CN108020590B - 一种鉴定珍珠蛋白成分的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定珍珠蛋白成分的新方法，该新方法包括：对珍珠蛋白进行SDS‑PAGE电泳，电泳后凝胶用考马斯亮蓝染色，脱色，扫描图谱并分析条带即可；将显色后的蛋白凝胶割下，清洗干净，晾干，用二硫苏糖醇预处理后用碘乙酰胺处理，再用胰蛋白酶处理，最后用液相色谱分离提取出肽段，备用；将肽段进行质谱检测，获得质谱图；将质谱图谱进行数据库分析。有益效果为：本发明鉴定新方法操作简单、快速高效，能除去珍珠蛋白中的糖链、降低分析难度，能够分析及鉴定珍珠中可溶性蛋白质的成分，为珍珠蛋白的进一步深入研究和综合开发提供理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及属生化分析技术领域，尤其是涉及一种鉴定珍珠蛋白成分的新方法。
背景技术
三角帆蚌(HyriopsiscumingiiLea)为我国特有种，隶属于软体动物门(Mollusca)瓣鳃纲(Lamellibranchia)真瓣鳃目(Eulamellibranchia)蚌科(Unionidae)帆蚌属(Hypriosis)，为淡水底栖贝类，在鄱阳湖、洞庭湖、太湖等大中型湖泊及其流域中广泛分布。其所产珍珠质地细腻光滑，色泽鲜艳，晶莹剔透，是我国生产淡水珍珠的当家品种。珍珠颜色有白、黄、紫、红、黑等基本色相，每种色相又包含很多色度，而颜色及其色度均一性是衡量珍珠价值的重要指标之一，为了制作颜色一致、色度均匀的高品质项链，往往需采用化学漂白和人工分拣的处理方式。但是，化学漂白处理会破坏珍珠表面结构，降低光泽度，严重影响珍珠品质，而人工分拣需要大量的年轻劳动力，且分拣结果仍存在颜色误差，所以人工培育色度均一的珍珠具有重要的经济价值。由于珍珠质颜色主要由遗传决定，蛋白质可能是决定珍珠颜色的关键，因此，利用蛋白质组学技术方法，对参与珍珠颜色形成的蛋白成分进行分析和鉴定是必需的。但是珍珠中蛋白含量极低，提取过程中极易酸化，降解，不易提取，珍珠中蛋白存在以糖基化为主的多种蛋白质翻译后修饰情况，一个蛋白在2D电泳时候可能存在多个蛋白质点，增加了分析的难度，此外，珍珠在内的cDNA或protein数据库严重不足，造成蛋白质鉴定特别是质谱分析时难于进行比对。
现有技术如授权公告号为CN 101788541 B的中国发明专利，公开了一种分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法，该方法利用低熔点琼脂糖和聚丙烯酰胺混合凝胶作为电泳支持介质，联和应用凝胶垂直电泳结合高效液相色谱分离-电喷雾质谱鉴定的分析路线和固相梯度pH干胶条等电聚焦结合上述凝胶垂直电泳分离-基质辅助激光解吸电离质谱鉴定的分析路线，分离鉴定大分子量蛋白质。所提供的凝胶孔径大、机械强度大、分辨率高、重现性好、及质谱兼容性好，可同时根据组分的不同比例调整合适的大分子量分离范围。能选择性地分离100kDa以上分子量区间的蛋白质，重现性达RSD7.6％，明显提高鉴定率。本方法为分离大分子量蛋白质提供有效工具，可应于蛋白质组学研究领域。但是该方法是针对蛋白质分子量为100kDa以上的大分子量蛋白质，珍珠总蛋白的分子量分布广泛，该方法不适合鉴定珍珠蛋白成分。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、快速高效，能除去珍珠蛋白中的糖链、降低分析难度，能够分析及鉴定珍珠中可溶性蛋白质的成分的鉴定珍珠蛋白成分的新方法。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种鉴定珍珠蛋白成分的新方法，包括电泳检测、液相色谱分离、质谱检测和蛋白数据库分析，其具体步骤为：
