其中，最具有潛力的分析方法，就屬探針法，因為它操作簡單，同時具有高靈敏度，高偵測極限，且最重要的是，探針法可用於活體細胞內的偵測。
目前已發展出用於偵測生物硫醇的探針，分別是利用不同原理使探針產生螢光的開-關和顏色上的變化，其中，依反應原理可歸類成三種類型：麥可加成反應(Michael addition reaction)(Chem.Commun.,2012,48,2722-2724)、環化反應(cyclization reaction)(Inorg.Chem.,2010,49,7898-7903)和裂解反應(cleavage reaction)(J.Org.Chem.,2009,74,4855-4865)。
麥可加成反應：2012年，Pinaki Talukdar等人將順丁烯二酐(maleic anhydride)接在色烯喹啉(chromenoquinoline)螢光染劑上進行探針製作，且利用PET(photo-induced electron transfer)和ICT(intramolecular charge-transfer)原理將螢光抑制，使探針在與生物硫醇作用並進行加成反應後，不再具有PET和ICT效應，因此能呈現高強度螢光。此探針也能成功地用於細胞實驗。麥可加成反應如下式所示：
環化反應：2010年，Jingli Yuan等人以Ru離子為中心做成金屬錯合物，利用其周圍之衍生官能基醛(aldehyde)與生物硫醇(半胱胺酸和高半胱胺酸)作用，產生環化反應並形成冷光，藉以偵測半胱胺酸和高半胱胺酸。環化反應如下式所示：
裂解反應：2009年，Jianzhang Zhao等人將2,4-二硝基苯磺醯氯(2,4-dinitrobenzene sulfonyl chloride)接在炔芘(alkynylpyrenes)螢光染劑衍生物上進行探針製作。因ICT效應將螢光抑制，使此探針在與生物硫醇作用並進行裂解反應後，由於不再具有ICT效應，因此能呈現高強度螢光。此探針也成功地被用於細胞實驗。裂解反應如下式所示：
雖上述三種方法皆能成功地用於目標化偵測生物硫醇的探針，然而，此些方法於生理環境中，皆具長反應時間(response time)的問題，且該等方法也都具有高背景螢光(background fluorescence)的缺點。
過去有研究指出，以螢光染劑苯并噁-1,3-二唑(benzoxa-1,3-diazole)衍生物作為偵測特定化合物的探針，但此些苯并噁-1,3-二唑衍生物的探針，皆無法用於目標化偵測生物硫醇。如1968年，Ghosh等人(Biochem.J.,1968,108,155)，透過因對抗ICT過程(ICT process)而呈現非螢光(non-fluorescent)狀態的4-氯-7-硝基苯并噁-1,3-二唑化合物(4-chloro-7-nitrobenzoxa-1,3-diazole，以下稱NBD-Cl)和胺基酸或其他含胺基(amine)化合物作用，使其氯官能基(chloride)與胺基酸或其他含胺基化合物進行取代反應後，不再對抗ICT過程，因此能產生螢光，藉以偵測胺基酸或其他含胺基化合物，其如下式NBD-Cl與甘胺酸(glycine)之取代反應所示：
雖然NBD-Cl的氯官能基也能和生物硫醇的硫醇基(thiol)進行取代反應並產生螢光，但由於氯官能基具有高拉電子能力(electron-withdrawing characteristic)，其除了可和生物硫醇反應外，也能和其他非生物硫醇之胺基酸、含胺基化合物或鹽類離子等化合物或離子行取代反應，因此，NBD-Cl無法作為目標化偵測生物硫醇的探針。
因此，本發明之第一目的，即在提供一種能作為目標化偵測生物硫醇(硫化氫、半胱胺酸、高半胱胺酸或穀胱甘肽)之探針的以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物。
於是本發明以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物，具有以下化學式(I)：
其中，R1與R2分別為氫或C1~C10烷基，R3為硝基或-SO2R4，R4為苯基或-NR5R6，R5及R6分別為氫、C1~C10烷基、芳基、烷芳基或芳烷基。
因此，本發明之第二目的，即在提供一種偵測一待測品中是否存有生物硫醇的方法。
於是本發明偵測一待測品中是否存有生物硫醇的方法包含一反應步驟及一檢測步驟。
該反應步驟是使如前述化學式(I)所述之以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物與該待測品進行混合而獲得一試樣。
該檢測步驟是觀察該試樣的顏色變化，其中，當顏色由無色改變為彩色，表示該待測品中存有生物硫醇。