电泳检测：采用10-15%的十二院基磺酸钠-聚丙烯酰胺分离胶对珍珠蛋白进行SDS-PAGE电泳，80V恒压15min，120V恒压至终点，电泳后凝胶用考马斯亮蓝R-250染色2-4h，然后脱色至背景清晰，然后扫描图谱并分析条带，即可，该步骤等电聚焦电泳与SDS-PAGE结合起来，根据蛋白质的等电点和相对分子质量的不同将蛋白质分离开来，可以同时显现出成百上千种蛋白质，大大提高了蛋白质分离的分辨率，提高凝胶电泳中蛋白质的溶解度、回收率，减少了蛋白质样品水解，降低了杂质和人为操作所带来的分辨率损失；
液相色谱分离：将显色后的蛋白凝胶割下，清洗干净，晾干，在50-60℃下用还原剂二硫苏糖醇预处理50-70min，再于暗室中用碘乙酰胺处理40-50min，取出后放入胰蛋白酶溶液中，在0-5℃下处理20-30min，去除多余酶液后，然后加入20-40μL 25mM碳酸氢铵，在35-40℃下酶解10-15h，再加入3-6%的甲酸停止反应，最后用液相色谱分离提取出肽段，备用，该步骤中蛋白凝胶经过处理能够充分烷基化组氨酸和半胱氨酸，使酶充分吸胀进胶粒，进而使蛋白质充分酶解成多肽，用液相色谱分离可快速分离出肽段；
质谱检测：将肽段点在Anchor Chip靶上，晾干，点上0.1μL基质，晾干，进行质谱检测，测定范围在300-1500Da之间，获取质谱图，自动剔除胰酶自降解的峰和污染物质的峰，对珍珠肽段进行快速准确的检测，从而得到相应的荷质比数据及对应的强度信息；
蛋白数据库分析：图谱用Biotools软件进行检索，以Mascot为搜索引擎，搜索参数为：数据库为oreochromis niloticus，数据检索的方式为combined，最大允许漏切位点设为1，酶设为胰蛋白酶。
优选的，珍珠蛋白为角壳蛋白时，电泳前需将角壳蛋白溶于7-9M尿素或4-6M盐酸胍溶液中，在50-60℃下用二硫苏糖醇预处理20-40min，再于30-40℃暗室中用碘乙酰胺处理20-40min，透析，再加入肽N-糖苷酶F，在30-40℃下酶解12-18h，分离，纯化，洗脱，备用，该可切除去珍珠蛋白与糖链的连接，将珍珠蛋白中的糖链释放出来，纯化蛋白质，减少蛋白中的糖基对电泳测试的影响，降低电泳分析的难度，且链的断裂发生在糖苷键上，对蛋白无影响。
优选的，分离胶中含有0.01-0.02‰的石墨烯，石墨烯中还原石墨烯和氧化石墨烯的重量比为1:4.3-4.7，氧化石墨烯的羧基率为2-4wt%，该石墨烯表面积较大，使得分离胶中的孔径更加均匀，可以提高凝胶的分辨率和可检测的蛋白点数量，从而提高电泳中蛋白质的溶解度和回收率，此外，羧基化石墨烯可提供更多的负电荷，促进蛋白质被覆盖、包裹，有效增加蛋白质迁移距离，从而使蛋白质在凝胶中迁移更快，从而提高蛋白质的分离效果，且该凝胶可以分离蛋白质的分子量范围大。
优选的，液相色谱分离填料为改性介孔硅胶，改性介孔硅胶中2-巯基-1-甲基咪唑和2-巯基-5-甲基-1,3,4-噻二唑的偶联密度为90-110µmol/g和30-50µmol/g，该改性介孔硅胶具有更好的分离选择性和低的传质阻力，使得蛋白质酶解产物的分离更加快速高效，具有分辨率高、快速、重复性好等优点，提高了再现性、分辨率及分离蛋白质的能力，另一方面该改性介孔硅胶能够提供足够大的电荷排斥作用力和合适的疏水性，具有良好的分离效果，有助于蛋白的洗脱。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1）本发明鉴定方法操作简单、快速高效，能除去珍珠蛋白中的糖链、降低分析难度，能够分析及鉴定珍珠中蛋白成分，为珍珠蛋白的进一步深入研究和综合开发提供理论依据；