本發明之功效是由於該以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物[化學式(I)]上的硫氰酸酯官能基(SCN)拉電子能力較氯官能基低，使該式(I)化合物僅會和生物硫醇中的硫醇基行取代反應，並不會像習知以氯官能基進行取代反應的NBD-Cl，除了可和生物硫醇反應外，也能和其他非生物硫醇之胺基酸、含胺基化合物或鹽類離子等化合物或離子反應，而無法用於目標化偵測生物硫醇。因此，藉由該硫酸氰酯官能基的特性，使本發明以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物[化學式(I)]能作為目標化偵測生物硫醇的探針。
以下將就本發明內容進行詳細說明：
[以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物]
本發明以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物[化學式(I)]之化學結構包含一具螢光性質且可應用於光學影像之螢光染劑的苯并噁-1,3-二唑環作為骨架，及一可專
一性與生物硫醇進行取代反應之硫酸氫酯(SCN)官能基。
較佳地，該式(I)之R1與R2分別為氫、甲基或乙基。更佳地，R1與R2分別為氫。
該式(I)之R3(硝基或-SO2R4)為一拉電子基，且不會與生物硫醇、其他非生物硫醇之胺基酸、含胺基化合物或鹽類離子等化合物或離子進行取代反應。
當R3為-SO2R4且R4為苯基或-NR5R6時，較佳地，該R5及R6分別為氫、甲基或苯基。
較佳地，該式(I)之R3為硝基、-SO2-Ph、-SO2NH2、-SO2N(CH3)2或-SO2NH-Ph(Ph表示苯基)。更佳地，R3為硝基。
在本發明的一具體實施例中，該式(I)之R1與R2分別為氫，R3為硝基。
本發明以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物[化學式(I)]之製備方法如下列反應式I所示，其是於甲醇(MeOH)溶劑中，混合4-氯-苯并噁-1,3-二唑化合物[化學式(III)]，及硫酸氰鈉(sodium thiocynate,NaSCN)並進行反應而得。
本發明以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物
[化學式(I)]可用於目標化偵測生物硫醇，因此可作為偵測生物硫醇的探針。
[偵測一待測品中是否存有生物硫醇的方法]
本發明偵測一待測品中是否存有生物硫醇的方法，包含一反應步驟及一檢測步驟。該反應步驟是使該以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物[化學式(I)]之硫氰酸酯官能基和該待測品中的生物硫醇進行取代反應，且該硫氰酸酯官能基並不會和其他種類胺基酸(非半胱胺酸、高半胱胺酸或穀胱甘肽)、含胺基化合物或鹽類離子等化合物或離子進行取代反應。
該檢測步驟主要是觀察該試樣的顏色變化，其中，當顏色由無色改變為彩色，表示該待測品中存有生物硫醇。較佳地，上述的觀察可以利用肉眼觀察。
下列反應式II列出本發明以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物[化學式(I)]分別和半胱胺酸(Cys)、高半胱胺酸(Hcy)、穀胱甘肽(GSH)之生物硫醇及其他非生物硫醇之胺基酸(other amino acids)反應的反應過程與最終產物。
<反應式II>
由反應式II可知，當本發明以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物[化學式(I)]未和半胱胺酸(Cys)、高半胱胺酸(Hcy)、穀胱甘肽(GSH)之生物硫醇行取代反應前，由於硫氰酸酯及R3(硝基或-SO2R4)分別為具有拉電子能力的官能基，會使該以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物[化學式(I)]呈「拉電子-拉電子(pull-pull)」系統，而使其對抗ICT過程(intramolecular charge-transfer process)，因此處於非螢光(non-fluorescent)狀態；而當該以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物[化學式(I)]和半胱胺酸、高半胱胺酸、穀胱甘肽之生物硫醇進行取代反應後，由於該半胱胺酸、高半胱胺酸或穀胱甘肽取代基具有推電子能力，而使所得的最終產物會呈現「推電子-拉電子(push-pull)」系統，不再對抗ICT過程，因此能產生螢光。
本發明偵測一待測品中是否存有生物硫醇的方法，較佳地，當該生物硫醇為硫化氫、半胱胺酸、高半胱
胺酸或穀胱甘肽時，該反應步驟可於任何模擬人體內pH值的環境下進行。更佳地，該反應步驟是於pH為7.0~7.5的環境下進行，又更佳地，該反應步驟是於pH為7.4的環境下進行。
較佳地，當該生物硫醇為半胱胺酸時，該反應步驟是於pH為4.5至5.5的環境下進行。
本發明偵測一待測品中是否存有生物硫醇的方法，還包含一於該檢測步驟後的分析步驟，該步驟是利用紫外光-可見光(UV-Vis)吸收光譜儀或螢光光譜儀對該試樣進行分析。
較佳地，當該分析步驟是利用紫外光-可見光吸收光譜儀時，可用來偵測硫化氫、半胱胺酸、高半胱胺酸或穀胱甘肽等生物硫醇。更佳地，該紫外光-可見光吸收光譜儀偵測的波長範圍為300~600nm。
較佳地，當該分析步驟是利用螢光光譜儀時，可用來偵測半胱胺酸、高半胱胺酸或穀胱甘肽等生物硫醇。更佳地，該螢光光譜儀偵測的波長範圍為500~750nm。
本發明之其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中：圖1是一相片，說明4-硝基7-硫氰酸基苯并噁-1,3-二唑化合物(NBD-SCN)與不同的生物硫醇(硫化氫、半胱胺酸、高半胱胺酸和穀胱甘肽)反應後且於白光或激發光照射下之顏色和螢光的影像變化，其中(a)是於白光照射
下，(b)是於激發光照射下；圖2是一相片，說明NBD-SCN與存在人體內不同的胺基酸和鹽類離子混合後之顏色變化；圖3是一曲線圖，說明NBD-SCN與存在人體內不同的胺基酸和鹽類離子混合後之紫外光-可見光吸收光譜變化；圖4是一曲線圖，說明NBD-SCN對於硫化氫之反應速率；圖5是一曲線圖，說明NBD-SCN與不同當量數的硫化氫反應後之吸收光譜變化(不同當量數硫化氫於不同吸收光波長之吸收光強度)；圖6是一線性曲線圖，說明NBD-SCN與不同當量數的硫化氫反應後之吸收光譜變化(不同當量數硫化氫於波長530nm之吸收光強度)；圖7是一曲線圖，說明NBD-SCN對於半胱胺酸之反應速率；圖8是一曲線圖，說明NBD-SCN對於高半胱胺酸之反應速率；圖9是一曲線圖，說明NBD-SCN與不同當量數的半胱胺酸反應後之螢光變化(不同當量數半胱胺酸於不同放射波長之螢光強度)；圖10是一曲線圖，說明NBD-SCN與不同當量數的高半胱胺酸反應後之螢光變化(不同當量數高半胱胺酸於不同放射波長之螢光強度)；圖11是一線性曲線圖，說明NBD-SCN與不同當量數的半胱胺酸反應後之螢光變化(不同當量數半胱胺酸於放
射波長550nm時之螢光強度)；圖12是一線性曲線圖，說明NBD-SCN與不同當量數的高半胱胺酸反應後之螢光變化(不同當量數高半胱胺酸於放射波長550nm時之螢光強度)；圖13是一長條圖，說明NBD-SCN與存在人體內不同的胺基酸和鹽類離子混合後之螢光變化；圖14是一折線圖，說明於不同的pH值時，NBD-SCN與半胱胺酸和高半胱胺酸於放射波長550nm時之螢光強度；圖15是一螢光影像相片，說明NBD-SCN偵測活體細胞內生性的生物硫醇之螢光影像；及圖16是一長條圖，說明NBD-SCN於細胞內的毒性分析。
本發明將就以下實施例來作進一步說明，但應瞭解的是，該實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為本發明實施之限制。
<實施例1>
製備4-硝基7-硫氰酸基苯并噁-1,3-二唑化合物(4-nitro-7-thiocyanatobenzoxa-1,3-diazole)[化學式(II)，以下簡稱NBD-SCN]
取0.5g之4-氯-7-硝基苯并噁-1,3-二唑(NBD-Cl)、1g硫氰酸鈉(sodium thiocyanate)與25mL甲醇進行混合，製得一反應液。使該反應液於室溫下攪拌3.5小時，至起始物NBD-Cl完全反應後，再以減壓濃縮機和真空抽乾系統去除溶劑，獲得一粗產物。利用矽膠管柱層析法純化該粗產物，以乙酸乙酯/己烷(體積比為1/3)沖提後，收集沖提液，再經乾燥得0.2235g之NBD-SCN，其為黃色粉末，且產率為40.2%。
將上述所得NBD-SCN分別利用1H-NMR、13C-NMR、質譜儀(EI-MS)及元素分析儀進行結構鑑定，其結果為：EI-MS(m/z)：計算值為221.9，發現值為221.9[M+]；1H NMR(CD3OD，400MHz)：δ 8.65(d,1H),8.02(d,1H)ppm；13C NMR(CD3OD，100MHz)：δ 150.14、144.23、131.86、131.18、126.03、107.23ppm；元素分析(C7H2N4O3S)：計算值為N,25.22、C,37.84、H,0.91；、S,14.43，發現值為N,25.90、C,38.25、H,0.88、S,14.53。