2）该方法可切除去珍珠蛋白与糖链的连接，将珍珠蛋白中的糖链释放出来，纯化蛋白质，减少蛋白中的糖基对电泳测试的影响，降低电泳分析的难度，且链的断裂发生在糖苷键上，对蛋白无影响；
3）该方法大大提高了蛋白质分离的分辨率，提高凝胶电泳中蛋白质的溶解度、回收率，减少了蛋白质样品水解，降低了杂质和人为操作所带来的分辨率损失；
4）该方法采用的分离胶的分辨率和可检测的蛋白点数量较高，可提高电泳中蛋白质的溶解度和回收率，且可提供更多的负电荷，促进蛋白质被覆盖、包裹，有效增加蛋白质迁移距离，从而提高蛋白质的分离效果，且该凝胶可以分离蛋白质的分子量范围大。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种鉴定珍珠蛋白成分的新方法，包括电泳检测、液相色谱分离、质谱检测和蛋白数据库分析，其具体步骤为：
1）电泳分离：采用10%的十二院基磺酸钠-聚丙烯酰胺分离胶对预处理的珍珠蛋白进行SDS-PAGE电泳，80V恒压15min，120V恒压至终点，电泳后凝胶用考马斯亮蓝R-250染色4h，然后脱色至背景清晰，然后扫描图谱并分析条带即可，上述分离胶中含有0.01‰的石墨烯，石墨烯中还原石墨烯和氧化石墨烯的重量比为1:4.7，氧化石墨烯的羧基率为2wt%；
2）液相色谱分离：将显色后的蛋白凝胶割下，清洗干净，晾干，在60℃下用还原剂二硫苏糖醇预处理50min，再于暗室中用碘乙酰胺处理50min，取出后放入胰蛋白酶溶液中，在1℃下处理30min，去除多余酶液后，然后加入20μL 25mM碳酸氢铵，在40℃下酶解10h，再加入6%的甲酸停止反应，最后用液相色谱分离提取出肽段，备用，上述液相色谱分离填料为改性介孔硅胶，改性介孔硅胶中2-巯基-1-甲基咪唑和2-巯基-5-甲基-1,3,4-噻二唑的偶联密度为90µmol/g和50µmol/g；
3）质谱检测：将肽段点在Anchor Chip靶上，晾干，点上0.1μL基质，晾干，进行质谱检测，测定范围在300-1500Da之间，获取质谱图，自动剔除胰酶自降解的峰和污染物质的峰，对珍珠肽段进行快速准确的检测，从而得到相应的荷质比数据及对应的强度信息；
4）蛋白数据库分析：图谱用Biotools软件进行检索，以Mascot为搜索引擎，搜索参数为：数据库为oreochromis niloticus，数据检索的方式为combined，最大允许漏切位点设为1，酶设为胰蛋白酶。
上述珍珠蛋白为角壳蛋白时，电泳前需将角壳蛋白溶于7M尿素或6M盐酸胍溶液中，在50℃下用二硫苏糖醇预处理40min，再于30℃暗室中用碘乙酰胺处理40min，透析，再加入肽N-糖苷酶F，在33℃下酶解18h，分离，纯化，洗脱，备用。
实施例2：
一种鉴定珍珠蛋白成分的新方法，其具体步骤为：
1）电泳分离：采用15%的十二院基磺酸钠-聚丙烯酰胺分离胶对预处理的珍珠蛋白进行SDS-PAGE电泳，80V恒压15min，120V恒压至终点，电泳后凝胶用考马斯亮蓝R-250染色2h，然后脱色至背景清晰，然后扫描图谱并分析条带即可，上述分离胶中含有0.02‰的石墨烯，石墨烯中还原石墨烯和氧化石墨烯的重量比为1:4.3，氧化石墨烯的羧基率为4wt%；
2）液相色谱分离：将显色后的蛋白凝胶割下，清洗干净，晾干，在50℃下用还原剂二硫苏糖醇预处理70min，再于暗室中用碘乙酰胺处理40min，取出后放入胰蛋白酶溶液中，在5℃下处理20min，去除多余酶液后，然后加入40μL 25mM碳酸氢铵，在35℃下酶解15h，再加入3%的甲酸停止反应，最后用液相色谱分离提取出肽段，备用，上述液相色谱分离填料为改性介孔硅胶，改性介孔硅胶中2-巯基-1-甲基咪唑和2-巯基-5-甲基-1,3,4-噻二唑的偶联密度为110µmol/g和30µmol/g；