<NBD-SCN與不同的生物硫醇(硫化氫、半胱胺酸、高半胱胺酸和穀胱甘肽)反應後之顏色和螢光的影像變化測試>
將實施例1所得NBD-SCN溶於40mM含1%甲醇且pH為7.4之4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩衝液中，配製一NBD-SCN濃度為20μM之含NBD-SCN緩衝液，並將該含NBD-SCN緩衝液分散在不同的小瓶子內(每瓶3
mL)，且分別加入10當量不同生物硫醇(硫化氫、半胱胺酸、高半胱胺酸和穀胱甘肽)水溶液(濃度為30mM，取用體積為20μL)並反應三十分鐘後，再分別經白光及激發光(476nm)照射，所得的影像照片分別如圖1[(a)白光照射(b)激發光照射]所示，其中，圖1的A為未與任何生物硫醇反應，B為與GSH反應，C為與Cys反應，D為與Hcy反應，E為與H2S反應。
由圖1可知，當NBD-SCN與穀胱甘肽(GSH)反應後的產物在白光照射下會變成黃色，且以一激發光照射後會產生微弱的螢光；當NBD-SCN與半胱胺酸(Cys)和高半胱胺酸(Hcy)反應後的產物在白光照射下會變成橘色，且當以一激發光照射後會產生強烈的螢光；當NBD-SCN與硫化氫(H2S)反應後的產物在白光照射下會變成紫紅色，且當以一激發光照射後並不會產生任何螢光。因此可證明，NBD-SCN對於不同的生物硫醇會產生不同的產物，並於白光照射下會呈現不同顏色，且於激發光照射下也會產生螢光影像變化。透過上述實驗，證明本發明以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物[化學式(I)]除了可用於偵測生物硫醇外，亦可用於判斷生物硫醇的種類。
<NBD-SCN與存在人體內不同的胺基酸和鹽類離子混合後之顏色變化測試>
將實施例1所得NBD-SCN溶於40mM含1%甲醇且pH為7.4之4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩衝液中，配製一NBD-SCN濃度為5μM之含NBD-SCN緩衝液，再
將該含NBD-SCN緩衝液分散在不同的小試管中(每根試管3mL)，並分別與10當量分別含不同生物硫醇(硫化氫、半胱胺酸、高半胱胺酸和穀胱甘肽)的水溶液(濃度為7.5mM，取用體積為20μL)、200當量分別含不同胺基酸(Met、Ser、Arg、Lys、Phe、Leu、Val、Ala、Gly)及鹽類離子(NaHSO3、Na2SO4、Na2SO3、NaNO2、NaNO3、NaHCO3、Na2CO3、CH3COONa、NaI、NaBr、NaCl)的水溶液(濃度分別為150mM，取用體積分別為20μL)混合30分鐘後拍照，所得相片如圖2所示。
由圖2可知，當NBD-SCN分別與人體內非生物硫醇之不同的胺基酸和鹽類離子混合後，並不會產生顏色上的變化，而當NBD-SCN與生物硫醇(硫化氫、半胱胺酸、高半胱胺酸和穀胱甘肽)混合後所得的產物，會產生不同的顏色上變化。當NBD-SCN與穀胱甘肽(GSH)混合後的產物會變成黃色；當NBD-SCN與半胱胺酸(Cys)和高半胱胺酸(Hcy)混合後的產物會變成橘色；當NBD-SCN與硫化氫(H2S)混合後的產物會變成紫紅色。由此可證明，本發明以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物[化學式(I)]對於存在人體內非生物硫醇之不同的胺基酸和鹽類離子並不會產生顏色上的變化，因此不會影響實驗結果的分析，其僅會對目標生物硫醇(硫化氫、半胱胺酸、高半胱胺酸和穀胱甘肽)反應，並產生不同的顏色變化，且用肉眼即可直接偵測並判斷出生物硫醇的種類。
<NBD-SCN與存在人體內不同的胺基酸和鹽類
離子混合後之紫外光-可見光(UV-vis)吸收光譜變化測試>
將實施例1所得NBD-SCN溶於40mM含1%甲醇且pH為7.4之4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩衝液中，配製一NBD-SCN濃度為5μM之含NBD-SCN緩衝液，再將該含NBD-SCN緩衝液分散在不同的小試管中(每根試管3mL)，並分別與10當量分別含不同生物硫醇(硫化氫、半胱胺酸、高半胱胺酸和穀胱甘肽)的水溶液(濃度為7.5mM，取用體積為20μL)、200當量分別含不同胺基酸(Met、Ser、Arg、Lys、Phe、Leu、Val、Ala、Gly)及鹽類離子(NaHSO3、Na2SO4、Na2SO3、NaNO2、NaNO3、NaHCO3、Na2CO3、CH3COONa、NaI、NaBr、NaCl)的水溶液(濃度分別為150mM，取用體積分別為20μL)混合30分鐘後，利用紫外光-可見光吸收光譜儀分析各混合成分於不同波長之吸收光強度，結果如圖3所示。
由圖3可知，當NBD-SCN與人體內非生物硫醇之不同的胺基酸和鹽類離子混合後，並不會產生紫外光-可見光吸收光譜上的變化；當NBD-SCN與生物硫醇混合後的產物，會產生不同的紫外光-可見光吸收光譜區域：硫化氫(H2S)為530nm、半胱胺酸(Cys)和高半胱胺酸(Hcy)為470nm、穀胱甘肽(GSH)為420nm。由此可證明，NBD-SCN對於存在人體內非生物硫醇之不同的胺基酸和鹽類離子並不會產生紫外光-可見光吸收光譜上的變化，僅會與目標生物硫醇反應，並分別產生不同的紫外光-可見光吸收光譜的區域。因此，本發明以苯并噁-1,3-二唑骨架
為主的化合物[化學式(I)]除了可利用紫外光-可見光吸收光譜儀來偵測生物硫醇(硫化氫、半胱胺酸、高半胱胺酸和穀胱甘肽)外，亦可用於判斷生物硫醇的種類。
<NBD-SCN對於硫化氫之反應速率測試>
將實施例1所得NBD-SCN溶於40mM含1%甲醇且pH為7.4之4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩衝液中，配製一NBD-SCN濃度為5μM之含NBD-SCN緩衝液。取3mL該含NBD-SCN緩衝液與10當量硫化氫水溶液(濃度為7.5mM，取用體積為20μL)反應後，再利用紫外光-可見光吸收光譜儀隨著時間分析波長530nm之吸收光強度，最後所得結果如圖4所示。
由圖4可知，當NBD-SCN與硫化氫(H2S)反應30秒後，即會達到平衡。由此可證明，本發明以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物[化學式(I)]與硫化氫反應的反應速率非常快速。
<NBD-SCN與不同濃度的硫化氫反應後之吸收光譜變化測試>
將實施例1所得NBD-SCN溶於40mM含1%甲醇且pH為7.4之4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩衝液中，配製一NBD-SCN濃度為5μM之含NBD-SCN緩衝液。分別取3mL該含NBD-SCN緩衝液與0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.2及1.6當量之硫化氫水溶液反應後(取用濃度為0.75mM，體積分別為0、4、6、8、10、12、16、24及32μL)，再利用紫外光-可見光吸收光譜儀分析後，所得結
果如圖5[不同當量數(0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.2及1.6)硫化氫於不同吸收光波長之吸收光強度]與圖6[不同當量數(0.2、0.3、0.4、0.5、0.6及0.8)硫化氫於波長530nm之吸收光強度]所示。
由圖5可知，當NBD-SCN分別與不同當量數的硫化氫(H2S)反應30分鐘後，會隨著硫化氫的當量數提高而在530nm吸收光波長產生波峰，證明NBD-SCN對於硫化氫反應後的產物，會產生530nm的吸收光波峰，且可藉由圖6中所得到良好的線性關係，由各吸收光強度分別定量出硫化氫的當量數，再經由換算可得硫化氫之濃度。因此，本發明以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物[化學式(I)]與硫化氫反應後會產生特定紫外光-可見光吸收光波長的波峰，並可透過紫外光-可見光吸收光譜儀來偵測並定量出硫化氫的濃度。
<NBD-SCN對於半胱胺酸和高半胱胺酸之反應速率測試>
將實施例1所得NBD-SCN溶於40mM含1%甲醇且pH為7.4之4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩衝液中，配製一NBD-SCN濃度為5μM之含NBD-SCN緩衝液。分別取3mL該含NBD-SCN緩衝液分別與10當量之半胱胺酸和高半胱胺酸水溶液(濃度分別為7.5mM，取用體積分別為20μL)反應後，利用螢光光譜儀隨著時間分析放射波長550nm時之螢光強度最後所得結果如圖7(半胱胺酸)與圖8(高半胱胺酸)所示。
由圖7可知，當NBD-SCN與半胱胺酸反應20秒後，即會達到平衡；由圖8可知，當NBD-SCN與高半胱胺酸反應15分鐘後，即會達到平衡。由此可證明本發明以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物[化學式(I)]與半胱胺酸或高半胱胺酸反應的反應速率是非常快速。
<NBD-SCN與不同濃度的半胱胺酸和高半胱胺酸反應後之螢光變化測試>