3）质谱检测：将肽段点在Anchor Chip靶上，晾干，点上0.1μL基质，晾干，进行质谱检测，测定范围在300-1500Da之间，获取质谱图，自动剔除胰酶自降解的峰和污染物质的峰，对珍珠肽段进行快速准确的检测，从而得到相应的荷质比数据及对应的强度信息；
4）蛋白数据库分析：图谱用Biotools软件进行检索，以Mascot为搜索引擎，搜索参数为：数据库为oreochromis niloticus，数据检索的方式为combined，最大允许漏切位点设为1，酶设为胰蛋白酶。
上述珍珠蛋白为角壳蛋白时，电泳前需将角壳蛋白溶于9M尿素或4M盐酸胍溶液中，在60℃下用二硫苏糖醇预处理20min，再于40℃暗室中用碘乙酰胺处理20min，透析，再加入肽N-糖苷酶F，在40℃下酶解12h，分离，纯化，洗脱，备用；
实施例3：
一种鉴定珍珠蛋白成分的新方法，其具体步骤为：
1）电泳分离：采用12%的十二院基磺酸钠-聚丙烯酰胺分离胶对预处理的珍珠蛋白进行SDS-PAGE电泳，80V恒压15min，120V恒压至终点，电泳后凝胶用考马斯亮蓝R-250染色3h，然后脱色至背景清晰，然后扫描图谱并分析条带即可，上述分离胶中含有0.05‰的石墨烯，石墨烯中还原石墨烯和氧化石墨烯的重量比为1:4.5，氧化石墨烯的羧基率为3wt%；
2）液相色谱分离：将显色后的蛋白凝胶割下，清洗干净，晾干，在55℃下用还原剂二硫苏糖醇预处理60min，再于暗室中用碘乙酰胺处理45min，取出后放入胰蛋白酶溶液中，在3℃下处理25min，去除多余酶液后，然后加入30μL 25mM碳酸氢铵，在37℃下酶解13h，再加入4%的甲酸停止反应，最后用液相色谱分离提取出肽段，备用，上述液相色谱分离填料为改性介孔硅胶，改性介孔硅胶中2-巯基-1-甲基咪唑和2-巯基-5-甲基-1,3,4-噻二唑的偶联密度为100µmol/g和40µmol/g；
3）质谱检测：将肽段点在Anchor Chip靶上，晾干，点上0.1μL基质，晾干，进行质谱检测，测定范围在300-1500Da之间，获取质谱图；
4）蛋白数据库分析：图谱用Biotools软件进行检索，以Mascot为搜索引擎，搜索参数为：数据库为oreochromis niloticus，数据检索的方式为combined，最大允许漏切位点设为1，酶设为胰蛋白酶。
实施例4：
一种鉴定珍珠蛋白成分的新方法，其具体步骤为：
1）电泳分离：采用12%的十二院基磺酸钠-聚丙烯酰胺分离胶对预处理的珍珠蛋白进行SDS-PAGE电泳，80V恒压15min，120V恒压至终点，电泳后凝胶用考马斯亮蓝R-250染色3h，然后脱色至背景清晰，然后扫描图谱并分析条带即可，上述分离胶中含有0.05‰的石墨烯，石墨烯中还原石墨烯和氧化石墨烯的重量比为1:4.5，氧化石墨烯的羧基率为3wt%；
2）液相色谱分离：将显色后的蛋白凝胶割下，清洗干净，晾干，在55℃下用还原剂二硫苏糖醇预处理60min，再于暗室中用碘乙酰胺处理45min，取出后放入胰蛋白酶溶液中，在3℃下处理25min，去除多余酶液后，然后加入30μL 25mM碳酸氢铵，在37℃下酶解13h，再加入4%的甲酸停止反应，最后用液相色谱分离提取出肽段，备用，上述液相色谱分离填料为改性介孔硅胶，改性介孔硅胶中2-巯基-1-甲基咪唑和2-巯基-5-甲基-1,3,4-噻二唑的偶联密度为100µmol/g和40µmol/g；
3）质谱检测：将肽段点在Anchor Chip靶上，晾干，点上0.1μL基质，晾干，进行质谱检测，测定范围在300-1500Da之间，获取质谱图；