將實施例1所得NBD-SCN溶於40mM含1%甲醇且pH為7.4之4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩衝液中，配製一NBD-SCN濃度為5μM之含NBD-SCN緩衝液。分別取3mL該含NBD-SCN緩衝液與0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6及2.0當量之半胱胺酸水溶液(取用濃度為0.75mM，體積分別為0、4、6、8、10、12、16、20、24、32與40μL)和0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0當量高半胱胺酸水溶液(取用濃度為0.75mM，體積分別為0、2、4、6、8、10、12、16、20、24、32與40μL)反應後再利用螢光光譜儀分析，所得結果如圖9[不同當量數(0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6及2.0)半胱胺酸於不同放射波長之螢光強度]、圖10[不同當量數(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6及2.0)高半胱胺酸於不同放射波長之螢光強度]、圖11[不同當量數(0、0.5、0.6、0.8及1.0)半胱胺酸於放射波長550nm時之螢光強度]及圖12[不同當量數(0、0.1、0.2、0.3、0.4及0.5)高半胱胺酸於放射波長
550nm時之螢光強度]所示。
由圖9與圖10可知，當NBD-SCN分別與不同當量數的半胱胺酸(Cys)和高半胱胺酸(Hcy)反應30分鐘後所得產物，會隨著半胱胺酸和高半胱胺酸的當量數提高而增加螢光強度。由此可證明NBD-SCN對於半胱胺酸和高半胱胺酸反應後的產物，會產生強烈的螢光，且可藉由圖11與圖12中所得良好的線性關係，由各螢光強度分別定量出半胱胺酸和高半胱胺酸的當量數，再經由換算得半胱胺酸合高半胱胺酸之濃度。因此，本發明以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物[化學式(I)]可利用螢光光譜儀來偵測並定量出半胱胺酸和高半胱胺酸的濃度。
<NBD-SCN與存在人體內不同的胺基酸和鹽類離子混合後之螢光變化測試>
將實施例1所得NBD-SCN溶於40mM含1%甲醇且pH為7.4之4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩衝液中，配製一NBD-SCN濃度為5μM之含NBD-SCN緩衝液，再分別取3mL該含NBD-SCN緩衝液與10當量分別含不同生物硫醇(硫化氫、半胱胺酸、高半胱胺酸和穀胱甘肽)的水溶液(濃度為7.5mM，取用體積為20μL)、200當量分別含不同胺基酸(Met、Ser、Arg、Lys、Phe、Leu、Val、Ala、Gly)及鹽類離子(NaHSO3、Na2SO4、Na2SO3、NaSCN、NaNO2、NaNO3、CH3COONa．3H2O、NaHCO3、Na2CO3、NaI、NaBr、NaCl)的水溶液(濃度為150mM，取用體積為20μL)混合30分鐘後，利用螢光光譜儀分析各混合成分於
放射波長550nm時之螢光強度，結果如圖13所示。
由圖13可得知，當NBD-SCN分別與人體內非生物硫醇之不同胺基酸、鹽類離子和硫化氫混合後，並不會產生螢光；當NBD-SCN與半胱胺酸(Cys)和高半胱胺酸(Hcy)混合後，會產生強烈的螢光；當NBD-SCN與穀胱甘肽(GSH)混合後，會產生微弱的螢光。由此可證明NBD-SCN對於人體內非生物硫醇之不同胺基酸、鹽類離子和硫化氫，並不會造成螢光上的變化，因此不會影響實驗結果的分析，其僅會對目標半胱胺酸、高半胱胺酸和穀胱甘肽反應，並產生強烈的螢光。因此，本發明以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物[化學式(I)]透過螢光變化可用來偵測半胱胺酸、高半胱胺酸和穀胱甘肽。
<於不同的pH值時，NBD-SCN與半胱胺酸和高半胱胺酸混合後之螢光測試分析>
調配具有pH值分別為4.82、5.00、5.23、6.02、6.2、7.06、7.38、7.79及8.00之9種40mM含1%甲醇的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩衝液。將實施例1所得NBD-SCN分別溶於上述9種具有不同pH值之40mM含1%甲醇的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩衝液中，以配製9種NBD-SCN濃度分別為5μM且為不同pH值之含NBD-SCN緩衝液。分別取3mL該等含NBD-SCN緩衝液與2當量之半胱胺酸和高半胱胺酸水溶液(濃度分別為0.75mM，取用體積分別為40μL)混合後，利用螢光光譜儀分析不同pH時，各成分(NBD-SCN未與半胱胺酸及高半胱胺
酸混合、NBD-SCN與半胱胺酸混合、NBD-SCN與高半胱胺酸混合)於放射波長550nm時之螢光強度，結果如圖14所示。
由圖14可知，當NBD-SCN分別與半胱胺酸(Cys)和高半胱胺酸(Hcy)於不同pH值的HEPES緩衝液混合30分鐘後，在偏酸性環境下(pH為4.5~5.5)，只有半胱胺酸會發出強烈的螢光，在生理環境下(pH為7.0~7.5)，NBD-SCN與半胱胺酸和高半胱胺酸混合皆會發出強烈的螢光。證明NBD-SCN可透過改變pH值，而專一性地與半胱胺酸反應並產生螢光。因此，本發明以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物[化學式(I)]可藉由調控pH值來改變不同的偵測目的，例如在酸性環境下只會與半胱胺酸反應並發出強烈的螢光，而在生理環境下則可與半胱胺酸和高半胱胺酸反應並發出強烈的螢光。
<利用NBD-SCN偵測活體細胞內生性的生物硫醇之螢光影像測試>
細胞株的來源與培養
在下面測試中所使用的老鼠巨噬細胞株(mouse macrophage cell line)RAW 264.7是購自於美國類型培養物收集中心(American Type Culture Collection,ATCC)，寄存編號(accession number)為TIB-71。
RAW 264.7細胞被培養於含有杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM)(購自於Cellgro)[添加有10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)(購
自於HyClone)、1%丙酮酸鈉(sodium pyruvate)以及1% MEM]的培養皿(petri dish)中，接著在培養條件被設定為37℃與5% CO2的培養箱中進行培養。之後，大約每隔1-2天更換新鮮的培養基。當細胞密度達到約80-90%匯聚(confluence)時，移除培養基並以磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate Buffered Saline,PBS)(pH 7.4)來清洗細胞共計3次，接著加入胰蛋白酶-EDTA(trypsin-EDTA)以使細胞自培養皿的底部脫離。之後，加入新鮮的培養基來中和胰蛋白酶的活性並以量吸管(pipette)反覆地吸沖培養基以充分打散細胞，然後將所形成的細胞懸浮液分配到新的培養皿中，並在培養條件被設定為37℃與5% CO2的培養箱中進行培養。
螢光影像測試
將實施例1所得NBD-SCN溶於40mM含1%甲醇且pH為7.4之4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩衝液中，配製一NBD-SCN濃度為5μM之含NBD-SCN緩衝液。將30μL該含NBD-SCN緩衝液與Raw 264.7細胞於培養箱(37℃，5% CO2)中共同培養30分鐘後，或於Raw 264.7細胞先加入N-乙基順丁烯二醯亞胺(NEM)於培養箱(37℃，5% CO2)培養30分鐘，再和5μM、30μL之含NBD-SCN緩衝液於培養箱(37℃，5% CO2)培養30分鐘後，利用螢光顯微鏡分別分析螢光影像，所得結果如圖15(A、C、E：白光影像；B、D、F：螢光影像)所示，其中，圖15的A及B為未和Raw 264.7細胞共同培養，C及D為和Raw 264.7
細胞共同培養30分鐘，E和F為和加入NEM之Raw 264.7細胞共同培養30分鐘。
由圖15可知，當5μM的NBD-SCN與Raw 264.7細胞共同培養30分鐘後之細胞螢光影像C與D，和沒有與NBD-SCN共同培養的細胞螢光影像A與B相較，證實NBD-SCN可以進入活體細胞內，並且偵測到細胞內生性的生物硫醇，進而發出強烈的螢光影像；而當我們先加入可以和生物硫醇反應的試劑NEM與細胞共同培養30分鐘，去除掉細胞內的生物硫醇後，將與NBD-SCN共同培養30分鐘的細胞螢光影像F和細胞螢光影像D(未去除生物硫醇)相較，可以看出細胞內生物硫醇的濃度不同。因此，對於細胞內生物硫醇的濃度，可以先加入本發明以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物[化學式(I)]後，再藉由螢光顯微鏡的螢光影像來觀察區分。