4）蛋白数据库分析：图谱用Biotools软件进行检索，以Mascot为搜索引擎，搜索参数为：数据库为oreochromis niloticus，数据检索的方式为combined，最大允许漏切位点设为1，酶设为胰蛋白酶。
上述珍珠蛋白为角壳蛋白时，电泳前需将角壳蛋白溶于8M尿素或5M盐酸胍溶液中，在57℃下用二硫苏糖醇预处理30min，再于37℃暗室中用碘乙酰胺处理30min，透析，再加入肽N-糖苷酶F，在37℃下酶解15h，分离，纯化，洗脱，备用，上述二硫苏糖醇中含有0.14%的二硫赤糖醇，该二硫赤糖醇的加入可提高二硫苏糖醇的稳定性，提高蛋白质中二硫键的还原速率，同时能大大阻止蛋白质中的半胱氨酸之间形成二硫键，且原速率不受反应环境的影响，不会与蛋白中的其他功能基反应，达到意想不到的效果。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种鉴定珍珠蛋白成分的新方法，包括电泳检测、液相色谱分离、质谱检测和蛋白数据库分析，其特征在于：
所述电泳检测步骤为：采用分离胶对预处理后的珍珠蛋白进行电泳，凝胶染色，脱色，然后扫描图谱并分析条带即可；
所述液相色谱分离步骤为：将显色后的蛋白凝胶割下，清洗干净，晾干，在50-60℃下用还原剂二硫苏糖醇预处理50-70min，再于暗室中用碘乙酰胺处理40-50min，取出后放入胰蛋白酶溶液中，在0-5℃下处理20-30min，去除多余酶液后，然后加入20-40μL 25mM碳酸氢铵，在35-40℃下酶解10-15h，再加入3-6％的甲酸停止反应，最后用液相色谱分离提取出肽段，备用；
所述质谱检测步骤为：将肽段点在Anchor Chip靶上，晾干，点上0.1μL基质，晾干，进行质谱检测，测定范围在300-1500Da之间，获取质谱图，自动剔除胰酶自降解的峰和污染物质的峰；
蛋白数据库分析：图谱用Biotools软件进行检索，以Mascot为搜索引擎，搜索参数为：数据库为oreochromis niloticus，数据检索的方式为combined，最大允许漏切位点设为1，酶设为胰蛋白酶；
所述电泳检测步骤中分离胶为10-15％的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺混合凝胶；
所述液相色谱分离步骤中液相色谱分离填料为改性介孔硅胶，所述改性介孔硅胶中2-巯基-1-甲基咪唑和2-巯基-5-甲基-1,3,4-噻二唑的偶联密度为90-110μmol/g和30-50μmol/g。
2.根据权利要求1所述的一种鉴定珍珠蛋白成分的新方法，其特征在于：所述电泳检测步骤中分离胶中含有0.01-0.02‰的石墨烯。
3.根据权利要求2所述的一种鉴定珍珠蛋白成分的新方法，其特征在于：所述电泳检测步骤中石墨烯中还原石墨烯和氧化石墨烯的重量比为1:4.3-4.7，所述氧化石墨烯的羧基率为2-4wt％。
4.根据权利要求1所述的一种鉴定珍珠蛋白成分的新方法，其特征在于：所述电泳检测步骤中SDS-PAGE电泳在80V恒压15min，120V恒压至终点。
5.根据权利要求1所述的一种鉴定珍珠蛋白成分的新方法，其特征在于：所述电泳检测步骤中采用考马斯亮蓝R-250染色，染色2-4h。
6.根据权利要求1所述的一种鉴定珍珠蛋白成分的新方法，其特征在于：所述珍珠蛋白为角壳蛋白时，电泳前需将角壳蛋白溶于7-9M尿素或4-6M盐酸胍溶液中，在50-60℃下用二硫苏糖醇预处理20-40min，再于30-40℃暗室中用碘乙酰胺处理20-40min，透析，再加入肽N-糖苷酶F，在30-40℃下酶解12-18h，分离，纯化，洗脱。
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