<NBD-SCN於細胞內的毒性測試>
以24孔盤培養Raw 264.7細胞至細胞密度達每孔盤1×105個細胞，將不同濃度(1.25、2.5、5、10、20μM)的NBD-SCN於37℃下分別加入每孔盤中(每孔盤10μL)與Raw 264.7細胞在培養箱(37℃，5% CO2)中培養24小時後，再加入3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT，40μL，10mgmL-1)到每孔盤中，經二小時的培養後，吸掉上清液，再加入400μL二甲亞碸(DMSO)到每孔盤中，並將該24孔盤置於震盪器震盪5分鐘以呈色，最後置換到96孔盤內，利用酵素免疫分析(ELISA)測讀儀
(ELISA reader,SpectraMax Plus384,Molecular Devices)讀取細胞在波長490nm下的吸收值OD490，並將未加入NBD-SCN的控制組之細胞存活率定為100%，再針對與不同濃度NBD-SCN共同培養的各組分別計算其細胞存活率，最後結果如圖16所示。
細胞存活率(%)是藉由將所測得的吸光值(OD490)代入下列公式(1)而被計算出：公式(1)：A=(B/C)×100
A=細胞存活率(%)
B=各組所測得的OD490吸光值
C=對照組所測得的OD490吸光值
由圖16可知，當不同濃度的NBD-SCN與Raw 264.7細胞共培養24小時後，和沒有與NBD-SCN共培養的細胞(控制組)做比較，可以清楚地看出，當NBD-SCN濃度達20μM(為前述「利用NBD-SCN偵測活體細胞內生性的生物硫醇之螢光影像測試」的4倍)仍有80%以上細胞存活率，可證實本發明以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物[化學式(I)]呈現低毒性。
綜上所述，由於本發明以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物[化學式(I)]上之硫氰酸酯官能基(SCN)僅會和生物硫醇(硫化氫、半胱胺酸、高半胱胺酸或穀胱甘肽)行取代反應，而不會和其他非生物硫醇之胺基酸、含胺基化合物或鹽類離子等化合物或離子行取代反應，因此能用於目標化偵測生物硫醇並作為偵測生物硫醇的探針，故確
實能達成本發明之目的。
惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利範圍及專利說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。
Claims (9)
- 一種以苯并噁-1,3-二唑骨架為主的化合物，具有以下化學式(I)：
- 如請求項1所述的化合物，其中，R1與R2分別為氫、甲基或乙基。
- 如請求項2所述的化合物，其中，R1與R2皆為氫。
- 如請求項1所述的化合物，是用於作為偵測一生物硫醇的探針，其中，該生物硫醇是選自於硫化氫、半胱胺酸、高半胱胺酸或穀胱甘肽。
- 一種偵測一待測品中是否存有生物硫醇的方法，包含：一反應步驟，使如請求項1至3中任一項所述之以苯并噁-1,3-二唑骨架為主之化合物與該待測品進行混合而獲得一試樣；及一檢測步驟，觀察該試樣的顏色變化，其中，當顏色由無色改變為彩色，表示該待測品中存有生物硫醇。
- 如請求項5所述的方法，其中，該生物硫醇是選自於硫 化氫、半胱胺酸、高半胱胺酸或穀胱甘肽。
- 如請求項5所述的方法，還包含一於該檢測步驟後的分析步驟，該步驟是利用紫外光-可見光吸收光譜儀對該試樣進行分析。
- 如請求項6所述的方法，其中，該生物硫醇為半胱胺酸、高半胱胺酸或穀胱甘肽，且該方法還包含一於該檢測步驟後的分析步驟，該步驟是利用螢光光譜儀對該試樣進行分析。
- 如請求項6所述的方法，其中，該生物硫醇為半胱胺酸，且該反應步驟是於pH為4.5至5.5的環境下進行。
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| CN108069921A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-05-25 | 台州学院 | 不对称双磺酰胺类化合物的合成及其用途 |
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| CN108069921B (zh) * | 2017-12-18 | 2019-02-26 | 台州学院 | 不对称双磺酰胺类化合物的合成及其用途 |
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